PRACTICA

ANLISIS MICROBIOLGICO DEL AGUA

INTRODUCCIN Dentro de las necesidades bsicas, y quizs una de las ms importantes que requiere toda poblacin, est relacionada con el acceso al agua de buena calidad, es decir, al agua potable . Es as como el agua, su accesibilidad y su calidad han comenzado a condicionar directamente el tipo de vida de una comunidad y por lo tanto su calidad de vida . Directamente asociado a la salud est el consumo, calidad y disponibilidad del agua. Estos tres componentes, separada o conjuntamente, han determinado una gran cantidad de problemas de salud que afectan a vastos sectores de la poblacin mundial. Un ejemplo de esto lo da el hecho que, aproximadamente, el 40% de la poblacin mundial sufre en la actualidad por falta de agua, y se ha comprobado que en los pases del tercer mundo o en vas de desarrollo, ms del 80% de las enfermedades tienen su origen en esta carencia o en las condiciones insalubres del agua que utilizan. Los recuentos de bacterias heterotrficas en placa son tiles para determinar la potabilidad de un agua; as como tambin la eficiencia de las operaciones para eliminar microorganismos, como la sedimentacin, filtracin y cloracin. La evaluacin rutinaria del agua en busca de microorganismos patgenos, como Salmonella spp. y Shigella spp. puede ser difcil de realizar ya que el nmero de estas bacterias es relativamente escaso, por lo que se tiene que recurrir a pruebas bacteriolgicas del agua potable que demuestren la presencia de microorganismos indicadores que siempre estn presentes en materia fecal, fcil de demostrar y que sirva de gua para conocer el grado de contaminacin fecal. El grupo Coliforme ha sido adoptado como el indicador de contaminacin fecal ms digno de confianza. El microorganismo indicador ms comnmente utilizado es Escherichia coli, considerando la OMS preferible emplear la expresin Coliforme fecal que comprende un nmero ligeramente mayor de variedades, todas ellas de claro origen fecal e indicadores de contaminacin fe cal reciente. OBJETIVOS -Realizar el recuento en placa de bacterias heterotrficas y la tcnica del NMP usando tubos mltiples para coliformes en muestras de agua potable -Determinar si la muestra analizada es apta para el consumo humano. MATERIALES -Muestras de agua potable de diferente origen (grifo, purificada y embotellada, cisterna u otro) -Frascos Shott de 500 mL. estril y con Tiosulfato de sodio al 3%. -3 tubos de ensayo conteniendo c/u 9 ml de agua de dilucin estril -6 tubos de 20 x 180 mm conteniendo c/u 15-20 ml de agar Plate count estril, mantenidos a 45-47 C en bao mara -5 tubos de 20 x 180 mm con campana de Durham, conteniendo 10 ml de caldo lauril triptosa de doble concentracin.

