Cours Protéomique Classique Étudiants

Prof MECHAKRA A.
Cours de Protéomique Classique- Février 2014
Université Constantine 1
Département de Biochimie et Biologie Cellulaire et Moléculaire
Spécialité : Analyse Protéomique et Santé
Cours de PROTEOMIQUE CLASSIQUE
Sommaire
Chap 1. Extraction des protéines et préparation des échantillons

1. Introduction
2 . Les différentes étapes d'une purification
21. Paramètres
22. Planification
23. Dosages
231. Dosage des protéines totales
232. Dosage de l'activité
224. Définition de l'unité enzymatique
24. Source de matériel
25. Extraction - Techniques d’extraction
26 Exemples de protocoles
Chapitre 2. Séparation et enrichissement

1 Précipitation différentielle au sulfate d'ammonium
2 Dialyse
3 Filtration sur membrane (unités de filtration)
4 Sédimentation
Chapitre 3. Purification par les méthodes chromatographiques

1. Filtration sur gel
2 Échange d'ions
3 Interactions hydrophobes
4 Hydroxyapatite
5 Chromatographie d'affinité
6 IMAC (immobilized metal affinity chromatography)
7 Système de chromatographie
8 HPLC
9 Techniques de précipitation après chromatographie
Prof MECHAKRA A. Cours de Protéomique Classique- Février 2014
Chap 1. Extraction des protéines et préparation des échantillons
1. Introduction
1.1. Définition du protéome
- Le protéome est l'ensemble des protéines produites par un génôme (ordre de 60000 protéines chez
l'Homme).
- Le protéome résulte de la traduction du génôme en protéines dans des conditions de vie définies. Il
varie selon le type des cellules, leurs activités et leur environnement.
- La taille du protéome est plus importante que celle du génôme, car un gène peut coder pour plusieurs
protéines en considérant les modifications introduites par la maturation des mRNA et les modifications
post-traductionnelles (glycosylation, phosphorylation,...). Le protéome est dynamique, le génome est
constant.
1.2. Définition de la protéomique
La protéomique s’intéresse à l’étude du protéome, c’est-à-dire à l’ensemble des protéines constituant un

organisme vivant dans sa globalité, un tissu, une cellule ou un compartiment cellulaire (ex: les protéines
nucléaires, les protéines mitochondriales, les protéines membranaires…)
L’approche protéomique vise aussi à établir l’identité, la quantité et la fonction de ces protéines, et à en
déterminer l’expression en fonction des conditions environnementales
1.3. Intérêt et applications de l’analyse protéomique
La protéomique permet de :
- Comprendre les processus cellulaires normaux ou responsables de maladies (cancers, maladie

neurodégénératives, etc...)
- Identifier de nouvelles protéines
- Identifier des protéines indicatrices de maladies (bio-marqueurs)
L’analyse protéomique propose de donner des cartes protéiques les plus globales d’un système biologique à un
moment donné de son existence en fonction des conditions physiopathologiques.
Mais ce type d’approche a été lié au développement simultané de différentes techniques allant de la préparation
de l’échantillon (gel d’électrophorèse, chromatographie liquide,…) à l’étude bioinformatique (banques de
données génomique et protéique, clusters d’ordinateurs,…), tout en passant par l’analyse par spectrométrie de
masse (sensibilité, résolution et précision des mesures de masse, nouvelles génération de spectromètres,…).
1.4. Schéma général (Voir schémas)
2 . Les différentes étapes d'une purification
21. Paramètres
Ce sont ses caractéristiques intrinsèques, celles qui rendent une protéine unique, qui vous permettront de la
séparer des autres protéines cellulaires : masse, forme, structures primaire, secondaire, tertiaire et peut-être
quaternaire; charge à un pH donné, densité; degré d’hydrophilicité ou d'hydrophobicité ; isoformes suite à un
épissage alternatif. Elle se retrouve peut-être dans une certaine région de la cellule ou dans une organelle donnée.
Tous ces critères peuvent être utilisés dans la démarche.
Paramètre Technique
Taille Filtration sur gel
Solubilité Précipitation séquentielle au sulfate

d'ammonium
Charge Chromatographie d'échange d'ions
Densité Centrifugation sur gradient;

ultracentrifugation
Hydrophobicité Chromatographie en phase inverse
Marqueur ajouté Chromatographie d'affinité
Exemple simulé d’une purification protéique (Tableau à discuter)
Etape Quantité de votre Proportion de votre

protéine (unités protéine
arbitraires)
matériel brut 4000 1 : 2 000 000
1 1000 1: 500 000
2 500 1: 100 000
3 200 1: 1 000
4 10 1: 100
5 5 1: 2
23. Planification
La planification doit inclure les étapes suivantes.

