Dissertacao 11 01 2007

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA
SNTESE E CARACTERIZAO DE NANOCRISTAIS LUMINESCENTES BASEADOS EM SEMICONDUTORES II-VI PARA FINS DE APLICAO COMO BIOMARCADORES
FREDERICO DUARTE DE MENEZES
RECIFE, AGOSTO DE 2006
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA
SNTESE E CARACTERIZAO DE NANOCRISTAIS LUMINESCENTES BASEADOS EM SEMICONDUTORES II-VI PARA FINS DE APLICAO COMO BIOMARCADORES
Dissertao
submetida
ao
programa de ps-graduao em qumica da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos para obteno do grau de mestre.
FREDERICO DUARTE DE MENEZES (Bolsista CNPq) Orientadores: Prof. Beate Saegesser Santos Prof. Severino Alves Jnior
Co-orientadores: Prof. Patrcia M. A. de Farias Prof. Ricardo de Carvalho Ferreira
RECIFE, AGOSTO DE 2006
Menezes, Frederico Duarte de Sntese e caracterizao de nanocristais luminescentes baseados em semicondutores II-VI para fins de aplicao como biomarcadores / Frederico Duarte de Menezes. Recife : O Autor, 2006. Xiv, 100 folhas : il., fig., tab. Dissertao (mestrado) Universidade Federal de Pernambuco. Departamento de Qumica Fundamental, 2006. Inclui bibliografia e anexos. 1. Qumica inorgnica 2. Qumica de colides 3. Semicondutores. 4. Nanopartculas I. Ttulo. 546 CDD (22.ed.) UFPE FQ-2007-001
AGRADECIMENTOS
Deus primeiramente, pela constante fora de vontade dada a mim para que eu pudesse superar minhas dificuldades.
minha me e ao meu irmo, Nilza e Fbio, as pessoas que so mais importantes da minha vida. Obrigado pelo apoio e carinho incomensurveis.
minha namorada, companheira e futura esposa, Juliana, pela ateno, carinho, dedicao e pacincia comigo, pois sei que no fcil me aturar de vez em quando. Obrigado por fazer parte da minha vida.
minha cunhada Alessandra e minha sobrinha e afilhada Beatriz, que agora fazem parte da famlia. E a todos os meus familiares.
Aos meus amigos de faculdade: Rafael, Curinga, Castro, Pequeno, Robson, Rogrio, Mnica, Ana, Wagner, Andr Cmara, Eduardo Zobi e a turma do PET, que sempre esto por ai pra dar uma fora. Valeu pessoal.
Aos meus amigos do Aikid.
Aos colegas de laboratrio: Dbora, Fernanda, Sidiclia, Luiz, Rodrigo, Edwin, Ingrid, Cauh, Aluzio e Denise, por me aturarem diariamente.
Aos meus amigos que posso contar a qualquer hora: Hugo, Claudilene, Jlio, Mrcio, Marcelo e Daniel.
Aos meus orientadores, Beate e Jnior, e co-orientadores, Patrcia e Ricardo Ferreira, pelo conhecimento passado e a oportunidade de desenvolver este trabalho. Um agradecimento especial professora Beate pela confiana depositada em mim para o desenvolvimento das nossas pesquisas e ao professor Severino Jnior pela ateno e considerao ofertadas.
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Ao meu grande amigo mineiro Wendel, pela hospitalidade e parceria em alguns dos trabalhos desenvolvidos. Sucesso no futuro, meu amigo.
As professoras Ivone e Valdnia, pela amizade e trabalhos desenvolvidos.
Ao Professor Fernando Galembeck e ao Dr. Carlos A. P. Leite, pelas microscopias eletrnicas obtidas dos materiais estudados.
CNPq pelo apoio financeiro.
E a todos aqueles que, peo desculpas neste momento, no tenham sido citados aqui, pela falta de neurnios que me assola neste momento.
Obrigado a todos vocs!
iii
RESUMO
Neste trabalho, apresentam-se metodologias de sntese de nanocristais luminescentes de semicondutores do tipo II-VI (CdS/Cd(OH)2 e CdTe/CdS). As metodologias empregadas para a obteno de suspenses de nanocristais em meio aquoso, baseadas em qumica coloidal, resultaram em partculas com tamanho mdio de 8,5 nm para o sistema CdS/Cd(OH)2 e 3,8 nm para o sistema CdTe/CdS. Estes materiais foram caracterizados atravs de tcnicas espectroscpicas (absoro, emisso e excitao eletrnica) e atravs de microscopia eletrnica de transmisso e difrao de raios-X para a elucidao das propriedades pticas e estruturais. Os nanocristais de CdS/Cd(OH)2 foram modificadas quimicamente para sua aplicao em sistemas biolgicos atravs da incorporao em sua superfcie do agente funcionalizante glutaraldedo e dos funcionalizantes compostos glutaraldedo/anti-A, glutaraldedo/concanavalina-A. Estes sistemas foram caracterizados atravs de espectroscopia eletrnica de absoro, emisso e excitao e por microscopia eletrnica de transmisso. Por fim, descrevem-se protocolos de utilizao destes nanocristais modificados como marcadores luminescentes de trs sistemas biolgicos: (i) hemcias de tipos sanguneos A+ e O+, (ii) parasitas do tipo Leishmania amazonensis e (iii) cortes histolgicos de tecido mamrio humano saudvel e um de seus respectivos tumores (Fibroadenoma). Observou-se a marcao bem sucedida nos trs sistemas e discutiu-se os diferentes perfis de marcao obtidos sugerindo-se algumas possibilidades para os processos de luminescncia.
Palavras-chaves:
nanocristais,
nanopartculas,
pontos
qunticos,
marcadores
fluorescentes, biomarcadores, funcionalizao, semicondutores, confinamento quntico.
iv
ABSTRACT
In this work we present synthetic procedures in aqueous medium for the obtention of luminescent II-VI (CdS/Cd(OH)2 and CdTe/CdS) semiconductor nanocrystals. These methodologies, based on colloidal chemistry, resulted in particles with a size average of 8,5 nm for the CdS/Cd(OH)2 system and 3,8 nm for the CdTe/CdS system. The optical properties of these materials were characterized using electronic absoprion, emission and excitation spectrocopies while the structural properties were characterized by transmission electronic microscopy and X-ray powder diffraction. The CdS/Cd(OH)2 nanocrystals were chemically modified (by using either one of the following functionalizers: glutaraldehyde, glutaraldehyde/Anti-A or glutaraldehyde/Concanavalin-A) for their application in biolabelling. These systems were characterized by electronic absorption, emission and excitation spectroscopy and by transmission electronic microscopy. Finally, we describe the experimental procedures used to conjugate
+
the
modified CdS/Cd(OH)2 nanocrystals in three different biological systems: (i) A and O+ type red blood cells, (ii) Leishmania amazonensis parasites in the promastigote form and (iii) histologycal sections of human mammary healthy tissues and Fibroadenoma tissues (a benign type of tumor). We discuss the different marking patterns observed for the biological samples in terms of different possible processes of luminescence.
Keywords: nanocrystals, nanoparticles, quantum dots, fluorescent labels, biolabels, functionalization, semiconductors, quantum confinement.
SUMRIO
Captulo 1 Nanocristais de semicondutores...............................................................01 1.1 Introduo .............................................................................................................01 1.1.1 Semicondutores.................................................................................................01 1.1.2 Confinamento Quntico ....................................................................................07 1.2 Breve histrico sobre nanocristais de semicondutores .........................................10 1.3 Motivao: aplicaes biolgicas de NCs de semicondutores .............................10 1.4 Colides ................................................................................................................12 1.5 Objetivos ...............................................................................................................15 1.6 Apresentao da dissertao .................................................................................16 1.7 Referncias............................................................................................................17
Captulo 2 Sntese e Caracterizao de suspenses coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2..................................................................................................................................................................... 19 2.1 Introduo .............................................................................................................19 2.1.1 Estabilizao de NCs: utilizao do Polifosfato ................................................20 2.2 NCs de CdS e CdS/Cd(OH)2 ...................................................................................................................... 22 2.3 Procedimentos experimentais ...............................................................................24 2.3.1 Metodologia de sntese do CdS e CdS/Cd(OH)2 ..................................................................... 24 2.3.2 Estudo da influncia da concentrao do polifosfato da sntese de NCs de CdS................................................................................................................................25 2.3.3 Caracterizao espectroscpica e estrutural dos NCs de CdS e CdS/Cd(OH)2 . 26 2.4 Resultados e discusso..........................................................................................29 2.4.1 Sistemas CdS e CdS/Cd(OH)2 .............................................................................................................. 29 2.4.1.1 Caracterizao estrutural dos NCs de CdS e CdS/Cd(OH)2........................................ 29 2.4.1.2 Caracterizao espectroscpica ......................................................................31 2.4.2 Estudo da influncia da concentrao do polifosfato na sntese de NCs de CdS................................................................................................................................34 2.5 Referncias............................................................................................................41
Captulo 3 Sntese e Caracterizao das suspenses coloidais de CdTe ...................42 3.1 Introduo .............................................................................................................42 3.1.1 Tiis: timos estabilizantes para meio aquoso ..................................................43 vi
3.2 Procedimentos experimentais ...............................................................................45 3.2.1 Reagentes utilizados ..........................................................................................45 3.2.2 Processos de reduo do telrio.........................................................................45 3.2.2.1 Mtodo de Reduo 1: Processo de reduo por congelamento.....................46 3.2.2.2 Mtodo de Reduo 2: Processo de reduo por titulao de cido ...............46 3.2.2.3 Mtodo de Reduo 3: Processo de reduo por aquecimento.......................46 3.2.2.4 Mtodo de Reduo 4: Processo de reduo por aquecimento, em meio alcalino e fotoassistida ..................................................................................................47 3.3 Sntese de NCs de CdTe .......................................................................................48 3.3.1 Mtodo de Sntese 1...........................................................................................48 3.3.2 Mtodo de Sntese 2...........................................................................................48 3.4 Estudo do efeito da concentrao de NCs nas propriedades espectroscpicas das suspenses obtidas..................................................................................................49 3.5 Precipitao seletiva das suspenses de NCs preparadas .....................................50 3.6 Caracterizao espectroscpica e estrutural dos NCs de CdTe ............................51 3.7 Resultados e discusso..........................................................................................52 3.7.1 Processos de reduo do telrio.........................................................................52 3.7.2 Sntese de NCs de CdTe ....................................................................................52 3.7.3 Caracterizao estrutural dos NCs de CdTe ......................................................54 3.7.4 Caracterizao espectroscpica .........................................................................57 3.7.5 Estudo do efeito da concentrao de NCs nas propriedades espectroscpicas das suspenses obtidas..................................................................................................59 3.7.6 Precipitao seletiva das suspenses de NCs preparadas ..................................61 3.8 Referncias............................................................................................................62
Captulo 4 Funcionalizao de nanocristais de CdS/Cd(OH)2 para aplicaes em marcao biolgica .................................................................................................63 4.1 Introduo .............................................................................................................63 4.2 Glutaraldedo: um bom funcionalizante?..............................................................65 4.3 Anticorpos e Lectinas: biomolculas direcionadoras ...........................................67 4.4 Procedimentos experimentais ...............................................................................70 4.4.1 Funcionalizao de NCs de CdS/Cd(OH)2................................................................................... 70 4.4.1.1 Funcionalizao com glutaraldedo ................................................................70 4.4.1.2 Funcionalizao com glutaraldedo/Anticorpo ...............................................70 vii
4.4.1.3 Funcionalizao com glutaraldedo/Concanavalina-A ...................................70 4.4.2 Caracterizao das suspenses funcionalizadas.................................................71 4.5 Resultados e discusso..........................................................................................72 4.5.1 Sistema funcionalizado com glutaraldedo ........................................................72 4.5.1.1 Caracterizao estrutural.................................................................................72 4.5.1.2 Caracterizao espectroscpica ......................................................................74 4.5.2 Sistema funcionalizado com glutaraldedo/Anticorpo.......................................74 4.5.3 Sistema funcionalizado com glutaraldedo/Concanavalina-A ...........................76 4.6 Referncias............................................................................................................78
Captulo 5 - Aplicao de NCs de CdS/Cd(OH)2 como sondas luminescentes para estudos em sistemas biolgicos ....................................................................................79 5.1 5.2 Marcao dos sistemas biolgicos ......................................................................79 Sistemas biolgicos estudados............................................................................81
5.2.1 Leishmania amazonensis ..................................................................................81 5.2.1.1 Introduo ......................................................................................................81
5.2.1.2 Marcao das leishmanias .............................................................................82 5.2.1.3 Resultados e discusso...................................................................................83 5.3.2 Hemcias...........................................................................................................86 5.3.2.1 Introduo .......................................................................................................86 5.3.2.2 Marcao de hemcias ....................................................................................86 5.3.2.3 Resultados e discusso...................................................................................87 5.3.3 Carcinognese e a presena de carboidratos nas membranas celulares............91 5.3.3.1 Introduo ........................................................................................................91 5.3.3.2 Marcao de fibroadenomas ...........................................................................92 5.3.3.3 Resultados e discusso....................................................................................93 5.4 Referncias...........................................................................................................96
Captulo 6 Concluses e Perspectivas .......................................................................97 Anexos ..........................................................................................................................99
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 - Esquema de formao de orbitais moleculares, ligante e antiligante, entre dois tomos quaisquer A e B. .......................................................................................02 Figura 1.2 - Formao das bandas de valncia e de conduo pelo rearranjo dos orbitais de um sistema poliatmico com n estruturas AB.............................................03 Figura 1.3 - Esquema de formao de um xciton. h+ representa o buraco gerado na Banda de valncia, pela excitao do eltron e- ............................................................06 Figura 2. 1 Representao esquemtica de uma cadeia de polifosfato ......................20 Figura 2. 2 - A: Esquema de uma nanocristal de CdS com a ilustrao de um possvel defeito em sua estrutura cristalina. B: Diagrama ilustrativo da banda de valncia (BV) e de conduo (BC) do CdS, separadas por um gap energtico............22 Figura 2. 3 Esquema geral de passivao de uma nanocristal de CdS por uma camada de Cd(OH)2. ........................................................................................................................................................................ 23 Figura 2. 4 Esquema geral do processo de sntese dos NCs de CdS, em meio aquoso, incluindo a etapa de passivao.......................................................................25 Figura 2. 5 Difratograma de raio-x de p de uma amostra de NCs de CdS/Cd(OH)2
