Variabilidade gentica em aaizeiro

Pesquisa

(Euterpe oleraceae Mart.)

Conservao e caracterizao de recursos genticos vegetais na Amaznia Oriental
aaizeiro (Euterpe oleraceae Mart.) uma palmeira nativa da Amaznia, que se encontra amplamente distribudo da Amaznia at a Bahia (Corra, 1926), com maior concentrao na parte oriental da Amaznia Legal, mais precisamente do litoral Atlntico at o municpio de bidos-PA, atingindo os arredores do municpio de Parintins-AM (Ducke, 1946). A produo de frutos a sua principal vocao, dos quais, atravs de macerao, manual ou mecnica, da polpa, se obtm uma

Maria Rosa Costa

Eng. Agro., M.Sc. em Gentica Embrapa Amaznia Oriental Belm PA mrco@cpatu.embrapa.br

Maria do Socorro Padilha de Oliveira

Eng. Agro., M.Sc. em Gentica Embrapa Amaznia Oriental Belm PA

Elisa Ferreira Moura

Bolsista PIBICCNPq/Embrapa Embrapa Amaznia - Belm PA Fotos cedidas pelas autoras

bebida concentrada, nutritiva e de alto valor calrico, conhecida por aa, a qual utilizada desde a poca pr-colombiana pela populao Amaznica. Vale ressaltar que, at pouco tempo, o consumo dessa bebida estava restrito ao estado do Par e a outros locais da Amaznia mas que, atualmente, vem conquistando novos mercados em outras regies brasileiras e at mesmo em outros pases. A segunda utilizao econmica do aaizeiro a produo de palmito. Esse mercado recente, tendo-se iniciado na dcada de 70 em substituio ao palmiteiro (E. edulis Mart.) que j se encontrava sob forte ameaa de extino. Ao contrrio do mercado de frutos, grande parte da produo sempre foi destinada demanda nacional e internacional. Apresenta-se, ainda, como produtor de celulose (Melo et al., 1974), e tem boa perspectiva como produtor de corante natural (Oliveira et al., 1998). O Estado do Par destaca-se como o maior produtor da bebida aa e de palmito, sendo, tambm, o maior consumidor de aa. Essa bebida o segundo alimento mais consumido pela populao local, superado apenas pela farinha de mandioca (Sudam, 1992). Contudo, a maioria da produo provm do extrativismo, pelo qual a estimativa de produtividade para frutos e palmito fica em torno de 12 t/ha/ano e 200 kg/ha/ano, respectivamente (Produtos..., 1998). Tais produtos renderam em impostos ao estado, em 1992, cerca de 200 milhes de dlares, sendo 15% correspondente a extrao de palmito. Esses resultados apontam a produo de frutos como a mais rentvel, sendo comercializada na forma de aa in natura e aa congelado. Vale ressaltar que, hoje, o aaizeiro (Euterpe oleracea) a maior fonte supridora de matriaprima para a indstria de palmito, respondendo por mais de 95% da produo nacional, cuja estimativa mdia de 11.000 toneladas. Para atender produo de uma tonelada de palmito enlatado, faz-se necessrio o corte de 4.000 plantas, o que, nas populaes naturais poder levar a espcie ao risco de extino, sendo necessrio e urgente envidar

