Hémogramme automatisé

Pentra 60 Horiba-ABX

Pentra 120 Retic Horiba-ABX

CELL-DYN 3700 Abbot

Laboratories

Coulter HMX Beckman

Coulter
LH 1500 Series Automation Beckman Coulter

CELL-DYN WorkCell Abbott

Laboratories
 Intérêt
• Cadence d’analyse
40-150 échantillons /heure en 18 paramètres

• Exactitude des résultats (2% à 5%)

• Contrôle qualité intégré aux manipulations

 Le résultat de la formule dépend de critères:

• morphologiques: approche descriptive

normalisée multicritère
taille
aspect du noyau
aspect du cytoplasme
• chimiques
• analytiques
 Chargement du tube

Perçage du tube et
prélèvement

Segmentation
des aliquotes
1- Mesure par impédance
 Principe de la mesure par impédance

• Le passage de cellules en suspension dans

un liquide conducteur à travers un orifice
modifie la résistance électrique entre deux
électrodes ( principe Coulter).

• Cette variation d’impédance est enregistrée

sous forme d’impulsions
 La variation d'impédance
Electrode interne

Vide régulé Micro-orifice

Electrode
60 à 100 µm
externe

Flux de diluant
Temps
Milieu électrolyte
très conducteur
Une cellule coupe le champ électrique
* diminution de la conductivité
* augmentation de la résistance électrique
Le nombre d ’impulsions
enregistré correspond au
passage des cellules

La hauteur des impulsions est

proportionnelle au volume de
la cellule détectée d’où
identification
 Le tri des impulsions (pulse
edit)
Les impulsions générées sont
triées de façon à ne garder que
celles correspondant à un
passage standard

Le flux de balayage ( sweep flow)

un flux de diluant balaie l ’arrière des
orifices, empêchant les cellules de
retourner dans la zone de détection et
de perturber l ’analyse ( surtout pour
les plaquettes)
 La correction de coïncidence
• Lorsque deux cellules traversent
simultanément l’orifice, elles ne génèrent
qu’une seule impulsion de forte intensité :
c’est le passage en coïncidence.
• la fréquence de coïncidence est une loi
statistiquement prévisible
• la correction est effectuée automatiquement
par l’analyseur.
 La distribution

N
O
M
B
R
E

25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
volume

Les cellules sont classées en fonction de leur volume dans

différents canaux, ce qui permet la construction des
histogrammes érythrocytaire et plaquettaire
 Un nombre élevé de canaux traduit avec précision la réalité.
* trop faible : ne rend pas compte de la répartition volumétrique vraie
* trop élevé : chaque cellule devient unique

4 canaux

Lkc et Erc 256

Plt 64
8 canaux

16 canaux
 Application : les numérations
• Numération des érythrocytes
• Numération des thrombocytes
• Numération des leucocytes
 Numération des Globules Rouges
Electrode interne

Vide régulé Bac de comptage des Rouges/Plt

Electrode
externe • Comptage et mesure du volume à partir
d'une suspension cellulaire.

• Toute particule d'un volume supérieur à

36 fl est comptée comme un globule
Flux de diluant
rouge.

• Les impulsions sont triées pour retenir

celles correspondant au passage standard.

• Le résultat est assujeti à une correction

dite "correction de coïncidence".
 Analyse érythrocytaire: 7 paramètres
Dilution 1/6250 triple comptage
VGM

Mesure entre 24 et 360 fL en 256 canaux

la plage 24 - 36 fL représente les interférences
 Indice de distribution érythrocytaire

• Coefficient de variation calculé à partir de la

courbe érythrocytaire.
• Donne l’étalement de la distribution autour de la
valeur moyenne
• modérément élevé: anisocytose
• indices très élevés: anomalies importantes
( double population, schizocytes, drépanocytes)
 L'IDC ou IDR ou RDW

L'IDC est une valeur statistique correspondant au CV % calculé

sur la distribution des rouges = coefficient d'anisocytose.

50 100 200 50 100 200 50 100 200

IDC Normal IDC Elevé IDC très Elevé

< 15,5% 18 % 35 %
 Numération des Plaquettes
Electrode interne
 Comptage et mesure du
Vide régulé
volume à partir d'une
Electrode
externe suspension cellulaire.

 Les particules de volumes

compris entre 2 et 20 fl sont
Flux de diluant comptées en tant que
plaquette.

