Antgenos Leucocitrios Humanos No- Clssicos HLA-G e HLA-E em leses benignas, pr-malignas e malignas de laringe associadas infeco pelo

o Papilomavrus Humano (HPV).

A diminuio dos nveis de E6 e E7 vistos no incio do ciclo de vida normal do vrus permite que o ciclo de vida inicial viral tenha um baixo nmero de clulas infectadas para a sobrevivncia e expanso viral aumentando gradualmente esta infeco. Uma vez que a integrao ocorre e os nveis de E2 diminuem, os nveis de E6 e E7 se elevam permitindo transformao celular (PETT et al., 2007; TUNGTEAKKHUN et al., 2008). Assim, as oncoprotenas (E6 e E7) podem interagir com protenas reguladoras do ciclo celular contribuindo para a carcinognese (DOORBAR et al., 2006). Deve ser notado que muitos ou a maioria destes eventos de integrao podem no ser produtivos, devido perda do aceptor de splicing e de stios de poliadenilao (THOMAS et al., 1999; ZHENG et al., 2006; TUNGTEAKKHUN et al., 2008). Em contrapartida, o DNA dos tipos de HPV de baixo risco no est integrado ao genoma celular, favorecendo a ao do gene E2 na represso da transcrio dos genes E6/E7. Na ausncia das oncoprotenas E6 e E7 o controle celular no est mais comprometido, o que resulta no menor risco de transformao maligna (WANG et al., 2003; PETT et al., 2007; MADKAN et al., 2007). A integrao no uma ocorrncia normal do ciclo de vida do HPV de alto risco, sendo caracterizada pela supresso de genes virais essenciais para a sntese do ciclo infeccioso do vrus. Assim, ela representa um subproduto da infeco viral que pode conferir uma vantagem seletiva para a clula hospedeira sem qualquer vantagem aparente para o vrus. Embora pores variveis no genoma do HPV de alto risco sejam deletadas, caractersticas consistentes podem ser notadas, particularmente a perda do gene viral E2, que pode inibir a transcrio do promotor viral de integrao ao DNA celular (DOWHANICK et al., 1995; PETT et al., 2007). A protena E7 do HPV 16 e HPV 18 capaz de reprimir o gene promotor da cadeia pesada do HLA de classe I, levando a uma perda do reconhecimento de clulas HPV infectadas pelos linfcitos T citotxicos. No caso especfico do HPV 18, E7 tambm reprime o gene promotor de LMP2/TAP1, diminuindo a atividade do MHC de classe I; essas caractersticas sugerem um maior potencial oncognico ao HPV 18 em relao ao HPV 16. O mesmo efeito repressor de LMP2/TAP1 observado no HPV 6 E7 (no oncognico), mas ao contrrio dos HPVs oncognicos, ele aumenta a atividade do promotor de classe I. A capacidade de inibir a transcrio de TAP e LMP, mas no influenciar nos nveis de transcrio do promotor de HLA de classe I, pode conferir um baixo risco para malignidade para os HPVs de baixo grau oncognico (GEORGOPOULOS et al., 2000). MADKAN, V.K.; COOK-NORRIS, R.H.; STEADMAN, M.C.; ARORA, A.; MENDOZA, N.; TYRING, S.K. The oncogenic potential of human papillomaviruses: a review on the role of host genetics and environmental cofactors. Brit. J. Dermatol., v. 157, p. 228241, 2007. PETT, M.; COLEMAN, N. Integration of high-risk human papillomavirus: a key event in cervical carcinogenesis? J. Pathol., v. 212, p. 356367, 2007. WANG, S.S.; HILDESHEIM, A. Viral and host factors in human papillomavirus persistence and progression. J. Natl. Cancer Inst. Monogr., v. 31, p. 3540, 2003.

