Chapitre 02 : Cinétique enzymatique

L’étude de la cinétique d’une enzyme consiste dans un premier temps à mesurer l’influence
de la concentration du substrat – ou des substrats – sur la vitesse de formation du produit - ou
des produits, vient ensuite la phase d’interprétation de ces mesures qui conduit aux paramètres
de vitesse maximum et d’affinité pour les substrats.

1. Notion de « vitesse initiale »

Dès que l’on met l’enzyme en contact avec une solution contenant le substrat, on observe
la formation du produit en fonction du temps (courbe ci-contre). On devrait mesurer la tangente
de cette courbe à l’origine. En pratique, on considère que la courbe présente une partie rectiligne
et l’on mesure l’augmentation de la concentration de produit ∆[P] pendant un intervalle de
temps ∆t.

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2. Hypothèse de Michaelis-Menten

Il existe plusieurs mécanismes enzymatiques différents selon l'enzyme considéré. Les

enzymes de Michaélis fonctionnent selon le mode suivant : un substrat S se lie avec l’enzyme
E pour donner un intermédiaire ES, puis cet intermédiaire se dissocie pour donner un produit P
avec régénération de l'enzyme E

Dans ce schéma :
• k1 : Constante de vitesse de formation du complexe ES
• k–1 : Constante de vitesse de dissociation du complexe ES
• kcat : Constante catalytique, constante de vitesse qui englobe la formation du complexe EP et
sa dissociation en E + P

3. Calcul de la vitesse initiale en conditions d’état stationnaire

On considère que le système évolue dans des conditions d’état stationnaire ; en d’autres
termes, la concentration du complexe ES est constante : dans un intervalle de temps
infinitésimal, il se forme autant de complexe ES qu’il n’en disparait :

On exprime alors la vitesse de formation du complexe

Et sa vitesse de disparition

Dans les conditions d’état stationnaire

La concentration totale d’enzyme [E]T est égale à la somme de la concentration de complexe

[ES] et d’enzyme libre [E] :

On a

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D’où [ES]

Et l’expression de la vitesse, v=Kcat [ES]

Ou bien

Où Vmax est la vitesse maximale (mol.L-1.S-1) =

Kcat [E]t
Et Km est la constante de Michaélis (mol.L-1)

4. Représentation graphique de l’équation de Michaelis

L’équation de Michaélis décrit la variation de la vitesse initiale en fonction de la
concentration de substrat

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 Hyperbole de Michaélis
5. Détermination expérimentale des valeurs de Vmax et de Km
D’après l’équation de Michaélis-Menten, Vmax et Km apparaissent comme deux constantes
caractéristiques d’un système enzymatique. Leur valeur peut être aisément déterminée par
mesure des vitesses initiales pour une série de concentrations de substrat, à concentration fixe
d’enzyme. Pour obtenir des valeurs précises, les concentrations de substrat doivent être
largement étalées de part et d’autre de Km afin de donner une hyperbole. Ces deux valeurs
peuvent aussi être déterminées par des méthodes graphiques à partir de transformations de
l’équation de Michaélis-Menten qui conduisent à des relations linéaires. La plus couramment
utilisée est celle de Lineweaver-Burk

En prenant la réciproque de l’équation de Michaélis-Menten, on arrive à :

Dans cette relation, dite de Lineweaver-Burk, 1/V0 est linéaire en 1/[S]. L’intersection de la
droite représentative avec l’abscisse détermine -1/Km et son intersection avec l’ordonnée
1/Vmax.

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6. Signification de la vitesse maximale Vmax et constante de Michaélis Km
 Vmax
- Correspond à la vitesse initiale quand l’enzyme est saturée par son substrat
- Renseigne sur l’efficacité catalytique de l’enzyme Vmax= kcat[Et]
 Km
- Affinité de l’enzyme pour le substrat, Km est d’autant plus élevée que l’affinité de l’enzyme
pour le substrat est plus faible (inversement proportionnelle à l’affinité).
7. Influence des facteurs du milieu sur l’activité enzymatique
Parmi les facteurs de l’environnement on retiendra l’action de la température du pH et des
inhibiteurs sur l’activité enzymatique
 Influence de la température : Si la température baisse fortement, cela ralentit l’agitation
moléculaire et la probabilité de rencontre entre l’enzyme et son substrat. La vitesse
enzymatique diminue. À très basse température les enzymes sont immobiles. À température
ambiante (37°C), l’agitation moléculaire est plus importante, ce qui favorise la formation
des complexes, la vitesse enzymatique augmente. 10 000 molécules de substrat sont
transformées par molécule d’enzyme et par seconde. Si la température augmente (>50°C)
cela provoque un changement irréversible de la structure tertiaire de l’enzyme. Le site actif
est modifié et l’enzyme dénaturée devient incapable de fixer son substrat. La vitesse
enzymatique est nulle.
 Influence du pH : Le pH a une influence sur la structure tertiaire de l’enzyme en modifiant
les charges positives et négatives des acides aminés. La structure tertiaire change et l’activité
enzymatique est modifiée.