a- Essai. Comment allez-vous suivre votre protéine pendant sa purification?
b- Choix de la source de matériel. Source native vs source recombinante; source dispendieuse mais
idéale vs source moins idéale mais peu chère; impératifs scientifiques vs impératifs pratiques...
c- Choix d’une technique d’extraction. Elles sont nombreuses, et présentent toutes des avantages et des
inconvénients.
d- Séparation et enrichissement. D’une masse de protéines et de contaminants cellulaires, vous devrez
extraire la pépite d’or. Les techniques de séparation utilisent différents aspects physico-chimiques des
protéines, telles que leur charge (chromatographie d'échange d'ions), leur masse (filtration sur gel,
gradients de densité) et leur solubilité (précipitation différentielle au sulfate d'ammonium).
23. Dosages
Une purification peut prendre plusieurs jours et nous voulons savoir à chaque étape où en est notre protéine.
Il est possible de vérifier la présence aussi bien que l'activité d'une protéine.
Quoiqu'il en soit, il est impératif de toujours, toujours garder des aliquotes (définir) de matériel à chaque étape!
De cette manière, on peut retracer après coup le déroulement de la purification, comprendre quelles en sont les
étapes les plus utiles ou les plus dommageables, et améliorer notre protocole pour l'avenir.
231. Critères
Sensibilité Parce que la protéine risque d'être très diluée à certaines étapes,
particulièrement les premières.
Spécificité Nous cherchons une aiguille dans une grosse boîte d'aiguilles, et comme
rien ne ressemble plus à l'une d'entre elles que sa voisine, il vaut mieux que
nous sachions vraiment reconnaître la nôtre.
Disponibilité des réactifs Si votre protéine n'est qu'un des facteurs impliqués dans une réaction in
vitro requérant huit autres protéines purifiées, mieux vaut déjà avoir ces
derniers si vous comptez utiliser un essai réactionnel. Sinon, optez pour un
essai que vous pouvez vraiment effectuer.
Coût Ce facteur se présente souvent.
Temps requis Plus votre purification est rapide et mieux ce sera. Votre essai devrait donc
vous permettre d'obtenir rapidement une idée de ce qui se passe avec votre
purification; si vous pouvez l'effectuer à chaque étape PENDANT la
purification, encore mieux.
232 Dosage des protéines (en général)
(A) Par mesure de l'absorption aux UV.
Ce type d'analyse est très pratique pour suivre la course de protéines sur une série de colonnes de
chromatographie. Tous les systèmes de chromatographie sont équipés d'une cellule spectrophotométrique pour
mesurer l'absorption des rayons UV par le matériel qui sort des colonnes.
En outre, n'oublions pas que l'ADN et l'ARN absorbent vers 250-260nm, ce qui risque de causer des soucis de
précision!
On peut utiliser le spectro pour détecter la présence de protéines parce que le tryptophane (Trp, W) absorbe la
lumière UV avec un pic à 280 nm. La tyrosine (Tyr, Y) le peut aussi, quoiqu'à un degré moindre, et un troisième
acide aminé cyclique, la phénylalanine, le peut aussi très faiblement.
(B) Par Méthodes colorimétriques.
Ces techniques demandent un traitement de l'échantillon à mesurer par une substance chimique qui, au contact
des protéines, produira un changement de couleur que l'on peut quantifier par spectrophotométrie si on dispose
d'une courbe standard fiable.
Pour cela, une courbe standard faite avec des quantités connues de BSA est nécessaire.
Exemple de courbe standard: la mesure de l’absorbance (Abs) de plusieurs échantillons avec une concentration
croissante en protéines donne à chaque fois une Abs plus élevée.
Voir courbe ci-dessous.

A
b
s
o
r
b
a
n
c
e
Toujours avoir plusieurs points sur notre courbe standard: on limite ainsi l'effet de ceux qui auraient eu une
mauvaise réaction.
Voici trois méthodes colorimétriques : voir tableau suivant
Méthode du biuret Basée sur la réduction du cuivre Cu2+ en Cu+.
Cu+ réagit avec le tryptophane (Trp, W), la tyrosine (Tyr, Y) et la cystéine (Cys, C). Il
leur donne une couleur bleue. Le pic d'absorption pour un test du biuret est à 550nm.
Ce test est peu sensible.
Il résiste assez bien aux différents composés présents dans les tampons mais est sensible
aux sels d'ammonium.
Méthode de Lowry Basée sur la réaction du biuret, elle utilise aussi la réduction du Cu2+ en Cu+. Depuis
1951, la méthode de Lowry est la plus citée de toutes dans la littérature scientifique.
Dans la méthode de Lowry, le Cu+ est utilisé pour réduire le réactif de Folin (une
solution phénolique contenant des composés de tungstène et de molybdène) qui change sa
couleur du jaune au bleu. On lit la réaction à 750 nm.
Plus sensible que la réaction du biuret, la méthode de Lowry est utilisée pour des
quantités de 2—100 µg.
Elle est sensible à plusieurs agents, dont l'EDTA, le DTT, le ß-mercapto, l'Hepes, le Tris,
le triton X-100, le NP-40, etc.
Méthode de Le bleu de Coomassie se lie à l'arginine (Arg, R), la tyrosine (Tyr, Y), le tryptophane
Bradford (Trp, W), l'histidine (His, H) et la phénylalanine (Phe, F) (surtout à R; huit fois plus
qu'aux autres en fait).
Il est assez insensible aux agents des tampons, mais est sensible aux détergents.
En solution, il a une forme cationique rouge qui absorbe à 470nm. Lié aux protéines, il a
une forme anionique bleue qui absorbe à 595nm.
Parce que les deux spectres d'absorption se chevauchent un peu, une courbe standard de
Bradford n'est pas parfaitement linéaire sur toute sa distance.
La méthode de Bradford est encore plus sensible que celle de Lowry (0,2 — 20 µg de
protéines).
233. Dosage de l'activité enzymatique
(i) Méthode continue
Le choix de l’essai repose une fois de plus sur la nature de la protéine: si c'est une kinase, nous testerons sa
capacité à phosphoryler un substrat; si c'est une polymérase, à synthétiser des polymères.
On distingue des méthodes dites continue, discontinue et couplée pour les essais enzymatiques :
Dans la méthode continue, le produit de l'enzyme est différent du substrat. Il n'est donc pas besoin de les séparer
avant de quantifier l'activité de l'enzyme. La méthode continue peut s'effectuer directement dans la solution où se
retrouve l'enzyme purifié.
C'est le cas de différentes phosphomonoestérases. On les teste en les incubant avec le 4-nitrophényl phosphate,
un composé incolore. L'action de ces enzymes convertit ce substrat en nitrophénol de couleur jaune. Comme la
couleur finale est distincte de la couleur initiale, on peut l'évaluer directement (voir exemples du travail
personnel).
(ii) Méthode discontinue
Il peut arriver que notre substrat ne puisse se distinguer du produit par la méthode de quantification utilisée. Le
cas le plus flagrant est celui des méthodes utilisant des isotopes radioactifs.
Un test de kinase, par exemple, peut recquérir l'utilisation d'ATP radioactif; la kinase, en utilisant cet ATP,
transfère un groupement phosphate isotopique sur son substrat. Il est cependant impossible de distinguer, dans le
mélange réactionnel, le substrat nouvellement phosphorylé de l'ATP se trouvant dans la solution, puisque tous
les deux sont radioactifs. Il faut donc d'abord les séparer.
(iii) Méthode couplée (ou indirecte)
Utilisée dans le cas où le produit d'une réaction particulière n'a pas de résultat facilement observable. On a
recourt à une deuxième réaction qui utilise le produit de la première comme substrat. C’est le cas de la glucose-
oxydase utilisée pour le dosage de la glycémie.
Voir aussi l’exemple ci-dessous :