Importncia dos marcadores moleculares da infeco por Vrus do Papiloma Humano

Durante a integrao do DNA na clula hospedeira ocorre disrupo do genoma do HPV, nomeadamente na regio do gene E2, o que conduz sobreexpresso das protenas oncognicas virais E6 e E7 e estabilizao dos transcritos que as codificam. Os locais de integrao do genoma viral encontram-se distribudos ao longo de toda a sequncia da clula hospedeira, no tendo sido identificadas zonas de integrao preferencial (Wentzensen et al., 2004). Nos ltimos anos, vrios trabalhos evidenciaram a importncia do estado fsico do DNA viral para a progresso e revelaram uma correlao positiva entre a integrao do HPV e o desenvolvimento de carcinoma e leses percursoras (Nagao et al., 2002; Kulmala et al., 2006; Ho et al., 2006; Saunier et al., 2008; Cricca et al., 2009). Outros, falharam na identificao de associaes estatisticamente significativas entre os dois parmetros (Huang et al., 2008). Alguns estudos (Pirami et al., 1997; Tonon et al., 2001; Peitsaro et al., 2002; Hudelist et al., 2004; Kulmala et al., 2006; Briolat et al., 2007; Huang et al., 2008) tm mostrado que, contrariamente ao que observado para o HPV 18, a linearizao do DNA do HPV 16 pode ocorrer numa fase inicial da infeco, e no apenas durante o processo de transformao maligna. Adicionalmente, uma proporo elevada de carcinomas com o HPV sob a forma exclusivamente epissomal demonstraram que a integrao do HPV 16 pode no ser essencial transformao maligna (Hudelist et al., 2004). Relativamente ao HPV 18, sabe-se que a infeco por este vrus conduz, normalmente, a um fentipo mais agressivo, com uma progresso mais clere do estdio de displasia para carcinoma invasivo (Badaracco et al., 2002; Ho et al., 2006). Na investigao do estado fsico do DNA por PCR em tempo real, este inferido a partir da razo E2/E6 (ou E2/E7). Esta abordagem baseia-se no conceito de que em infeces com o DNA sob a forma exclusivamente epissomal existem o mesmo nmero de cpias do gene E2 que do gene E6, originando uma razo igual a 1, enquanto quando o DNA viral se encontra exclusivamente sob a forma integrada gera um razo E2/E6 igual a 0, pela perda do gene E2 durante a integrao. Formas mistas, com cpias de DNA de HPV sob a forma epissomal e cpias sob a forma integrada (formas 16 concomitantes) apresentam uma razo E2/E6 com valores entre 0 e 1 (Ho et al., 2006; Roberts et al., 2008). O conhecimento aprofundado dos mecanismos envolvidos na integrao dos HPVar na clula hospedeira, pode fornecer um marcador de risco de progresso mais especfico que os actualmente disponveis (Gravitt et al., 2008). Neste contexto, um dos objectivos do presente trabalho foi a implementao de uma metodologia que permitisse analisar o estado fsico do DNA do HPV 16 e do HPV 18. Pretendeu-se igualmente realizar o estudo de casos, de forma a avaliar o poder de prognstico deste marcador. A sobreexpresso do RNAm E6/E7 foi detectada mais frequentemente nas leses HSIL (78,1%) e nos casos de carcinoma do colo do tero (100,0%) do que nos casos com citologia normal (56.1%) ou leses LSIL (58,5%). Wentzensen, N., Sherman, M. E., et al. (2009). Utility of methylation markers in cervical cancer early detection: appraisal of the state-of-the-science. Gynecol Oncol 112(2): 293-9.