 Le flux de balayage chasse les

GR qui pourraient créer des
Zone sensible Flux de balayage impulsions parasites dans la
zone sensible.
 Analyse plaquettaire : 4 paramètres

VMP

Mesures de 2 à 20 fL réparties en 64 canaux

 interférences

Les seuils sont variables, il y a toujours un risque

d ’interférence
 Numération leucocytaire

Numération leucocytaire
suspension où les érythrocytes ont été lysés
dilution au 1/250
seuil de mesure 30 fL ( population décomptée à
partir de 35fL)

Remarque : le dosage de l ’hémoglobine

sur la dilution des leucocytes
méthode de Drabkin par spectrophotométrie
 Lyse différentielle ou Cytolyse des leucocytes

La membrane devient semi-

perméable
Le cytoplasme est libéré
La membrane se rétracte
autour du noyau et des
granulations
Le volume final dépend de
la taille du noyau, de sa
lobularité et des
granulations.
La mesure de l’impédance sur cytolyse permet
d’obtenir une formule « 3 populations »
 Bilan
1- Numération des GR/plaquettes et discrimination par seuil volumétrique
2- Numération des GB après lyse des GR
3- Dosage de l’hémoglobine par méthode colorimétrique
4- Calculs : hématocrite, CCMH, TCMH

Altération des de la morphologie des GB

35-360 fL WBC,LY,MO,GR

RBC,HGB,HCT,MCV,MCH,
24-260 fL MCHC,RDC

PLT,PCT,MPV,PDW
2-20 fL
2 Analyse cytométrique tridimensionnelle

Détermination de la formule complète

 Principe de la mesure optique

• Les cellules sont analysées les unes à la suite des

autres grâce à un « gainage fluidique » (cytométrie
de flux )
• La cellule de mesure du cytomètre de flux comprend
un banc optique devant lequel passent les cellules.
• La lumière diffractée est analysée pour donner des
informations sur la taille et la densité intracellulaire
 La mesure optique
Diluant Diluant

Cellule SOURCE
photoélectrique

Diluant Diluant
Diffraction lumineuse Echantillon
La cellule passe individuellement devant un faisceau lumineux conventionnel (lampe halogène à vapeur
de Hg ou de Xe) ou LASER (Argon, Kryton-Argon, Helium-Neon…)
 Diffraction lumineuse
Grands angles = Densité intracellulaire
(8-20 )

Faisceau laser Petits angles = Taille

(1-6 )

Petits angles = Taille

Grands angles = Densité intracellulaire

 les différents paramètres utilisés pour
l’hémogramme automatisé
– Volume ou taille cellulaire
• Principe Coulter pour le volume ou mesure optique pour la taille
– Diffraction lumineuse
• Diffraction de la lumière par la cellule
– Conductivité ou Radio Fréquence (RF)
• Structure de la cellule par un courant haute fréquence
– Cytolyse
• Lyse différentielle des cellules
– Cytochimie
• Coloration de la cellule
– Marquage
• Marquage par des anticorps monoclonaux et fluorochromes
Impédance/Conductivité/Diffraction
Coulter
 1- le volume 2- la diffraction laser
mesure par impédance

3- la conductivité
Conductivité: analyse du noyau et de la composition Simultanéité des mesures
chimique du cytoplasme en enregistrant les modifications
subies par un courant haute fréquence traversant la cellules.
3 mesures physiques pour la formule complète

V
o
l
u
m
e

Conductivité
noyau

Diffraction : Surface,granulations
 Analyse en 3D

Exploration
réalisée sur
plus de 8000
cellules
Analyse en 256 canaux ( 16 millions de positions unitaires)
Le scattergramme DF1 (Abbott)
 Taille/Cytolyse/Cytochimie
(Activité peroxydasique) Bayer
 Combinaison cytochimique
Recherche de l ’activité myéloperoxydasique
in situ (MPO)
• les lymphocytes sans peroxydase ne sont
pas colorés (-)
• les monocytes sont faiblement colorés (+)
• les granulocytes neutrophiles sont fortement
colorés (+++)
 Taille/Cytolyse/Cytochimie (Peroxydase)
Diffraction lumineuse enregistrée sous deux angles différents (Bayer)

Miroir
Matrice
semi- PEROX
Petit angle 2/3 Lentille transparent
=
Taille

Lentille

Grand angle 5/15

= Miroir
semi-
Activité Cellule transparent
Traitement des cellules ;
Peroxydasique photoélectrique révélation de l'activité
peroxydasique
 Analyse des Globules blancs
large unstained cells
débris cellulaires

neutrophiles

Formule sur
lymphocytes monocytes éosinophiles 7000 cellules
LUC: grandes cellules sans peroxydase
( GL stimulés ou blastes agranuleux des LA ou GLHB des MNI)
 LUC N

Mo

L
E
débris
 Taille/Cytolyse/Cytochimie (Peroxydase)
Canal basophiles
Histogramme
Miroir
semi- Basophiles
Petit angle 2/3 Lentille transparent
=
Taille

Lentille Laser

Grand angle 5/15

= Miroir

Densité semi- Traitement des cellules ;

Cellule transparent
Lyse de tous les blancs
chromatinienne photoélectr
ique sauf des Basophiles
 Diagramme PEROX diagramme BASO
TAILLE TAILLE

LUC Neutrophiles . .
.
.. .
. .
. .
.
.
BASOS .
. .
.
. . . . .
. .
. . .
.
. . . . . . .
. .
. . . . .
. . .
. . . . . . . . .
. . . . . . .
Mo . . .
.