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esforos a fins de caracterizar o germoplasma disponvel em Bancos e/ ou em Colees de Germoplasma, de modo que se ofeream subsdios aos programas de melhoramento gentico dessa palmeira. Entre 1988 e 1990, foi instalada a coleo de germoplasma de aa da Embrapa Amaznia Oriental, localizada a 15km da sede, em Belm-PA. Ocupa uma rea de dois hectares, em terra firme, com solo do tipo latossolo amarelo, textura mdia. Os acessos foram plantados em linhas, no espaamento de 5m x 3m, sem repetio e com um nmero varivel de plantas (1 a 15). Botnica do aa O aaizeiro representado por uma nica espcie, a Euterpe oleracea Mart., sendo constitudo botanicamente de duas variedades, distintas pela colorao dos frutos (epicarpo) quando maduros, sendo elas: a violcea e a branca, esta ltima denominada tambm de verde. A variedade violcea, como o prprio nome diz, produz frutos violceos, polpa brilhante e escura, obtendo-se dela uma bebida de colorao arroxeada, e a mais comercializada. A variedade branca produz frutos com casca e polpa verde-escura brilhante, dando uma bebida de cor creme-claro (Cavalcante, 1991). A primeira rica em antocianina, substncia que reduz a taxa de colesterol, enquanto a segunda tem menor teor de leo na polpa. Pode ser considerado como uma planta hermafrodita, que possui, no mesmo indivduo e na mesma inflorescncia, flores unissexuais com as femininas perfeitas e as masculinas apresentando pistildio. Em suas inflorescncias, existe sempre um maior nmero de flores masculinas, estando as femininas ladeadas por duas masculinas, formando as trades. O ramo florfero do aaizeiro intrafoliar, envolvido por duas brcteas (espata) que, no momento da maturao da segunda espata, expe a inflorescncia andrgina. Apesar de existirem flores unissexuais distribudas ao longo de todas as rquilas, as nteses dessas flores tm separao temporal, com a maturao sexu-

Figura 1. Eletroforese do RAPD em aaizeiro gerado pelo primer OPN 6 da Operon Technologies. A primeira e a ltima colunas correspondem ao marcador Ladder e as demais, aos gentipos analisados

al dos dois gametas ocorrendo em pocas distintas, iniciando-se pelas masculinas. Anlise da variabilidade gentica Um dos maiores problemas dos recursos genticos a escassez de informaes, principalmente daquelas relacionadas com a documentao e a caracterizao gentica, e culmina com a carncia de estudos sobre o conhecimento da diversidade gentica das espcies com potencial econmico para a regio. Nesse sentido, a caracterizao de germoplasma necessria, com vistas a assegurar informaes sobre essas fontes de genes para utilizao futura, que, alm de prevenirem a perda desses recursos, so fundamentais para o sucesso da sua produo agrcola. Graas ao avano na rea de marcadores moleculares de PCR (Reao de Polimerase em Cadeia), hoje possvel estudar melhor o comportamento de organismos de interesse econmico. Trata-se de um processo cclico, no qual a enzima DNA polimerase faz cpias de um DNA, para o qual iniciadores (primers oligonucleotdeos) especficos so fornecidos, sendo que, em cada ciclo, o

nmero de cpias duplicado, produzindo um aumento exponencial do mesmo. O processo envolve as fases de desnaturao das fitas de DNA; anelamento dos oligonucleotdeos; extenso e polimerizao pela enzima DNA polimerase (Ges,1999). Essa tcnica, desenvolvida por WILLIAMS et al. (1990), distingue-se das demais tcnica de PCR pelo fato de se utilizar um nico primer, composto por 10 pares de bases de seqncias nucleotdicas arbitrrias, tendo, portanto, sua seqncia alvo desconhecida (Ferreira & Gratapaglia, 1996), ao contrrio das outras que requerem informaes a respeito da seqncia do DNA alvo para o desenho de primers especficos (Williams et al.,1990), o que permite a realizao de estudos de anlise gentica em diversas espcies. Mediante a utilizao dessa tcnica, detectam-se vrios polimorfismos entre diferentes populaes e/ou indivduos (presena x ausncia dos produtos de amplificao), visto que as seqncias internas dos segmentos amplificados pertencem a todas as classes de abundncia de DNA no genoma, desde sequncias de cpia nica at as altamente repetitivas. Parte-se da premissa de que os stios de hibridizao do primer esto dis47