...................................................................................................................................................................................................... 29
Figura 2. 6 Micrografia de MET em campo claro de uma amostra de NCs de CdS .30 Figura 2. 7 Espectros de Absoro com suas segundas derivadas (em vermelho), exibindo o primeiro mximo de absoro tanto para o CdS, quanto para o CdS/Cd(OH)2..................................................................................................................................................................... 31 Figura 2. 8 Espectros de excitao e emisso de uma suspenso de NCs de CdS/Cd(OH)2 ................................................................................................................32 Figura 2. 9 Possvel mecanismo de decaimento radiativo dos NCs, corroborado pela presena das trs bandas existentes no respectivo espectro de excitao .............33
ix
Figura 2. 10 Espectros de absoro eletrnica de suspenses de NCs de CdS obtidas com diferentes concentraes de polifosfato ................................................................34 Figura 2. 11 Micrografia de amostra de NCs de CdS sintetizadas com 0,11 mM da soluo de PP ...........................................................................................................35 Figura 2. 12 Micrografia de amostra de NCs de CdS sintetizadas com 0,28 mM da soluo de PP ...........................................................................................................36 Figura 2. 13 Micrografia de amostra de NCs de CdS sintetizadas com 0,39 mM da soluo de PP ...........................................................................................................37 Figura 2. 14 Micrografia de amostra de NCs de CdS sintetizadas com 0,50 mM da soluo de PP ...........................................................................................................38 Figura 2. 15 Micrografia de amostra de NCs de CdS sintetizadas com 0,72 mM da soluo de PP ...........................................................................................................39 Figura 3.1- Colorao do composto Na-Te-Te-Na(aq), formado pela reduo do Te0 ...........................................................................................................................47 Figura 3.2 Suspenso de NCs de CdTe recm preparada, apresentando colorao castanha caracterstica do semicondutor.......................................................................49 Figura 3.3 - Difratograma de raio-x de p de uma amostra de NCs de CdTe ..............54 Figura 3.4 Micrografias de MET em campo claro de uma amostra de NCs de CdTe/CdS......................................................................................................................55 Figura 3.5 Micrografias de MET em campo escuro, referente a Figura 3.4..............56 Figura 3.6 Espectros de Absoro eletrnica de suspenses de NCs de CdTe obtidas pelo Mtodo 1 (a) e Mtodo 2 (b) de sntese de NCs ...................................................57 Figura 3.7 - Espectros de emisso e excitao (vermelho) eletrnica de suspenses de NCs de CdTe obtidas pelo Mtodo 1 (a) e Mtodo 2 (b) de sntese de NCs ...........58 Figura 3.8 Espectros de emisso referentes diferentes diluies feitas em uma suspenso de NCs de CdTe obtidas pelo Mtodo 2 de sntese .............................59
Figura 3.9 Espectros de excitao das diferentes diluies feitas em uma suspenso De NCs de CdTe obtidas pelo Mtodo 2 de sntese......................................................60 Figura 3.10 Espectros de emisso de uma suspenso de NCs de CdTe e das fraes de NCs obtidas pelo processo de precipitao seletiva.................................................61 Figura 4.1 Esquema geral da conjugao de NC a uma biomolcula por intermdio de uma molcula funcionalizante ......................................................................................64 Figura 4.2 Estrutura geral do glutaraldedo ...............................................................65 Figura 4.3 Ligao entre grupamentos amino de protenas com os grupamentos aldedo da forma polimrico do glutaraldedo ..............................................................66 Figura 4.4 Esquema geral da polimerizao do glutaraldedo em meio alcalino ......67 Figura 4.5 Estruturas funcionais de um anticorpo .....................................................68 Figura 4.6 Micrografia de campo claro de uma amostra de NCs de CdS/Cd(OH)2 funcionalizada com glutaraldedo .................................................................................72 Figura 4.7 Micrografia de baixa energia (20eV) de uma amostra de NCs de CdS/Cd(OH)2 funcionalizada com glutaraldedo.....................................................73 Figura 4.8 Espectros de emisso de uma amostra de NCs de CdS/Cd(OH)2 com e sem a funcionalizao com glutaraldedo ..................................................................74 Figura 4.9 Evoluo temporal dos espectros de emisso de uma amostra de NCs funcionalizada com glutaraldedo (CdS/Cd(OH)2/glut) e com glutaraldedo/Anti-A (CdS/Cd(OH)2/glut/Anti-A) .........................................................................................75 Figura 4.10 Evoluo temporal das bandas de emisso geradas pela excitao em 337, 488 e 543 nm.........................................................................................................76 Figura 5.1 Esquema representativo de uma leishmania na forma promastigota........82 Figura 5.2 - Micrografias obtidas da luminescncia do parasita, aps marcao com os NCs funcionalizados com glutaraldedo ......................................................................83
xi
Figura 5.3 - Micrografias obtidas da luminescncia do parasita, aps marcao com os NCs no funcionalizados ..............................................................................................84 Figura 5.4 Perfil tridimensional de marcao de Leishmania amazonensis com NCs de CdS/Cd(OH)2. ..........................................................................................................85 Figura 5.5 Descrio esquemtica da conjugao de CdS/Cd(OH)2-Glut-Anti-A membrana de hemcias, atravs de reao especfica antgeno-anticorpo ...................87 Figura 5.6 Micrografias obtidas da luminescncia das hemcias A+, aps marcao com os NCs/glut/Anti-A ...............................................................................................88 Figura 5.7 - Micrografias obtidas da luminescncia das hemcias O+, aps marcao com os NCs/glut/Anti-A ...............................................................................................89 Figura 5.8 Mapas de intensidade de hemcias A+ (a) e O+ (b) mostrando a diferena entre as intensidades das emisses exibidas .................................................................89 Figura 5.9 Esquema representando o processo de marcao dos tecidos ..................93 Figura 5.10 Imagem tpica de um corte de tecido de Fibroadenoma marcado com CdS/Cd(OH)2/glut/ConA e tratado com Azul de Evans obtida atravs de microscopia confocal sob excitao dual em 488 e 543 nm .............................................................94 Figura 5.11 Cortes de fibroadenomas de tecidos mamrios ......................................94 Figura 5.12 Cortes de tecido mama saudvel (a) e de fibroadenoma (b) tratados com AE e marcados com NCs/glut/ConA ............................................................................95
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LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1 Valores de band gap de alguns semicondutores do tipo II-VI .................04 Tabela 2.1 - Concentraes de [(NaPO3)n] utilizadas para a preparao de suspenses de NCs de CdS ..............................................................................................................25 Tabela 2.2 Dados relativos s micrografias exibidas nas Figuras 2.11 2.15...........39 Tabela 3.1 pKa de alguns tiois utilizados como estabilizantes na sntese de NCs de semicondutores do tipo II-VI ...................................................................................44
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LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
eV CdS Cd(OH)2 CdTe CdSe ZnO ZnS ZnTe PP aB Eg NCs Cd(ClO4)2 [NaPO3]n DRX MET TOPO TOP NaBH4 AMA Glut ConA Anti-A
Eltron Volts Sulfeto de Cdmio Hidrxido de Cdmio Telureto de Cdmio Seleneto de Cdmio xido de Zinco Sulfeto de Zinco Telureto de Zinco Polifosfato raio de Bohr band gap Nanocristais Perclorato de Cdmio Polifosfato de Sdio Difrao de raio-X Microscopia Eletrnica de Transmisso Trioctilfosfinxido Trioctilfosfina Borohidreto de Sdio cido mercaptoactico Glutaraldedo Concanavalina-A Anticorpo contra hemcias tipo A
xiv
Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

1.1 Introduo 1.1.1 Semicondutores
A natureza fsico-qumica dos materiais em geral se d pela configurao eletrnica e dinmica das molculas que os compe. Portanto, para que se possa chegar a uma compreenso mais profunda das propriedades e, consequentemente, de possveis aplicaes dos diversos materiais existentes, assim como de novos materiais a serem desenvolvidos, faz-se necessrio o entendimento de como suas molculas so formadas e, como e quais so as interaes intermoleculares existentes nestes materiais. Toda molcula existente pode ser descrita como sendo formada por pelo menos uma estrutura de ligao entre seus tomos: o orbital molecular. O orbital molecular resulta da combinao entre dois orbitais atmicos que estejam relacionados a eltrons de spins opostos, pertencentes aos tomos formadores da molcula. Esta combinao se d de tal forma que as energias individuais dos eltrons envolvidos na formao da molcula sofrem uma redistribuio, resultando em uma estrutura que corresponde a mistura entre os respectivos orbitais atmicos destes eltrons. O orbital molecular deve ser interpretado como uma nova funo de onda, resultante da combinao entre as funes de onda dos seus eltrons participantes e cujo operador hamiltoniano deve levar em considerao duas novas perturbaes que contribuem para a energia final deste orbital: a repulso entre os eltrons localizados no orbital molecular e as atraes entre os eltrons de um tomo e o ncleo do outro tomo. Este novo orbital, que descreve o compartilhamento entre os eltrons dos tomos envolvidos, a estrutura responsvel pelas novas propriedades fsicas e qumicas da molcula formada. Uma molcula possui como estrutura eletrnica, no mnimo, dois orbitais moleculares: um orbital ligante, de menor energia, e um orbital antiligante, de maior energia. Os eltrons compartilhados na ligao qumica encontram-se normalmente localizados no orbital ligante, pois esta uma regio de menor energia e representa a configurao mais estvel de uma molcula, localizando-se no orbital antiligante
apenas sob a ao de uma perturbao externa ao ambiente eletrnico da molcula, resultando em um estado excitado desta [1,2] (Figura 1.1).
Orbital Antiligante
tomo A
tomo B
Orbital Ligante
Figura 1.1 Esquema de formao de orbitais moleculares, ligante e antiligante, entre dois tomos quaisquer A e B.
Quando um dado material formado pelo empacotamento de vrias molculas idnticas em uma rede ordenada e esta rede passa a ser estvel devido s foras de coeso entre as molculas, temos a formao de um material cristalino [1]. O empacotamento das molculas resulta em uma perturbao mutua entre os orbitais de uma dada molcula com os orbitais das molculas vizinhas. Esta perturbao resulta em uma nova mistura destes orbitais, forando-os a se rearranjarem
energeticamente. Este rearranjo resulta na distribuio da energia total em toda extenso da rede cristalina do material. Com isso, surge uma nova estrutura eletrnica, no mais referente s molculas individuais, mas sim ao material cristalino como um todo. Esta nova estrutura eletrnica, chamada de banda, assemelha-se aos orbitais moleculares precursores. A banda de menor energia, equivalente ao conjunto dos orbitais ligantes, denomina-se de banda de valncia (BV) e a banda de maior energia, equivalente ao conjunto dos orbitais anti-ligantes, denomina-se banda de conduo (BC) (Figura 1.2).
Orbitais Anti Ligantes
tomos A
tomos B
Orbitais Ligantes Orbitais Anti Ligantes Banda de Conduo tomos A tomos B
....
....
Banda de Valncia Orbitais Ligantes
Figura 1.2 Formao das bandas de valncia e conduo pelo rearranjo dos orbitais de um sistema poliatmico com n estruturas AB.
Quando localizados na BV os eltrons de um material cristalino encontram-se sob efeito atrativo dos ncleos ao seu redor, tendo pouca mobilidade de translao na rede cristalina. Por outro lado, quando promovidos para a BC, estes eltrons encontram-se com uma mobilidade maior, permitindo, por exemplo, sua orientao em um fluxo ordenado. Em um material cristalino ideal, isto , sem defeitos em sua rede cristalina, estas bandas so separadas entre si, do ponto de vista energtico, por uma regio onde nenhum eltron de valncia do material pode transitar. Esta regio chamada de band gap (Eg) refere-se ao valor mnimo de energia que se deve fornecer para um eltron situado na BV para que este seja promovido para a BC [1,2]. Esta uma das vrias aproximaes que se utilizam para a descrio da natureza de vrios materiais semicondutores existentes. Quando o valor energtico de Eg alto, acima de 4eV aproximadamente, h uma grande dificuldade de se promover eltrons da banda de valncia para a banda de conduo, sendo esta a propriedade caracterstica dos materiais dieltricos, como o xido de silcio, por exemplo, cujo valor da banda proibida da ordem de 8eV. Por
outro lado, h materiais formados exclusivamente por tomos de metais de transio como ferro, platina ou prata, por exemplo, cujos valores de Eg so nulos ou muito prximos de zero, permitindo que, termodinamicamente, haja uma populao considervel de eltrons ocupando a banda de conduo. Isto decorre da interpenetrao entre as BVs e as BCs, em muitos casos no existindo band gap, ou sendo este desprezvel. Nestes casos, os eltrons migram facilmente de uma banda para outra, sendo esta a caracterstica principal dos materiais condutores. Por fim h uma classe de materiais cujas caractersticas encontram-se na fronteira entre os materiais isolantes e os materiais condutores. Nesta classe, os valores de Eg variam entre 0 e 4eV aproximadamente (Tabela 1.1) e sob certas condies, como temperaturas elevadas ou interao com radiao externa, a promoo de eltrons para a BC torna-se facilitada. A esta classe, de compostos denomina-se semicondutores.
Tabela 1.1 Valores de band gap de alguns semicondutores do tipo II-VI
Semicondutor CdTe CdSe CdS ZnSe ZnO ZnS

a b
Band gap (eV) 1.60a 1.84a 2.5b 2.82a 3.4b 3.68b
Gaponenko [3]. [4].
Os semicondutores so materiais bastante utilizados nas mais diversas reas, devido principalmente s suas propriedades eltricas e pticas. Podem ser das mais diversas naturezas como compostos binrios (ZnS, ZnO, CdTe, entre outros) e materiais com a incluso de certos tipos de elementos, isto , dopados (Si dopado com P ou B, por exemplo), dentre outros. Para os nossos estudos, estamos interessados na famlia de semicondutores formados pela combinao entre metais de transio da famlia II B, como zinco e cdmio, e calcogenentos da famlia VI A. Da o nome dado a esta famlia de compostos: semicondutores do tipo II-VI. A estrutura de bandas dos semicondutores cristalinos determinada pela simetria da rede cristalina. Para cada tipo de simetria, pode-se correlacionar uma
representao mnima da estrutura cristalina, que se repete periodicamente em toda rede do cristal. Esta representao mnima conhecida como zona de Brillouin, existindo diferentes zonas para diferentes simetrias. Dentro de uma zona de Brillouin, existe associado um conjunto de vetores k, atravs do qual se translada de uma zona para outra idntica na rede cristalina, passando-se por diferentes pontos com simetrias diferentes na rede. Supondo-se agora que um eltron translade pela rede cristalina atravs de um destes vetores, este ir sofrer perturbaes de diferentes valores energticos, sendo estas perturbaes tambm peridicas. As combinaes de todas as perturbaes que um dado eltron possa sofrer, para um dado conjunto de vetores k resultam nas estruturas de bandas de cada tipo de semicondutor que seja representado por uma dada zona de Brillouin. Dependendo das estruturas das bandas geradas, o valor do band gap de um semicondutor ser referente ao intervalo entre o valor mximo de energia da banda de valncia permitido para um eltron e o valor mnimo permitido da banda de conduo. Se estes valores estiverem correlacionados a um mesmo vetor k de deslocamento, dizemos que o semicondutor do tipo gap direto e, caso contrrio, se estes valores correspondem a vetores k diferentes, dizemos que o semicondutor do tipo gap indireto. No nosso caso, os semicondutores do tipo II-VI so todos de gap direto. Uma propriedade interessante nos semicondutores, e que tambm ocorre em metais, a sua forma de interao com a radiao eletromagntica [3]. Quando um fton de energia superior a Eg interage com um eltron na BV do semicondutor, este eltron migra para a BC, gerando uma vacncia, isto , um buraco virtual na camada de valncia. Este buraco (h+) possui carga igual a do eltron, mas de sinal oposto. O conjunto eltron-buraco chamado de xciton, que possui sua existncia vinculada a foras coulmbianas fracas, formando um estado ligado (Figura 1.3).