-10 tubos de 18 x 150 mm con campana de Durham, conteniendo 10 ml de caldo lauril triptosa de simple concentracin -10 tubos de 18 x 150 mm con campana de Durham, conteniendo 10 ml de caldo Lactosa bilis verde brillante de concentracin sencilla. -10 tubos de 18 x150 mm con campana de Durham, conteniendo 10 ml de caldo E.C. (Escherichia coli) de simple concentracin. -6 cajas Petri estriles -Gradillas para tubos de 18 x 150 mm y de 20 x 180 mm -Pipetas estriles de 10 ml y de 1 ml graduadas en dcimas, estriles. -Mechero Bunsen -Asa bacteriolgica -Agitador de tubos Vortex -Contador de colonias Quebec. -Incubadora a 35C. -Bao mara para C. termotolerantes a temperatura constante de 44,5 C. PROCEDIMIENTO Recoleccin de muestras Las muestras que se tomarn para el anlisis deben ser representativa s para poder determinar as su calidad microbiolgica. Hay normas para la toma de muestras de aguas segn sus distintas procedencias (grifos, pozos, depsitos, lagos, ros, manantiales, etc.). Para su recogida debe utilizarse frascos estriles y debe recolectarse cantidades comprendidas entre 200, 500 y 1000 ml. Muestreo de un Grifo Abrir el grifo, hasta que alcance su flujo mximo y dejar correr el agua durante dos minutos. Este procedimiento limpia la salida y descarga el agua que ha estado almacenada en la tubera. Abrir el frasco de muestreo. Llenar el frasco dejando un espacio de aire (aproximadamente un tercio del frasco) para facilitar la agitacin de la muestra antes del anlisis bacteriolgico. Cuando se estime probable que el agua a analizar contenga trazas de cloro, cloramina u ozono, ser necesario neutralizar su efecto bactericida en el momento del muestreo. Para ello se aadir una cantidad suficiente de tiosulfato sdico. Para un volumen de 250 ml son suficientes 0,2 ml de una solucin acuosa al 3% de tiosulfato sdico. Procedimiento analtico Su anlisis debe comenzar antes de que hayan transcurrido 6 horas desde el momento de la toma de muestras. En circunstancias excepcionales, las muestras pueden conservarse a una temperatura de 4C durante un periodo mximo de 24 h antes de su anlisis . Homogeneizar agitando un nmero no menor de 25 veces, inclinando el frasco y formando un ngulo de aproximadamente 45 entre el brazo y el antebrazo. Recuento de bacterias heterotrficas 1. Realizar diluciones decimales de la muestra de agua, hasta la dilucin 10-3. Depositar 1ml de cada dilucin en cada placa Petri, por duplicado. 2. Verter 15-20 ml del medio agar Plate count contenido en tubos en cada placa y homogeneizar cada caja mediante movimientos de translacin y rotacin en una superficie plana aproximadamente 1 minuto evitando que se mojen la

tapa y los costados de la caja, de esta manera el agua y el agar son mezclados ntimamente. 3. Dejar solidificar (5-10 min), invertir las placas y colocarlas en la estufa a 37C (+/-1C), incubar durante24- 48h. Si se desea conocer la flora bacteriana total de la muestra, se emplean placas con medio agar extracto de levadura y las condiciones sern: 22C durante 72 horas. 4. Transcurrido el tiempo de incubacin contar las colonias que se han desarrollado en cada una de las placas, usando un cuenta colonias para efecto de facilitar la lectura. Seleccionar las placas que contengan entre 30 y 300 colonias y descartar las otras . 5. Si la cantidad de agua sembrada ha sido de 1ml la expresin del resultado es directa. Si la cantidad de agua sembrada ha sido de 0.1 ml, el nmero de colonias contadas habr de dividirse por el volumen de muestra sembrada, es decir, por 0.1, para obtener el nmero de colonias por mililitro. 6. Los resultados se expresarn as: NMERO DE BACTERIAS MESFILAS AEROBIAS: ________ufc/ml NOTA: Si no se observan colonias en ninguna de las cajas sembradas, el resultado no ser 0 (cero) UFC/ml, sino que ser referido al menor grado de dilucin sembrado. Si la menor dilucin sembrada fue de 10 -1, el resultado sera: <10 UFC/ml. Numeracin de Coliformes por el Mtodo del Nmero Ms Probable por tubos mltiples La tcnica del NMP comprende siempre una prueba p resuntiva y otra confirmativa Se sembrar 10, 1 y 0,1 ml de la muestra, en tres series de 5 tubos cada una. A) Prueba presuntiva 1. Inocular la primera serie de tubos con caldo Lauril triptosa a doble concentracin con 10 mililitros de muestra. A continuacin, inocular un mililitro de muestra en cada uno de los 5 tubos correspondientes a la siguiente serie. Finalmente sembrar 0,1 mililitros de la muestra en cada uno de los 5 tubos. 2. Despus de la inoculacin de todos los volmenes de muestra, ag itar la gradilla con los tubos inoculados. Hacerlo en forma horizontal y evitando que el medio sembrado llegue a la tapa de los tubos . 3. Despus de la incubacin a 35 0,5 C por 24 3 horas, retirar los tubos de la incubadora para efectuar la primera lectura de los resultados. Agitar suavemente cada tubo y examinar la produccin de gas. Retirar los tubos con resultado positivo (produccin de gas, retenida en el tubo Durham; no es importante la cantidad de gas) y anotar los resultados. 4. Devolver a la incubadora (35 0,5 C) todos los tubos con resultados negativos, por un periodo adicional de 24 1 hora. La segunda lectura (a las 48 3 horas) ser hecha en las mismas condiciones, despus de esta ltima lectura. Los tubos con resultado positivo sern separados para continuar la marcha analtica y los que resulten negativos sern descartados. 5. Si el total de tubos son NEGATIVOS: El examen se da por terminado, reportando la AUSENCIA DE COLIFORMES TOTALES Y FECALES en la muestra analizada. B) Prueba confirmativa a) Prueba confirmativa para Coliformes totales Todos los tubos positivos de la prueba presuntiva son confirmados. Agitar cada tubo positivo de la prueba presuntiva con un asa de siembra estril para homogeneizar e inocular con tres asadas tubos conteniendo 10 mililitros de caldo verde brillante lactosa bilis 2% (CLVBB 2%) correspondiente. Evitar tomar la pelcula superficial. b) Prueba confirmativa para coliformes termotolerantes