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Tabela 1. Identificao dos indivduos analisados pertencentes coleo de germoplasma de aaizeiro. Belm, Par. 2001 Indivduo 001=1 006=3 042=3 067=1 050=9 064=1 072=2 090=8 127=1 135=6 Origem Brasil Brasil Brasil Brasil Brasil Brasil Brasil Brasil Brasil Brasil Procedncia Benfica-Par (Povoado de Santa Maria) Mosqueiro-Par (Stio Santa Lcia) Muan-Par (Fazenda Esprito Santo) Breves-Par (Furo dos Macacos, rea de influncia do rio Amazonas) Breves-Par (Furo Jaburu, rea de influncia do rio Amazonas) Breves-Par (Furo dos Macacos, rea de influncia do rio Amazonas) Breves-Par (Furo do Tajapuru, rea de influncia do rio Par) Oiapoque-AP (localidade Aaizal, rio Curipi) Guimares-MA (localidade Jandiritina) So Joo do Araguaia-Par (Estrada da Transamaznica, ramal Apinags)
para que se possam obter amplificaes reproduzveis e confiveis (Timmerman & Mccallum,1993). O objetivo deste estudo foi examinar o polimorfismo gerado por marcadores RAPD e analisar a diversidade gentica entre acessos de aaizeiro, de diferentes procedncias. Material e Mtodos Material vegetal e extrao de DNA O material investigado foi composto de dez acessos de aaizeiro provenientes do banco de germoplasma da Embrapa Amaznia Oriental, em Belm -PA. O DNA genmico foi obtido atravs de folhas recmcoletadas que, aps desinfeco, foram maceradas com nitrognio lquido, e cerca de 200mg de p foi transferido para tubos eppendorf. Adicionaram-se, em seguida, 700 l de soluo extratora. Os tubos foram misturados em vortex e colocados em banho-maria a 600 C, durante 60 minutos. O extrato foi misturado com 700 l de clorofrmio-lcool isoamil (24:1) para formar uma emulso. Aps centrifugar por 10 minutos a 4 0C e 12.000 rpm, a parte superior aquosa foi cuidadosamente isolada e submetida a lcool 95 %, o que ocasionou a precipitao do DNA. O material foi colocado em 200 C, por 20 minutos, sendo, em seguida, centrifugado por 10 minutos, a 40 C e 12.000 rpm, lavado com 1000 l de etanol 70%, para remover sais e, posteriormente seco a temperatura ambiente por, aproximadamente, doze horas. O DNA foi ressuspendido com 100l RNAse/ TE (10ug.ml-1). A concentrao de DNA foi estimada em gel de agarose 1,5% pela comparao do DNA total com trs concentraes do DNA lambda. As amostras utilizadas no RAPD, aps a quantificao total, partiram de diluies da amostra total em gua estril de modo que contivesse 5ng/l de DNA. As alquotas foram armazenadas a -200C. Anlise RAPD A seleo de primers foi realizada pela comparao de quatro indivduos com caractersticas morfolgicas contrastantes. Selecionou-se aqueles que apresentaram um bom padro de amplificao e que geraram polimorfismo entre os indivduos. Foram escrutinados oito kits da Operon Technologies, Alameda, CA, USA, compostos de 20 primers arbitrrios, num total de 160. As reaes foram desenvolvidas de acordo com o protocolo de Williams e col., (1990), em um volume final de 13l contendo gua destilada autoclavada, 20mM Tris-HCl (pH 8,0), 50mM KCl, 2,0mM MgCl2, 200M de cada dNTP, BSA purificada (2,5 mg/ ml), 1,3 uM primer arbitrrio, 1U.I Taq DNA polimerase e 15 ng de DNA genmico, cobertas com uma gota de leo mineral comercial. As amplificaes foram realizadas em termociclador de DNA Thermolyne Amplitron II modelo DB.80225, sendo realizados 40 ciclos de 1, a 94 0 C; 1 a 37 0C; e 2, a 72 0C, seguidos de mais 7 minutos a 72 0C, para a completa extenso dos produtos am-