Dosage de l'activité de l'aspartate aminostransférase. Cet enzyme convertit le 2-oxoglutarate et l'aspartate en
glutamate et en oxaloacétate.
Cette réaction est couplée à une deuxième réaction pour révéler sa présence : l'action de l'enzyme malate
déhydrogénase, qui convertit l'oxaloacétate et le NADH en malate et en NAD +. Cette dernière qui est
responsable de la baisse d'absorbance observée. Une telle méthode couplée nous permet donc de mesurer
indirectement l'activité d'un enzyme dont le produit immédiat ne se prêterait pas à une mesure plus directe.
Travail personnel n°2 : rechercher un article récent décrivant le protocole de purification d’une
protéine ou enzyme
224. Purification d'un enzyme: définition de l'unité.
L'activité d'une enzyme devra être définie en termes d'unités (voir exemples du travail personnel 2).
La notion d'unité permet de comparer les activités de différentes préparations d'enzymes (on peut comparer
l'activité spécifique de plusieurs préparations indépendantes).
225. Essais d'activité non-enzymatique
Il peut arriver (et même il arrive fréquemment) que l'activité que nous cherchions ne soit pas enzymatique. C'est
le cas, par exemple, de la recherche de protéines se liant à l'ADN. De telles protéines peuvent être des enzymes,
mais ce n'est pas un pré-requis; de plus, leur liaison à l'ADN n'est pas un processus enzymatique.
Vous avez vu au semestre précédent différentes techniques d'interaction ADN-protéines; pour le moment,
mentionnons qu'il est possible d'utiliser de telles techniques pour suivre la présence et la spécificité d'une
protéine pendant sa purification.
Les essais les plus simples pour une protéine liant l'ADN sont la migration retardée EMSA, pour electromobility
shift assay et l'empreinte à la DNAse (footprinting).
23. Source de matériel
231. Généralités
La source de notre matériel peut ne pas être sujette à discussion. Si nous étudions des protéines dans leur
contexte naturel, nous n'avons d'autre choix que d'aller les y chercher.
Cependant, si nous pouvons utiliser une source alternative pour obtenir de grandes quantités de protéines, nous
devrions opter pour une méthode quelconque de surexpression. Alors qu'une protéine dans son contexte naturel
ne représente qu'une fraction infime du pourcentage de la masse totale des protéines, une protéine surexprimée
peut en représenter une fraction impressionante.
Tissu
Travailler avec du tissu comme source de matériel peut être indispensable, mais ce n'est certes pas commode. Le
tissu devra souvent être brisé et/ou traité à la collagénase pour en briser les fibres insolubles et très solides. Un
avantage est que la protéine vient de son milieu naturel; un autre est que le tissu en question est peut être vendu à
prix très avantageux.
Cellules en culture
Probablement la source la plus courante de protéines non-exprimées dans un système recombinant procaryote.
Les levures
Les conditions de culture pour les levures sont élémentaires, elles peuvent donner énormément de matériel, et
elles ont l'avantage (par rapport aux procaryotes) d'être plus près, évolutivement parlant, des eucaryotes
supérieurs. On y retrouvera donc des enzymes, comme les sérine-thréonine kinases, que ne possèdent pas les
vecteurs d'expression procaryotes.
Les bactéries
Elles restent ce qui se fait de moins cher et de plus puissant en fait d’usines moléculaires. Les bactéries peuvent
être utilisées pour exprimer des quantités astronomiques de matériel.
Les virus
Une approche intéressante pour la production de protéines par des cellules eucaryotes est d'en introduire la
séquence codante dans le génome d'un virus, puis d'utiliser celui-ci pour infecter des cellules.
On utilise beaucoup le baculovirus pour infecter des cellules d'insectes.
Le tableau qui suit présente les caractéristiques de différentes sources de protéines exprimées à partir d'un
vecteur d'expression.
Bactérie Levure Insecte Mammifère in vitro
Facilité du +/- complexe, complexe, simple,

+/- complexe, lent complexe, lent
procédé lent lent rapide
Expression rapide rapide assez lente assez lente très rapide
Production élevée élevée moyenne moyenne faible
milieu pas cher pas cher coûteux couteux couteux
protéine souvent, avec aussi ne s'applique

souvent parfois rarement
sécrétée? corps d'inclusion pas
purification simple simple assez simple assez simple simple
co-expression difficile difficile assez facile difficile facile
Repliement
pas toujours pas toujours oui oui pas toujours
correct
oui, riche en simple, pas

N-glycosylation non complexe non
mannose d'acide sialique
O-glycosylation non oui oui oui non
sur Tyr; très rare sur