La prueba confirmativa para coliformes termotolerantes se realizar sembrando 3 asadas de todos los tubos positivos de la prueba presuntiva en tubos con teniendo 10 mililitros de caldo E.C. La siembra para la confirmacin de coliformes totales y termotolerantes puede hacerse en forma paralela. Despus de la siembra, agitar la gradilla con los tubos inoculados. Hacerlo en forma horizontal y evitando que el medio sembrado llegue a la tapa de los tubos. 1. Incubar los tubos de caldo verde brillante lactosa bilis 2% sembrados a 35 0,5 C durante 24 3 horas. Despus de la incubacin, retirar los tubos para efectuar la primera lectura. Agitar suavemente cada tubo y examinar la produccin de gas. Retirar los tubos con resultado positivo (produccin de gas en el tubo Durham; no es importante la cantidad de gas) y anotar los resultados. Volver a incubar los tubos negativos a 35 0,5 C durante 24 1 horas y repetir el procedimiento de lectura. Anotar los resultados. 2. Incubar todos los tubos de caldo EC inoculados (no ms de 30 minutos despus de la inoculacin) en bao Mara a 44,5 0,2 C durante 24 2 horas. Proceder a la lectura considerando como resultado positivo para la prueba todos los tubos que presentaron formacin de gas en el tubo Durham. Con los datos obtenidos en la prueba confirmativa, calcular el NMP de coliformes totales y termotolerantes Para este clculo, se seleccionan los tubos con resu ltados positivos en las pruebas confirmativas de coliformes totales y termotolerantes, obtenidos en las tres series consecutivas inoculadas. Con los tubos positivos de cada serie se forma una combinacin de nmeros (tambin denominada cdigo), que corresponde a un valor de Nmero Ms Probable de coliformes. *Si en ninguno de los tubos de confirmacin se observa produccin de gas, aun cuando se observe turbidez. Se consideran negativos, establecindose el Cdigo 0-0-0 para efecto del clculo del NMP, reportndose la ausencia de coliformes totales o de C. termotolerantes C) Presentacin de resultados Los resultados se expresan de la siguiente manera: NMP DE COLIFORMES TOTALES: _______________/100 ml NMP DE COLIFORMES FECALES: _______________/100 ml