Banda de conduo
e-
xciton h
h+ Banda de valncia
Figura 1.3 Esquema de formao de um xciton. h+ representa o buraco gerado na banda de valncia, pela excitao do eltron e-.
A esta estrutura ligada denomina-se xciton ligado e este se comporta como uma espcie independente, apresentando um conjunto de nveis de energia distintos do semicondutor que podem ser descritos como uma interao tipo tomo de hidrognio, possuindo o primeiro nvel excitado um pouco abaixo - <0,1 eV - da BC do semicondutor. Assim como o tomo de hidrognio, o xciton ligado possui um raio associado denominado raio de Bohr do xciton [3,5] (Equao 1.1).
4 0 h 2 1 1 aB = *+ * m0 e2 me mh
(1.1)
Na Equao 1.1, a constante dieltrica do meio onde se encontra o semicondutor, e me* e mh * so, respectivamente, as massas efetivas do eltron e do buraco do xciton e m0 a massa padro do eltron. O xciton formado possui uma vida muito curta (nanosegundos) e o processo de decaimento energtico para a BV denominado de recombinao excitnica. Duas formas de perda do excesso de energia so possveis: uma forma no radiativa, onde a energia pode ser dissipada na prpria rede cristalina atravs da gerao de vibraes especficas na rede (fnons) e/ou atravs da emisso de ftons com energia menor do que os ftons de excitao [3]. Em semicondutores macroscpicos o primeiro
processo predominante sobre o segundo, devido presena de defeitos intrnsecos na rede cristalina durante a formao do cristal.
1.1.2 Confinamento Quntico
Quando se encontram em dimenses macroscpicas (tambm descritos como bulk) os materiais cristalinos possuem suas propriedades fsicas e qumicas determinadas principalmente pelos tomos que compem o ncleo do cristal, sendo os tomos da superfcie de menor importncia para a determinao destas propriedades. Em um material no estado bulk, qualquer variao nas dimenses do cristal no interfere nas suas propriedades [1,2]. Entretanto, quando o nmero de tomos de um cristal se reduz a algumas dezenas de milhares, seus tomos de superfcie passam a fazer parte de uma frao significativa do material, participando efetivamente em suas propriedades fsicas [6]. Segundo o modelo de orbitais moleculares descrito na seo anterior, a reduo drstica do nmero de tomos no cristal reduz a sobreposio dos seus orbitais moleculares, fazendo com que o rearranjo energtico destes seja menor, resultando numa configurao de bandas de valncia e de conduo mais semelhantes orbitais moleculares. Neste caso, o cristal obtido possui propriedades intermedirias entre o material bulk e os ons que o constituem. Este fenmeno conhecido como Confinamento semicondutores. Quntico [2,6], sendo bastante importante para materiais
Quando as dimenses de um semicondutor se reduzem de tal forma que os seus valores sejam prximos ou menores do que as dimenses do raio de Bohr do seu xciton, os eltrons de valncia tornam-se confinados superfcie do cristal, quando excitados por um fton. Isto ocorre porque o material no mais se comporta como uma rede cristalina, onde os eltrons podem migrar em qualquer direo sofrendo perturbaes mnimas dos ncleos dos tomos. Neste estado, os eltrons se comportam como se percebessem as bordas do cristal, tornando-se mais atrados pelos ncleos prximos [2,3]. Isto faz com que as energias vinculadas s funes de onda que descrevem o deslocamento de cada eltron se aproximem dos valores atmicos, mais altos do que as energias envolvidas no cristal.
Este confinamento pode ser interpretado de forma simples utilizando-se o modelo de partcula na caixa. Segundo este modelo, um eltron encontra-se confinado dentro de uma caixa virtual, onde as funes de onda do eltron se restringem ao interior da caixa, no permitindo ao eltron que se desloque para alm das limitaes de suas paredes. Quanto menor forem as dimenses da caixa, maior a separao energtica entre os diferentes nveis associados cada um a uma funo de onda. Fazendo-se uma analogia ao cristal de um semicondutor e definindo as BVs e BCs por funes de onda quaisquer, quando as dimenses do cristal se reduzem a poucos nanmetros, h um distanciamento energtico entre as bandas, que se reflete no aumento do valor energtico de seu Eg. Alm disso, ocorre uma discretizao das BV e da BC que, em outras palavras, a diminuio dos intervalos energticos que determinam as bandas, podendo ocorrer o surgimento de novas bandas durante o processo de quantizao [3]. Outro modelo bastante utilizado para descrever o efeito de confinamento quntico o modelo de massa efetiva [2,3,7]. Este modelo leva em considerao para os clculos dos nveis energticos do cristal que os eltrons, e os buracos formados no surgimento de xcitons, possuem uma massa considerada diferente do que os eltrons e buracos no bulk. Esta diferena nas massas no deve ser interpretada como uma mudana na quantidade de matria do eltron, mas sim como o eltron se comporta quando perturbado por uma fora externa. Isto ilustrado pela clssica frmula da segunda Lei de Newton [3]:
m* i a = F
(1.2)
Esta mudana de comportamento ocorre pois, nas dimenses reduzidas do cristal nanomtrico, um eltron ou um buraco pode possuir uma massa efetiva (m*) maior ou menor do que quando se encontravam no material bulk. Neste modelo, o clculo da energia do band gap do material confinado pode ser realizado, utilizandose a seguinte frmula [5]:
1 1.8e2 E = Eg + + * 2 * 2m0 R me mh 4 0 R
2h2 1
(1.3)
Na Equao 1.3, o primeiro termo o valor da energia do band gap do bulk; o segundo termo diz respeito a aproximao do confinamento ao modelo de partcula na caixa, dando ao novo band gap uma dependncia proporcional a 1/R2 em relao ao raio no material e o terceiro termo diz respeito s interaes coulmbicas do material, tendo uma dependncia proporcional a 1/R. Esta uma frmula bastante til nos clculos envolvendo semicondutores sob efeito de confinamento fraco, porm, sofrendo considerveis desvios nos resultados para materiais sob confinamento forte. Podemos ter dois tipos de confinamento quntico em um material: o confinamento fraco e o forte [3]. O confinamento fraco ocorre quando o raio do material nanomtrico est muito prximo do valor do seu respectivo raio de Bohr do xciton, ou seja, r aB. Neste caso, a variao do raio do material contribui com sob um fator de 1/R2 para a variao do band gap. Por outro lado, quando o raio do material muito menor do que aB temos o confinamento forte, que contribui sob um fator de 1/R3 para a variao do band gap do material [8]. Com o efeito de confinamento quntico, todas as propriedades do semicondutor se modificam, algumas mais significativamente do que outras. As propriedades pticas tais como absoro eletrnica e fotoluminescncia [2,3,5-8], por exemplo, alteram-se drasticamente com a quantizao de semicondutores. Com o aumento do confinamento quntico, eltrons excitados com alta energia decaem por recombinao excitnica emitindo ftons que podem ter energias em praticamente qualquer regio do espectro visvel, at mesmo no infravermelho. Contrastando com o bulk, onde o processo de relaxao ocorre praticamente pela gerao de fnons no cristal, o processo de fotoluminescncia em semicondutores de dimenses no regime de confinamento quntico encontra-se bastante pronunciado.
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1.2 Breve histrico sobre nanocristais de semicondutores
Em 1982 [9] foi publicado um dos primeiros trabalhos sobre preparao e estudos das propriedades de nanocristais (NCs) luminescentes de semicondutores (quantum dots) tipo II-VI, onde Henglein e colaboradores descrevem a sntese e caracterizao ptica de NCs de sulfeto de cdmio (CdS) e co-colides de sulfeto de cdmio e zinco (CdS-ZnS). A partir desta data, houve um crescimento considervel no nmero de trabalhos publicados nos quais so descritas as mais diversas metodologias empregando-se tcnicas conhecidas de qumica coloidal para a obteno de semicondutores de banda direta em combinaes do tipo III-V, II-IV, II-VI e I-VI. Dos sistemas mais investigados, em termos de preparao e caracterizao, citam-se TiO2, CdS, CdSe, Cd(Se,S), CdTe, PbS e ZnS [10-12]. Foram relatadas tambm, em menor escala, a sntese de nanopartculas de ZnO, AgI, AgBr, HgI2, PbSe, ZnTe, In2S3, In2Se3, Cd3P2, CuCl, CuBr [13-16] e mais recentemente, tentativas com GaAs [17,18]. Nestes trabalhos pode-se observar ainda estudos detalhados sobre: clculo de interaes entre eltrons e buracos, dependentes do tamanho do cristal [7]; processos de fotoluminescncia nos NCs [19]; processos de fotodegradao dos NCs [20]; variao das condies experimentais sobre as propriedades dos NCs [21]; elaborao de novas metodologias de obteno destes materiais [22-26]; e mtodos de separao de NCs por seleo de tamanho [27].
1.3 Motivao: aplicaes de NCs de semicondutores como biomarcadores
Desde as primeiras publicaes que descreveram a utilizao dos NCs como marcadores biolgicos com propriedades singulares em 1998 [28,29], uma grande quantidade de artigos vm sendo publicados anualmente descrevendo o uso de NCs como sondas luminescentes nos mais diversos sistemas biolgicos. Muitos destes trabalhos descrevem a simples modificao de protocolos de marcao j bem descritos, apenas substituindo o fluorforo orgnico classicamente utilizado pelos NCs luminescentes, resultando em melhoras na sensibilidade e especificidade destes protocolos. Alguns estudos ainda mostram que quando funcionalizados com biomolculas como albumina [30] ou polietilenoglicol [31], por exemplo, os NCs
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diminuem sua citotoxicidade, permitindo que estes sejam utilizados para estudos de processos metablicos sem interferncia qumica no sistema em estudo. Os NCs de semicondutores vem sendo cada vez mais utilizados como marcadores luminescentes para estudos de sistemas biolgicos vivos in vitro e at mesmo alguns estudos in vivo [31]. Isto se deve principalmente s seguintes vantagens em relao aos fluorforos orgnicos comumente utilizados para estes tipos de estudos:
Largo espectro de excitao, em relao aos fluorforos orgnicos, possibilitando uma maior opo de comprimentos de onda para a promoo da luminescncia dos NCs.
Maior fotoestabilidade, permitindo que os sistemas biolgicos possam ser excitados por perodos longos sem ocorrer fotoescurecimento. Diversas possibilidades de conjugao a biomolculas, sem que a fotoluminescncia seja significativamente suprimida, permitindo o
desenvolvimento de protocolos para estudos de vrios sistemas biolgicos. Possuem estreitas bandas de emisso, em comparao aos fluorforos orgnicos, possibilitando estudos com marcaes mltiplas em sistemas biolgicos, utilizando NCs com emisses em diferentes comprimentos de onda, sem que haja sobreposio considervel das bandas. Fotoluminescncia com alto deslocamento de Stokes, o que praticamente dispensa a utilizao de filtros para eliminar a interferncia da radiao de excitao. Tempos de decaimento na ordem de centenas de nanosegundos, possibilitando deteco resolvida no tempo suprimindo a autofluorescncia existente na maioria dos sistemas biolgicos [28].
H tambm as vantagens dos NCs luminescentes em relao aos marcadores radiolgicos, ainda muito utilizados em algumas reas de diagnsticos clnicos, como o baixo risco de contaminao e danos causados no manuseio dos NCs e o elevado tempo de utilizao e armazenamento dos NCs, para aplicaes posteriores.
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1.4 Colides
Um colide pode ser definido como um sistema formado por partculas ou macromolculas cujas dimenses estejo dentro da faixa de alguns nanmetros (10-9 m) at alguns micrmetros (10-6 m), dispersas em um meio homogneo no qual no sejam solveis, formando um sistema heterogneo, mas que possui um aspecto visual homogneo. Devido a esta caracterstica, muitas vezes os colides recebem o adjetivo de sistemas micro-heterogneos [32]. O que distingue os sistemas coloidais de outros sistemas dispersos so, dentre outras caractersticas, as seguintes propriedades: capaz de espalhar um feixe de luz ordenado, devido interao entre os ftons incidentes e as partculas formadoras da fase dispersa deste colide (Efeito Tyndall); As partculas dispersas (partculas coloidais) possuem um baixo coeficiente de difuso no meio dispersante; Esta mistura possui uma baixssima presso osmtica; passvel de sofrer um processo de dilise, pelo qual selecionadas impurezas podem ser retiradas da mistura; E, finalmente, esta mistura um sistema termodinamicamente metaestvel, ou seja, sua estabilidade quanto manuteno da sua homogeneidade s ocorre sob certas condies de temperatura e de impurezas e ons dissolvidos na fase dispersante.
As propriedades das partculas coloidais como tamanho, formato, flexibilidade e distribuio de cargas eltricas na superfcie so os principais fatores que determinam a natureza de um sistema coloidal, podendo este ser dividido basicamente em dois subgrupos: Disperses coloidais: sistemas termodinamicamente instveis, devido alta energia livre de superfcie das partculas coloidais e irreversvel, pois no possvel ressuspender o sistema aps a separao das fases dispersa e dispersante; Solues verdadeiras de macromolculas: sistemas termodinamicamente estveis e de fcil reconstituio aps a separao das fases formadoras.
