IEB 448 LABORATORIO DE BIORREACTORES METODOLOGA ANALTICA EXPERIENCIAS DE FERMENTACIN GUA DE LABORATORIO

INTRODUCCIN Para llevar a cabo las experiencias relacionadas con la puesta en marcha y operacin de fermentadores, es necesario utilizar diversas tcnicas analticas para la determinacin de las variables involucradas en el proceso. Dentro de las variables ms importantes a analizar se encuentran la concentracin celular, la concentracin de sustratos y la concentracin de productos si los hubiera. En este curso las experiencias de fermentacin se llevarn a cabo utilizando una cepa de Saccharomyces cerevisiae, utilizando glucosa como fuente de carbono y energa y sulfato de amonio como fuente de nitrgeno. Para determinar la concentracin celular se emplear la tcnica del peso seco. La concentracin de sacarosa se determinar utilizando la tcnica de determinacin de azcares reductores del cido dinitrosaliclico. OBJETIVOS Familiarizarse con los procedimientos de las metodologas analticas que se emplearan en las experiencias de fermentacin. Confeccionar las curvas patrones para las metodologas analticas de las determinaciones de concentracin celular y concentracin de fuente de carbono. METODOLOGA Determinacin de la concentracin celular mediante la tcnica del peso seco A la suspensin celular que se les entregar en el laboratorio se le debe determinar la masa de clulas secas por unidad de volumen en duplicado. Para esto se centrifuga un volumen conocido de suspensin (20 mL) a 10.000 rpm por 10 minutos, se retira el sobrenadante y se lava el residuo de clulas con agua desionizada. El lavado del residuo se realiza resuspendiendo las clulas en agua desionizada y centrifugando de la misma forma que la suspensin original. Se realizan al menos tres lavados. Despus del ltimo lavado, se retira el sobrenadante, el pellet se resuspende en una cantidad mnima de agua desionizada (suficiente para poder vaciarlo al recipiente donde se secar) y se introduce en la estufa de secado en un recipiente previamente secado y pesado. Las dos muestras de clulas se dejen secar a 105 C hasta que alcancen peso constante. La concentracin celular de la suspensin se obtiene con los valores del peso seco de las clulas y el volumen de suspensin de donde se extrajeron. Para realizar la curva patrn de clulas, la suspensin celular inicial se debe someter a sucesivas diluciones y determinar su absorbancia a 650nm utilizando agua desionizada como blanco. Para construir la curva patrn se grafica la absorbancia a 650 nm versus la concentracin celular. La concentracin celular correspondiente a cada valor de absorbancia se obtiene a partir de la concentracin celular de la suspensin original y la dilucin de la misma.

Determinacin de glucosa mediante el mtodo del cido dinitrosaliclico Preparacin del reactivo Para preparar 250 ml de reactivo DNS se debe proceder de la siguiente manera: A alrededor de 120 mL de agua desionizada se adicionan 4 g de NaOH y se solubilizan bajo agitacin. Disolver luego en esta mezcla, 75 g de tartrato de sodio y potasio, tambin bajo agitacin. Calentar y agregar lentamente 2.5 g de cido dinitrosaliclico. Enfriar y aforar a 250 mL con agua desionizada.

Procedimiento En tubos de ensayo con tapa rosca se adicionan 1 mL de la muestra a analizar y 1 mL del reactivo DNS. Introducir los tubos tapados en un bao de agua a ebullicin, en donde se incuban por 5 minutos. Enfriar los tubos en un bao de hielo. Adicionar 10 mL de agua desionizada a cada tubo y dejar reposar por 10 min. Determinar la absorbancia a 540 nm utilizando como blanco una muestra de 1 mL de agua desionizada. Se debe realizar una curva patrn con glucosa en un rango entre 0 y 1.0 g/L (0.1; 0.4; 0.6; 0.8 y 1.0 g/L).