MICROBIOLOGA DEL AGUA

EL AGUA Es el recurso natural ms abundante del planeta, indispensable para el desarrollo de la vida. Tres cuartas partes de la Tierra estn cubiertas por agua planeta agua. 97.5% de agua es salada, el 2,5% es dulce La provisin de agua dulce est disminuyendo a nivel mundial. Ms de 1200 millones de habitantes no tienen acceso a una fuente de agua. Las enfermedades por aguas contaminadas matan ms de 4 millones de nios al ao. 20% de todas las especies acuticas de agua dulce estn extintas o en peligro de desaparecer. TIPOS DE AGUA DULCE: De acuerdo a su procedencia y uso: de manantial, potable y residual. El agua de manantial es el flujo natural del agua que surge del interior de la tierra. Puede aparecer en tierra firme o ir a dar a cursos de agua, lagunas o lagos. Los manantiales pueden ser permanentes e intermitentes, y tener origen atmosfrico (agua de lluvia que se filtra en la tierra y surge en otro lugar a menor altitud) o gneo, dando lugar a manantiales de aguas termales. El agua potable es generalmente captada de los ros y luego se trata para hacerla apta para el consumo humano. Las aguas residuales son las que tienen incorporadas un producto de desecho. Pueden tener origen domstico o industrial. AGUA POTABLE Agua potable es aquella que, bien en su estado natural o despus de un tratamiento adecuado, es apta para el consumo humano y no produce ningn efecto perjudicial para la salud. Es limpia, transparente, sin olores o sabores desagradables y est libre de contaminantes. De acuerdo a lo establecido por la Organizacin Mundial de la Salud (O.M.S), el agua potable debe cumplir con los siguientes requisitos: A. No debe contener sustancias nocivas para la salud, es decir, carecer de contaminantes: Biolgicos (microbios y / o grmenes patgenos) Qumicos Txicos (orgnicos o inorgnicos), Radiactivos. B. Poseer una proporcin determinada tanto de gases (O y CO ), como de sales
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inorgnicas disueltos(as). C. Debe ser incolora o translcida, inodora y de sabor agradable.

AGUA DE CONSUMO HUMANO La mayor parte proviene de aguas superficiales (ros, arroyos y lagos). Esta agua pueden estar contaminada con residuos domsticos, agrcolas e industriales. Los contaminantes son qumicos, fsicos y biolgicos. Si tiene m.o. patgenos puede comprometer la salud y la vida. Los patgenos ms frecuentes son los que causan infecciones del tracto intestinal. Los controles microbiolgicos rutinarios se basa en la bsqueda de m.o. indicadores. La presencia de un m.o. indicador evidencia que el agua est contaminada con materia fecal y que cualquier m.o. patgeno del tracto intestinal pueda estar presente en el agua. CONTAMINACIN DE AGUAS CONTINENTALES El agua natural est normalmente contaminada por el aire y el suelo.

 OMS, considera agua contaminada cuando su composicin o su estado natural se ve modificada de tal modo, que pierde las condiciones aptas para los usos que estaba destinada. 75% de ros, lagos y arroyos del mundo estn contaminados 25 millones de muertes en paises en vas de desarrollo. En la India, al Ganges se vierten directamente aguas residuales y cenizas de difuntos. Esta utilizan para beber, cocinar, lavar, ceremonias de baos purificadores. CAUSAS DE LA CONTAMINACIN *Vertidos de aguas residuales urbanas: > m.o, nutrientes, detergentes. *Vertidos industriales: > residuos qumicos *Vertidos de las explotaciones ganaderas: estircol (materia orgnica, N,P). *Vertidos de aguas residuales agrcolas: Abonos, plaguicidas y sales Otros: explotaciones mineras (Cu, Cd y Pb), embarcaciones (alteran plancton por hidrocarburos) MICROORGANISMOS PATGENOS EN EL AGUA

Algunos agentes de enfermedades transmitidas por el agua son organismos acuticos indgenas: especies de Legionella, especies de Vibrio, Aeromonas hydrophila y Pseudomonas aeruginosa. Pero la mayora de estas enfermedades son producidas por patgenos que se originan del tracto entrico de humanos o animales. Las bacterias patgenas generalmente requieren grandes dosis para causar infecciones. Las dosis medias infecciosas varan de 102 a 108 El inters se centra en los microorganismos patgenos, que son los diferentes tipos de bacterias, virus, protozoos y otros organismos, que transmiten enfermedades . ORIGEN BACTERIANO ENFERMEDAD Fiebres tifoideas y paratifoideas Disentera bacilar Clera Gastroenteritis agudas y diarreas

AGENTE Salmonella typhi, Salmonella parathypi A y B Shigella Vibrio cholerae Escherichia coli ET Campylobacter