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Em um sistema coloidal disperso, as partculas existentes possuem um tamanho mdio suficientemente grande para que haja a formao de uma superfcie de separao entre estas e a fase dispersante, sendo o estudo destas interfaces um dos grandes temas de pesquisas em qumica coloidal. Os elevados valores da relao rea superficial/volume das partculas faz com que propriedades desta interface, como dupla camada eltrica e adsoro tenham uma grande contribuio na manuteno da estabilidade do sistema coloidal, visto que alteraes que ocorrem nos valores destas propriedades alteram o equilbrio metaestvel entre repulso e atrao das partculas coloidais entre si, acelerando ou retardando o processo natural de separao de fases do sistema atravs da coalescncia e precipitao das partculas coloidais. Sabe-se que as partculas coloidais no se encontram estticas no meio, mas sim sob movimento desordenado, conhecido como movimento browniano, podendo participar de colises e subseqentes processos de agregao. A estabilidade de um colide diz respeito velocidade com que as partculas da fase dispersa se agregam, formando partculas maiores que conseqentemente iro precipitar, desfazendo o colide. Dentre os fatores mais importantes que controlam a taxa de colises entre as partculas e sua agregao temos a temperatura, que atua diretamente na velocidade com que as partculas coloidais se deslocam na fase dispersa. Outro fator importante que determina a estabilidade coloidal presena de eletrlitos dissolvidos na fase dispersa. A importncia deste fator reside na natureza eltrica de um colide. As partculas formadoras da fase dispersa normalmente so carregadas eletrostaticamente, com as cargas distribudas sobre a sua superfcie. Neste caso, partculas com cargas de sinais iguais geram colides mais estveis, visto que a repulso eletrosttica entre as partculas diminui a aproximao entre partculas vizinhas, diminuindo a velocidade com que estas se agregam. Por outro lado, partculas com cargas de sentido oposto tendem a se agregar mais rapidamente por atrao eletrosttica, resultando em uma rpida desestabilizao do colide. Com isso, pode-se deduzir que eletrlitos dissolvidos na fase dispersante de um colide podem agir no desequilbrio das cargas das partculas coloidais, induzindo sua agregao e a destruio do respectivo colide. Para reduzir a ao destes eletrlitos, normalmente utilizam-se compostos qumicos denominados estabilizantes, que se agregam quimicamente ou fisicamente na superfcie das partculas coloidais, promovendo um
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aumento na carga eletrosttica das partculas, o que minimiza a ao dos eletrlitos interferentes e aumentando a estabilidade coloidal. Infelizmente, o processo de desestabilizao de um colide um processo termodinamicamente favorvel, isto , por melhores que sejam as condies em que um colide se encontre, fatalmente ocorrer a agregao de suas partculas com conseqente precipitao do colide. Um processo interessante que contribui para a desestabilizao de um colide denominado envelhecimento coloidal. Por este processo, as partculas vo se tornando cada vez maiores com o decorrer do tempo, chegando a ponto do colide no mais conseguir manter a sua homogeneidade, ocorrendo a precipitao da fase dispersa. Um modelo cintico interessante que descreve o envelhecimento coloidal, e muito aplicado para vrios sistemas estudados, o chamado modelo de envelhecimento de Ostwald [33]. Segundo este modelo, partculas pequenas dissolvem-se, difundindo-se para a superfcie de partculas maiores, aumentando gradativamente o nmero e o tamanho das partculas maiores, contribuindo para a desestabilizao do colide. Este modelo baseia-se no efeito Kelvin, que diz que quanto menor o raio de uma partcula dispersa em um meio, maior a sua solubilidade e maior a sua velocidade de dissoluo no dispersante[32]. Ainda sobre o modelo de Ostwald, para todo sistema composto por partculas dispersas, existe um valor particular de raio para as partculas denominado de raio crtico. Partculas com dimenses menores que o raio crtico tendem a se dissolver e partculas com raio maior do que o raio crtico tendem a crescer no meio, direcionando o processo de envelhecimento. Como invivel experimentalmente obter-se um colide totalmente monodisperso, fica claro a espontaneidade do processo de envelhecimento dos colides, segundo o modelo de Ostwald.
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1.5 Objetivos
O objetivo principal do presente trabalho a obteno e caracterizao de NCs luminescentes de materiais semicondutores II-VI atravs de tcnicas baseadas em qumica coloidal, com o intuito final de aplicao destes NCs como marcadores biolgicos. Para tanto, deseja-se atingir as seguintes metas:
Obteno de suspenses de NCs de CdS, CdS/Cd(OH)2 e CdTe dentro do regime de confinamento quntico destes materiais, em meio aquoso, utilizando-se tcnicas simples e de baixo custo;
Controle dos parmetros de sntese dos NCs, com o intuito de se controlar quimicamente seu tamanho e, conseqentemente, sua fotoluminescncia (regio do espectro visvel e alta intensidade de luminescncia);
Caracterizao das suspenses obtidas, objetivando-se a avaliao estrutural e espectroscpica dos NCs sintetizados; Modificao qumica da superfcie dos NCs, com o intuito de utiliz-los posteriormente para marcao de sistemas biolgicos; Realizao de experimentos de marcao biolgica, envolvendo os NCs e trs sistemas biolgicos: clulas sanguneas, parasitas do tipo Leishmania amazonensis e cortes histolgicos de tecidos tumorais.
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1.6 Apresentao da dissertao
Os trabalhos desenvolvidos nesta dissertao encontram-se distribudos em quatro captulos, da seguinte forma:
Captulo 2: Trata da sntese e caracterizao estrutural e espectroscpica de suspenses coloidais de NCs de CdS e CdS/Cd(OH)2. Alm disso, neste captulo ainda descreve-se como a concentrao do estabilizante escolhido na preparao dos NCs interfere na sntese destes cristais;
Captulo 3: Trata da sntese e caracterizao estrutural e espectroscpica de suspenses coloidais de NCs de CdTe . Descrevem-se diferentes metodologias utilizadas na obteno do precursor telureto (Te-2), necessrio para a sntese dos NCs, assim como as metodologias utilizadas para a obteno de NCs luminescentes de CdTe;
Captulo 4: Neste captulo descrevem-se metodologias simples de funcionalizao dos NCs obtidos pela metodologia descrita no Captulo 2, com o intuito de posterior aplicao para marcao de sistemas biolgicos. Neste captulo ainda descreve-se as observaes realizadas a respeito das caracterizaes espectroscpicas dos NCs funcionalizados;
Captulo 5: Este captulo mostra algumas aplicaes de marcao biolgica utilizando os NCs funcionalizados pelas metodologias descritas no Captulo 4. Ainda descreve-se o comportamento dos NCs quando conjugados com os diferentes sistemas biolgicos, no que diz respeito a modificaes em sua fotoluminescncia.
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1.7 - Referncias
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4 5
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6 7 8
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10 Hines, M. A., Guyot-Sionnest,P., J.Phys. Chem. 102 (1998) 3655. 11 Brus, L. E., Appl.Phys.A, 53 (1991) 465. 12 Hoyer, P., Weller, H. Chem.Phys.Letters, 221 (1994) 379. 13 Spanhel, L., Weller, H., Henglein, A., J.Am.Chem.Soc. 109 (1987) 6632 14 Spanhel, L., Henglein, A., Weller, H., Ber.Bunsen-Ges.Phys.Chem. 91 (1987) 1359. 15 Henglein, A., Gutierrez, M., Weller, H., Fojtik, A., Jirkovsky, J. Ber. BunsenGes.Phys.Chem., 93 (1989) 593. 16 Weller,H., Angew.Chem.Int.Ed.Engl. 32 (1993) 41. 17 Kamat,P.V., Ford,W.E. Chem.Phys.Letters, 135 : 4,5 (1987) 421. 18 Rajh, T., Vucemilovic, M. I., Dimitrijevic, N. M., Micic, O. I., Nozik, A. J, Chem.Phys.Letters, 143 : 3 (1988) 305. 19 Chestnoy, N., Harris, T. D., Hull, R., Brus, L. E. J. Phys. Chem. 90 (1986) 3393. 20 Baral, S., Fojtik, A., Weller, H., Henglein, A. J. Am. Chem. Soc. 108 (1986) 375. 21 Spanhel, L., Haase, M., Weller, H., Henglein, A. J. Am. Chem. Soc. 109 (1987) 5649. 22 Rogach, A. L., Katsokas, L., Kornowski, A., Su, D., Weller, H. Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 100 (1996) 1772.
18
23 Kapitonov, A. M., Stupak, A. P., Gaponenko, S. V., Petrov, E. P., Rogach, A. L., Eychmller, A. J. Phys. Chem. B. 103 (1999) 10109. 24 Murray, C. B., Norris, D. J., Bawendi, M.G. J. Am. Chem. Soc. 115 (1993) 8706 25 Green, M., OBrien, P. Chem. Commun. (1999) 2235. 26 Gaponik, N., Talapin, D. V., Rogach, A. L., Hoppe, K., Shevchenko, E. V., Kornowski, A., Eychmller, A., Weller, H. J. Phys. Chem. B. 106 (2002) 7177. 27 Eychmller, A., Katsikas, L., Weller, H. Langmuir. 6 (1990) 1605. 28 Bruchez, M., Jr., Moronne, M., Gin, P., Weiss, S., Alivisatos, A.P. Science 281 (1998) 2013 29 Chan, W.C.W., Nie, S. Science 281 (1998) 2016. 30 Lovric, J., Bazzi, H.S., Cuie, Y., Fortin, G. R. A., Winnik, F. M., Maysinger, D., J. Mol. Med. 83 (2005) 377. 31 Akerman, M.E., Chan, C.W., Laakkonen, P., Bhatia, S.N., Ruoslahti, E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(20) ( 2002) 12617. 32 Shaw, D. J. Introduction to Colloid and Surface Chemistry. ButterworthHeinemann : UK, 1992. 32 Voiutskii, S. S. Colloid chemistry. Moscow: Mir, 1978. 33 Finsy, R. Langmuir. 20 (2004) 2975.
Captulo 2 Sntese e Caracterizao de suspenses coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2
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Captulo 2 Sntese e Caracterizao de suspenses coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2 :
2.1 - Introduo
As vrias tcnicas existentes para a obteno de nanocristais (NCs) de metais e semicondutores [1-5] podem ser classificadas como pertencentes a dois grupos de mtodos: i) bottom-up e ii) top-down. As tcnicas aqui mencionadas baseiam-se em qumica coloidal, portanto, tcnicas bottom-up de obteno de NCs. A escolha da qumica coloidal deve-se aqui se as suas vantagens, tais como:
1. Dispensa o uso de suportes ou substratos para obteno e crescimento das nanoestruturas, diferente de mtodos como os baseados em processos de eletrodeposio [6] e de deposio por vapor ou plasma. 2. Gera uma quantidade mnima de resduos, diferindo neste aspecto, de mtodos como os que utilizam fotocorroso controlada de cristais macroscpicos para a gerao de NCs, onde boa parte do precursor descartada ao final do processo. 3. Flexibiliza a obteno de nanopartculas com propriedades pticas e eletrnicas distintas ajustando-se poucos parmetros de sntese (por exemplo: quantidade de estabilizante, quantidade e proporo entre os precursores dos NCs e pH do meio). 4. Possibilita alterao da superfcie dos cristais para aplicaes direcionadas, tais como marcao biolgica. 5. Possibilitam produo em larga escala, a custo inferior as demais tcnicas [1].
Para a obteno de uma suspenso coloidal estvel de NCs, devem ser observados os vrios fatores envolvidos na sua preparao, como: concentrao dos precursores da fase dispersa, tipo e quantidade de estabilizante utilizado, tempo de reao, pH do meio e temperatura. Estes fatores influenciam, particularmente, no tamanho mdio, cristalinidade e disperso de tamanho dos NCs. Para a minimizao da disperso de tamanho dos NCs numa suspenso, tcnicas como a precipitao seletiva, cromatografia por excluso e a eletroforese em gel [7] podem ser aplicadas.
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Conforme mencionado no Captulo 1, o modelo cintico mais aceito para explicar o crescimento temporal de NCs o chamado envelhecimento de Ostwald. Neste modelo, partculas com menor dimetro se dissolvem e seus ons se difundem preferencialmente para a superfcie das partculas maiores, aumentando o dimetro destas e, conseqentemente, aumentando tambm o dimetro mdio das partculas remanescentes. Isso ocorre de forma mais lenta ou mais rpida, dependendo da disperso de tamanho das partculas presentes em um dado sistema, da concentrao dos ons e da temperatura. Por isso, foram realizados estudos dos fatores que interferem na cintica de formao dos NCs e na sua estabilidade.
2.1.1 Estabilizao de NCs: utilizao do Polifosfato
O polinion polifosfato (PP) foi o agente escolhido para a estabilizao das suspenses coloidais de NCs de CdS e CdS/Cd(OH)2 em meio aquoso [8]. O PP um polmero inorgnico constitudo de algumas poucas milhares de unidades do monmero PO3-, constituindo um polinion de cadeia rgida (Figura 2.1).
O P ...O OO
O P OO
O P OO
O P OO
O P OO
O P OO...
Figura 2. 1 Representao esquemtica de uma cadeia de polifosfato
O PP j foi utilizado como estabilizante para suspenses aquosas de NCs de CdS, ZnS, dentre outros semicondutores, e isto se deve pois suas cadeias recobrem a superfcie dos NCs, resultando numa camada protetora com carga superficial negativa, o que dificulta a aproximao e conseqente coalescncia dos NCs. Isto s possvel devido forte interao eletrosttica entre as cadeias de PP e os ctions de cdmio presentes na superfcie dos NCs [9]:
nCd +2 + PP -2n
Cdn PP (2.1)
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Conforme ser abordado em seo posterior, a concentrao de PP utilizada na sntese de suspenses coloidais de CdS interfere de forma significativa na cintica de formao dos NCs, com conseqente alterao da sua distribuio de tamanho.
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2.2 - NCs de CdS e CdS/Cd(OH)2 : O sulfeto de cdmio (CdS) um semicondutor binrio do tipo II-VI, de band gap direto, com Eg = 2,5 eV (aproximadamente 495 nm). Foi um dos primeiros semicondutores a serem utilizados para os estudos sobre confinamento quntico [10]. Este semicondutor foi escolhido como sistema principal de estudo no presente trabalho, pois a metodologia de obteno de NCs em meio aquoso simples, estabelecida na literatura [11,12] e encontra-se implantada no grupo de pesquisa. Alm disso, sob certas condies de sntese, seus NCs possuem luminescncia na regio visvel do espectro, quando excitadas na regio do UV. Como as aplicaes que se desejam para os NCs depende de suas propriedades pticas, este mtodo bastante atrativo pois garante a produo de NCs com boa qualidade que permitem a utilizao destes como possveis marcadores biolgicos fluorescentes. Para as aplicaes onde a luminescncia dos NCs utilizada, fazem-se necessrias pequenas modificaes nos processos de sntese das suspenses coloidais de NCs de CdS, de forma a minimizar o surgimento de nveis eletrnicos entre as camadas de valncia e de conduo do semicondutor, normalmente resultantes de defeitos na estrutura cristalina dos NCs (internos e/ou na superfcie dos cristais). Estes nveis acarretam vias no radiativas de desativao do eltron-buraco diminuindo ou mesmo suprimindo completamente a luminescncia dos NCs [11](Figura 2.2).
A CdS
B BC
(a)
Eg Gap
(b)
(c)
Defeito BV
Figura 2. 2 - A : Esquema de um nanocristal de CdS com a ilustrao de um possvel defeito em sua estrutura cristalina. B : Diagrama ilustrativo da banda de valncia (BV) e de conduo (BC) do CdS, separadas por um gap energtico. (a) e (c) representam nveis eletrnicos gerados por defeitos, interferindo na BC e (b) representa o nvel eletrnico gerado por um defeito, interferindo na BV.
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Ao processo de eliminao desses defeitos denomina-se passivao. Este processo resume-se no recobrimento dos nanocristais (ncleos) obtidos, com uma camada de outro semicondutor (casca), cuja diferena energtica possui um valor maior do que o gap do nanocristal original (ncleo), o que acarreta na aniquilao dos nveis eletrnicos dos defeitos dos NCs. A Figura 2.3 ilustra de forma simples o processo de passivao.