. . . .
. . . . . .
. . . . . . . .
. . . . . .
. . . . . . . . . .
. .
L . .
. .
. . .
. .
.
. . .
. . . .
y Noyaux . . . . . .
Noyaux
monolobés Polylobés
Débris Eosinophiles

DENSITE/SEGMENTATION
 Taille/Cytolyse/Cytochimie
(Coloration des Eo.) Abx Horiba
Absorbance
Matrice LMNE
Nombre
Eo . .
. . .
. . . .
. .
. .. . . .
. . . . . .
.. .
. . . . .
. . . .
. . . . . . .
. . . . . .. . . .
. . . . .
. . .

Bruit Ne . .
de . . . . GCI
. . Basophiles
. . .
. .
fond . .
. . . . . .
Noyaux
. . . . .
. . GB
. .
. .
. .
. . .
.
GCI
.
. .
. . . . . . .
. .
. . .
.
. .
. .
.
.
Volume
. . . .
. . . .
. .
. . . . . . .
. . .
Histogramme Ba
. .
. .
. . Ly . .
. . .
.
Mo+Ba . . .

Volume
LyA
 3 Le marquage spécifique

- ADN: noyau
- ARN : réticulocytes /plaquettes réticulées
- Récepteurs membranaires : CD4/CD8
Diffraction lumineuse + Marquage
ADN/ARN
Abbott
Marquage de l’ADN à l'iodure de propidium

Laser ARGON

Granulations PMT1

Eosinophiles
Lobularité 90 Dépol.
90 Pol.
PMT2

PMT3

Complexité.
Viabilité Blcs 7
Erythroblastes
Numération
0 Taille
 Analyse de la fluorescence:
Marquage des noyaux accessibles
Leucocytes
viables
Les noyaux nus des
cellules lysées et les
Leucocytes
noyaux des cellules
non viables
mortes sont
marqués par
l'iodure de
propidium
Noyaux nus
Marquage fluorescent sur ARN

Laser ARGON

Réticulocytes PMT1

Filtre FL1 auto commutable

PMT2

PMT3

Complexité.
7

Numération
0 Taille
 Réticulocytes
Fluorescence vs Complexité
Réticulocytes : coloration au bleu de méthylène
 Mesure des réticulocytes
Pré-traitement: coloration
au BCB et décoloration de
l ’hémoglobine

Réticulocytes en %
réticulocytes en nombre absolu
volume moyen
indice de maturation
Diffraction lumineuse /Fluorescence
Sysmex
• cytolyse différentielle des
cellules nucléées autres que les
polynucléaires basophiles.
• Comptage des PB par
diffraction optique
• Lyse des globules rouges et des
plaquettes.
• les membranes des globules blancs
sont rendues perméables au
fluorochrome. Fixation du
fluorochrome sur l’ARN et l’ADN
cellulaires.
• Comptage par diffraction à petit angle,
grand angle et intensité de
• fluorescence (3D).
 4- Bilan
Français Anglais Unités
Nb érythrocytes Erc RBC 103/mm 3 ou 1012/L
Concentration en Hb HGB g/dL
Hémoglobine
Hématocrite Ht HCT L/L
VGM VMC MCV fL
TCMH TCMH MCH pg
CCMH CCMH MCHC L/dl de GR
Indice de distribution IDC RDW %
érythrocytaire IDR
Nb plaquettes plt PLT 109/L
Volume plaquettaire moyen VMP MPV fL

Thrombocrite TCT PCT L/L

Indice de distribution IDP PDW %
plaquettaire
Nb de leucocytes Lkc WBC 109/L
Nb de neutrophiles Ne Ne 109/L
Nb de lymphocytes Ly Ly 109/L
Nb de monocytes Mo Mo 109/L
Nb d’éosinophiles Eo Eo 109/L
Nb de basophiles Ba Ba 109/L
 Les alarmes
• Les messages quantitatifs
anomalies par rapport à des valeurs seuils
• Les messages globaux
ex: données erronées
• les messages de suspicion
anomalies morphologiques, cellules immatures,
blastes, poïkilocytose, agrégats plaquettaires,
plaquettes géantes…