phosphorylation oui oui oui non
Ser et Thr
acétylation non oui oui oui non

24. Extraction
241 Généralités
À moins que notre candidate ne soit une protéine sécrétée et donc disponible dans le milieu, nous devrons
sélectionner une méthode pour briser les cellules et en extraire le contenu.
Plusieurs choix s’offrent à nous, choix qui seront faits en fonction du type de cellule utilisé, des conditions de
purification de notre protéine, de l’équipement disponible, et même de nos goûts personnels.
Les principales approches de lyse des cellules sont les suivantes. Un choc osmotique peut suffire à briser la
membrane cellulaire de cellules fragiles. Ce choc peut être assisté par un léger traitement avec un détergent (ce
qui permet aussi d’aider à maintenir les protéines en solution). Une certaine action mécanique peut aussi être
ajoutée au processus: un homogénéisateur à piston permet de briser la plupart des cellules de mammifères.
Pour les cellules de plantes, de levures ou les bactéries, toute approche "douce" devra tenir compte de la présence
d’une paroi cellulaire très résistante; les protoplastes de telles cellules seront préparés en traitant ces dernières
avec des enzymes (telle la lyticase) qui détruiront la paroi sans briser la membrane plasmique.
Finalement, dans tous les cas, une méthode brutale peut aussi être utilisée. Le traitement aux ultrasons, une lyse
mécanique utilisant des billes de verre ou une presse Aminco-French, comme les cycles de
congélation/décongélation, sont tous des moyens envisageables.
242 Tampon
L’extraction s’effectuera dans une solution tampon, dans laquelle les cellules seront resuspendues après une
centrifugation visant à les concentrer. À cette étape, notre protéine est fort probablement en concentration infime
par rapport à toutes les autres protéines cellulaires; nous mettrons les chances de notre côté en limitant toute
dilution supplémentaire. On cherchera autant que possible à maintenir une concentration élevée dès les premières
étapes.
Le tampon de lyse répondra à certaines exigences expérimentales. Il devrait avoir un fort pouvoir tampon, car le
contenu des cellules peut être à un pH inapproprié.
Rappelons-nous que le pouvoir tampon d’une substance est plus élevée dans une région de pH proche de son
pKa; voici les pKa de certains tampons populaires.
Bis-TRIS 6,46
PIPES 6,76
MOPS 7,20
HEPES 7,48
Tris 8,06
Glycine 9,78
Le HEPES (pour la chromatographie d’échange de cations) et le Tris (pour l’échange d’anions) sont ceux que
vous rencontrerez le plus souvent en purification de protéines.
La protéine devra être protégée d’une oxydation excessive : c’est pourquoi un agent réducteur comme la
glutathione, l’acide ascorbique, le beta-mercaptoethanol ou le dithiothreitol (DTT) pourra être ajouté au tampon.
On retrouve souvent du glycérol dans la composition des tampons. Il stabilise les interactions protéine-protéine.
243. Addition d’inhibiteurs de protéases
La cellule même d’où elle provient est remplie de protéases qui peuvent l’hydrolyser. En brisant les lysosomes
(particulièrement si nos cellules de départ ont une forte activité catabolique, comme les cellules du foie; ou si ce
sont des cellules de plantes avec des vacuoles riches en protéases) nous avons libéré une horde de protéases dans
le même tampon de lyse que notre protéine. La solution? Tenir le pH élevé (entre 7 et 8), garder la soupe au frais
(4°C) et ajouter des inhibiteurs de protéases à la solution.
Voici quelques-uns de ces inhibiteurs:
Inhibiteurs Cible
PMSF Toutes les sérine protéases (trypsine, thrombine, chymotrypsine, papaine, etc).
AEBSF Toutes les sérine protéases (trypsine, thrombine, chymotrypsine, papaine, etc).
Plus soluble et moins toxiq inhibiteurs ue que son prédécesseur, le PMSF.
EDTA et EGTA métalloprotéases (métal comme cofacteur)
Benzamidine sérine protéases
Pepstatin A protéases aspartiques comme la cathepsine D, la rénine, la pepsine et les protéases

d'HIV.
Leupeptin sérine- (trypsine, plasmine, kallikréine porcine) et cystéine- protéases (papaine,

cathepsine B). N'inhibe pas la thrombine ni la chymotrypsine.
Aprotinin sérine protéases, mais pas la thrombine ou le facteur X.
Chymostatin sérine protéases avec une spécificité de type chymotrypsine (chymotrypsine,

chymases, cathepsine G et des cystéine protéases comme les cathepsines B, H et
L.
Antipain Inhibe la papaine, la trypsine et la plasmine jusqu'à un certain point. Plus

spécifique pour la trypsine et la papaine que ne l'est la leupeptine.
244. Techniques d’extraction
1 Choc osmotique
Le choc osmotique permet de briser certaines cellules fragiles avec un minimum de dommages. Les cellules sont
incubées dans une solution hypo-osmotique. Cherchant à rétablir l’équilibre osmotique, l’eau pénètre dans la
cellule et finit par causer une rupture de la membrane plasmique. On peut ajouter un peu de détergent (NP-40,
LDAO, triton X-100) et un moyen mécanique.
2 Homogénéisateurs (voir schéma)

Exemples : homogénéisateur de de type Dounce, de type Potter-Elvehjem et la presse Aminco- French
3 Les billes de verre

L’appareil utilisé pour cette technique ressemble à un blender, à ceci près qu’il est beaucoup plus petit et ne
contient pas de lames. Son contenant amovible est rempli de petites billes de verre sur lesquelles on verse la
suspension de cellules. La suspension se répartit entre les billes. Le tout est alors scellé et on lance la machine,
qui fait tourbilloner les billes de verre fortement dont l’action abrasive fait réduire les cellules en bouillie. Les
billes coulent au fond dès que l'agitation cesse.
4 La sonication
Elle consiste en la destruction des cellules par les ultrasons. Ici, une tige de métal (le "sonicateur") à l’extrémité
très fine est introduite dans la suspension de cellules et induite à vibrer violemment, émettant un bruit très fort
déplaisant.
5 Enzymes lytiques
Différents enzymes comme le lysozyme (du blanc d'oeuf de poule, par exemple) ou la lyticase de S.aureus sont
disponibles pour hydrolyser les parois des cellules; il suffit de choisir le plus approprié.
5 Élimination précoce de ce qui n'est pas utile

La cellule contient une très grande quantité de protéines, parmi lesquelles celle qui nous intéresse est fort
probablement très minoritaire. Si possible, il sera donc tout à notre avantage de nous débarasser le plus vite
possible de la majorité des protéines qui ne nous intéressent pas.
De nombreuses protéines sont concentrées dans une région limitée de la cellule : facteurs de transcription et
histones dans le noyau, par exemple; protéines mitochondriales dans les mitochondries, etc. Plusieurs protocoles
existent pour isoler ces organelles les unes des autres par centrifugation. Une extraction douce des organelles
suivie de leur isolation donne une très grande longueur d’avance pour la suite de la purification. Exemple ci-
dessous : séparation des composantes cellulaires par centrifugation différentielle.
Les protéines nucléaires sont presque toujours préparées à partir de noyaux et pas de cellules entières. Une bonne
façon de séparer les noyaux du reste est de déposer le lysat cellulaire (avec les noyaux intacts) sur un coussin de
saccharose. La densité du sucrose ne laisse passer que les particules denses comme les noyaux, les débarassant
de la majeure partie du reste du matériel cellulaire.
10 La chromatine
Selon la technique utilisée, nous nous retrouverons avec un extrait protéique brut contenant de l’ADN plus ou
moins intact et associé à un grand nombre d’histones. Plus cette chromatine est intacte, et plus notre soupe est
visqueuse. Une extraction à la presse Aminco-French ou au sonicateur va pulvériser la chromatine et n'en laisser
que des débris.
On peut séparer la plupart des protéines de la chromatine en changeant la force ionique de la solution (ce qui se
passe lors d'une précipitation au sulfate d’ammonium, par exemple).
11.Protéines membranaires
Ces protéines ne se promènent pas librement en milieu aqueux puisqu’elles comptent au moins un domaine
transmembranaire hydrophobe. Elles sont donc assez insolubles et difficiles à préparer. Leur purification requiert
l’utilisation de détergents.
12. Corps d’inclusion

