De l’analyse des lipides à l’analyse

lipidomique
Généralité :
- Rôle des lipides dans de nombreux processus biologiques (physiologique
pathologiques (impliqués dans cancérogénèse neurodégénérations)

Lipidomique = caractérisation complète des lipides et de leurs rôles biologiques dans le

contexte de l’expression des protéines impliquées dans le métabolisme des lipides et leur
fonction

- Consortium crée en 2003

- Base de données LIPID MAPS (lipid metabolites and pathways strategy)
- + de 40 000 structures caractérisées

Base de donnée différenciée en 3 parties : Pour information

- LIPID MAPS Structure Database (LMSD) ; une base de données de structures et
d’annotations de lipides biologiquements pertinents contenant plus de 46 000 lipides
différents
- LIPID MAPS In-silico Structure Database (LMISSD) une base de données de lipides
prédits par calcul
- LIPID MAPS Gene/proteome Database (LMPD) une base de données de gène et de
produits géniques impliqués dans le métabolisme des lipides

Lipidomique :
 Développement possible grâce à de nouvelles techniques comme la
chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem LC-SM/SM
(spectrométrie de masse)
 1 seule analyse  Caractérisation de plusieurs lipides
 Famille des lipides très complexe
 Lipidomique des lipides de structure
 Lipidomique des médiateurs lipidiques

Famille des lipides :

- Famille hétérogène de composés chimiques :
o AG, glycérolipides, stérols, lipides complexes (phospholipides, sphingolipides),
glycolipides et polycétides)
- Nombre de structure par classe : total = 37 127 (2012)
Photo
Lipidomique des lipides de structure :
- Mono, di et triacylglycérols
o Réserve énergétique
o 1g de corps gras fournit 37,6 kJ
- Phospholipides
o Constituants des membranes biologiques
o Bicouche phospholipidique
- Cérides
o Isolant thermique
o Tissu adipeux sous-cutané
- Stérols
o Cholestérol
o Maintien de l’intégrité de la membrane biologique

Lipidomique des médiateurs lipidiques :

- Médiateurs lipidiques d’origine enzymatique (libérés après
action d’une enzyme)
o Dérivés des AG polyinsaturés (molécules de la
signalisation intracellulaire)
o Hydrolysés par des phospholipases
- Médiateur lipidiques d’origine non enzymatique
o Intérêt en nutrition et santé humaine
o Exemple  :isoprostane
 Dérivé de l’acide arachidonique (C20 :4)
 Impliqué dans certaines pathologies
 Marqueur de stress oxydant (normal puisque formé
en présence de radicaux libres)
 Formé dans le cas de dommages tissulaires
 Marqueur de péroxydation lipidique
 L’oxydation des lipides insaturés qui peut se produire lors du
rancissement des aliments
 1- Les acides gras et les acylglycérols
a. Les acides gras

Généralité :
- Acides monocarboxyliques
- Au moins 4 atomes de carbone
- Chaine linéaire (huiles végétales alimentaires) ou ramifiée (huile et graisses animales)
- Saturés, mono-insaturés ou poly-insaturés (stéréochimie Z ou E)
- 2 nomenclatures ∆ , ϖ

- Constituants majoritaires des triglycérides (ou triacylglycérols)

- Analyse par CPG des esters d’acides gras rendus volatiles (pour pouvoir être
transportés par gaz) par :
o Transméthylation rapides à température ambiante en conditions alcalines
o Transméthulation par le méthanol à l’aide d’un catalyseur (BF3)

BF3 : trifluorure de bore (agent méthylant)

- Formation d’éthers : triméthylsilyléthers en présence d’agent silylant, le

triméthylchlorosilane (TMCS)
Les acides gras volatiles sont analysés par CPG (chromato phase gazeuse)
- Très sélective on peut séparer grâce aux insaturations

b. Les glycérides

Généralité :
- Ester d’acides gras et de glycérol
- Mono, di et triglycérides
- Très grande diversité
- Acides gras insaturés sur la position 2
 - Analyse par CPG
- Analyse par HPLC en phase inverse (apolaire de type silice greffé avec les chaines
octadécyl (C18)
- Identification difficile des différents composés compte-tenu de leur très grande
diversité
- Analyse de l’acide gras en position 2 : hydrolyse enzymatique par la lipase
pancréatique (identifier progressivement les AG qui sont libérés)

c. Les lipides complexes : les phospholipides

Généralité :
- Ester d’acides gras et de glycérol estérifié par un résidu d’acide phosphorique lui-
même estérifié par un composé R.
- Mélange complexe de phospholipides
- Actuellement plus de 8 000 phospholipides différents dans la base de donnée.

