Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey

Fundamentación de la Biología Molecular

BT1014 Grupo 102
Profesor: José Luis Duarte de Jesús

Evidencia 1: Reporte escrito final

Campus Toluca. Facultad de Ingeniería y Ciencias, Departamento de

Biotecnología

2 de septiembre de 2022

SEMESTRE AGO-DIC 2022

ÍNDICE

INTRODUCCIÓN 3

IDENTIFICACIÓN DEL PATÓGENO RELACIONADO CON EL CCU

TÉCNICAS
Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR) 4
Captura de híbridos 6

IDENTIFICACIÓN DE INFECCIÓN ACTIVA DEL PATÓGENO

TÉCNICAS
Reverse Transcription PCR (RT-PCR) 7
Northern Blot 8

IDENTIFICACIÓN DE LOS BIOMARCADORES INDUCTORES DE CCU

TÉCNICAS
Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas ELISA 9
Western Blot 11

BIBLIOGRAFÍA 13

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INTRODUCCIÓN
El cáncer cervicouterino (CCU) es la segunda enfermedad neoplásica más común y mortal en
la población femenina mexicana. En latinoamérica, las tasas más altas de mortalidad por CCU
corresponden a México y Chile, mientras que las más bajas a Cuba, Puerto Rico y Argentina.

El desarrollo de cáncer cervicouterino se debe a la infección de un agente patógeno denominado virus

del papiloma humano. Los Papillomaviridae son una familia de virus pequeños que infectan las
células epiteliales de piel y mucosas; su genoma es circular de doble cadena (dsDNA) y tiene una
longitud de aproximadamente 7,500 pb. Dentro de la familia Papillomaviridae existen 16 géneros; el
género Alphapapilomavirus es aquel que se asocia con la infección genital y sus diversos serotipos
pueden clasificarse dentro de dos categorías según su expresión carcinogénica; existe la categoría de
alto y bajo riesgo. Los serotipos de bajo riesgo presentan verrugas cutáneas e incluyen los serotipos 6,
11, 42, 43 y 44 mientras que los de alto riesgo (VPH-AR) son aquellos relacionados al desarrollo de
cáncer cervicouterino (tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59 y 68). El genoma se
divide en tres secciones funcionales (se expresan), la región E (early) o temprana expresa las seis
proteínas regulatorias no estructurales (E1-E7) que están involucradas en la transcripción; la región L
(late) o tardía codifica las proteínas estructurales L1 y L2. La última región se denomina región larga
de control (LCR, Long Control Region) la cual contiene el origen viral de la replicación. Las
funciones específicas asociadas a las proteínas del VPH se encuentran descritas en la Fig 1; los genes
E6 y E7 son los principales responsables del desarrollo de cáncer cervicouterino.

Fig 1: Proteínas del VPH, clasificación y función específica de cada una. Los títulos E y L refieren a la
sección temprana (early) o tardía (late). (Santos-López, G. et al. 2015).

El ciclo de replicación del virus consiste de tres etapas (Fig. 2); en la primera etapa, el virus se
introduce al tejido epitelial, abriéndose paso hacia la membrana basal; esto suele darse gracias a una
abrasión o lesión en el tejido. Cuando el genoma viral se introduce al núcleo de la célula epitelial
empieza la etapa de amplificación del genoma; en esta etapa se comienzan a expresar los genes E1 y
E2; sin embargo se encuentran en un estado estacionario o controlado. Los genes E1 y E2 dan lugar a
los genes subsecuentes (E6, E7, E4 y E5) los cuales contribuyen a que el genoma viral se mantenga en
la célula, permitiendo la replicación viral y dando lugar a una mayor producción viral. Los genes E6,
E7, E4 y E5 se comienzan a expresar en el tejido suprabasal o capa espinosa. El gen E4 es el principal

3
responsable de la amplificación del genoma ya que incrementa el número de copias del genoma y
permite que se comience la transcripción de los genes L1 y L2. La última etapa del ciclo de vida del
virus solo se presenta en queratinocitos diferenciados e incluye la síntesis de proteínas de la cápside
L1 y L2, la síntesis del ADN viral vegetativo, el ensamble y liberación de los viriones.

El propósito de esta investigación es reconocer los serotipos del agente causal relacionado a la
aparición de cáncer cervicouterino; así como conocer los métodos de diagnóstico basados en la
biología molecular, identificación del patógeno, diferenciar las técnicas o tecnologías utilizadas para
la detección de infección activa y los biomarcadores inductores de CCU.