Prof. Ana Luisa F. Gouva www.anticorpos.com.br http://www.drashirleydecampos.com.br/noticias/6733 O HPV um vrus da famlia Papovaridae, com mais de 100 tipos identificados, alguns deles responsveis por verrugas vulgares, outros por verrugas anogenitais e ainda papilomas da nasofaringe. O vrus possui um genoma de DNA de cadeia dupla combinado com histonas, formando um complexo semelhante a um cromossoma, contido num capsdeo externo de protena virtica. Tal capsdeo formado por 72 subunidades (capsmeros), com arranjo icosadrico, sendo por este motivo, de aparncia esfrica microscopia eletrnica. constitudo por dois tipos de protena estrutural: L1 (protena maior), que gnero-especfica, sendo sua presena correlacionada presena de HPV intacto nos tecidos, servindo como medidor indireto de infectividade e L2 (protena menor), que altamente tipo-especfica. O genoma do vrus contm dois segmentos principais, sendo cada um constitudo por uma srie de "regies" ou ORFs (opening reading frames) que codificam as protenas virais. O segmento E (early) que representa 45% do genoma, constitudo por oito ORFs e codifica protenas relacionadas com a replicao e controle do genoma. O segmento L (late) que representa 40% do genoma responsvel por codificar as protenas estruturais do capsdeo do vrus. Entre os segmentos L e E existe um outro segmento que representa 15% do genoma, que contm elementos regulatrios. Os estados fsicos do DNA do vrus so diferentes nas leses benignas e malignas. Nas primeiras, ele est presente na forma epissomal (no integrado ao genoma da clula hospedeira) e em mltiplas cpias; j nas leses malignas ele integra-se ao genoma da clula hospedeira formando uma ligao estvel e perdendo a capacidade de se replicar de maneira autnoma. Nas leses malignas o stio de ligao nos cromossomas aleatrio, porm constante em todas as clulas de um mesmo tumor e parece ter alguma preferncia por locais frgeis ou prximos a oncogenes celulares. O stio de abertura da molcula circular do DNA do vrus especfico, ou seja, sempre se abre no mesmo local, entre E1 e E2. E2 responsvel por reprimir a transcrio dos genes virais E6 e E7. Uma vez que E2 inativado pela abertura da molcula virtica, h uma super expresso dos genes E6 e E7. O potencial oncognico do vrus relacionado aos produtos destes genes, que interagem e inativam protenas celulares derivadas dos genes supressores de tumores p53 e p105RB, alm de promover a degradao destes genes, bloqueando sua funo. A oncogenicidade, portanto, vai depender diretamente do grau de afinidade entre as protenas derivadas dos gens supressores de tumores e as protenas virais derivadas de E6 e E7. Assim sendo, os produtos dos genes E6 e E7 dos HPV de alto risco (tipos 16, 18 e 31 - encontrados principalmente nas leses subclnicas) apresentam grande afinidade com as protenas derivadas de p53 e p105-RB, enquanto os produtos derivados dos genes dos vrus de baixo risco (tipos 6 e 11 - encontrados predominantemente nos condilomas) possuem baixa afinidade. O resultado da integrao do vrus a imortalizao das clulas em que o HPV foi integrado. Tais clulas exibem morfologicamente figuras de mitose anormais, pleomorfismo nuclear, valores de DNA aneuplides, consistentes com nmero cromossomal anormal e alterao arquitetural dos cromossomos. Porm, estas clulas s passam a ser tumorignicas quando os gens transformantes E6 e E7 so expostos a oncogenes celulares ativados. Contudo, o HPV no atua isoladamente na oncognese; outros fatores, tais como estado imunolgico do hospedeiro, estado nutricional, uso de fumo e lcool atuam em conjunto. O HPV atinge o ncleo das clulas basais atravs de microlaceraes no epitlio, sendo que os primeiros sinais de transcrio do genoma virtico aparecem cerca de 4 semanas aps a infeco. O perodo de incubao varia de 3 a 18 meses e a persistncia das