Passivao
BC CC Band gap BV CV CdS Cd(OH)2
BC CC Band gap BV CV CdS
Figura 2. 3 Esquema geral de passivao de uma nanocristal de CdS por uma camada de Cd(OH)2.
No caso do CdS, deposita-se ao final da sntese dos NCs uma camada de hidrxido de cdmio (Cd(OH)2), cujo gap entre a banda de valncia e a banda de conduo maior do que o gap do CdS. Esta camada de passivao obtida simplesmente pela precipitao do Cd(OH)2, em meio bsico, sobre a superfcie dos NCs. Observa-se na literatura que outros semicondutores com gap maior do que o do CdS tambm podem ser utilizados no processo de passivao. Dentre os semicondutores utilizados em processos de passivao cita-se o sulfeto de zinco (ZnS) [13].
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2.3 Procedimentos experimentais:
2.3.1 - Metodologia de sntese do CdS e CdS/Cd(OH)2: O processo que se utilizou neste trabalho apenas uma adaptao do mtodo original desenvolvido por Weller e colaboradores [11]. Utilizou-se como precursores dos NCs o perclorato de cdmio (Cd(ClO4)2) e o gs sulfdrico (H2S); gua desionizada foi utilizada como fase dispersante; e o polifosfato de sdio ((NaPO3)n) foi utilizado como estabilizante da suspenso coloidal. Para a sntese do CdS/Cd(OH)2, preparou-se de uma soluo contendo 96 mL de gua desionizada, 2,5 mL de uma soluo 0,01M de Cd(ClO4)2 (Sigma-Aldrich) e 2,0 mL de uma soluo 0,0051g/mL de PP ([(NaPO3)n]) (Sigma-Aldrich), onde n=9 para o lote utilizado. O pH da soluo final foi ajustado, utilizando-se uma soluo 0,1M de NaOH, para o valor de 8,5, valor necessrio para que as NCs possuam uma luminescncia com o comprimento prximo de 500 nm aps a sua passivao. Aps o ajuste do pH, o sistema foi vedado com um septum de borracha. Finalmente, injetou-se na soluo, de forma rpida, 750L de H2S (White Martins, 98%), equivalente a 2,5x10-5 mols de S-2, com o auxlio de uma seringa especfica para gases. A proporo final entre os ons Cd+2 e S-2 foi de Cd/S=1. O balo foi ento agitado de forma vigorosa por 10 minutos, tempo no qual pode-se observar a mudana de colorao da soluo, de incolor para amarelo, evidenciando a formao do produto, CdS. Aps 24 horas da preparao da suspenso de NCs de CdS realizou-se a passivao da suspenso coloidal. Para isto, ajustou-se novamente o pH da suspenso com uma soluo 0,1M de NaOH, para o valor de 10,5, e adicionou-se lentamente 6 mL da soluo 0,01M de Cd(ClO4)2 (Figura 2.4). A adio lenta do Cd(ClO4)2 nesta etapa crucial para que se evite a formao de aglomerados de hidrxido de cdmio isolados que possam vir ocasionar a precipitao da suspenso.
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CdS/Cd(OH)2
Agitao
Figura 2. 4 Esquema geral do processo de sntese dos NCs de CdS em meio aquoso, incluindo a etapa de passivao.
2.3.2 Estudo da influncia da concentrao do polifosfato na sntese de NCs de CdS:
Alm da sntese de NCs luminescentes, buscou-se observar como a concentrao do estabilizante interfere na cintica de formao do colide, principalmente no que diz respeito ao tamanho dos NCs obtidos. Este interesse justifica-se nas observaes preliminares sobre o efeito do PP na sntese de NCs da CdS, realizados por Santos em sua tese de doutorado [12]. Para isso, preparou-se cinco amostras de CdS 1/1, como descrito na seo anterior, mas variando-se apenas a concentrao de PP ([(NaPO3)n]) em cada suspenso preparada, conforme a Tabela 2.1.
Tabela 2.1: Concentraes de [(NaPO3)n] utilizadas para a preparao de suspenses de NCs de CdS.
AMOSTRA
Volume de [(NaPO3)n] 0,0051 g/mL
Concentrao final de Fosfato (PO3-) 0,001M 0,0025M 0,0035M 0,0045M 0,0065M
1 2 3 4 5
2 mL 5 mL 7 mL 9 mL 13 mL
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2.3.3 Caracterizao espectroscpica e estrutural dos NCs de CdS e CdS/Cd(OH)2: Antes e aps a passivao realizou-se a caracterizao do processo de sntese por espectroscopia de absoro UV/Visvel, para a verificao da qualidade da suspenso coloidal, isto , para verificar-se a ausncia total de partculas ou contaminantes fora do regime coloidal, alm de confirmar se o tamanho das partculas recm sintetizadas encontravam-se no regime de confinamento quntico. Para isso, utilizou-se um espectrofotmetro de absoro da marca Perkin-Elmer modelo Lambda 6, com resoluo de 0,5 nm. A regio analisada foi entre 190 at 900 nm. Aps a passivao da suspenso, realizou-se a caracterizao espectroscpica (espectroscopia de emisso e excitao) das suspenses de CdS/Cd(OH)2 obtidas, utilizando-se para isso um espectrofluormetro ISS K2, com resoluo de 1,0 nm e lmpada de Xennio de 300 W como fonte de excitao. A caracterizao estrutural dos NCs foi realizada atravs da anlise por difrao de Raios-X de p (DRX) e por microscopia eletrnica de transmisso (MET) de amostras das suspenses obtidas. A anlise por DRX nos d informaes a respeito da cristalinidade do material obtido e sua estrutura cristalina. No presente estudo, as amostras para anlise por DRX foram preparadas atravs da desestabilizao parcial do colide, utilizando-se fraes de isopropanol absoluto, de tal forma que estas pudessem ser precipitas seletivamente por tamanho, atravs de centrifugao. Para isso, seguiu-se o seguinte procedimento: Coletou-se aproximadamente 40 mL de suspenso de CdS recm preparada e adicionou-se isopropanol absoluto, at o surgimento de uma leve turvao da suspenso; Para acelerar a desestabilizao do colide, manteve-se a suspenso turva sob refrigerao a 0C, por 6 horas; Em seguida, centrifugou-se a amostra a 4.500 rpm, durante 10 minutos; Desprezou-se o sobrenadante e lavou-se a fase slida com acetona; O precipitado, disperso na acetona, foi gotejado lentamente sobre um suporte de vidro, obtendo-se uma amostra representativa para a anlise por DRX.
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O equipamento utilizado para a obteno dos difratogramas foi um difratmetro Siemens Nixford D5000 digital (com biblioteca cristalogrfica), com radiao incidente K(Cu) = 1,542 . Para o clculo do tamanho mdio das partculas sintetizadas, a partir do difratograma de raio-x obtido, utilizou-se a frmula de Scherrer [12]:
0,9 = d B cos (2.2)

onde: d = dimetro mdio das nanocristais (em nm); = comprimento de onda utilizado pelo equipamento ( = 0,1542 nm); B = largura de linha a meia altura do pico de difrao de maior intensidade (em radianos) = ngulo de incidncia do feixe de raio-x no pico mais intenso no difratograma. O sistema cristalino do material obtido foi verificado com o auxlio do programa computacional Maud [16].
A microscopia eletrnica de transmisso foi utilizada para obter-se informaes a respeito do tamanho mdio e disperso de tamanho das partculas, assim como informaes sobre sua morfologia. A preparao das amostras para microscopia foi realizada segundo o seguinte protocolo: Diluio de uma pequena quantidade de amostra em gua ultrapura e sonicao por 3 minutos, com a finalidade de diminuir o nmero de possveis aglomerados de nanoestruturas; Deposio e secagem de uma gota da amostra diluda sobre uma pequena grade de cobre recoberta por um filme polimrico de parldio e por um filme fino de carbono, em torno de 5 nm;
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Para obteno das imagens utilizou-se um microscpio modelo Carl Zeiss CEM 908, com microssonda, operado com energia de 80kV. Foram coletadas imagens de campo claro (cc ou bright field). Este tipo de imagem obtido atravs da difrao de um feixe de eltrons pelos ncleos dos tomos contidos na amostra analisada. A difrao ocorre para todas as direes o que representa um processo de coliso elstica, servindo para os estudos sobre a morfologia do material analisado. A anlise da disperso de tamanho e morfologia dos NCs, foi realizada analizando-se as micrografias obtidas com o programa computacional Scion [16].
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2.4 Resultados e discusso:
2.4.1- Sistemas CdS e CdS/Cd(OH)2: 2.4.1.1 Caracterizao estrutural dos NCs de CdS e CdS/Cd(OH)2: A Figura 2.5 mostra o difratograma da suspenso de NCs de CdS/Cd(OH)2.
50
(111)
40
CdS/Cd(OH)2
Intensidade (u.a.)
30
(200)
20
(220)
(311)
10
0 20 30 40 50 60 70
2/Graus
Figura 2. 5 Difratograma de raio-x de p de uma amostra de NCs de CdS/Cd(OH)2.
Pode-se observar a presena de picos alargados no difratograma. Isto ocorre devido ao regime de tamanho nanomtrico das partculas analisadas. Partculas muito pequenas possuem poucos planos cristalinos que contribuem para interferir com os feixes de raios-x incidentes em suas superfcies, o que resulta no alargamento dos picos referentes a estes poucos planos detectveis. Utilizando-se a equao de Scherrer (Seo 2.3) estimou-se que os NCs analisados possuem um dimetro mdio de 8,5nm, o que demonstra que os cristais obtidos encontram-se em regime nanomtrico. Os picos mais intensos exibidos no difratograma representam o sistema cristalino cbico (blenda de zinco), em concordncia com trabalhos j relatados sobre NCs de CdS estabilizados com polifosfato [14]. Vale ressaltar que embora bastante comum, o sistema cbico no o nico sistema cristalino que pode estar presente em NCs de CdS. Dependendo do tipo de
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estabilizante utilizado, o sistema hexagonal (wurtzita) tambm pode ser observado em suspenses de NCs de CdS [14]. A Figura 2.6 mostra a micrografia de MET de uma amostra de NCs de CdS, exibindo tambm o histograma que representa a distribuio dos NCs em relao s suas dimenses (em nm).
Figura 2. 6 Micrografia de MET em campo claro de uma amostra de NCs de CdS (a barra de escala da micrografia equivale a 40nm) (a) . Histograma de distribuio de tamanho dos NCs na micrografia (b). Distribuio dos tamanhos segundo anlise Gaussiana (curva vermelha) e lognormal (curva em negrito).
De acordo com a distribuio lognormal realizada sobre o histograma da Figura 2.5, as NCs analisadas na micrografia tm um dimetro mdio de D = 7,8 1,8 nm. Este valor encontra-se de em concordncia com os resultados obtidos pelo DRX, assim como os resultados obtidos pelas anlises espectroscpicas (descritos logo abaixo). A disperso dos tamanhos possui um valor de 23,5%. A distribuio lognormal aplicada neste caso, pois leva em considerao as populaes de partculas existentes com grandes dimetros. Estas partculas, embora possam parecer estatisticamente desprezveis, podem influenciar consideravelmente no processo de crescimento dos NCs, segundo o modelo de envelhecimento de Ostwald.
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2.4.1.2 Caracterizao espectroscpica:
A Figura 2.7 mostra espectros de absoro e segunda derivada representativos dos sistemas CdS e CdS/Cd(OH)2, sintetizados segundo metodologia relatada na Seo 2.2.1.
1,0
CdS
1,0
CdS/Cd(OH)
Absorbncia (u.a.)
Absorbncia (u.a.)
Mximo de Absoro em 484 nm

0,5
0,5
0,0 300
400
500
0,0 300
400
500
Comprimento de Onda (nm)
Figura 2. 7 Espectros de Absoro com suas segundas derivadas (em vermelho), exibindo o primeiro mximo de absoro tanto para o CdS, quanto para o CdS/Cd(OH)2
Como pode ser visto, comparando-se os espectros, o processo de passivao no alterou o tamanho dos NCs de CdS, o que pode ser comprovado pelos valores dos primeiros mximos de absorbncia dos dois sistemas. O valor de 484 nm para o primeiro mximo de absorbncia indica que as NCs obtidas possuem o seu band gap com o valor de aproximadamente 2,55 eV. Este valor maior do que o band gap do semicondutor CdS em dimenses macroscpicas (bulk), cujo valor de 2,50 eV [17]. A diferena entre os gaps dos NCs e do bulk de apenas 0,05 eV, indicando que os NCs encontram-se em regime de confinamento quntico fraco [19]. Como tambm pode ser visto nos espectros na Figura 2.7, as bandas de absoro das amostras analisadas apresentam-se consideravelmente alargadas. Este alargamento deve-se principalmente distribuio de tamanho dos NCs obtidas pelo processo de sntese, cujo resultado so partculas com diferentes dimetros e conseqentemente, diferenas de alguns dcimos nos valores energticos do band gap entre si.
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A Figura 2.8 mostra os espectros de excitao e emisso de uma suspenso de NCs de CdS/Cd(OH)2, cujo tamanho mdio 8,5 nm.
1,1 1,0
CdS/Cd(OH)2
____ ____
Excitao Emisso
Intensidade Normalizada (u.a.)
0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 300
499 nm 358 nm 401,5 nm 466 nm
350
400
450
500
550
600
Figura 2. 8 Espectros de excitao e emisso de uma suspenso de NCs de CdS/Cd(OH)2.
Como pode ser observado no espectro acima, a emisso dos NCs sintetizados, apresenta um mximo em =499 nm, o que corresponde a emisso na regio visvel do espectro eletromagntico. Spanhel e colaboradores [11] reportaram o valor do pH inicial no processo de sntese dos NCs de CdS como fator determinante para o comprimento de onda de emisso de suspenses de CdS/Cd(OH)2. O valor de pH inicial igual a 8,5 que foi utilizado nos experimentos descritos, tende a resultar em suspenses de NCs com banda de emisso centralizada em torno de 500 nm. Valores altos de pH inicial (entre 8.8 e 9.2) tendem a produzir NCs cuja emisso tende para valores energticos maiores. Isto ocorre devido ao fato de que para valores de pH inicial altos, os NCs obtidos apresentam dimetro mdio menor (em torno de 4 nm [11]), o que significa que os mesmos encontram-se em regime de confinamento forte, deslocando suas emisses para regies de energia mais elevadas. Isto importante pois possibilita a aplicao desses NCs como marcadores biolgicos, como ser discutido nos Captulos 5 e 6, pois os ftons emitidos pelos cristais no possuem energia suficiente para gerar danos nos sistemas biolgicos estudados.
33
O espectro de excitao mostra uma banda estruturada com trs mximos que se estende de 300 480 nm. Pode-se inferir que cada mximo de excitao est correlacionado com uma banda de conduo dos NCs de CdS/Cd(OH)2. Cada uma atua no processo de recombinao excitnica, de forma equivalente, dos NCs, visto que o comprimento de onda referente a cada pico, corresponde ao mximo observado em = 499 nm. O que se sugere (Figura 2.9), observando-se o espectro de excitao da suspenso, que os NCs obtidos possuem uma estrutura de eletrnica formada por trs bandas de conduo, localizadas em 2,66; 3,08 e 3,46 eV. Assim, sugere-se que o processo de decaimento das transies excitnicas ocorre da seguinte forma: as bandas de maior energia possuem um decaimento no radiativo para a banda menos energtica, sendo esta a nica a possuir um decaimento radiativo para a banda de valncia, participando efetivamente no processo de fotoluminescncia.