tribudos ao acaso pelo genoma e que as diferenas nesses stios resultam na amplificao de fragmentos distintos (de tamanhos variveis), que podem ser utilizados como marcadores moleculares (Bardakci & Skibinski, 1994). Sendo, portanto, o polimorfismo detectado pela presena de um fragmento especfico amplificado em um indivduo comparado com a ausncia dele em outro indivduo (Williams et al., 1990; Fairbanks et al.,1991). O polimorfismo gerado pode ser devido a uma troca nica de base, a qual previne uma associao estvel com o primer ou por mudanas que alterem o tamanho (pequenas inseres ou delees) ou previnam a amplificao dos fragmentos (inseres que separem os stios em mais de 3.000 bp, inverses, delees); (Waugh & Powell, 1992). O poder de deteco do polimorfismo, na tcnica RAPD (polimorfismos de DNA amplificados ao acaso), a olho nu, diretamente em gel de eletroforese ou atravs de corantes especficos para DNA (brometo de etdio e outros) , na grande maioria dos casos, uma vantagem significativa para a deteco da variabilidade gentica. Muito embora a tcnica de RAPD resulte em uma srie de vantagens, visto que apresenta uma notvel simplicidade e rapidez, ela bastante sensvel, e pequenas modificaes na concentrao dos componentes da reao so capazes de produzir alteraes no padro dos marcadores obtidos. Em decorrncia disso, recomendvel uma otimizao cuidadosa das condies experimentais
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plificados. O mtodo utilizado para a separao dos produtos amplificados foi a eletroforese horizontal em gel de agarose 1,5% corado com brometo de etdio 1mg/ml. Utilizaram-se 13l de cada reao acrescidos de 2l de uma soluo de azul de bromofenol (40%) mais sacarose. Foram utilizados TBE (Trizma base 0,1 M; cido brico 1M e EDTA 0,5M) como tampo do gel e de corrida. Aps a eletroforese, os gis foram visualizados e fotografados em equipamento de foto documentao por transiluminao em ultravioleta. Anlise dos dados Aplicou-se um ladder de 1Kb no incio e no final do gel para definir o tamanho aproximado dos fragmentos gerados nas PCRs. Inicialmente foi construda uma matriz para os fragmentos polimrficos amplificados, com presena (1) e ausncia de banda (0). Somente foram consideradas as bandas que no davam margens a dvidas. Bandas muito fracas, de difcil resoluo, no foram includas. Para anlise dos dados, utilizou-se o NTSYS-pc( Numerical Taxonomy and Multivariate Analysis System), verso 2.02. A similaridade entre as amostras foi estimada pelo coeficiente de jaccard, que gerou a matriz de similaridade. A partir dessa matriz, foi gerado o cluster, pelo mtodo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Average), que foi expresso

na forma de um dendograma. Resultados e Discusso Dos 160 primers testados, obtevese um total de 83 primers polimrficos, que se mostraram viveis para o estudo pretendido, demonstrando um aproveitamento de 46 %. Um total de 177 marcadores RAPD, com tamanhos que variavam de 300 a 2.200 pb, foi amplificado pelos 24 primers utilizados, dos quais 75 eram polimrficos, gerando 43% de polimorfismo. O nmero de marcadores amplificados variou de 12 (OPN-16) a 4 (OPN-3). O nmero de fragmentos polimrficos por primer variou de 7 (OPAZ-4) a 1 (OPN-9 e OPN-11). Observou-se, dentre os fragmentos amplificados, a ocorrncia de bandas especficas aos indivduos. Na Figura 1, podem ser visualizados exemplos desses marcadores. Na Tabela 2, encontra-se a matriz de distncia gentica gerada pelo coeficiente de jaccard para todos os indivduos que compunham a amostra. As maiores distncias foram obtidas comparando-se o indivduo 127=1com os demais. Na Figura 2, encontra-se o dendograma gerado pelo mtodo UPGMA, atravs do programa NTSYS-pc. Essa anlise de distncia gentica gerou o cluster que mostra a separao dos acessos em cinco grupos, considerando-se a distncia gentica relativa de 71%. Observa-se que o indivduo 127-1 exibiu um grau de diferencia-

o maior, com maior distanciamento gentico, fato que pode ser explicado pela sua procedncia de outro estado, no caso, o Maranho, separado geograficamente das reas de ocorrncia do estado do Par em, aproximadamente, 1.000km, inclusive recebendo denominao caracterstica do estado. Jussara, quando no Par, generalizadamente, todos os acessos so denominados de aa. Isso indica que esse acesso um bom candidato como fonte de gene no programa de hibridizao dessa espcie, visando ao melhoramento gentico, no estado do Par. A maior similaridade ocorreu entre os indivduos 001=1 e o 006=3 (0,81), o que pode ser explicada pela proximidade geogrfica da rea de ocorrncia, ou seja, os municpios de Benfica e Mosqueiro, que distam cerca de 60 km. Assim, observa-se uma correlao positiva entre a distribuio geogrfica e a distncia gentica, desde que no ocorra nenhuma barreira de disperso de semente. Em relao ao acesso 090-8, proveniente do Oiapoque - AP, observase que existe uma proximidade em relao aos acessos 042-3, 006-3 e 001-1, oriundos de Muan Par, Mosqueiro-PA e Benfica-PA, respectivamente, fato que pode ser explicado pela tendncia de que naquela regio, a disperso de sementes do aaizeiro ocorra basicamente pelo rio, o que contribui para a similaridade de alguns materiais desses dois estados.