leses pode ser avaliada em semanas, meses ou anos. Esta variao parece estar mais relacionada com particularidades do hospedeiro que do vrus, a exemplo do que observado em pacientes com imuno-deficincias que parecem ser portadores de leses mais exuberantes e persistentes. A manuteno do estado epissomal no replicativo do DNA virtico, que corresponde ao estado de infeco latente, pode depender da expresso do ORF E2. Na infeco produtiva as clulas da camada basal da epiderme, que tm a capacidade de se replicar, sofrem um aumento da taxa de proliferao, possivelmente pela combinao dos efeitos das protenas expressas pelos ORFs E5 (que age em conjunto com receptores de fator de crescimento epidrmico), E6 (que se liga protena p53) e E7 (que se liga protena Rb). medida em que a clula se diferencia, h maior produo de antgenos e replicao virtica nas clulas superficiais, de modo que a quantidade de DNA aumenta em direo superfcie do epitlio. Durante este processo h acmulo tanto de protenas do genoma quanto de protenas estruturais relacionadas ao capsdeo. As partculas virticas so liberadas por interferncia da protena codificada a partir do gene E4 que desestabiliza a trama de ceratina intracelular. A vacuolizao caracterstica da clula pode ser resultado do colapso da citoceratina que interage com protenas transcritas em ceratincitos com diferenciao terminal a partir de E4.

Os papilomavrus imunognese

humanos

HPV:

Carcinognese

O gene E6 de HPVs de alto risco no apresenta homologia significativa em sua seqncia, se comparado com outros genes que codificam protenas com atividade transformante. Entretanto, a protena E6 apresenta semelhana funcional com a protena E1B de adenovrus e com a principal protena T de SV 40 (Simian virus 40). A protena E6, com 150 aminocidos, aproximadamente, identificada no ncleo e nas membranas no-nucleares. A integridade das quatro repeties de cistena, que formam dois domnios chamados de dedo de zinco, essencial para a estabilidade e para a maioria das funes biolgicas da E6. A protena E6 do HPV-16 degrada e inativa a protena celular p53 pela via de protelise, mediada pela ubiquitina. Um polipeptdeo celular do hospedeiro chamado de polipeptdeo associado E6 (E6-AP) inicialmente liga-se E6 e o complexo E6/E6-AP atua como uma ubiquitina-ligase, conjugando ubiquitina p53. A degradao da p53 resulta em aumento da instabilidade gentica e em acmulo de mutaes oncognicas. Este mecanismo in vivo pode ser especialmente importante nas fases incipientes da progresso tumoral (Schiffman & Burk, 1997; Mansur, 2001). J o gene E7 apresenta homologia significativa em sua seqncia com os genes E1A de adenovrus e T de SV 40. Esta observao foi crtica para a elucidao das propriedades bioqumicas de E7. A protena E7, com aproximadamente 100 aminocidos, encontrada no citoplasma e no ncleo das clulas do hospedeiro. A regio N-terminal necessria para sua ligao pRB. A poro Cterminal da E7 responsvel pela estabilidade intracelular. Esta parte de E7 pode tambm contribuir na ativao transcricional e constitui um segundo stio de ligao pRb (protena de susceptibilidade ao retinoblastoma), que regula negativamente o ciclo celuar de G1 para S. A protena E7 do HPV-16, fosforilada, ligase s formas hipofosforiladas da pRb e esta interao libera o fator de transcrio E2F, antes ligado pRb. E2F ativa, ento, a transcrio dos genes necessrios para a sntese de DNA. Desta forma, a protena E7 perturba o crescimento celular normal, estimulando, de maneira ininterrupta, a expresso de genes responsveis pela diviso celular (Schiffman & Burk, 1997; Mansur, 2001). E qual seria a relao entre a ruptura do gene E2 e a carcinognese? A expresso da protena E2 apresenta como conseqncia a diminuio da

expresso das protenas E6 e E7. Quando ocorre a integrao do genoma viral ao DNA celular e a ruptura do gene E2, os genes que codificam E6 e E7 perdem a influncia inibitria exercida por E2 e passam a ser expressos em maior quantidade, aumentando a concentrao das protenas E6 e E7 no citoplasma e no ncleo da clula infectada. Dessa forma, apesar da protena E2 no apresentar atividade transformante, seu mecanismo de ao relevante para a induo do processo de imortalizao celular promovido pelos HPVs de alto risco (Mansur, 2001).