Compte rendu :

Microbiologie

Groupe : 4B
Réalisé par :
 Ichraq Talbaoui.
 Khaoula Tassa.
Encadré par :
Said Boughribil.

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Sommaire :
 Séance1 : Techniques de bases/Ensemencement-
Isolement-Filtration
 Séance2 : Identification biochimique des bactéries.
 Séance3:Identification microscopique des
microorganismes.

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Séance n°1 :Techniques de
bases/Ensemencement-Stérilisation-
Transvasement
-Mise en évidence de bactéries dans différents
milieux :
Le but :
Le but de cette manipulation est de mettre en évidence les bactéries
dans différents milieux.

Les Matériels Utilisés :

La boite de pétri Le bec bunsen

Un écouvillon une étuve

Les différents milieux qui seront ciblés :
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 1.Air extérieur.
2.Air intérieur.
3.La main.
4.Projections oropharyngés.
Le mode opératoire :
La gélose nutritive contient tous les nutriments nécessaires au
développement des bactéries, Après ensemencement et pour
accélérer le développement, on place les boites de pétri dans une
étuve. Apres 48h, on bloque le développement des bactéries en
faisant les boites dans le réfrigérateur, car elles ne peuvent pas se
développer à une température≤6°C.Puis on observe les résultats

Pour l´air extérieur et intérieur :

-on ouvre la boite de pétri à l´intérieur de la salle pendant

30min.
-on la ferme, puis on la place dans l´étuve 37°C pendant 24h.
-on ouvre la boite de pétri à l´extérieur de la salle dans un endroit
abrité pendant 30min, on la ferme, puis on la place dans l´étuve 37°C
pendant 24h.

Pour la flore de la peau :

-on place l´écouvillon dans un tube contenant d´eau physiologique

stérile.
-on essore contre la paroi du tube.
-on frotte l´écouvillon à la surface de la main.
-on étale une goutte de la suspension ainsi obtenue sur la surface de
la gélose, coulée en boite de Pétri.

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-on la place à l´étuve pour développer la flore bactérienne et on
incube 48h à 30°C.
Pour les Projections oropharyngés :
-On dépose la boite de gélose ouverte à 30cm de la bouche d´un
étudiant qui parle à voix haute (la boite doit être disposée face aux
projections oropharyngées).

Résultats obtenus :

A l´intérieur A l´extérieur

A la surface de la main
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-On observe que les colonies sont plus développées dans le milieu
intérieur que dans le milieu extérieur.
-On voit que les colonies de la main sont de 5 types de bactéries qui
sont différents au niveau de la forme et la couleur et le nombre.
Pour les Projections oropharyngés :

Le 1er étudiant Le 2éme étudiant

-On observe que les colonies sont plus développées chez le premier
étudiant que le deuxième et qu´ ils sont du même type.

2-La stérilisation :
La meilleure façon de tuer les microbes est par ‹‹ chaleur › ›
car elle détruit leurs protéines ainsi que les enzymes qui y
présentes. Ainsi, le processus de stérilisation suit le principe
de destruction des microbes, qui peut être soit par la chaleur
sèche ou par la chaleur humide ou par filtration.
 Stérilisation par chaleur sèche :

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Le flambage : le passage dans la flamme du Bec Bunsen de la
surface de matériel non inflammable assure une bonne stérilisation.

Zone d´asepsie.

Les matériels utilisés :

Le four de pasteur. La boite de pétri.

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 L´anse d´inoculation.
Le four de pasteur :c´est un four-étuve à air chaud et sec. Il
est utilisé à 180°C pendant 90min.il n´est utilisé que pour la
stérilisation de la verrerie préalablement nettoyée et séchée
ou de matériels métalliques.
Mode opératoire :
-on divise une boite en deux compartiments
-on ensemence le premier à l´aide d´une anse non stérilisée et l´autre
avec l´anse après stérilisation par flambage. L´ensemencement doit
être assuré en stries serrées.
-on incube à 37®C pendant 24h.
Les résultats obtenus :

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Le développement de colonies dans les deux zones avec l´anse
stérilisée par flambage(F),et avec l´anse non flambée(NF) ,car on
avait une contamination au niveau de la partie à l´aide d´une anse
stérilisée par flambage.