La même chose est vraie de protéines exprimés chez E.coli, surexprimées ou non, et qui se retrouvent dans des
agrégats insolubles appelés corps d’inclusion.
Les corps d’inclusion peuvent être récupérés par centrifugatrion puis resolubilisation des protéines qu’ils
contiennent avec des agents vigoureux comme la guanidine-HCl, le SDS ou l’urée 8M sont utilisés pour
resuspendre les agrégats; ils doivent ensuite être éliminés pour permettre la renaturation.
245. Exemples de protocoles

le protocole du Protein Purification and Expression Facility de l'EMBL, à Heidelberg en Allemagne :
Tampon de lavage
50 mM Tris-HCl pH 7.5
50 à 200 mM NaCl
Tampon d'extraction
50 mM Tris-HCl pH 7.5
8 M urea
1 mM DTT
1 mM PMSF* * Le PMSF est instable en solution aqueuse et est ajouté au
tampon au moment décrit dans le protocole.
Procédure
 1. Centrifuger le lysat cellulaire à 4°C pour 20 min. à 30 000 g (16 000 rpm dans un rotor SS34 de
Sorvall ou JA-20 de Beckman).
 2. Resuspendre le culot dans 10 mL de tampon de lavage contenant 1% triton X-100 et 1M urée par
gramme de culot de cellules. Incuber à T/P pour 5 minutes.
 3. Centrifuger le lysat cellulaire comme à l'étape (1).
 4. Répéter 3 fois.
 5. Resuspendre le culot dans 10 mL de tampon de lavage et centrifuger la suspension à 4°C pour 30
min. à 45 000 rpm dans un rotor 45Ti de Beckman.
 6. Resuspendre les corps d'inclusion dans le tampon d'extraction. Utiliser assez de tampon pour obtenir
une concentration finale en protéine de 1 mg/mL. Ajouter 10 uL PMSF (100 mM) par mL de solution.
Incuber une heure à T/P.
 7. Diluer la solution dix fois avec le tampon d'extraction et dialyser toute la nuit contre 100 volumess de
solution de lavage.
 8. Centrifuger le dialysat à 4°C pour 30 min. à 45 000 rpm dans un 45Ti.
Chapitre 2. Séparation et enrichissement
Après avoir choisi une source de matériel et sélectionné une technique d'extraction, vous voici arrivé à l'étape de
la séparation des protéines et de l'enrichissement de celle que vous voulez purifier.
1 Précipitation différentielle au sulfate d'ammonium
Cette technique utilise la solubilité différentielle des protéines. Comme chaque protéine est plus ou moins
soluble en solution selon sa composition, on peut en séparer plusieurs en fonction de leur tendance à précipiter
plus ou moins vite quand on change la force ionique de la solution qui les contient.
Une force ionique élevée peut avoir deux effets sur la solubilité: neutraliser certaines charges ioniques requises
en surface pour le maintien de la solubilité, et compétitionner avec les protéines pour les molécules d'eau
disponibles en solution. Quand la concentration en sel est assez élevée pour priver une protéine des molécules
d'eau qui l'hydratent, celle-ci sort de solution et précipite. C'est ce qu'on appelle le phénomène de salting-out.
Les protéines seront éventuellement toutes précipitées par une teneur en sel assez élevée, mais certaines d'entre
elles seront remarquablement résistantes alors que d'autres précipiteront très facilement. C'est cette différence de
solubilité qui permet de les séparer.
La série de Hofmeister ci-dessous décrit les effets relatifs de différents ions sur la précipitation des protéines ou
la promotion de leurs interactions hydrophobiques. (L'anion phosphate et le cation ammonium sont est les plus
efficaces pour précipiter les protéines; l'anion chlorate et le cation Ca 2+ sont au contraire les plus efficaces pour
les remettre en solution. Notez que ce ne sont pas toutes les combinaisons de ces ions qui donnent un sel
soluble).
précipitation PO43- > SO42- > COO- > Cl- > Br- > NO3- > ClO4- chaotropique
(salting out) NH4+ > Rb+ > K+ > Na+ > Cs+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ (salting in)
Le sel le plus utilisé en laboratoire pour précipiter les protéines est le sulfate d'ammonium (NH 4)2SO4. Sa
solubilisation n'affecte pas la température de la solution (au contraire du NaCl, dont la solubilisation
exothermique aide à faire fondre la glace dans les rues l'hiver), il ne dénature pas les protéines et ne coûte pas
cher.
Le tableau ci-dessous donne les quantités de (NH4)2SO4 requises pour atteindre le niveau de saturation à 0°C.
(Le tableau indique aussi combien de sel ajouter à une solution qui en contient déjà).
La procédure suivie d'habitude est la précipitation fractionnée comme indiquée dans le tableau ci-dessous.
(1) Ajustement à 20% sulfate Centrifugation et récupération du culot

(fraction C20)
(2) Ajustement du surnageant Centrifugation et récupération du culot

à 40% sulfate (fraction C40)



