1.

Finalidade: Determinao da atividade de colinesterase no sangue com intuito de monitoramento de exposio ocupacional, e para isso, foram utilizados o mtodos de Slva & Mdio e o mtodo de Ellman et al. Sendo o primeiro um mtodo diferencial de campo, que visa a rapidez, para a triagem das amostras; e o segundo mtodo, que um mtodo espectrofotomtrico para a monitorizao precisa da atividade da colinesterase em sangue. A

determinao da colinesterase foi feita em amostras de soro e plasma.

2. Fundamentos dos mtodos: Os inseticidas organofosforados, organoclorados e/ou carbamatos apresentam com mecanismo de ao txica a inibio da acetilcolinesterase neural, impedindo assim a degradao do neurotransmissor chamado de acetilcolina, de maneira que os sinais e sintomas da intoxicao por esses compostos se devem ao acmulo de acetilcolina nas terminaes nervosas. Como esse tipo de enzima tambm est presente no sangue e igualmente inibida, a determinao da atividade de colinesterase no sangue de grande importncia para a verificao do grau de exposio a inseticidas

organofosforados e carbonatos. Em funo da porcentagem de inibio verificada em um indivduo, associada ao quadro clnico apresentado pode saber se a exposio ao inseticida est sendo excessiva ou no. Os mtodos utilizados baseiam-se na medida da velocidade de hidrlise da acetilcolina pelas colinesterases: Mtodo Colorimtrico, no qual se baseia na variao do pH do meio de reao, pelo cido actico liberado na hidrlise da acetilcolina pela enzima colinesterase, verificada atravs do indicador azul de bromotimol, que assume diferentes coloraes em funo da atividade enzimtica, e o Mtodo Espectrofotomtrico, que baseado na medida

colorimtrica da velocidade de hidrlise da acetilcolina pelas colinesterases sanguneas. A tiocolina liberada reage com o cido 5,5-ditiobis(2-nitrobenzico) (DTNB) liberando um composto de cor amarela que quantificado espectrofotometricamente em comprimento de onda de 430nm. Em ambos os mtodos utilizamos o soro e o plasma, pois, a verdadeira colinesterase

(acetilcolinesterase) encontrada nas hemcias e a pseudocolinesterase (acilcolina acil-hidrolase) encontrada no soro. No mtodo de Silva & Mdio foi preparada uma escala de variaes de corres para o reagente azul de bromotimol na presena de cido actico.

Figura 1 - Estrutura do Azul de Bromotimol Para avaliao da amostra foi adiciono o substrato da colinesterase, a acetilcolina, que aps a reao gera cido actico e tiocolina; permitindo a reao do cido actico com o azul de bromotimol gerando uma colorao relativa a quantidade de cido actico, como no esquema representado abaixo.
Colinesterase Acetilcolina cido Actico + Tiocolina + Azul de Bromotimol

Colorao

No mtodo espectrofotomtrico, no utilizamos uma escala de cores, e sim fazemos a leitura da absorbncia gerada pela complexao a tiocolina e o Reagentes de Ellman (DTNB). Como descrito nas reaes abaixo.

Colorao amarelada

3. Fluxograma dos Mtodos

Mtodo de Slva & Mdio

Mtodo de Ellman

4. Resultados e Discusso

Para cada diluio feita na escala de cores corresponde a uma diferente porcentagem de atividade enzimtica, conforme mostra tabela abaixo: Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Atividade Enzimtica (%) 0,00 0,0 12,5 12,5 25,0 25,0 37,5 37,5 50,0 50,0 62,5 62,5 75,0 75,0 87,5 87,5 100,0 100,00

Para amostra foi utilizados o sangue de um indivduo no exposto para verificar mos o tempo necessrio para a reao, o tempo gasto pela amostra do indivduo que tinha 100% da atividade de colinesterase chegou cor do tubo 10 no tempo de 30 minutos. Para a amostra do indivduo exposto aps o 30 minutos necessrios para que a colinesterase exercesse atividade, notamos que a colorao do tubo correspondia a colorao do tubo 3 da escala de cores. Portanto o indivduo estava com a atividade enzimtica na faixa de 50,0% - 62,5%. Como a atividade foi inferior a 75,0% e esse no um mtodo especfico necessria a uma nova coleta para uma anlise

espectrofotomtrica pelo mtodo de Ellman. Atravs dos clculos realizados pela equao abaixo:

Onde Abs a variao entre os valores de absorbncia observados, t a variao do tempo entre as leituras e v o volume da amostra considerando a diluio. Que depois foi corrigida multiplicando-a pelo fator de correo para a temperatura. Temos os intervalos de valores que so considerados normais: 15,5 31,0 1,3 7,8 32,0 58,0

Atividade colinestersica do sangue total (ST) Atividade colinestersica do plasma (PL) Atividade colinestersica eritrocitria (E)

Para a amostra que nos analisamos encontramos os seguintes valores: Atividade colinestersica do sangue total (ST) = 8,8094 Atividade colinestersica do plasma (PL) = 2,784 Atividade colinestersica eritrocitria (E) = 18,8998

5. Laudo frente ao resultado

Pelo mtodo de Slva & Mdio foi possvel fazer a triagem rpida para verificarmos como estava a atividade da colinesterase de uma indivduo que provavelmente teve ma exposio indevida a algum inseticidas que possua em sua composio agentes qumicos organofosforados e/ou organoclorados. O teste de campo nos permitiu constatar que a atividade colinestersica estava na faixa de 50,0% 62,5%; porm foi necessrio o uso de outro mtodo mais especfico para a monitorizao do nvel da atividade enzimtica. No mtodo de Ellman, ou mtodo espectrofotomtrico, foi possvel constatar que a atividade colinestersica do sangue total est abaixo da faixa de normalidade. Porm a atividade colinestersica do plasma est dento da faixa considerada de normalidade, entretanto a colinesterase plasmtica na verdade uma pseudocolinesterase. A atividade colinestersica eritrocitria, que a colinesterase verdadeira, esta abaixo da faixa de normalidade; portanto conclumos que o indivduo apresenta-se numa condio de intoxicao por organofosforados e/ou organoclorados.

6. Referncias Bibliogrficas

ELLMAN et al. A new rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochemic Pharmacol, v.7, p. 88-95, 1961.

SILVA, S.E. & MIDIO, F.A. Field Method for the determination of whole blood cholinesterases. Med Lav., 1995.

CONCEIO FILHO, J.N. Avaliao da atividade de colinesterase srica em pacientes intoxicados por Aldicarb atendidos pelo CIAVE-Ba. Monografia (Curso de Especializao em Anlises Clnicas) Universidade Catlica do Salvador, 2002.

CAVALIERE, M.J.; CALORE, E.E.; PEREZ, N.M.; PUGA, F.R. Miotoxicidade por organofosforados. Rev. Sade Pblica, v. 30, p. 267-272, 1996.