300
Bandas de Conduo banda 1 banda 2 banda 3 h Emisso
Comp. de Onda (nm)
350
400
450
500 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1
Banda de Valncia
Figura 2. 9 Possvel mecanismo de decaimento radiativo dos NCs, corroborado pela presena das trs bandas existentes no respectivo espectro de excitao.
Em um experimento visando a averiguao da fotoestabilidade dos NCs sob excitao por longos perodos de tempo, visando futuras aplicaes biolgicas, uma suspenso recm preparada foi irradiada em =337nm continuamente durante uma hora. Observou-se que o mximo de emisso permaneceu constante, o que evidencia a fotoestabilidade dos NCs nessas condies.
34
2.4.2 Estudo da influncia da concentrao do polifosfato na sntese de NCs de CdS:
A Figura 2.10 mostra os espectros de absoro eletrnica de cinco suspenses de NCs de CdS obtidas com diferentes concentraes do estabilizante polifosfato.
0,20
2,0 mL PP 5,0 mL PP 7,0 mL PP 9,0 mL PP 13,0 mL PP
0,15
Absorbncia (u.a)
0,10
0,05
0,00 450 500 550
Figura 2. 10 Espectros de absoro eletrnica de suspenses de NCs de CdS obtidas com diferentes concentraes de polifosfato.
Como pode ser observado, h uma pequena variao entre as posies das bandas de absoro das suspenses obtidas com diferentes concentraes do PP. Estes deslocamentos podem estar correlacionados variao do tamanho mdio dos NCs sintetizados, ocasionada pelas taxas de nucleao dos sistemas que so modificadas pela maior ou menor presena do agente estabilizante. Este tipo de fenmeno, o qual um parmetro de sntese interfere diretamente no tamanho final dos NCs sintetizados, j foi relatado para o caso da variao do pH inicial das suspenses e da razo entre os ons formadores do semicondutor dos NCs [11] e para outro estabilizante como o 1tioglicerol [19]. Vale ressaltar que nos espectros acima, as amostras preparadas com 9,0 e 13,0 mL de soluo 0,0051g/mL de PP no apresentam deslocamento de suas bandas de absoro para regies de alta energia, mas sim um processo de alargamento da banda, sugerindo um aumento na disperso dos tamanhos dos NCs, o que pode erroneamente induzir a idia de que estas bandas esto se deslocando para regies mais energticas.
35
As Figuras 2.11 a 2.15 mostram as micrografias obtidas para suspenses com diferentes concentraes de PP.
[PP]=0,11 mM
Figura 2.11 - Micrografia de amostra de NCs de CdS, sintetizadas com 0,11mM da soluo de PP. (a barra de escala das micrografias equivale a 40nm).
36
[PP]=0,28 mM
Figura 2.12 - Micrografia de amostra de NCs de CdS, sintetizadas com 0,28 mM da soluo de PP. (a barra de escala das micrografias equivale a 40nm).
37
[PP]=0,39 mM
38
[PP]=0,50 mM
39
[PP]= 0,72 mM
Figura 2. 15 Micrografia de amostra de NCs de CdS, sintetizadas com 0,72 mM da soluo de PP. (a barra de escala das micrografias equivale a 40nm).
A Tabela 2.2 exibe o tamanho mdio e a disperso de tamanho dos NCs para as micrografias ilustradas nas Figuras 2.11 e 2.12.
Tabela 2.2 Dados relativos s micrografias exibidas nas Figuras 2.11 e 2.12.
Razo Cd/P 0,25 0,10 0,07 0,06 0,04
Dimetro(nm) 7,8 27,0 20,8 20,6 23,0
Disperso de tamanho (%) 23,50 43,83 38,94 36,47 37,83
Como pode ser visto pelos resultados ilustrados acima, o efeito da concentrao de PP na sntese dos NCs aparentemente no-linear, visto que as variaes dos
40
tamanhos mdios e de suas disperses no seguem um comportamento crescente ou decrescente, para os experimentos realizados. Porm, a importncia da participao do estabilizante PP na formao de uma suspenso de NCs com distribuio homognea de tamanhos, dentro das condies experimentais utilizadas, foi aqui comprovada. A seguinte explicao proposta para as observaes feitas sobre este experimento: H um equilbrio nas interaes entre as cadeias de PP e os ons Cd+2, antes da adio do H2S ao meio, exemplificado na Equao 2.1. No momento da adio do H2S no meio, este equilbrio sofre forte interferncia da presena dos on S-2, que comeam a competir com os polinions de PP pela interao com os ons Cd+2 (Equao 2.3).
Cdn PP + nS-2
nCdS + PP-2n
(2.3)
O equilbrio mostrado na equao acima mantm-se deslocado para a esquerda, quando h uma elevao na quantidade de PP presente. Isto ocorre, pois com uma maior quantidade de PP no meio, h um aumento na repulso eletrosttica entre as cadeias, resultando em uma expanso do sistema supramolecular formado entre as cadeias de PP interagindo com os ons Cd+2. Esta expanso resulta em uma maior barreira estrica e eletrosttica dificultando a complexao dos ons S-2 com os ons Cd+2, acarretando um aumento no tempo de nucleao. Isto leva formao lenta de centros de cristalizao dos NCs, aumentando a disperso final dos tamanhos das partculas formadas [20].
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2.5 Referncias:
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Captulo 3 Sntese e Caracterizao das suspenses coloidais de CdTe
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Captulo 3 Sntese e Caracterizao das suspenses coloidais de CdTe:
3.1 Introduo
Diferentemente dos nanocristais de CdS, descritos no Captulo 2, cujos primeiros estudos datam da dcada de 80 [1-3], a sntese de nanocristais de telureto de cdmio (CdTe) por via coloidal s comeou a ser reportada na literatura por volta da dcada de 90 [4,5,11]. Isto se deveu principalmente dificuldade de obteno de nanopartculas de CdTe com boa estabilidade coloidal e fotoluminescncia com intensidade aprecivel para fins de aplicaes. O principal fator que dificulta a preparao dos nanocristais de CdTe a obteno de fontes estveis de ons Te-2. Isto se deve reatividade do metal telrio ao oxignio da atmosfera o qual forma rapidamente seu respectivo xido TeO que, por sua vez, dificulta sua reduo forma Te-2. Assim, todas as rotas de obteno do on Te-2 utilizadas at hoje utilizam sistemas com atmosfera inerte [7-9], como forma de evitar a oxidao do on obtido. Alm disso, algumas dessas rotas utilizam precursores do on Te-2 perigosos, cujo manuseio incorreto pode levar a acidentes graves. Como exemplo, tem-se o sal Al2Te3 que quando posto para reagir com cido sulfrico produz o hidreto de telrio (H2Te), que pode ser ento borbulhado em uma soluo contendo o precursor metlico divalente (Cd+2, Zn+2, Pb+2, etc.) para a formao do semicondutor desejado [6]. Alm disso, uma das vias de sntese mais utilizadas atualmente baseia-se na obteno dos nanocristais luminescentes de CdTe em meio orgnico, utilizando os reagentes trioctilfosfina (TOP) e trioctilfosfinxido (TOPO) [10,11]. Estes reagentes so utilizados para a criao de ambientes micelares inversos para a formao dos nanocristais. Isto dificulta consideravelmente sua utilizao em aplicaes biolgicas, pois o meio aquoso diminui consideravelmente a estabilidade dos NCs obtidos em meio orgnico. Por fim, o fator crucial que dificulta a utilizao destes mtodos de sntese de NCs de CdTe por vrios laboratrios de pesquisa o alto custo envolvido para a aquisio dos reagentes utilizados no processo de sntese.
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Felizmente, novos processos de reduo de Te modificados de mtodos descritos na literatura [6-8,12] (Seo 3.2), possibilitaram a sntese coloidal de NCs de CdTe com alta luminescncia diretamente em meio aquoso, com um custo bem mais baixo do que os processos citados no pargrafo anterior. O processo mais utilizado neste caso o que utiliza o borohidreto de sdio (NaBH4) como agente redutor do Te0 e molculas contendo o grupo tiol, como o cido mercaptoactico, por exemplo, como agentes estabilizantes dos NCs sintetizados. Outra vantagem na obteno dos nanocristais de CdTe por estas vias a possibilidade de se aplicar o mtodo de precipitao seletiva, no somente separando populaes de nanopartculas com tamanhos mdios diferentes, mas tambm purificando os resduos e diminuindo a disperso de tamanhos. A menor disperso de tamanhos resulta em espectros de emisso com larguras de bandas mais estreitas [6].
3.1.1 Tiis: timos estabilizantes para meio aquoso.
A utilizao de pequenas molculas orgnicas contendo grupamentos SH vem sendo reportada crescentemente na literatura como timos estabilizantes para NCs de CdTe sintetizados em meio aquoso. Isto se deve a algumas propriedades interessantes dos tiis. O pKa dos grupamentos SH destas molculas, onde se incluem o cido mercaptoactico e o mercaptoetanol dentre tantas outras, encontra-se normalmente acima de 8,0 (Tabela 3.1), valor no qual o pH do meio tende a gerar NCs com dimetros pequenos e com baixa disperso de tamanho. Alm disso, os grupamentos resultantes da desprotonao das sulfidrilas possuem uma alta afinidade por ons como Cd+2 e Zn+2, formadores de semicondutores do tipo II-VI. Isto garante uma baixa dissociao da camada de estabilizante formada nas superfcies dos NCs.
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Tabela 3.1 pKa de alguns tiois utilizados como estabilizantes na sntese de NCs de semicondutores do tipo II-VI.
Estabilizante Mercaptoetilamina (HSCH2CH2NH2) (MEA) cido Mercaptoactico (HSCH2COOH) (AMA) cido 3-Mercaptopropinico (HSCH2CH2COOH) (AMP) 2-Mercaptoetanol (HSCH2CH2OH) (MOH)
a b
pKSH 8.27 10.05b 10.20b 9.43
Nosaka e colaboradores [13]. Zhang e colaboradores [8].
Alm disso, sabe-se que suspenses de NCs produzidas com um pequeno excesso de tiis, em condies alcalinas, produzem a hidrlise parcial destes grupamentos, resultando na incorporao dos tomos de enxofre na interface dos NCs com o meio. No caso de NCs de CdTe, por exemplo, esta hidrlise parcial capaz de contribuir significativamente no aumento da luminescncia dos cristais, visto que uma camada de CdS forma-se na superfcie dos NCs [12] e como o band gap do CdS maior do que o band gap do CdTe (EgCdS = 2,50 eV e EgCdTe = 1,47 eV [14]), este processo pode ser interpretado como uma passivao dos NCs.
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3.2 Procedimentos experimentais:
3.2.1 Reagentes utilizados:
Em todos os experimentos descritos nesta seo, utilizaram-se os seguintes reagentes:
Telrio metlico em p 99% (Across); cido mercaptoactico (AMA) 97% (Sigma/Aldrich); Borohidreto de sdio 98% (Sigma/Aldrich); Argnio (White Martins); Nitrognio (White Martins); gua ultra-pura deionizada.
3.2.2 Processos de reduo do telrio:
Para a sntese dos NCs luminescentes de CdTe (Equao 3.1), alguns processos de reduo do telrio metlico, em meio aquoso, foram testados para a obteno da fonte de Te-2:
+2
2 Cd 2Te0 + 4 NaBH 4 Na Te Te Na 2CdTe (3.1)
Isto se fez necessrio para a escolha, dentre os mtodos testados, daquele que renderia uma fonte de ons Te-2 de forma mais prtica e com maior rendimento. Vale ressaltar que vrias so as metodologias existentes para a reduo do telrio em meio orgnico. Entretanto, o enfoque deste trabalho reside na reduo em meio aquoso, como uma forma de simplificar o processo de sntese dos NCs de CdTe. As metodologias apresentadas a seguir so todas adaptaes de processos descritos na literatura [6-8,12]. Porm, cada processo sofreu pequenas modificaes na tentativa de um maior rendimento na obteno dos ons Te-2.
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3.2.2.1 - Mtodo de Reduo 1: Processo de reduo por congelamento (adaptado de Zhang e colaboradores [6]):
Em um balo de fundo redondo de 100 mL, adicionou-se aproximadamente 10 mL de gua, 0,0128 g (0,1 mmol) de Te0 em p e colocou-se o sistema sob agitao em banho de gelo. Quando a temperatura do sistema atingiu 4C adicionou-se o agente redutor borohidreto de sdio (NaBH4) (0,2 mmol). Manteve-se o sistema sob agitao e banho de gelo durante 30 minutos e, em seguida, congelou-se a mistura durante 24 horas. Aps o congelamento, manteve-se a mistura sob refrigerao a 4C para que este descongelasse de forma lenta. Toda a reao ocorreu em atmosfera ambiente. Aps o descongelamento total, pode-se observar uma soluo violeta formada, correspondendo ao composto ditelureto de sdio (Na-Te-Te-Na) [5].
3.2.2.2 Mtodo de Reduo 2: Processo de reduo por titulao de cido:
Em um balo de fundo redondo de 15mL, pesou-se 0,0032g (0,025 mmol) de Te0 em p. Em seguida, adicionou-se ao balo aproximadamente 0,01g (0,26 mmol) de NaBH4. Em seguida, adicionou-se cerca de 500L de uma soluo de NaOH 1M ao balo e homogeneizou-se a mistura. Por fim, gotejou-se na mistura, sob agitao, uma soluo de cido perclrico (HClO4) 0,1M, at resultar em uma soluo violeta, correspondendo formao do composto ditelureto de sdio.
3.2.2.3 Mtodo de Reduo 3: Processo de reduo por aquecimento[5]:
Em um balo de fundo redondo de 100mL, adicionou-se aproximadamente 5mL de gua, 0,0128g (0,1 mmol) de Te0 em p e colocou-se o sistema sob agitao e aquecimento. Vedou-se o balo com a ajuda de um septum de borracha. Todo o processo foi realizado sob atmosfera inerte, utilizando-se fluxo de Argnio. Quando a temperatura do sistema alcanou o valor de 80C, adicionou-se ao balo, com a ajuda de uma seringa, o agente redutor NaBH4 (0,2 mmol) recm dissolvido em aproximadamente 2mL de gua. Aps uma hora de agitao e ainda sob aquecimento a
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80C, pode-se observar a formao de uma soluo violeta, correspondendo ao composto ditelureto de sdio.
