NOVA LiteTM HEp-2

Para Diagnstico In Vitro

Complejidad de CLIA: Alto

708100

Aplicacin
NOVA LiteTM HEp-2 es un ensayo por inmunofluorescencia indirecta para el screening y la determinacin semicuantitativa de anticuerpos antinucleares (ANA) en suero humano. La presencia de anticuerpos antinucleares puede ser utilizada en conjuncin con otros tests serolgicos y resultados clnicos para ayudar en el diagnstico de Lupus Eritematoso Sistmico (LES) y otras enfermedades reumticas o del tejido conectivo.

Sumario y Explicacin de la prueba

El trmino anticuerpos antinucleares describe una variedad de autoanticuerpos que reacciona con los constituyentes de los ncleos celulares incluyendo el ADN, ARN y varias protenas y ribonucleoprotenas.1 Estos autoanticuerpos aparecen con elevada frecuencia en pacientes con enfermedades reumticas o del tejido conectivo, y especialmente en el caso del lupus eritematoso sistmico. De hecho, prcticamente todos los pacientes con LES son ANA positivos. Esta sensibilidad diagnstica ha conducido a la incorporacin del ensayo ANA en los Criterios Revisados para la Clasificacin de Lupus Eritematoso Sistmico de 1982 realizados por una subcomisin del Colegio Americano de Reumatologa.2 Aunque los ensayos ANA son un excelente test de screening para el LES (un resultado negativo prcticamente permite descartar la presencia de LES3 activo), no son, de ningn modo, un ensayo especfico. Los pacientes con otras enfermedades del tejido conectivo, como la artritis reumatoide, el escleroderma y la dermatomiositis, dan con frecuencia resultados positivos, y tambin pueden observarse valoraciones de ANA bajas en otros estados patolgicos y en la poblacin normal. Pueden obtenerse resultados positivos para ANA en pacientes que han sufrido quemaduras graves o infecciones vricas y tambin se han dado casos en algunas personas normales sanas, especialmente en las poblaciones de mayor edad. Debido a esta ausencia de especificidad, se recomienda que todas las muestras con resultados positivos para ANA se valoren segn el punto final y que se lleven a cabo ensayos ms especficos para autoanticuerpos anti-ADN de doble cadena (dsDNA) y para autoanticuerpos anti-antgeno nuclear extrable (ENA). La inmunofluorescencia indirecta es el mtodo de referencia para los ensayos de ANA. Los substratos ms comunes son secciones finas de rganos de roedor o diversos tipos de lneas celulares. Est generalmente aceptado que los substratos de lneas celulares son preferibles a las secciones de rganos ya que estas clulas de divisin rpida tienen niveles ms elevados de ciertos antgenos relevantes desde el punto de vista clnico, incluyendo el centrmero, SS-A(Ro), Scl-70 y PCNA/Ciclina. Adems del tipo de substrato, existen otros tres factores crticos para el funcionamiento de los ensayos de ANA: 1) el fijador utilizado para la preparacin del portaobjetos, 2) la relacin fluorescena/protena (F/P) y 3) la especificidad de subclase de inmunoglobulina del conjugado. Se conoce que algunos fijadores o combinaciones de los mismos destruyen ciertos antgenos nucleares y, por tanto, debera evitarse su uso. La sensibilidad y la tincin de fondo no especfica de un conjugado se determina mediante la relacin F/P, mientras que la especificidad patolgica de un conjugado se determina mediante la reactividad de la subclase de inmunoglobulina. Prcticamente todos los autoanticuerpos significativos desde el punto de vista clnico muestran especificidad para la subclase IgG incluso en presencia de ANA especficos de la IgM y la IgA.4 En contraposicin, los ANA encontrados en donantes de sangre sanos son solamente de las subclases IgM y IgA.5 Debido a esto, los conjugados especficos de la IgG son ms especficos para la enfermedad. El substrato escogido para el kit NOVA LiteTM HEp-2 es una lnea de clulas epiteliales (HEp-2) humanas fijadas de forma ptima y el conjugado consiste en anticuerpos anti-IgG humana purificados por afinidad con una relacin F/P cuidadosamente seleccionada. Estos parmetros de reactivo permiten al test NOVA LiteTM HEp-2 detectar autoanticuerpos relevantes desde el punto de vista clnico (incluyendo SS-A y Scl-70) que otros tests comerciales ANA pueden no detectar. Adems, la especificidad del conjugado IgG elimina los resultados fisiolgicos positivos falsos producidos por los autoanticuerpos IgM de valoracin baja que se encuentran normalmente en personas mayores, pero sanas.