Dosage des phospholipides : (PL) :

 Dosage du phosphore :
o Correspondance entre la masse du phosphore et la masse du PL
o Masse du PL = Masse de P x 26,5
o 1mg de P correspond en moyenne à 26,5mg de PL

o Différentes méthodes permettent le dosage du P

 Dosage colorimétriques :
 Méthode au molybdate d’ammonium
 Méthode au phosphovanadomolybdate
 Spectrométrie d’émission atomique (AES)
 Permet un emesure quantitative de l’émission provenant des
atomes ayant été stimulé a des hauts niveaux d’énergies
émettant des radiations
 Avantage peut se faire directement sur des molécules en
solution dans un solvant
 Spectrométrie d’adsorption atomique (AAS)
  Il faut produire des cendres (minéralisation) qui seront
solubilisés dans un acide fort, puis on excite les atomes et on
mesure leurs radiation émises.

o Analyse individuelle de chaque PL

Figure 1CCM sur plaque de silice

2- Extraction des lipides

Généralité :
- Doit permettre le dosage des lipides et leur caractérisation
- Doit tenir compte de
o La teneur en lipides
o Des proportions relatives de lipides neutres et de phospholipides
o La composition en acides gras
o La répartition en classes des différents lipides
o L’existance de complexes stables lipides-protéines ou lipides-glucides

 Extraction directe par le solvant

- Méthodes à froid
- Dépend du caractère apolaire +/- prononcé
 - Solvant les plus utilisés : hexane, éther diéthylique
- Mélange de solvants (chloroforme/méthanol ou hexane/isopropanol)
- Pouvoir extracteur variable selon le solvant et le lipide

 Extraction après traitement chimique

- Hydrolyse acide ou basique associée à un traitement thermique pour dissocier les
complexes lipides-protéines et lipides-glucides et libérer les lipides
- Extraction des lipides par un solvant
- Séparation des lipides neutres et des lipides polaires sur cartouche de silice.

3- De l’analyse des lipides à l’analyse lipidomique

Possibilités :
1ère : analyse des lipides par classe de polarité (on ne peut pas se baser uniquement dessus
car trop de lipides différents)
2ème : analyse des lipides par espèces moléculaire (on ne peut pas se baser que sur ça
compte tenu du nombre important dans chaque classe)
3ème : simplification de l’échantillon (saponification, analyse des AG méthylés…)
4ème. : analyse lipidomique ; combinaison de ces critères
- Couplage de techniques, analyse multidimensionnelle
- Analyse par classe/couplage HPLC et spectrométrie de masse
- Technique séparatrices et spectrométrie de masse
- Couplage chromatographoque (chromatographie phase normale et chromatographie
de phase inverse, chromatographie bidimensionnelle)

Analyse globale par LC-MS/MS et GC/MS

LC = liquide chromatographie
LC-MS/MS : chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem

Analyse des spectres compliqué se fait par des ordi spécialisés.

Rapport m/z : m = masse z = charge

GC/MS :
Chromatographie gazeuse couplée à la spectrométrie de masse en tandem
Séparation en fonction de leurs polarité et en fonction de leurs rapport m/z (masse sur la
charge)
Couplage = Analyse globale par LC-MS/MS et GC/MS :
Donne une cartographie de l’ensemble des lipides

Exemple  :
- Cartographie de l’ensemble des phospholipides du cerveau et notamment analyse
du suivi de l’oxydation des cardiolipines présentes dans les mitochondries et
responsables de l’apoptose des neurones lésés
o Cardiolipines : lipides localisés à la membrane interne de la mitochondrie et
joue un rôle dans l’activation de la cytochrome C oxydase
o Elles se relocalisent quand elles sont stressées oxydés à la membrane externe
de la mitochondrie se termine par la libération du cytochrome C (apoptose
des neurones lésés)

- Caractérisation de tous les métabolites conduisant à la synthèse des acides biliaires

- Analyse de la composition lipidique de membranes de cellules cancéreuses

Lipidomique : outil de recherche très pertinent

- Dans la biochimie des lipides
- La découverte de biomarqueurs cliniques
- Le diagnostic de maladies
- La compréhension de leur pathogénèse
- Grâce aux avancées technologiques en chromatographie et spectrométrie de masse