3.2.2.4 Mtodo de Reduo 4: Processo de reduo por aquecimento, em meio alcalino e fotoassistida (adaptao do Mtodo de Reduo 3):
Em um balo de fundo redondo de 100mL, adicionou-se aproximadamente 5mL de gua, 0,0064g (0,05 mmol) de Te0 em p, 350L de uma soluo 2M de NaOH. Vedou-se o balo com a ajuda de um septum de borracha. Todo o processo foi realizado sob atmosfera inerte, utilizando-se um fluxo de Nitrognio. Colocou-se o sistema sob agitao e aquecimento. Quando a temperatura do sistema alcanou o valor de 80C, manteve-se o sistema a esta temperatura por 20 minutos. Em seguida, ainda sob aquecimento, adicionou-se ao balo, com a ajuda de uma seringa, o agente redutor NaBH4 (0,1 mmol) dissolvido em aproximadamente 2mL de gua. Neste momento, irradiou-se o sistema com uma lmpada de tungstnio de 100 Watts e manteve-se a irradiao durante o restante do processo. Uma hora aps a adio do agente redutor, observou-se a formao de uma soluo violeta escura, correspondente formao do composto ditelureto de sdio (Figura 3.1).
Figura 3.1- Colorao do composto Na-TeTe-Na(aq), formado pela reduo do Te0.
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3.3 Sntese de NCs de CdTe:
Como ser abordado na Seo 3.3.1, todos os mtodos de reduo do telrio tiveram xito. Entretanto, apenas os mtodos 3 e 4 resultaram em um rendimento capaz de prover reprodutibilidade nas snteses dos NCs de CdTe. Para estes mtodos, descreve-se a seguir as metodologias de sntese de NCs utilizadas.
3.3.1 Mtodo de Sntese 1.
Esta metodologia utiliza o mtodo 3 de reduo do telrio (Seo 3.2.2.3). Em um balo de fundo redondo de 100mL, adicionou-se 0,2 mmol de Cd(ClO4)2 (20 mL de uma soluo 0,01 M de Cd(ClO4)2). Em seguida, adicionou-se 20 mL de gua e 1,2 mL de uma soluo 4,9 % de AMA. Neste momento a soluo tornou-se turva, devido insolubilidade parcial do complexo formado entre o Cd+2 e o AMA. Elevou-se o pH da mistura at o valor de 11,5, tornando-se a soluo lmpida novamente e completou-se o volume da soluo para 80mL. Esta soluo injetada no balo no qual reduziu-se o telrio metlico, com o auxlio de uma seringa. Exatamente aps a injeo da soluo de Cd+2-AMA no balo contendo Te-2, pode-se observar uma mudana de colorao da soluo no balo, para um tom castanho, indicando a formao dos NCs de CdTe (Figura 3.2). Manteve-se o sistema ainda sob agitao por aproximadamente 20 minutos, antes da retirada do septum deste. A razo final Cd/Te foi de 2/1.
3.3.2 Mtodo de Sntese 2.
Esta metodologia utiliza o mtodo 4 de reduo do telrio (Seo 3.2.2.4). Em um balo de fundo redondo de 100mL, adicionou-se 0,2 mmol de Cd(ClO4)2 (20 mL de uma soluo 0,01 M de Cd(ClO4)2). Em seguida, adicionou-se 20 mL de gua e 1,5 mL de uma soluo 4,9 % de AMA. Neste momento a soluo tornou-se turva, devido insolubilidade parcial do complexo Cd+2-AMA formado. Elevou-se o pH da mistura at o valor de 10,5, tornando-se a soluo lmpida novamente. Esta soluo injetada no balo no qual reduziu-se o telrio metlico, com o auxlio de uma seringa. Exatamente aps a injeo da soluo de Cd+2-AMA no balo contendo Te-2, pode-se observar uma mudana de colorao da soluo no balo, para um tom
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castanho, indicando a formao dos NCs de CdTe (Figura 3.2). Manteve-se o sistema ainda sob agitao por aproximadamente 20 minutos, antes da retirada do septum. A razo final Cd/Te foi de 4/1.
Figura 3.2 Suspenso de NCs de CdTe recm preparada, apresentando colorao castanha caracterstica do semicondutor.
3.4 Estudo do efeito da concentrao de NCs nas propriedades espectroscpicas das suspenses obtidas:
Como ser melhor discutido na Seo 3.5.4, observou-se que a concentrao de NCs numa suspenso coloidal pode interferir consideravelmente no rendimento de sua fotoluminescncia. Para a avaliao desta inferncia, realizou-se a evoluo espectroscpica (emisso e excitao eletrnica) de uma suspenso de NCs de CdTe obtida pelo Mtodo 2 para diferentes concentraes. Preparou-se suspenses de NCs, a partir da suspenso original, seguindo os fatores de diluio: 1/2, 1/4 1/8, 1/16, 1/32 e 1/64. Em seguida, realizou-se a caracterizao espectroscpica de cada suspenso preparada, quanto as suas bandas de emisso e excitao eletrnica, e comparou-se os resultados obtidos com os dados referentes suspenso original.
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3.5 Precipitao seletiva das suspenses de NCs preparadas.
Com o intuito de se isolar populaes de NCs com uma distribuio de tamanhos homognea, realizou-se o processo de precipitao seletiva [6,15] dos NCs nas suspenses recm preparadas. Neste processo utiliza-se um no solvente, neste estudo o isopropanol [6], para desestabilizar parcialmente a suspenso coloidal de NCs,
permitindo que NCs com tamanhos mdios prximos sejam separados dos demais a partir de centrifugao da suspenso. Em seguida, as partculas precipitadas podem ser resuspensas em gua, resultando em uma suspenso de NCs com disperso de tamanho reduzida. O procedimento empregado neste processo foi o seguinte: Coletou-se 20 mL de uma suspenso de NCs luminescentes de CdTe recm preparada; Gotejou-se, sob agitao constante, isopropanol at a turvao da suspenso; Em seguida, centrifugou-se a suspenso, a 3500 rpm por 10 minutos; Retirou-se o sobrenadante e suspendeu-se o precipitado em 10 mL de gua; Repetiu-se este procedimento at que nenhum precipitado fosse mais formado
aps centrifugao.
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3.6 Caracterizao espectroscpica e estrutural dos NCs de CdTe:
As descries das tcnicas de caracterizao, assim como as especificaes dos equipamentos utilizados para as caracterizaes dos NCs sintetizados so as mesmas descritas na Seo 2.3.3 do Captulo 2. Sucintamente, realizou-se a caracterizao espectroscpica atravs de
espectroscopia de absoro UV/Visvel, para a verificao da qualidade da suspenso coloidal, assim como espectroscopia de emisso e excitao das suspenses de CdTe obtidas, para a verificao das propriedades pticas dos sistemas. Realizaram-se tambm caracterizaes estruturais, por meio de DRX de p obtido por precipitao seletiva dos NCs e microscopia eletrnica de transmisso (MET) de amostras das suspenses obtidas.
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3.7.1 Processos de reduo do telrio: Os resultados obtidos nos diferentes processos de reduo do Te0 mostraram que todas as metodologias foram capazes de gerar ons Te-2 a partir da utilizao do borohidreto de sdio como agente redutor. Entretanto, apenas os Mtodos de Reduo 3 e 4 mostraram-se capazes de reduzir o telrio metlico com um rendimento capaz de gerar reprodutibilidade na sntese dos NCs de CdTe. Os Mtodos de Reduo 1 e 2 resultaram na produo de uma grande quantidade de resduo do agente redutor, que se agregava com a parte do telrio ainda no reduzido, diminuindo o rendimento da produo de Te-2 e impedindo uma boa reprodutibilidade na sntese de NCs de CdTe. Utilizou-se o meio alcalino para a reduo do Te0 no Mtodo de Reduo 4 como um recurso para tornar o meio aprtico, aumentando a atividade do NaBH4 no processo de reduo do metal. Por fim, observando-se os resultados das tentativas de reduo do telrio no decorrer deste trabalho, constatou-se que as redues realizadas na presena de luz ocorreram mais rapidamente e com um rendimento maior do que as redues realizadas sob iluminao fraca. Esta observao, de que a luz catalisa de alguma forma o processo de reduo, foi o que induziu a introduo da irradiao direta de luz durante o processo de reduo, com a finalidade de melhorar o processo.
3.7.2 Sntese de NCs de CdTe :
O Mtodo 1 de sntese, embora satisfatrio, ainda produziu uma pequena quantidade de resduo da sntese, o que pode corresponder a parte do telrio metlico que tenha se associado aos resduos do agente redutor, precipitando como um aglomerado escuro no fundo do balo. Por outro lado, o Mtodo 2 de sntese no exibiu nenhum resduo visvel, indicando fortemente que o rendimento da sntese de NCs foi maior do o obtido pelo Mtodo 1. Os mtodos de sntese de NCs utilizados neste trabalho resultaram em suspenses estveis, com uma fotoluminescncia conservada por um tempo superior a 6 meses, quando armazenadas sob refrigerao na ausncia de luz.
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Observou-se que nos dois mtodos empregados, a colorao das suspenses obtidas variou com o tempo quando os sistemas foram mantidos sob aquecimento. As suspenses se apresentaram inicialmente com colorao castanho escuro, que se tornou mais claro com o decorrer do aquecimento. Paralelamente, foi observado que a fotoluminescncia das suspenses s comeou a ser detectada aps um certo intervalo de tempo (superior a quinze minutos) do aquecimento dos sistemas. Sugere-se que estes fenmenos devem estar correlacionados ao processo de hidrlise parcial dos grupos tiis das molculas de AMA utilizadas como estabilizantes dos NCs. Com o pH alcalino das suspenses preparadas combinado com o aquecimento destas, parte das molculas de AMA sofrem hidrlise, permitindo que o tomo de enxofre desprendido durante este processo reaja com ons Cd+2 presentes na superfcie dos NCs, formando uma fina camada de CdS sobre estes. Esta camada atua passivando-os e permitindo que exibam uma fotoluminescncia detectvel. Esta justificativa corroborada por observaes prvias descritas na literatura [6,15] para sistemas de NCs de CdTe obtidos por mtodos de sntese semelhantes. Com isto, tem-se um forte indcio de que os NCs obtidos so de natureza heterognea, sendo compostos de um ncleo de CdTe e uma casca de CdS.
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3.7.3 - Caracterizao estrutural dos NCs de CdTe:
A Figura 3.3 mostra um difratograma representativo de NCs de CdTe obtidas pelo Mtodo 2 de sntese (Seo 3.3.2).
40
CdTe
(111) Intensidade (u.a.)

30
(200) (220)
20
(311)
10
0 20 30 40 50 60 70 80
Figura 3.3 - Difratograma de raio-x de p de uma amostra de NCs de CdTe.
A anlise do difratograma acima revelou que o dimetro mdio dos NCs obtidos d=3,8 nm, a partir de clculo utilizando a equao de Scherrer (ver Seo 2.3 do Captulo 2), o que se encontra em boa concordncia com dados da literatura [9]. O sistema cristalino dos NCs o cbico (blenda de zinco), exibido pelos picos mais intensos do difratograma. Este dado tambm se encontra em concordncia com a literatura [9,15]. Por fim, observa-se que o difratograma obtido no apresenta picos detectveis correspondendo presena de CdS, o que sugere que este semicondutor se apresenta em pequena quantidade nos NCs de CdTe. Na Figura 3.4 pode-se observar uma micrografia de MET de campo claro de uma amostra de NCs de CdTe/CdS. Embora no se tenha uma boa resoluo dos NCs presentes na micrografia de campo claro, a micrografia de campo escuro (Figura 3.5) revela a presena de inmeras estruturas com planos cristalinos. Tendo em vista o tamanho mdio de 3,8 nm dos NCs, calculado atravs do difratograma de raio-X, acredita-se que as pequenas estruturas cristalinas observadas sejam os NCs de
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CdTe/CdS preparados. A resoluo obtida nas micrografias no permitiu as medidas de tamanho mdio dos NCs observados, assim como a disperso destes NCs.
Figura 3.4 Micrografia de MET em campo claro de uma amostra de NCs de CdTe/CdS. A barra de escala equivale a 40 nm.
56
Figura 3.5 Micrografia de MET em campo escuro, referente a Figura 3.4. A barra de escala equivale a 40 nm.
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3.7.4 - Caracterizao espectroscpica:
A Figura 3.6 exibe os espectros de absorbncia, com suas respectivas segundas derivadas, obtidos pelas metodologias de sntese descritas na Seo 3.3.
0,50
CdTe/CdS
1,50
CdTe/CdS
1,25
Absorbncia (u.a.)

0,25
Absorbncia (u.a.)
1,00
0,75
0,50
0,25
0,00 400
450
500
550
600
650
0,00 400
450
500
550
600
650
Figura 3.6 Espectros de Absoro eletrnica de suspenses de NCs de CdTe obtidas pelo Mtodo 1 (a) e Mtodo 2 (b) de sntese de NCs.
Como se pode observar nos espectros acima, as suspenses de NCs de CdTe obtidas pelas metodologias de sntese empregadas evidenciam a primeira banda de absoro praticamente na mesma regio espectral, com os mximos das bandas diferindo em apenas 3 nm. Os valores dos band gaps dos NCs relativos aos espectros acima so: Eg = 2,36 eV para os NCs relativos ao Mtodo 1 de sntese e Eg = 2,38 para os NCs relativos ao Mtodo 2 de sntese. Pode-se correlacionar os band gaps obtidos com os tamanhos mdios dos NCs. Neste caso, os dados obtidos pela espectroscopia de absoro eletrnica indicam fortemente que os mtodos de sntese empregados, com as condies inicias descritas, produziram NCs com tamanhos mdios muito prximos entre si. Entretanto, observa-se claramente uma diferena nas magnitudes das absorbncias das amostras analisadas na Figura 3.5. Uma explicao plausvel para este fato que o Mtodo 2 de sntese foi capaz de produzir uma maior quantidade de NCs do que o Mtodo 1. Este fato corroborado pelas observaes feitas na Seo 3.7.2.
A Figura 3.7 exibe os espectros de emisso e excitao das suspenses de NCs obtidas pelos mtodos de sntese descritos. Os espectros de emisso referem-se a uma excitao em 337 nm.
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a
1,0
CdTe/CdS Mximo em 531 nm

1,0
b
0,8
CdTe/CdS Mximo em 555 nm
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0,0 300
350
400
450
500
550
600
650
0,0 300
350
400
450
500
550
600
650
Figura 3.7 - Espectros de emisso e excitao (vermelho) eletrnica de suspenses de NCs de CdTe obtidas pelo Mtodo 1 (a) e Mtodo 2 (b) de sntese de NCs.