Yersinia enterocoltica Salmonella sp. Shigella sp. ORIGEN VIRAL ENFERMEDAD Hepatitis A y E Poliomielitis Gastroenteritis agudas y diarreas AGENTE Virus de la hepatitis A y E Virus de la polio Enterovirus Rotavirus Virus Nortwalk Astrovirus Calicivirus Adenovirus Reovirus AGENTE Entamoeba histolytica Giardia lamblia Cryptosporidium

ORIGEN PARASITARIO ENFERMEDAD Disentera amebiana Giardiasis Criptosporidiosis

En los pases en vas de desarrollo las enfermedades producidas por estos patgenos son uno de los motivos ms importantes de muerte prematura, sobre todo de nios. Normalmente estos microbios llegan al agua en las heces y otros restos o rgnicos que producen las personas infectadas. En el futuro se incrementarn debido a aumento de actividad agrcola, aumento de la poblacin, aumento de la migracin, cambio climtico; adems habr mayor resistencia de microorganismos a los desinfectantes. PURIFICACIN DEL AGUA A) Por sedimentacin: separa tanto los slidos decantables como aquellos que flotan B) Por filtracin: filtros de arena fina, gruesa, grava y roca. C) Por desinfeccin a) Por ebullicin b) Por cloracin: cloro debe introducirse a travs de la pared celular de la bacteria y difundirse dentro del citoplasma, accin que depende en alto grado del tiempo de contacto. c) Por ozono: El ozono mata a la bacteria por medio de la ruptura de la membrana celular. INVESTIGACIN DE LA CALIDAD SANITARIA A. Inspecciones Sanitarias B. Pruebas bacteriolgicas * La muestra se tomar en frasco estril. * La muestra ha de ser representativa de la fuente original. * Se evitar la contaminacin de la muestra durante y despus de obte nerla. * La muestra se analizar lo ms pronto posible. * Si no es posible examinar la muestra enseguida, deber guardarse en refrigeracin entre 0 y 10 C Recuento de bacterias heterotrficas en placa (RHP)

 Indicadores comnmente usados - Coliformes totales - Coliformes fecales (termotolerantes) - E. coli - Estreptococos fecales y Enterococos Otros indicadores - Estafilococos - Bacterifagos - Clostridium sulfito reductores - Pseudomonas spp. - Mycobacteria - Aeromonas Otros anlisis especficos *Investigacin de bacterias patgenas: Salmonella, Shigella, E. coli, Vibrio, P. aeruginosa, S. aureus *Investigacin de virus: Enterovirus, Rotavirus, Virus de hepatitis. *Investigacin de parsitos: Giardia, Cryptosporidium, Cyclospora, amebas, Balantidium. Ascaris, Trichuris, Toxocara, etc. BACTERIAS HETEROTRFICAS Las bacterias heterotrficas (hetertrofas) se definen como aquellas bacterias que usan compuestos del carbono orgnico como fuente de energa y el carbono para su crecimiento. Son bacterias que ocurren naturalmente en el agua cuyos requerimientos de nutrientes son sencillos, capaz de crecer en medios de cultivos slidos de uso comn. Incluye tanto a las bacterias saprofticas como a las patgenas, es decir las que causan como las que no causan enfermedades. Este recuento de colonias es til para evaluar el estado de los recursos de agua en su origen y la eficacia del proceso de tratamiento de las aguas destinadas al consumo humano e indica la limpieza y el estado de los sistemas de distribucin. De igual modo, permite detectar cambios anmalos en el nmero de microorganismos en la red de distribucin y no necesariamente la posibilidad de riesgo a la salud pblica. As, todo aumento repentino del nmero obtenido puede advertir de la existencia de un foco de contaminacin y requerira su inmediata investigacin. BACTERIAS COLIFORMES Son bacilos gram-negativos, anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas en 24 a 48 h a 35 C. Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae e incluye a E. coli y a especies de los gneros Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter. Escherichia coli produce dolor abdominal, diarrea, nauseas, vmitos y fiebre. Klebsiella produce enfermedades respiratorias. Citrobacter produce alteraciones a nivel del colon y a nivel intestinal.

 Son usadas como indicadores de posible contaminacin fecal, porque se originan del tracto intestinal humano y animales homeotrmicos. Conforme mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de estar frente a una contaminacin reciente.