Fig 2: Ciclo de replicación del VPH, (Van Doorslaer, K. et al. 2018). En la etapa 1 del ciclo de vida del
virus se expresan las proteínas E1, E2, E6 y E7 en mayor medida y las proteínas E4 y E5 comienzan a
expresarse.. En la segunda etapa se da la expresión máxima de los genes E4 y E5; en menor medida
están presentes los genes E1, E2, E6 y E7 . En la etapa final se expresan las proteínas virales E4, L1 y
L2; mientras que los genes E1, E2, E5, E6, E7 se encuentran en menor concentración.

IDENTIFICACIÓN DEL PATÓGENO RELACIONADO CON EL CCU

Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR)

La PCR es una técnica de diagnóstico molecular que consiste en la amplificación térmica y

exponencial del genoma viral a través del proceso de replicación del ADN por varios ciclos (Fig 3). El
proceso inicia tomando una muestra del tejido que contiene el fragmento de ADN de interés; el
proceso de extracción de la muestra debe de ser adecuado para la misma, ya que así se asegura que el
material genético está en condiciones óptimas de calidad y cantidad. Después de la extracción, la

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cadena molde de ADN se somete a un proceso de desnaturalización (separación de las hebras de
ADN). La segunda etapa refiere al alineamiento de las hebras con los primers o cebadores; los cuales
consisten en una secuencias cortas y específicas que se unen y permiten replicar el genoma del VPH,
así como delimitar la cadena. En la extensión, la polimerasa comienza a sintetizar una cadena
complementaria para cada hebra del ADN agregando los desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs).

Fig 3: Mecanismo de la técnica de reacción en cadena de polimerasa (PCR). (Ramirez, A., 2022). En el
ciclo 1: Desnaturalización, alineamiento y extensión. Ciclos posteriores: amplificación del genoma de
interés. Morado = primers. Verde=dNTPs y cadenas sintetizadas. Azul = cadena molde de ADN.

Finalmente, el ADN extendido se somete a una electroforesis en gel y, con la ayuda de un marcador
de peso molecular se puede determinar la coincidencia de proteínas o genes del VPH presentes en el
tejido (Fig. 4), incluso en el ciclo de vida temprana del virus. La técnica nos permite reconocer con
certeza el serotipo de VPH que se encuentra infectando a la paciente; sin embargo es una técnica que
requiere de conocimiento, equipo y personal especializado para realizarse.

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 Fig 4: Electroforesis de una PCR de serotipo de alto riesgo 16 de VPH (VPH-AR). Amplificación de
primers específicos para genotipo. (Haghshenas, M. et al. 2013).
M = Marcador de peso molecular (100 pb-1000 pb)
NC = Control negativo
C+h = Control interno de ADN humano
C+16, C+31, C+33, C+35 = Controles positivos para VPH tipo 16, 31, 33 y 35.
1,2,3,4 = Muestras clínicas

Gracias a la electroforesis se puede determinar que las muestras 1 y 3 tienen un resultado negativo
para los serotipos específicos de la prueba; por otro lado, las muestras 2 y 4 son positivas para el VPH
de tipo 16.

Captura de Híbridos II

La captura de híbridos, como su nombre indica, se basa en el proceso de hibridación de los ácidos
nucléicos; siendo estos las moléculas objetivo (aquellas que provienen de las células recuperadas para
la muestra), y las secuencias sintéticas complementarias (Sondas de ARN de serotipos de VPH de alto
riesgo: 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 y 68). En primera instancia, se extrae la muestra
haciendo uso de un cepillo que se introduce en el canal endocervical, la muestra se conserva en un
tubo que se lleva a un laboratorio; ahí, las muestras se desnaturalizan (Fig. 5). Cuando se forma un
híbrido de ADN y ARN se determina que hay presencia de alguno de los serotipos de VPH en la
muestra; el resultado se interpreta como un resultado cualitativo por quimioluminiscencia, es decir,
una señal luminiscente se interpreta como una prueba positiva, sin hacer distinción entre los serotipos.

Fig 5: Técnica de Captura de Híbridos. (Apas Perez de Nucci et al., 2016). Procedimiento:
Desnaturalización, hibridación, captura de híbridos, detección de híbridos formados, revelado y lectura

La captura de híbridos es una prueba que puede alcanzar un valor negativo y predictivo del 100%
respecto a la citología; es decir, si una mujer cuenta con un resultado negativo tiene menor
probabilidad de desarrollar una lesión pre-cancerosa en los próximos 5 años.