Procedimiento de trabajo
En la tcnica de inmunofluorescencia indirecta, las muestras se incuban con un substrato de antgenos y posteriormente se lavan para eliminar los anticuerpos que no han reaccionado. El substrato se incuba con un conjugado especfico marcado con fluorescena y posteriormente se lava para eliminar el reactivo que no se ha enlazado. Cuando se observan a travs de un microscopio de fluorescencia, las muestras positivas para autoanticuerpos mostrarn una fluorescencia de color verde manzana en las reas de la clula o del ncleo donde se ha enlazado el autoanticuerpo.

Reactivos
1. 2. 3. 4. 5. 6. Portaobjetos con substrato HEp-2 (clulas epiteliales humanas); 12 portaobjetos/pocillos, con desecante Conjugado de anticuerpos anti-IgG humana (Cabra) marcados con fluorescena en tampn con Azul de Evans y un 0.09% de azida sdica, 15mL Control de Patrn ANA Titulable, 1 vial de tampn con un 0.09% de azida sdica y anticuerpos de suero humano anti-HEp-2, prediluido, 0.5mL Control Negativo para Sistemas IFA, 1 vial de tampn con un 0.09% de azida sdica y sin anticuerpos de suero humano anti-HEp-2, prediluido, 0.5mL Concentrado de PBS (40x), suficiente para 2000 mL Medio de Montaje, 0.09% de azida sdica, 7mL
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7.

Cubreobjetos

Advertencias
1. Todo material de origen humano usado en la preparacin de los controles para este producto se ha examinado resultando negativo para anticuerpos contra HIV, HbsAg, y HCV por mtodos aprobados por la FDA. Ningn mtodo puede sin embargo ofrecer garanta completa que HIV, HBV, HCV o otros agentes contagiosos estn ausentes. Por lo tanto, los Control de Patrn ANA Titulable y Control Negativo para Sistemas IFA deben manejarse como si fueran material potencialmente contagioso.6 Dado que se utiliza azida sdica como conservante, este producto puede ser txico por ingestin o absorcin a travs de piel o mucosas. La azida sdica puede reaccionar con el plomo o cobre de las tuberas para formar azidas metlicas potencialmente explosivas. Si se utilizan desages para la eliminacin de reactivos se recomienda lavarlos con abundante agua para prevenir la formacin de dichas azidas metlicas. Se recomienda utilizar el equipo protector apropiado al trabajar con este kit. Los reactivos derramados deben limpiarse inmediatamente. Siga las normas aplicables en su laboratorio acerca de la eliminacin de residuos.

2.

3. 4.

Precauciones
1. 2. 3. 4. Este producto es para ser usado en el Diagnstico In Vitro. La sustitucin de componentes diferentes de los incluidos en el sistema puede generar resultados inconsistentes. Un lavado incompleto o ineficiente de los pocillos puede dar lugar a un fondo elevado. La adaptacin de este ensayo para su uso en procesadores automticos u otros aparatos de manipulacin de lquidos, totalmente o en parte, puede producir diferencias en los resultados de la prueba respecto a los obtenidos con el procedimiento manual. Es responsabilidad de cada laboratorio el validar que su procedimiento automtico produzca resultados dentro de unos lmites aceptables. Una gran variedad de factores puede afectar al rendimiento del ensayo. Entre estos factores pueden incluirse la temperatura de los reactivos al inicio del proceso, la potencia de la lmpara del microscopio, la fiabilidad y reproducibilidad de la tcnica de pipeteo usada, las condiciones de lavado y la duracin de los tiempos de incubacin. Se requiere trabajar de una manera consistente para obtener resultados precisos y reproducibles. El conjugado anti Humano IgG puede experimentar cambios de color con el tiempo debido a la exposicin a la luz, estos cambios, sin embargo, no afectan a su rendimiento. Se recomienda seguir estrictamente el protocolo.

5.

6. 7.

Condiciones de Almacenaje
1. 2. Guardar todos los reactivos del kit en nevera a 2-8C. No congelar. Los reactivos son estables hasta la fecha de caducidad si son almacenados y manipulados correctamente. La solucin de lavado diluida es estable 4 semana a 2-8C.