La protéine se retrouvera dans une des fractions C20, C40, C60, C80 ou C100.
Les culots de protéines peuvent alors être re-suspendus. Ils contiendront cependant encore une grande quantité
de sulfate dont il faut se débarrasser par dialyse ou dessalage.
2 Dialyse
La méthode la plus utilisée pour changer la concentration en sels d'une solution protéique est la dialyse. Dans
une dialyse, les protéines dans une concentration de sels donnée sont séparées d'une solution à la concentration
en sels différente par une membrane poreuse. Les pores de cette membrane peuvent avoir différentes tailles;
certaines membranes ne laisseront passer que des ions alors que d'autres laisseront même passer de petites
protéines (jusqu'à des poids moléculaires de 50 000 Da).
Les sels auront tendance à équilibrer leur concentration de part et d'autre de la membrane. En utilisant un volume
de tampon de dialyse beaucoup plus grand que celui de la solution protéique, on changera rapidement la teneur
en sels de celle-ci en la même que celle du tampon de dialyse.
Afin d'accélérer le processus, il vaut mieux changer souvent le tampon de dialyse pour du tampon neuf plutôt
que d'utiliser une seule quantité (même grande) de tampon. Voyez plutôt: puisque C1V1=C2V2, la dialyse de
10mL de solution protéique à 500mM dans 1000mL de tampon de dialyse à 100mM donnera une concentration
de 104 mM à l'équilibre.
(500mM x 10 mL) + (100mM x 1000mL) = 1010 mL x 104mM
On aurait pu atteindre la même concentration en dialysant dans un plus petit volume et en changeant le tampon
une fois:
dialysat protéique tampon dialyse équilibre
1) (500mM x 10mL) + (100mM x 100mL) = 110mL x 136 mM
2) (136mM x 10mL) + (100mM x 100mL) = 110mL x 103 mM
La vitesse de dialyse dépend beaucoup de la quantité de matériel à dialyser et de la viscosité des solutions.
3 Filtration sur membrane (unités de filtration)
On y utilise des membranes avec une porosité permettant à certaines substances de passer (sels, petites
molécules, petites protéines).
4 Sédimentation
Les protéines ont un coefficient de sédimentation défini par leur taille, leur forme et leur densité. On peut donc
les séparer par ultracentrifugation sur des coussins ou des gradients de sucrose ou d'autres substances.
Différents types de gradients permettant la séparation de particules en fonction de leur densité.
Une centrifugation isopycnique utilise un tampon avec gradient de densité incluant les densités de toutes les
particules à séparer. Les particules vont donc se stabiliser à un point du gradient égal à leur propre densité.
En (A), on utilise dans le tampon un agent comme le CsCl qui forme spontanément un gradient pendant la
centrifugation; le matériel à séparer peut lui être directement mélangé.
En (B), on utilise dans le tampon un gradient préformé (par exemple de sucrose) et le matériel est déposé au
sommet. Les particules à séparer s'enfoncent jusqu'à leur point isopycnique (ou de même densité).
En (C), on voit que le résultat est le même en bout de course.
En (D), on prépare un gradient discontinu en supreposant des coussins de densité différente. Le matériel est
déposé en haut et centrifugé.
En (E), on voit que les particules s'enfoncent jusqu'à la frontière d'un coussin dont la densité excède la leur.
La centrifugation zonale utilise un coussin ou un gradient dans lequel les particules s'enfoncent plus ou moins
vite en fonction de leur coefficient de sédimentation. Comme la densité maximale du gradient ne dépasse pas
celles des particules, celles-ci s,enfonceraient toutes jusqu'au fond si on ne les arrêtait pas avant.
Chapitre 3. Purification par les méthodes chromatographiques
1. Filtration sur gel
Il s'agit ici d'une séparation des protéines selon leur taille utilisant un tamis moléculaire. Une
colonne de chromatographie pour filtration sur gel est remplie d'une résine consistant en billes
creuses et poreuses. La taille des pores de ces billes est telle que certaines protéines (petites)
peuvent entrer et sortir à leur guise; que certaines (plus ou moins grosses) peuvent essayer
d'entrer mais avec plus ou moins de succès, alors que d'autres (trop grosses) ne peuvent pas
entrer du tout et passent tout droit.
Les plus grosses protéines, celles qui passent carrément entre les billes, sortent en premier de
la colonne. Les autres sont retardées par leurs interactions avec les billes; les plus petites
protéines, qui peuvent entrer et sortir à leur guise, sont les dernières à quitter la colonne.
Nom de la résine Capacité de fractionnement (en

Da)
type dextran
Sephadex G-10 700
Sephadex G-25 1 000- 5 000
Sephadex G-75 3 000- 70 000
Sephadex G-200 5 000- 800 000
type polyacrylamide
Bio-gel P2 200- 2 000
Bio-gel P6 1 000- 6 000
Bio-gel P-150 15 000- 150 000
Bio-gel P-300 60 000- 400 000
type agarose
Sepharose 2B 2 000 000- 25 000 000
Sepharose 4B 300 000- 3 000 000
Bio-gel A-0,5M 30 000- 500 000
Bio-gel A-15M 30 000- 15 000 000
Bio-gel A-150M 5 000 000- 150 000 000
Cette technique est très efficace mais nécessite une haute concentration et un faible volume de
matériel de départ parce que les protéines ont tendance à s'étaler le long de la colonne, ce qui
réduit la qualité de leur séparation si elles n'y entrent pas relativement toutes en même temps.
La forme d'une colonne de filtration devrait être étroite et longue pour une meilleure
séparation.
2 Échange d'ions
Dans une colonne à échange d'ions, les protéines collent par affinité électrostatique à des
groupements chargés de la résine. Une résine portant des groupements positifs est dite
"échangeuse d'anions", parce que des ions négatifs ou les groupements acides d'une protéine
peuvent interagir avec. Une résine portant des groupements négatifs est dite "échangeuse de
cations" parce que ce sont des cations ou les groupements basiques d'une protéine qui
interagissent avec elle.
On fera décoller les protéines d'une telle résine en augmentant progressivement la force
ionique du tampon d'élution, ou en changeant le pH de telle façon que la protéine soit moins
chargée. Un gradient salin permet de séparer les protéines selon leur degré de charge positive
ou négative à un certain pH et est une étape de choix dans une purification.
La résine n'a pas à être utilisée en colonne. On peut la mettre au fond d'un bécher et y ajouter
la solution de protéine (ce qui est pratique dans les premières étapes d'une purification si on a
de très grands volumes de matériel). On peut aussi mettre les protéines en contact avec la
résine dans un bécher ou un tube, effectuer des lavages à faible force ionique dans le même
récipient, puis déposer la résine dans une colonne vide pour procéder à une élution plus
contrôlée.
Il existe une très grande variété de résines échangeuses d'ions, variant les groupes chargés
comme la nature des supports solides.
3 Interactions hydrophobes
En solution, les protéines à caractère hydrophobe cherchent davantage à s'associer entre elles
qu'à s'hydrater avec les molécules d'eau.
Des résines portant des groupements hydrophobiques (cycliques ou aliphatiques) permettent