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 IDENTIFICACIÓN DE INFECCIÓN ACTIVA DEL PATÓGENO

Reverse Transcription PCR (RT-PCR)

Como su nombre lo menciona, una RT-PCR se basa en la técnica de PCR; es decir en un proceso de
amplificación del ARN. No obstante, el ARN al ser una molécula sensible e inestable, el primer paso
consiste en convertir el ARN a ADN usando una enzima denominada retrotranscriptasa. La diferencia
principal radica en que los resultados de la RT-PCR se analizan en tiempo real. El resultado se lee en
cada ciclo de la reacción y así se obtienen resultados cuantitativos o semicuantitativos. Consiste de
tres pasos: extracción, preparación de la mezcla y amplificación. Las sondas marcadas se realizan
gracias a fluoróforos específicos para cada serotipo. Es una alternativa de menor costo y relativamente
sencilla que permite reconocer el nivel de los genes de interés presentes en la muestra a través del
análisis de las curvas de amplificación (Fig. 6).

Fig 6: RT-PCR. Se analizan diferentes fases de amplificación; analizando la intensidad de emisión de

fluorescencia y se calcula la diferencia entre la curva y el control negativo ( Ferramola, M. 2011).
Eje X = número de ciclos de la RT-PCR
Eje Y= Intensidad de la emisión de fluorescencia (DRn)
Northern Blot

La técnica está basada en el principio de hibridación. En esta técnica, las moléculas de ARN de la
muestra se aíslan y se migran a una membrana de unión al ARN para el análisis de resultados. Para
esto, la muestra se desnaturaliza y los fragmentos de ARN más grandes se presentan en la parte
superior de la placa de gel mientras que los más ligeros migran al fondo de la placa. Los fragmentos,
posteriormente, se transfieren a una membrana sólida, la cuál es expuesta a una sonda de ADN
marcada con Rayos X; lo cuál permite que los fragmentos de ARN que tengan una secuencia
complementaria de ADN (hibridación) sean visualizados en la prueba de Northern Blot (Fig. 7). La
Northern Blot permite determinar los tamaños de las transcripciones de ARN.

7
 Fig 7: Procedimiento de la técnica de Northern Blot. (NIH, 2022). Extracción de ARN, electroforesis
en gel (separamiento de los fragmentos según su longitud). Blotting. (transferencia a membrana).
Hibridación con ADN complementario (sondas). Visualización.

Si bien es una prueba que puede ser utilizada para la identificación de infección activa del VPH;
cuenta con una sensibilidad menor al compararse con una RT-PCR.

IDENTIFICACIÓN DE LOS BIOMARCADORES INDUCTORES DE CCU

Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a Enzimas (ELISA)

La prueba ELISA se basa en la detección de proteínas relacionadas con el CCU (E6 y E7). Existen
diversos tipos de ELISA: directo, indirecto y de captura (Fig. 8); cada uno cuenta con tres
componentes en común: Se marca un antígeno específico haciendo uso de una enzima, un soporte
para el antígeno (usualmente de 96 pocillos) y un sustrato que será sujeto a una transformación por
parte de la enzima si se detecta una proteína, las cuáles se detectan siguiendo métodos colorimétricos,
fluorescentes o luminiscentes. A continuación se explica el funcionamiento detrás de un ELISA de
captura, ya que es la forma más utilizada para la detección de antígenos .

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 Fig 8: ELISA de sándwich directo. (ELISA Technique, s. f.). De izquierda a derecha: Anticuerpo de
captura inmovilizado, adición de antígeno, fase de lavado, adición del anticuerpo de detección
conjugado, fase de lavado secundaria, adición de sustrato, detección y cuantificación.

En un ensayo de captura o sándwich directo, el soporte cuenta con un anticuerpo específico para el
antígeno que puede estar presente en la muestra. Si el antígeno está presente, este se unirá al
anticuerpo. Aquellos componentes que no se hayan unido al anticuerpo se eliminarán realizando un
lavado. Posteriormente se agrega un segundo anticuerpo marcado con una enzima (conjugado), el cuál
se adhiere al antígeno de interés. Existe una segunda fase de lavado para eliminar el conjugado que no
se unió y finalmente se añade el sustrato incoloro; el cual, en caso de existir el conjugado se
transforma en un producto detectable (emisión del color del fluoróforo, absorbancia) (Fig. 9). La
concentración de los antígenos se puede determinar mediante una curva de calibración por
espectrofotometría.