Tabela 2. Matriz de distncia gentica estimada pelo coeficiente de Jaccard para todos os indivduos de aaizeiro estudados. Belm, Par, 2001 001=1 001=1 006=3 042=3 067=1 050=9 064=1 072=2 090=8 127=1 135=6 1.0000 0.8088 0.6521 0.5937 0.5245 0.6406 0.5384 0.6417 0.3582 0.7741 1.0000 0.7042 0.6029 0.5151 0.6470 0.5735 0.6714 0.4626 0.6956 1.0000 0.5384 0.4918 0.5846 0.5806 0.6119 0.4833 0.7142 1.0000 0.4905 0.5689 0.5357 0.5000 0.3750 0.5483 1.0000 0.5471 0.5400 0.4500 0.4166 0.4500 1.0000 0.6181 0.5967 0.3559 0.5714 1.0000 0.5932 0.4423 0.4920 1.0000 0.4655 0.6250 1.0000 0.4166 1.0000
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006=3

042=3

067=1

050=9

064=1

072=2

090=8

127=1

135=6

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Figura 2. Dendograma gerado pelo mtodo de anlise cluster UPGMA para o coeficiente de jaccard, para as 75 bandas polimrficas geradas pelo RAPD

Os quatro acessos procedentes de Breves-PA apresentaram distanciamento gentico considervel, sendo que dois deles participaram do mesmo agrupamento (064-1 e 072-2) e diferiram dos demais. Pelo fato de pertencerem mesma procedncia, esperava-se uma maior proximidade gentica entre eles. Contudo, como o aaizeiro tem sido relatado como uma espcie algama, esperada grande variao gentica dentro da mesma procedncia, ou populao, principalmente naquelas localizadas no esturio amaznico (Ohashi, 1990). Pode-se inferir tambm que os resultados obtidos possam estar relacionados com o que foi mencionado por Cavalcante (1991), que considerou Breves como o centro de origem dessa espcie, e tambm por haver sido encontrada alta divergncia entre os acessos daquele municpio, pode-se esperar, que naquele lugar esteja localizado o centro de diversidade da espcie. Esse estudo de diversidade gentica na coleo de aaizeiro atravs de marcadores RAPD permitiu a obteno de informaes teis para o seu manejo. Acredita-se que essa abordagem seja vlida e a formao de uma core collection depender de estudos que incluam toda a coleo, sendo interessante, nesse caso, realizar comparaes com outras tc50

nicas moleculares, o que forneceria um quadro geral da diversidade na espcie. Agradecimento: Agradeo a colaborao prestada pela Dra.Ana Yamaguishi Ciampi para a realizao deste trabalho. Referncias Biliogrficas BARDAKCI, F.; SKIBINSKI, D.O.F. Aplication of the RAPD technique in tilapia fish: species and subspecies identification. Heredity, v.73, p.117132. 1994. CAVALCANTE, P.B. Frutas comestveis da Amaznia. 5 ed. Belm: CNPq, 1991. p. 25- 28 (Coleo Adolfo Ducke). CRREA, M.P. Diccionrio das plantas teis do Brasil e das exticas cultivadas. Rio de Janeiro, Imprensa Nacional, v.1, p. 229-231, 1926 DUCKE, A. Plantas de cultura pr-colombiana na Amaznia Brasileira. Notas sobre as espcies ou formas espontneas que supostamente lhes teriam dado origem. Belm: Instrituto Agronmico do Norte, 1946. 24p. (Boletim tcnico,8) FAIRBANKS, D.J.; ANDERSEN, W.R.; MAUGHAM, P.J. Analyses for Biological resource characterization: a laboratory manual. Provo:

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