de retenir de telles protéines sur une colonne. À l'inverse de ce qui se passe sur une colonne
de chromatographie par échange d'ions, une colonne de chromatographie d'interaction
hydrophobe est chargée à haute force ionique (qui favorise les interactions hydrophobes) et
est éluée avec un gradient de sel à la baisse. Grâce à cela, on peut faire passer un échantillon
frais élué (avec une haute concentration en sel) d'une colonne d'échange d'ions directement
sur une colonne d'interaction hydrophobe, sans avoir à dialyser ou diluer.
Les résines les plus utilisées pour ce type de chromatographie sont l'octyl- et le phényl-
sépharose.
4 Hydroxyapatite
L'hydroxyapatite est du phosphate de calcium cristallisé comme nos dents en contiennent.

Cette substance retient les protéines de deux façons: son calcium interagit avec les
groupements acides des protéines alors que son phosphate interagit avec leurs groupements
aminés. L'élution n'est pas ici faite avec un gradient de sel mais plutôt avec un gradient de
phosphate ou de potassium pour compétitionner ces interactions.
5 Chromatographie d'affinité
Dans une telle technique, on a recours à l'affinité de certaines molécules pour d'autres. On
pourra ainsi fixer des anticorps sur une matrice solide dans une colonne (Protéine A-
sépharose, par exemple) et faire passer notre échantillon sur la colonne pour y attraper les
protéines reconnues par l'anticorps.
On a souvent recours à des colonnes dont la matrice porte des fragments spécifiques d'ADN
pour aller pêcher les protéines liant l'ADN. Le bromure de cyanogène (CNBr) est l'un des
réactifs utilisés pour coupler ainsi une cible à la matrice d'une colonne.
Plusieurs protéines de fusion ont des étiquettes permettant de reconnaître et de fixer des
résines spécialement adaptées. Une telle étiquette est la glutathione-S-transférase, qui permet
à la protéine à laquelle elle est fusionnée de se fixer sur une résine de glutathione-sépharose.
La chitin-binding-protein (CBP) fait la même chose pour une résine couplée à de la chitine,
un polymère de N-acétylglucosamine.
Les lectines comme l'agglutinine de germe de blé (WGA, pour wheat germ agglutinin) ont la
très utile capacité de permettre l'adsorption de protéines glycosylées. Le WGA lie le N-
acétylglucosamine; la concanavalin A (Con A) lie le mannose et le glucose
Puisque la chromatographie d'affinité repose sur l'interaction entre deux ou plusieurs

molécules, on devine que seule l'imagination limite ses possibilités de combinaison. Il suffit
de disposer de deux substances qui ont de l'affinité l'une pour l'autre et d'en fixer une sur un
support solide.
On retrouve dans le commerce des résines d'affinité déjà faites.
6 IMAC (immobilized metal affinity chromatography)
Ce type de chromatographie d'affinité fait appel à l'immobilisation, sur une résine, d'un atome
métallique comme le nickel ou le cobalt. Cet atome immobilisé peut établir des liens de
coordination avec certains polypeptides, comme par exemple une chaîne d'histidines.
L'étiquette 6-His est justement ajoutée aux protéines pour que ces dernières soient plus
aisément purifiées par chromatographie d'affinité pour le métal.
Dans la figure ci-dessous, une résine IMAC populaire (nickel- nitriloacetic acid ou nickel-
NTA) utilise un ion de nickel comme site actif. L'ion Ni2+ possède six liens de coordination.
Quatre sont sollicités par le NTA pour l'immobiliser sur la résine; il en reste donc deux pour
interagir avec les atomes d'azote du cycle de la chaîne latérale de deux résidus histidines.
À pH <6, les résidus histidines commenceront à être réduits et ne pourront plus lier le nickel.
On peut donc utiliser une variation de pH pour faire décoller les protéines. Cependant, la
technique d'élution la plus usuelle (plus douce) se fera à l'aide d'un composé qui
compétitionnera avec l'histidine pour le nickel: l'imidazole.
Imidazole, un composé compétitionnant avec l'histidine pour

permettre l'élution de protéines d'une colonne d'affinité pour le métal
immobilisé.
Le nickel peut être chélaté par l'EDTA et l'EGTA, aussi ces composés doivent être utilisés
avec parcimonie (et selon les instructions du fournisseur en résine).
7 Système de chromatographie
Les figures ci-dessous décrivent un système de chromatographie
Montage classique (inspiré du système FPLC d'Amersham Biosciences).

Montage moderne
Principaux éléments du montage
- La colonne : c’est le coeur de ce système est évidemment. Elle est reliée au reste du
système de façon à ce que le tampon la traverse de haut en bas.
- Le tampon provient de réservoirs situés tout au bout en amont du système. On a ici
représenté deux tampons différents (A et B) reliés chacun à une pompe (A et B), même si
bien entendu il est possible de faire fonctionner ce système avec un seul tampon et une seule
pompe. L'avantage d'en avoir deux est qu'on peut programmer le système pour pomper
progressivement plus d'un tampon que de l'autre, générant ainsi un gradient. (D'ordinaire, les
deux tampons ont la même composition sauf pour la concentration en sel; faire varier la
proportion de l'un par rapport à l'autre pendant la chromatographie génère un gradient de force
ionique dans la colonne).
- Chaque pompe est reliée au mélangeur, une chambre où s'effectue le mélange des
deux tampons. Le tampon de chromatographie passe ensuite dans le distributeur, qui l'enverra
soit vers la colonne, soit vers une autre destination. C'est aussi dans le distributeur qu'on
déposera l'échantillon à chromatographier; le distributeur le dirige vers la colonne.
- En aval de la colonne, on installe d'habitude un conductimètre, qui enregistre la
conductivité du tampon (et donc sa concentration en sel)
- et une cellule spectrophotométrique qui enregistre l'absorbance aux UV pour
détecter le passage des protéines. L'éluat de la colonne est ensuite recueilli en petites fractions
par un collecteur.
La figure ci-dessous nous montre ce à quoi ressemble l'enregistrement de L’ABSORBANCE