COLIFORMES TERMOTOLERANTES (FECALES) Bacterias que forman parte del grupo Coliforme, Son bacilos gram negativos, no esporulados que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas a 44.5 0,2 C dentro de las 24 2 hrs. La mayor especie en el grupo de coliformes termotolerantes es la E. coli.

ENTEROCOCOS FECALES Los enterococos pueden considerarse como indicadores de contaminacin fecal. Sin embargo, algunos enterococos presentes en las aguas pueden proceder de otros hbitats. Se pueden detectar y cuantificar las especies: Enterococcus faecalis, E. faecium, E. duransy E. hirae. Adems, pueden determinarse ocasionalmente otras especies de Enterococcus y algunas especies de Streptococcus (en particular S. bovis y S. equinus). Estas especies de Streptococcus no tienen una supervivencia larga en agua y probablemente no puedan determinarse cuantitativamente. Clostridium perfringens (incluidas esporas) Los bacterias incluidas en el gnero Clostridium tienen morfologa bacilar, son Grampositivas, anaerobias estrictas y capaces de formar esporas. La especie C. perfringens est normalmente presente en heces. Sus esporas son resistentes al calor, a los procesos de desinfeccin y a los tratamientos de depuracin habituales de las aguas (cloracin), por lo que su supervivencia en agua es mayor. La diferenciacin de C. perfringens de otras

especies de Clostridium, se basa en su capacidad de fermentar la sacarosa con produccin de cido, en su incapacidad de fermentar la celobiosa (debido a la ausencia de -Dglucosidasa) y en la produccin de fosfatasa cida. PARMETROS MICROBIOLGICOS PARA AGUA DE CONSUMO HUMANO Al hacer el anlisis de las aguas no buscamos tal o cual microorganismo patgeno, es decir, no aislamos o identificamos los microorganismos patgenos del agua, sino que averiguamos si esta tiene o no contaminacin de origen fecal. Parmetros microbiolgicos Recuento de bacterias heterotrficas a 35C Recuento de colonias a 22C Coliformes totales Coliformes termotolerantes E.coli Enterococos Clostridium perfringens (incluidas las esporas) Pseudomonas aeruginosa Valor paramtrico 500 UFC/ml 200 UFC/ml 0/100 ml 0/100 ml 0/100 ml 0/100 ml 0/100 ml Ausencia en 100 ml

En el caso de incumplimiento de estos parmetros (Lmites permisibles), la autoridad sanitaria valorar la calificacin del agua como apta o no apta para el consumo humano en funcin del riesgo para la salud.

ANLISIS MICROBIOLGICO DEL AGUA Se puede definir el anlisis microbiolgico como el conjunto de operaciones encaminadas a determinar los microorganismos presentes en una muestra problema de AGUA. A.RECUENTO ESTNDAR EN PLACA Se cuenta las colonias despus de haber sembrado en la placa cantidades alcuotas de la muestra. B.TCNICA DE FILTRACIN CON MEMBRANA La muestra se filtra a travs de un filtro de membrana de 0,45 m. de manera que los microorganismos quedan retenidos en su superficie. A continuacin la membrana se deposita en una placa de 55 mm que contiene el agar apropiado. Despus del periodo de incubacin a una determinada temperatura, las colonias que han crecido en la superficie de la membrana pueden ser contadas directamente. C.TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE (NMP) La tcnica de fermentacin en tubos mltiples es una alternativa para la determinacin de coliformes totales y termotolerantes. En esta tcnica los resultados de la fermentacin en tubos mltiples se expresan en trminos de Nmero Ms Probable (NMP) de microorganismos existentes. El mtodo del NMP por tubos mltiples se fundamenta en un modelo de clculo de probabilidades. De acuerdo con la alternativa de siembra elegida, se selecciona la tabla de NMP correspondiente para obtener los recuentos de coliformes. La tcnica de fermentacin en tubos mltiples para la determinacin de coliformes totales y termotolerantes consta de dos fases: la fase presuntiva y la fase confirmatoria.Es una versin simplificada de la tcnica multiple tube fermentation for members of the coliform group del Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater (American Public Health Association-American Water Works Association, 1999) y OMS (1988).