Recoleccin de Muestras
Este kit requiere suero como muestra. La adicin de azida u otros conservantes a las muestras puede afectar adversamente los resultados. No deben utilizarse muestras contaminadas, tratadas por calor o que contengan partculas visibles. Deben asimismo evitarse las muestras lipmicas o hemolizadas. Tras la recoleccin de las muestras de sangre, el suero debe ser separado del cogulo. El documento NCCLS H18-A2 recomienda las siguientes condiciones de almacenaje para muestras: 1) Guardar las muestras a temperatura ambiente no ms de 8 horas. 2) Si el ensayo no se va completar en 8 horas, refrigerar la muestra a 2-8C. 3) Si el ensayo no se va completar entre 48 horas, o para enviar las muestras, congelar a -20C o a temperatura inferior. Una vez descongeladas las muestras deben agitarse bien antes de utilizarse.

Procedimiento Materiales Suministrados

20 1 1 1 2 1 1 12- pocillos con substrato HEp-2 15mL Conjugado de anticuerpos anti-IgG 0.5mL Control de Patrn ANA Titulable 0.5mL Control Negativo para Sistemas IFA 25mL Concentrado de PBS (40x) 7mL Medio de Montaje 20 Cubreobjetos

Material necesario no incluido

Micropipetas con capacidad para pipetear de 15 a 1000L Agua destilada o desionizada Frascos lavadores o pipetas Pasteur Cmara hmeda Recipiente de 1L de capacidad (para diluir PBS) Cubeta de Coplin Microscopio de fluorescencia con una emisin de fluorescencia de 495nm y un filtro de barrera de 515nm
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Metodologa Antes de empezar

1. 2. Llevar todos reactivos y muestras a la temperatura ambiente (20-26C) y agitar. Diluya el concentrado de PBS: IMPORTANTE: Diluya el concentrado de PBS a 1:40 aadiendo el contenido de la botella de concentrado de PBS a 975mL de agua destilada o desionizada y mezcle completamente. El tampn de PBS se utiliza para diluir las muestras de pacientes y como tampn de lavado. El tampn diluido puede almacenarse un mximo de 4 semanas a una temperatura de 2-8C. Diluya las Muestras de los Pacientes: a. Screening Inicial: Diluya las muestras de los pacientes a 1:40 con un tampn de PBS diluido (esto es, aada 50L de suero a 1.95mL del tampn de PBS). b. Titulacin: Realice series de diluciones dobles a partir de la dilucin inicial de screening para todas las muestras positivas con el tampn de PBS diluido (p. ej. 1:80, 1:160,... 1:2560).

3.

Procedimiento de Ensayo
1. Preparacin de los portaobjetos con substrato: Espere a que el portaobjetos con substrato alcance la temperatura ambiente antes de extraerlo de su funda. Etiqutelo y colquelo en una cmara hmeda adecuada. Aada 1 gota (20-25L) de control positivo y negativo sin diluir en los pocillos 1 y 2 respectivamente. Aada 1 gota (20-25L) de la muestra del paciente diluida a los pocillos restantes. Incubacin del portaobjetos: Incube el portaobjetos durante 30 + 5 minutos en una cmara hmeda (una servilleta de papel humedecida colocada plana en el fondo de un recipiente cerrado de plstico o cristal le permitir mantener las condiciones de humedad adecuadas). No permita que el substrato se seque durante el procedimiento de ensayo. Lavado de los portaobjetos: Tras la incubacin, utilice un frasco de lavado o una pipeta para lavar suavemente el suero con el tampn de PBS diluido. Oriente el portaobjetos y el chorro del tampn PBS de forma que le permita evitar, en la medida de lo posible, que la solucin pase por encima de varios pocillos a la vez. Evite dirigir el chorro directamente sobre los pocillos para que no se dae el substrato. Si est deseado, ponga los portaobjetos en un tarro de Coplin del almacenador intermediario diluido de PBS por hasta 5 minutos. Adicin de conjugado fluorescente: Expulse el exceso de tampn PBS. Site el portaobjetos de nuevo en la cmara hmeda y cubra inmediatamente cada pocillo con una gota de conjugado fluorescente. Incube los portaobjetos durante otros 30 + 5 minutos. Lavado de los portaobjetos: Repita el paso 3. Cubreobjetos: Los procedimientos para los cubreobjetos varan de un laboratorio a otro; sin embargo, recomendamos el siguiente procedimiento: a. Site un cubreobjetos en una toallita de papel. b. Aplique el medio de montaje siguiendo una lnea continua en el borde inferior del cubreobjetos. c. Elimine el exceso de tampn PBS y ponga en contacto del borde inferior del portaobjetos con el borde del cubreobjetos. Deje caer suavemente el portaobjetos sobre el cubreobjetos de forma que el medio de montaje fluya hacia el borde superior del portaobjetos sin que se formen burbujas de aire ni se queden atrapadas.