Fig 9: Placa de prueba ELISA. (Vaisman, C. 2020). El cambio del color del sustrato de naranja a azul
indica presencia de anticuerpos (Control positivo).

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La prueba ELISA permite dar un seguimiento al desarrollo del CCU en las pacientes, es una
alternativa de alta sensibilidad y especificidad.

Western Blot (W.B)

Otra técnica de análisis de proteínas es la Western Blot o electroinmunotransferencia (Fig. 8). Al ser
una técnica basada en el blotting, se constituye de los mismos pasos que una Northern Blot; a
diferencia de que la W.B se utiliza para la detección de una sola proteína contenida en una muestra
biológica (tejido o sangre). La Western Blot suele ser catalogada como una prueba de validación o
confirmación. La electroforesis específica para la W.B. se le denomina SDS-PAGE. donde SDS es el
desnaturalizador y PAGE refiere a electroforesis en gel de poliacrilamida. La detección de la proteína
se puede realizar con quimioluminiscencia, colorimetría o fluorescencia.

Fig 10: Resultados de pruebas Western Blot para la expresión de Rb. (Yang, X., & Lu, L., 2015).

En la parte superior (Fig. 10) se presentan 7 muestras para el análisis de presencia del biomarcador
Rb; cuando no se presenta indicación en la prueba se infiere que el estatus de VPH es negativo. Caso
contrario, al presentarse una línea en el marcador de Rb, hay presencia de VPH.

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 Fig 11: Resultados de pruebas Western Blot para la expresión de p53. (Yang, X., & Lu, L., 2015).

El biomarcador p53 regula la producción de tumores. Si está presente pero en baja cantidad se trata de
una producción normal de la proteína p53 y un resultado negativo de VPH. Al existir una disminución
de la p53 se da un resultado positivo de VPH debido a que la proteína E6 interfiere con la producción
de p53. En la Fig. 11 se presentan 8 muestras, 2 de ellas cuentan con indicador en p53 por lo tanto su
estatus de VPH es negativo.

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BIBLIOGRAFÍA

Arellano Gajón, M. (2022). Métodos de detección del Virus de Inmunodeficiencia Humana.

https://www.uv.mx/rm/num_anteriores/revmedica_vol2_num2/articulos/met_detect_vih.html

Apas Perez de Nucci, A., Perrotta, M., & Maciel, A. (2016). Aplicaciones clínicas, toma de la
muestra y lectura de los test de HPV.
http://www.fasgo.org.ar/images/Moodulo_COMRA_test_VPH.pdf

Bolhassani, A. (2018). HPV Infections: Diagnosis, Prevention, and Treatment. In HPV

Infections: Diagnosis, Prevention, and Treatment.
https://doi.org/10.2174/97816810861701180101

Captura de Híbridos para Detección de VPH. (s. f.). pruebaparalavida.org.

https://pruebaparalavida.org/captura-de-hibrido-para-deteccion-de-vph/

Coutlée, F., Rouleau, D., Ferenczy, A., & Franco, E. (2005). The laboratory diagnosis of
genital human papillomavirus infections. Canadian Journal of Infectious Diseases and
Medical Microbiology, 16(2), 83-91. https://doi.org/10.1155/2005/798710

Detección de HPV de alto riesgo mediante el Sistema de Captura de Híbridos. (2017).

Tecnolab Qiagen.
https://www.diagnosticsnews.com/productos-y-tecnologias/27364-tecnolab-qiagen-deteccion-
de-hpv-de-alto-riesgo-mediante-el-sistema-de-captura-de-hibridos

Doorbar, J. (2005). The papillomavirus life cycle. Journal of clinical virology, 32, 7-15.
https://doi.org/10.1016/j.jcv.2004.12.006

Dorado, P. G. (2005). Amplificación de DNA mediante PCR (Reacción en Cadena de la

Polimerasa). Dep Bioquímica y Biol Mol,
1-18.https://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-mol/pdfs/44%20PCR.pdf

ELISA Technique. (s. f.). Rockland. https://www.rockland.com/resources/elisa-technique/

Ferramola, M. (2011). Trabajo Práctico Nº 4: PCR en Tiempo Real.

https://slideplayer.es/slide/21379/

García-Rojo, M., & Morillo-Castro, A. (1999). TÉCNICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR

EN EL DIAGNÓSTICO EN DERMATOLOGÍA.
https://sisbib.unmsm.edu.pe/bvrevistas/dermatologia/v09_sup1/tecnicas.htm