 Stérilisation par chaleur humide :

Les matériels utilisés :

L´autoclave. La boite de pétri.

L´autoclave : c´est un appareil indispensable dans un laboratoire de
microbiologie, le chauffage a lieu sous pression de vapeur d´eau, à
une température de 120°C pendant une durée qui varie en fonction
du milieu et du volume. Il tue toutes les endospores.

L´anse d´inoculation.
Mode opératoire :
-On divise la boite en deux.
-on ensemence le premier avec l´ose , à partir d´une solution
bactérienne non autoclavée la moitié de la boite.
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-Apres autoclavage de cette suspension, à 120®C pendant 30min, on
ensemence la deuxième partie de la boite avec des stries serrées.

Résultats obtenus :

On observe le développement de colonies uniquement dans la zone

ensemencée à l´aide d´une suspension non autoclavée (NA).

 Stérilisation par filtration :

La filtration est une technique qui consiste à faire passer un liquide d
´où les microorganismes sont retenus par le filtre .

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Mode opératoire :
-après filtration de 10ml d´une suspension bactérienne sur une unité
de filtration sur un filtre millipore en cellulose de diamètre des pores
de 0,2 micromètre .Le filtre sera récupéré et mis sur une boite de
Pétri contenant une gélose nutritive.

3-Ensemencement :
Ensemencement a pour but de ramener des bactéries d´une
suspension vers un milieu de culture pour favoriser la multiplication
bactérienne d´isoler une espèce, évaluer la pureté ou pour conserver
quelques souches.
Ensemencement selon la méthode des quadrants :
L´ensemencement selon la méthode des quadrants est un type d
´ensemencement qui permet d´obtenir des colonies isolées afin d
´apprécier leur pureté. Il consiste à disperser le microorganisme à la
surface d´un milieu solide afin d´obtenir des colonies séparées.

Principe de la méthode des quadrants.

Mode opératoire :
-On divise la boite de pétri en 3 compartiments.
-on étale en réalisant des stries serrées sur environ ½ de la boite.

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-on stérilise l´anse flambée pour faire étaler une autre fois.
-on étale la deuxième partie environ ¼ par l´anse en stries peu
séparés.
-on étale la troisième partie environ ¼ par des stries sous forme de Z.

Résultats obtenus :

-On observe que les colonies obtenues sont isolées.

Ensemencement sur une gélose inclinée :
L´ensemencement sur une gélose inclinée offre aux bactéries deux
milieux de culture avec des conditions d´aérobies différents : à la
surface et dans la gélose.

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 Principe de l´ensemencement sur une gélose inclinée.

Les matériels utilisés :

La pipette pasteur tube à essaie contient de la

Gélose.
Mode opératoire :
La gélose inclinée sera ensemencée à l´aide de la pipette pasteur.
Une fois les bactéries sont repiqué l´ouverture du tube doit être
flambé par passage 2 à 3 fois sur la flamme bleue du bec bunsen, puis
la pipette doit être introduite jusqu´en profondeur puis après en
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remontant par un mouvement spiralé allant du fond vers le haut sans
toucher ses parois.

Résultats obtenus :
On voit qu´il y a l´isolation de colonies.

3-Transvasement :
C´est une technique a pour but de verser le contenu d´un tube dans
un autre tube sans contaminer le contenu stérile.

Les matériels utilisés :

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 Le tube à essaie
Mode opératoire :

-On utilise deux tubes à essais, l´un contient un bouillon nutritif

stérile et l´autre est vide. Le contenu doit être partagé entre deux
tubes, la manipulation doit se faire selon la zone d´asepsie.

Résultats obtenus :
Les deux tubes ne changent pas .il n´ y a pas de l´apparition de
troubles qui témoigne d´une contamination du contenu.

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