2.

3.

4.

5. 6.

Control de Calidad
El Control de Patrn ANA Titulable y el Control Negativo para Sistemas IFA deberan ensayarse para cada portaobjetos con el fin de asegurar que todos los reactivos y los procedimientos se han llevado a cabo de la forma adecuada. Los controles adicionales de suero adecuados debern prepararse alicuotando las mezclas de suero humano y almacenndolo a < -70oC. Para que los resultados se consideren vlidos, deben cumplirse todos y cada uno de los siguientes criterios. Si alguno de ellos no se cumple, el resultado del test se considerar invlido y el ensayo deber repetirse. 1. El Control de Patrn ANA Titulable sin diluir debe ser > 3+. 2. El Control Negativo para Sistemas IFA debe ser negativo.

Interpretacin de los Resultados

Reaccin Negativa. Se considerar una muestra como negativa si la tincin especfica es igual o inferior al Control Negativo para Sistemas IFA. Las muestras pueden mostrar diversos grados de tincin de fondo debido a los anticuerpos heterfilos o a niveles inferiores de autoanticuerpos contra algunos constituyentes del citoplasma, como las protenas contrctiles. Reaccin Positiva. Se considerar una muestra como positiva si la tincin especfica es superior al Control Negativo para Sistemas IFA. Determine el patrn de tincin de cada muestra y pondere su intensidad de acuerdo con los siguientes criterios: 4+ Fluorescencia verde manzana brillante 3+ Fluorescencia verde manzana claro 2+ Fluorescencia positiva claramente visible 1+ La menor fluorescencia especfica que permite diferenciar claramente una nuclear y/u citoplasmtica estructura celular de la fluorescencia de fondo. Interpretacin de los patrones. Pueden presentarse diversos patrones de tincin nuclear y/u citoplasmtica dependiendo de los tipos y de las cantidades relativas de autoanticuerpos presentes en la muestra. Pueden presentarse los siguientes patrones de tincin:
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Homogneo: Tincin slida del ncleo con o sin enmascaramiento aparente de los nucleolos. Antgenos Nucleares presentes: ADN de doble cadena, ADN de cadena simple, histonas Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas sugieren la presencia de LES; las valoraciones inferiores sugieren la presencia de LES u otras enfermedades del tejido conectivo. Perifrico: Tincin slida, primordialmente alrededor de la regin ms exterior del ncleo y tincin ms dbil hacia la parte central del ncleo. Antgenos Nucleares presentes: ADN de doble cadena, ADN de cadena simple, DNP, histonas Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas sugieren la presencia de LES; las valoraciones inferiores sugieren la presencia de LES u otras enfermedades del tejido conectivo. Moteado: Tincin fina o de apariencia granulosa del ncleo, generalmente sin tincin fluorescente de los nucleolos. Antgenos Nucleares presentes: Sm, RNP, Scl-70, SS-A, SS-B, y otros sistemas antgeno/anticuerpo todava sin caracterizar. Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas sugieren la presencia de LES (anticuerpo antiSm), enfermedades combinadas del tejido conectivo (anticuerpo anti-RNP), escleroderma (anticuerpo anti-Scl-70), o el complejo sndrome de Sjogren-sicca (anticuerpo anti-SS-B); las valoraciones inferiores sugieren otras enfermedades del tejido conectivo. Nucleolar: Tincin con motas grandes y gruesas en el ncleo, generalmente un nmero inferior a 6 por clula, con o sin motas finas ocasionales. Antgenos Nucleares presentes: 4-6S ARN y otros antgenos nucleares desconocidos. Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas son frecuentes en el escleroderma y el sndrome Sjogren. Centromrico: Patrn de tincin con motas discretas. Las motas del ncleo son muy discretas y normalmente son mltiplos de 46. Antgenos Nucleares presentes: Centrmeros cromosmicos (cinetocoro). Enfermedad asociada: Altamente indicativa del sndrome de CREST, una variante de la esclerosis sistmica progresiva (PSS). CREST es un tipo de PSS con calcinosis prominente, adems del fenmeno Raynaud, dismotilidad esofgica y lesiones limitadas de la piel (frecuentemente confinadas a la cara o los dedos), telangiectasia. Mitocondrial: Moteado discreto del citoplasma y relativamente moderado en el rea del ncleo. Antgenos presentes: Varios tipos de antgenos mitocondriales. Enfermedad asociada: Las valoraciones elevadas indican cirrosis biliar primaria. Es importante que el usuario sepa hasta qu punto puede confiar en los patrones para determinar la especificidad de los autoanticuerpos, excepto en el caso del patrn nuclear y el patrn centromrico, en los que cada uno de los antgenos est muy bien definido y sus patrones son caractersticos. Ya que muchos autoanticuerpos, o combinaciones de los mismos, pueden inducir un patrn moteado u homogneo, se recomienda la realizacin de ensayos de seguimiento de los autoanticuerpos (tales como para el ADN de doble cadena o ENA) en todas las muestras moteadas u homogneas.