Haghshenas, M., Galini-Moghaddam, T., Rafiei, A., & Ashrafi, G., H. (2013). Prevalence and
type distribution of high-risk human papillomavirus in patients with cervical cancer: A
population-based study. researchgate.net.
https://www.researchgate.net/figure/Gel-electrophoresis-pattern-of-high-risk-HPV-type-16-by
-genotype-specific-primers_fig1_237058607

Hidalgo-Martínez, A. C. (2006). El cáncer cérvico-uterino, su impacto en México y el porqué

no funciona el programa nacional de detección oportuna. Revista Biomédica, 17(1).
https://doi.org/10.32776/revbiomed.v17i1.441

12
MELCHOR, O. Y. L. (2005). Análisis proteómico de sueros en pacientes con cáncer
cérvico-uterino.
https://ipicyt.repositorioinstitucional.mx/jspui/bitstream/1010/727/3/TMIPICYTL8A62005.pd
f

Meites, E., Gee, J., Unger, E., & Markowitz, L. (2007). Human Papillomaviruses.
https://www.cdc.gov/vaccines/pubs/pinkbook/hpv.html#hpv

Mesa-Arango, J., A., Tapia-Vela, L., J., Loaiza-Díaz, N., Echeverry-Chica, J., &
Toro-Montoya, A., I. (2021). Detección y genotipificación del virus del papiloma humano de
alto riesgo mediante PCR multiplex en tiempo real (RT-PCR VPH AR).
https://medicinaylaboratorio.com › myl › download

NIH (2022). Western Blot. https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Western-Blot

Northern Blot: Definición, principios, pasos, resultados y aplicaciones. (2021). El Gen

Curioso. https://www.elgencurioso.com/diccionario/northern-blot/

NIH. (2022). Northern Blot. https://www.genome.gov/es/genetics-glossary/Northern-blot

NIH (s.f). RT-PCR.

https://www.cancer.gov/espanol/publicaciones/diccionarios/diccionario-cancer/def/rt-pcr

Philippe Le Mercier, Chantal Hulo, Patrick Masson (content); Edouard de Castro (software).
(s. f.). Papillomaviridae ~ ViralZone. https://viralzone.expasy.org/5

Ramirez, A. (2022). El test PCR como herramienta de diagnóstico (1/2): Principios básicos.
3tres3.com.
https://www.3tres3.com/articulos/test-pcr-como-herramienta-de-diagnostico-1-2-principios-ba
sicos_48139/#img-1

Samperio Calderón, J, E., & Salazar Campos, A. (2019). Eficacia de las pruebas diagnósticas
del Cáncer Cervicouterino y Virus del Papiloma Humano.
https://revistas.proeditio.com/jonnpr/article/view/2953/html2953esp

Santos-López, G., Márquez-Domínguez, L., Reyes-Leyva, J., & Vallejo-Ruiz, V. (2015).

Aspectos generales de la estructura, la clasificación y la replicación del virus del papiloma
humano. Revista Médica del Instituto Mexicano del Seguro Social, 53(S2),
166-171.http://revistamedica.imss.gob.mx/editorial/index.php/revista_medica/article/view/18
4/541

Torrealba, C. (2019). Introducción a Western Blot. allscience.com.

https://www.e-allscience.com/blogs/articulos/introduccion-a-western-blot

Vaisman, C. (2020). Diagnóstico serológico: ELISA.

https://www.estornuda.me/post/diagnostico-serologico-elisa

Van Doorslaer, K., Chen, Z., Bernard, H. U., Chan, P. K., DeSalle, R., Dillner, J., ... & Burk,
R. D. (2018). ICTV virus taxonomy profile: Papillomaviridae. Journal of General Virology,
99(8), 989-990.https://ictv.global/report/chapter/papillomaviridae/papillomaviridae

13
Wang, X., Huang, X., & Zhang, Y. (2018). Involvement of human papillomaviruses in
cervical cancer. Frontiers in microbiology, 9, 2896. https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02896

Yang, X., & Lu, L. (2015). Expression of HPV-16 E6 protein and p53 inactivation increases
the uterine cervical cancer invasion. Drug research, 65(2), 70–73.
https://doi.org/10.1055/s-0034-1372614

Yuil, J. M. R., Pérez, P. M., de Ríos, E. Y., & Castro, M. R. (2012). ELISA and its
applications in Dermatology. Dermatología Cosmética, Médica y Quirúrgica, 10(3), 212-222.
ELISA y sus aplicaciones en dermatología - Medigraphichttps://www.medigraphic.com › pdfs
› dcm-2012

14