de l'éluat en fonction du temps pendant une chromatographie d'échange d'ions avec un
gradient de sel.
Le conductimètre a enregistré le passage d'une concentration en ions de plus en plus élevée

avec le temps. Les protéines, elles, décrochent de la colonne en fonction de l'effet qu'a ce
gradient de sel sur leur interaction avec les groupements chargés de la colonne. Les protéines
du pic 1 décrochent avant les protéines du pic 8; c'est donc que leur interaction avec la
colonne était plus faible.
Remarquez que les pics ont des formes différentes. La plupart d'entre eux reflètent sûrement
la présence de plusieurs protéines différentes, surtout si cette chromatographie a été pratiquée
en début de purification. On remarquera aussi que certains pics sont fusionnés: ainsi, le pic 2
est court, il est presque à la même place que le pic 3 et lui donne une épaule. On trouve une
autre épaule, beaucoup plus importante, dans le pic 8; cependant, dans ce cas, l'épaule peut
simplement être due à la très grande taille du pic.
8 HPLC
High performance liquid chromatography: il s'agit d'une technique permettant de séparer les
protéines (entre autres) avec une très grande résolution.
En gros, un système HPLC ressemble au système vu ci-haut: les différences majeures seront
que la colonne est généralement en acier et que le tampon de chromatographie (le solvant) est
sous haute pression pendant la séparation.
Plusieurs types de séparation sont possibles en HPLC. La chromatographie d'échange d'ions et

la filtration sur gel s'y pratiquent selon les mêmes principes qu'avec une chromatographie
"low pressure" (même si à strictement parler, ce n'est pas un "gel" qu'on trouve ici dans la
colonne pour effectuer la filtration).
On distingue souvent en HPLC la chromatographie en phase normale de la chromatographie

en phase inverse.
-En phase normale, la matrice de la colonne est très polaire (de style silice, par exemple) et la
phase mobile (le solvant) est non-polaire (n-hexane, par exemple).
-En phase inverse, vous l'avez deviné, c'est le contraire: la matrice de la colonne est non-
polaire ou hydrophobique et le solvant est polaire (eau, méthanol, acétonitrile). C'est le
pendant à haute pression de la chromatographie à interaction hydrophobe.
Le HPLC se distingue par le très petit diamètre de ses colonnes (moins de 5 mm); un flot à
haute pression de solvant; la capacité de séparer et détecter de très petites quantités; et
finalement une très haute résolution. Voir schéma général
9 Techniques de précipitation
On a souvent recours à une précipitation d'un aliquote de notre préparation pour des fins
analytiques (pour mettre les protéines sur gel, par exemple). Il existe plusieurs techniques
rapides et fiables pour précipiter les protéines (voir exemple présenté en cours).

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Prof MECHAKRA A.

Cours de Protéomique Classique- Février 2014

Chap 1. Extraction des protéines et préparation des échantillons

Chapitre 2. Séparation et enrichissement

Chapitre 3. Purification par les méthodes chromatographiques

Chap 1. Extraction des protéines et préparation des échantillons

1.1. Définition du protéome

1.2. Définition de la protéomique

La protéomique s’intéresse à l’étude du protéome, c’est-à-dire à l’ensemble des protéines constituant un

1.3. Intérêt et applications de l’analyse protéomique

- Comprendre les processus cellulaires normaux ou responsables de maladies (cancers, maladie

1.4. Schéma général (Voir schémas)

2 . Les différentes étapes d'une purification

Tous ces critères peuvent être utilisés dans la démarche.

Taille Filtration sur gel

Solubilité Précipitation séquentielle au sulfate

Charge Chromatographie d'échange d'ions

Densité Centrifugation sur gradient;

Hydrophobicité Chromatographie en phase inverse

Marqueur ajouté Chromatographie d'affinité

Exemple simulé d’une purification protéique (Tableau à discuter)

Etape Quantité de votre Proportion de votre

matériel brut 4000 1 : 2 000 000

1 1000 1: 500 000

2 500 1: 100 000

La planification doit inclure les étapes suivantes.

232 Dosage des protéines (en général)

(A) Par mesure de l'absorption aux UV.

(B) Par Méthodes colorimétriques.

Voir courbe ci-dessous.

Voici trois méthodes colorimétriques : voir tableau suivant

Méthode du biuret Basée sur la réduction du cuivre Cu2+ en Cu+.

Ce test est peu sensible.

233. Dosage de l'activité enzymatique

(i) Méthode continue

(ii) Méthode discontinue

(iii) Méthode couplée (ou indirecte)

Voir aussi l’exemple ci-dessous :

224. Purification d'un enzyme: définition de l'unité.

225. Essais d'activité non-enzymatique

23. Source de matériel

On utilise beaucoup le baculovirus pour infecter des cellules d'insectes.

Bactérie Levure Insecte Mammifère in vitro

Facilité du +/- complexe, complexe, simple,

Expression rapide rapide assez lente assez lente très rapide

Production élevée élevée moyenne moyenne faible

milieu pas cher pas cher coûteux couteux couteux

protéine souvent, avec aussi ne s'applique

purification simple simple assez simple assez simple simple

co-expression difficile difficile assez facile difficile facile

oui, riche en simple, pas

O-glycosylation non oui oui oui non

sur Tyr; très rare sur

acétylation non oui oui oui non

243. Addition d’inhibiteurs de protéases

Voici quelques-uns de ces inhibiteurs:

EDTA et EGTA métalloprotéases (métal comme cofacteur)

Benzamidine sérine protéases

Pepstatin A protéases aspartiques comme la cathepsine D, la rénine, la pepsine et les protéases

Leupeptin sérine- (trypsine, plasmine, kallikréine porcine) et cystéine- protéases (papaine,

Aprotinin sérine protéases, mais pas la thrombine ou le facteur X.

Chymostatin sérine protéases avec une spécificité de type chymotrypsine (chymotrypsine,

Antipain Inhibe la papaine, la trypsine et la plasmine jusqu'à un certain point. Plus