Limitaciones del Procedimiento

1. Las valoraciones elevadas de ANA sugieren enfermedades del tejido conectivo pero no deberan tener una validez diagnstica. Los resultados de ANA deberan considerarse en combinacin con otros resultados serolgicos as como con el historial clnico del paciente. Los patrones de ANA cambian frecuentemente cuando la muestra se valora segn el punto final. Este fenmeno se debe a que los anticuerpos con menor valoracin estn por debajo de la sensibilidad del sistema, puesto que se ensaya con una muestra ms diluida. Varios factores externos influyen en la sensibilidad del ensayo, como pueden ser el tipo de microscopio de fluorescencia utilizado, la potencia y antigedad de la lmpara, los aumentos utilizados, el sistema de filtros y la subjetividad del tcnico. Si se utiliza un filtro paso banda en lugar de un filtro de barrera 515, puede observarse un aumento de la tincin de los artefactos. Para etiquetar los portaobjetos utilice solamente un lpiz. La utilizacin de cualquier otro instrumento de escritura puede ocasionar una tincin de los artefactos. Todas las cubetas de Coplin que se utilicen en el lavado de los portaobjetos deben estar limpias de residuos de tintura. La utilizacin de cubetas de Coplin con residuos de tintura puede provocar la tincin de los artefactos. Los resultados de este ensayo deben utilizarse conjuntamente con hallazgos clnicos y otras pruebas serolgicas. La funcionalidad del ensayo no ha sido establecida para matrices diferentes del suero.

2.

3.

4. 5. 6.

7. 8.

Valores Esperados
Se ensay una serie de muestras de pacientes con enfermedades del tejido conectivo, as como 200 muestras aleatorias de donantes de sangre, utilizando el kit NOVA LiteTM HEp-2. Los resultados se muestran a continuacin: Grupo de pacientes LES Lupus inducido por la medicacin Artritis reumatoide Escleroderma Dermatomiositis Sndrome de Sjogren Nmero 105 24 40 24 14 14 Nmero de positivos con NOVA LiteTM HEp-2 101 24 28 18 10 12
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Normales

200

Referencias
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2. 3. 4. 5. 6.

Tan EM: Autoantibodies to nuclear antigens (ANA): Their immunobiology and medicine. Advances in Immunology 33: 167-239, 1982. Tan EM, et al.: The 1982 Revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 25: 1271-1277, 1982. Casalo SP, Friou GJ and Myers LL: Significance of antibodies to DNA in systemic lupus erythematosus. Arthritis and Rheumatism 7: 379-390, 1964. Gonzalez E and Rothfield N: Immunoglobulin class and pattern of nuclear fluorescence in systemic lupus erythematosus. The New England Journal of Medicine 274: 1333-1338, 1966. Wiik A: Antinuclear factors in sera from healthy blood donors. Acta Path Microbiology Scand. 84: 215-220, 1976. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Centers for Disease Control/National Institute of Health, Fourth Edition, 1999 (HHS Pub. #(CDC) 93-8395).

Fabricante: INOVA Diagnostics, Inc. 9900 Old Grove Road San Diego, CA 92131 United States of America

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