Os mximos de emisso das bandas exibidas nos espectros acima indicam que os NCs devem possuir tamanhos mdios levemente diferentes entre si, o que justifica os mximos de emisses diferentes. Alm disso, pode-se verificar nos espectros que, embora os NCs obtidos pelo Mtodo 1 de sntese possuam um band gap menor do que os NCs obtidos pelo Mtodo 2 (valores calculados a partir dos espectros de absoro eletrnica), estes apresentam uma banda de emisso em regio de maior energia do que a outra suspenso analisada. Uma provvel explicao para este fato que os NCs obtidos pelo Mtodo 2 de sntese possuem mais defeitos em sua estrutura cristalina, fazendo com que parte da energia liberada pela recombinao excitnica destes NCs seja dissipada nestes defeitos e a energia restante seja finalmente liberada na forma de ftons de menor energia. Os espectros exibidos na Figura 3.7 mostram ainda que os espectros de excitao das duas amostras diferem claramente entre si, embora se tratem apenas de NCs com absorbncias e emisses levemente diferentes. Como j dito anteriormente, supe-se que o Mtodo 2 de sntese produziu uma concentrao maior de NCs do que o Mtodo 1. Suspeitando-se da presena de algum tipo de interao entre os NCs, capaz de alterar os processos envolvidos na absoro e posterior emisso de ftons, prosseguiu-se com a avaliao das mudanas espectrais da suspenso obtida pelo Mtodo 2.
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3.7.5 - Estudo do efeito da concentrao de NCs nas propriedades espectroscpicas das suspenses obtidas:
A Figuras 3.8 e 3.9 exibem a evoluo dos espectros de emisso e excitao eletrnica, respectivamente, com a diluio da suspenso de NCs.
1, 0 0,8 0, 6 0, 4
0 45 0 50
Intensida de Norma lizada
0,2 0,0
Figura 3.8 Espectros de emisso referentes diferentes diluies feitas em uma suspenso de NCs de CdTe obtidas pelo Mtodo 2 de sntese.
to en im pr m Co
0 55 0 60 0 65
DI LU DI I LU DI O I LU DI O 1/ I 64 LU O DI 1/ I 32 LU O 1/ DI I 16 LU O 1/ SU I 8 SP 1/ O 4 .O 1/ RI 2 G IN AL
de
a nd O ) m (n
60
1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 300 350 Com 400 prim ento de O nda
SUSP. ORIGINAL DILUIO 1/2 DILUIO 1/4 DILUIO 1/8 DILUIO 1/16 DILUIO 1/32 DILUIO 1/64
450
(nm )
Figura 3.9 Espectros de excitao das diferentes diluies feitas em uma suspenso de NCs de CdTe obtidas pelo Mtodo 2 de sntese.
Como se pode observar, no h uma correlao linear entre as diluies realizadas e os respectivos espectros de emisso e excitao obtidos. Observa-se que a emisso inicialmente aumenta consideravelmente com o aumento das diluies, decrescendo aps as diluies preparadas segundo os fatores 1/16, 1/32 e 1/64. As intensidades obtidas nos espectros de excitao aparentemente obedeceram a uma seqncia decrescente de valores, com o aumento das diluies. Entretanto, as intensidades relativas dos mximos locais de excitao da amostra com concentrao original mostraram-se diferentes dos mximos de excitao das amostras diludas. Estas observaes corroboram ainda mais com a proposio de que h um ntido fenmeno que correlaciona as propriedades espectroscpicas das suspenses de NCs de CdTe obtidas, com as suas elevadas concentraes de NCs. Uma explicao plausvel para as observaes feitas acima que h um efeito de auto supresso da luminescncia dos NCs, devido a alta concentrao destes na suspenso original. Para uma elucidao completa, um estudo espectroscpico mais aprofundado se faz necessrio. A no linearidade observada para o comportamento da fotoluminescncia pode ser o resultado de um somatrio deste processo dependente da concentrao da amostra, somado a outras propriedades do sistema, como o ndice de refrao.
Intensidade N ormalizada
61
3.7.6 - Precipitao seletiva das suspenses de NCs preparadas
A Figura 3.10 exibe os espectros de emisso de uma suspenso de NCs de CdTe e das fraes de NCs obtidas pelo processo de precipitao seletiva.
Suspenso Original 1 Frao 2 Frao

1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0 400 450 500 550 600 650
Figura 3.10 Espectros de emisso de uma suspenso de NCs de CdTe e das fraes de NCs obtidas pelo processo de precipitao seletiva.
Como se pode observar na Figura 3.10, o processo de precipitao seletiva separou duas populaes de NCs que, pela posio dos mximos das respectivas bandas de emisso, tratam-se de partculas com tamanhos mdios levemente diferentes. Alm disso, observa-se que a emisso da suspenso original situa-se em uma regio entre as bandas de emisso das fraes obtidas, o que indica que a emisso da amostra original deve tratar-se da combinao das emisses das fraes obtidas. Estes resultados encontram-se em concordncia com experimentos semelhantes j descritos na literatura [6,15].
62
3.8 Referncias:
1. Henglein, A. J. Phys. Chem. 86 (1982) 2291. 2. Alfassi, Z., Bahnemann, D., Henglein, A. J. Phys. Chem. 86 (1982) 4656. 3. Rossetti, R., Brus. L. J. Phys. Chem. 86 (1982) 4470. 4. Rogach, A. L., Katsokas, L., Kornowski, A., Su, D., Weller, H. Ber. Bunsenges. Phys. Chem. 100 (1996) 1772. 5. Kapitonov, A. M., Stupak, A. P., Gaponenko, S. V., Petrov, E. P., Rogach, A. L., Eychmller, A. J. Phys. Chem. B. 103 (1999) 10109. 6. Gaponik, N., Talapin, D. V., Rogach, A. L., Hoppe, K., Shevchenko, E. V., Kornowski, A., Eychmller, A., Weller, H. J. Phys. Chem. B. 106 (2002) 7177. 7. Goodman, M. M., Jr., F. F. K. Organometallics, 2 (1983) 1106. 8. Zhang, H., Zhou, Z., Yang, B., Gao, M. J. Phys. Chem. B. 107 (2003) 8. 9. Talapin, D. V., Haubold, S., Rogach, A. L., Kornowski, A., Haase, M., Weller, H. J. Phys. Chem. B. 105 (2001) 2260. 10. Boyle, T. J., Bunge, S. D., Alam, T. M., Holland, G. P., Headley, T. J., Avilucea, G. Inorg. Chem. 44 (2005) 1309. 11. Murray, C. B., Norris, D. J., Bawendi, M.G. J. Am. Chem. Soc. 115 (1993) 8706. 12. Zhang, H., Yang, B. Thin Solid Films. 418 (2002) 169. 13. Nosaka, Y., Ohta, N., Fukuyama, T., Fujii, N. J. Colloid Interface Sci. 155 (1993) 23. 14. http:// www.semiconductors.co.uk. Acessado em 10/06/06. 15. Rogach, A. L. Mater. Sci. Eng. B. 69-70 (2000) 435. 16. Talapin, D. V. Tese de Doutorado. Hamburg, University of Hamburg, 2002.
Captulo 4 Funcionalizao de nanopartculas de CdS/Cd(OH)2 para aplicaes em marcao biolgica
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Captulo 4 Funcionalizao de nanocristais de CdS/Cd(OH)2 para aplicaes em marcao biolgica:
4.1 - Introduo
Como j brevemente descrito no Captulo 1, uma das reas mais promissoras para aplicao de NCs luminescentes de semicondutores a biotecnologia [1], como marcadores fluorescentes de sistemas biolgicos [2-6], com o intuito de se estudar os processos bioqumicos produzidos por esses sistemas. Estes processos biolgicos podem ser monitorados, por exemplo, mediante anlise da luminescncia dos NCs acopladas a diferentes componentes biolgicos (protenas citoplasmticas, cadeias de DNA ou RNA, etc.) do sistema, assim como pela anlise das modificaes espectrais dos NCs, em diferentes condies biolgicas [6-8]. Estes estudos vem sendo cada vez mais desenvolvidos, devido a suas respostas rpidas, muitas em tempo real, sobre os processos bioqumicos monitorados, principalmente in vitro, em sistemas vivos de interesse biotecnolgicos, na rea de diagnsticos clnicos [9] e no desenvolvimento de novas teraputicas. Como definido por Medintz e colaboradores [6] estruturas hbridas inorgnicasbiolgicas so produzidas mediante conjugao de nanoestruturas, como nanopartculas, por exemplo, a biomolculas de interesse como DNA, protenas, etc. O material resultante destas conjugaes possui propriedades de ambos os elementos formadores: propriedades espectroscpicas das nanoestruturas e funcionalidades biolgicas das biomolculas. Estas estruturas hbridas podem ento ser utilizadas para o monitoramento de sistemas biolgicos, focando-se processos especficos que possam interagir com as biomolculas dos hbridos. O ponto chave para o sucesso na obteno destas estruturas hbridas o processo de associao destas estruturas inorgnicas com as biomolculas. Este o foco de estudo do que se chamamos de funcionalizao. D-se o nome de funcionalizao [6] modificao qumica da superfcie dos NCs com o intuito de acopl-las a sistemas biolgicos e/ou torn-las mais biocompatveis, isto , capazes de serem inseridas nos sistemas biolgicos causandolhes o mnimo de alteraes fisiolgicas.
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O processo de funcionalizao normalmente realizado empregando-se pequenas molculas orgnicas, os funcionalizantes, capazes de formar ligaes qumicas com a superfcie dos NCs, introduzindo-lhes novos grupos funcionais superficiais, que podem ento se complexar com diferentes componentes biolgicos (Figura 4.1). Entretanto, podemos ainda utilizar molculas mais complexas para a funcionalizao dos NCs, como o caso de pequenos peptdeos at protenas como a albumina ou imunoglobulinas. Vale ressaltar que tais funcionalizantes devem ser escolhidos de tal forma que no sejam capazes de suprimir a luminescncia dos NCs e que no destruam a estabilidade coloidal dos NCs.
Funcionalizante Camada de Passivao
NC
Biomolcula
Figura 4.1 Esquema geral da conjugao de NC a uma biomolcula por intermdio de uma molcula funcionalizante.
O processo de funcionalizao pode ser dividido em funcionalizaes simples, onde utiliza-se apenas um tipo de agente funcionalizante para a modificao da superfcie dos NCs, ou funcionalizaes complexas, onde utilizamos mais de um tipo de agente funcionalizante, sendo neste caso o processo realizado em pelo menos duas etapas. No primeiro caso geramos NCs com pouca especificidade de acoplamento com estruturas biolgicas, isto , os grupamentos funcionais inseridos na superfcie dos NCs podem se complexar com outros grupamentos funcionais presentes em mais de um tipo de biomolculas. Este o caso do agente funcionalizante glutaraldedo [11-13] (Seo 4.2). Outro funcionalizante bastante eficiente para esse caso o cido mercaptoactico, j descrito no Captulo 3 como estabilizante de NCs de CdTe, que pode reagir com ons Cd+2 na superfcie dos NCs, tanto de CdS/Cd(OH)2 quanto de CdTe, atravs do seu grupamento tiol e introduzindo o grupamento carboxilato na superfcie dos NCs. O
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grupamento carboxilato introduzido pode reagir com aminas primrias resultando em uma amida relativamente estvel. No segundo caso, como exemplo de funcionalizao complexa, temos a associao dos NCs com imunoglobulinas. Imunoglobulinas so protenas
especializadas produzidas pelo sistema imunolgico de mamferos, capazes de reconhecer e combater agentes patgenos ao organismo. Por fim, deve-se salientar que os agentes funcionalizantes, simples ou complexos, devem interferir o mnimo possvel nas propriedades espectroscpicas dos NCs, isto , a luminescncia deve sofrer o mnimo de interferncia, de tal forma a manter uma luminescncia residual detectvel, quando os NCs forem inseridos nos sistemas biolgicos. Alm disso, nas funcionalizaes complexas envolvendo biomolculas, deve-se ter em mente que as funes biolgicas das biomolculas no devem ser alteradas completamente pelo processo de funcionalizao, pois isto aniquilaria a especificidade que se procura com este tipo de tratamento. O conceito de funo biolgica utilizado neste caso diz respeito ao modo como as biomolculas interagem com os sistemas biolgicos. A conformao de uma enzima, por exemplo, o que determina a sua funo como catalisadora de uma certa reao bioqumica. Caso esta conformao, chamada de conformao ativa, seja alterada por alguma modificao qumica feita na molcula, a enzima fatalmente pode perder a sua funcionalidade quanto a sua atividade cataltica.
4.2 Glutaraldedo: um bom funcionalizante?
O glutaraldedo uma molcula bidentada com dois grupamentos aldedo em suas extremidades [11] (Figura 4.2). um excelente agente fixador de estruturas celulares sendo, por isso, largamente utilizado na preparao convencional de tecidos para anlises por microscopia.
Figura 4.2 Estrutura geral do glutaraldedo
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A sua ao fixadora, superior ao do formaldedo, por exemplo, deve-se a sua capacidade de gerar ligaes cruzadas entre estruturas proticas celulares, preservando a conformao da clula aps sua fixao [11,13]. Este tipo de grupamento, presente tanto na forma monomrica quanto na forma polimrica do glutaraldedo, pode se ligar a aminas primrias presentes em diferentes biomolculas, como protenas dos mais diversos tipos (Figura 4.3), assim como em outras estruturas como os cidos nuclicos. A reao entre o grupamento aldedo e uma amina primria gera uma estrutura lbil conhecida como base de Schiff, que aps reduo por borohidreto de sdio, por exemplo, resulta em uma amina secundria estvel [11,13]. Aps a ligao com os grupamentos NH2 de aminocidos formadores das protenas, o glutaraldedo insolubiliza estas estruturas, podendo estas sofrer processos de colorao histoqumica sem que percam muita definio de sua conformao.
P R O T E N A
Poli(glutaraldedo)
Qualquer grupo amino
Protenas ancoradas
P R O T E N A
P R O T E N A
Figura 4.3 Ligao entre grupamentos amino de protenas com os grupamentos aldedo da forma polimrico do glutaraldedo. Adaptado de [11].
Tambm j conhecida a capacidade do glutaraldedo de se polimerizar, gerando o poliglutaraldedo, em meio alcalino (Figura 4.4). Isto de grande importncia para aplicaes nas quais se deseja imobilizar estruturas biolgicas em suportes slidos, para aplicaes como cromatografias por afinidade, ou para aplicaes na rea de imuno histoqumica [13].
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Glutaraldedo
Meio Alcalino
Poli(glutaraldedo)
Figura 4.4 Esquema geral da polimerizao do glutaraldedo em meio alcalino. Adaptado de [11].
Estas propriedades podem ser combinadas na produo de hbridos inorgnicobiolgicos para estudos de sistemas biolgicos. Sabendo-se da capacidade de conjugao do glutaraldedo a protenas e outras estruturas que possuam grupamentos amino, o glutaraldedo pode ser ento utilizado como agente funcionalizante inespecfico, permitindo a ligao de NCs, por exemplo, a qualquer estrutura protica; ou como agente intercalante entre NCs e biomolculas capazes de se ligar especificamente a certas estruturas biolgicas. Para este tipo de finalidade, o glutaraldedo deve ser utilizado em concentraes abaixo de 1% [11], para evitar que algum excesso de glutaraldedo venha a interferir nos experimentos, fazendo ligaes indesejveis, ou inativando as biomolculas. Neste trabalho utilizou-se o glutaraldedo como funcionalizante dos NCs de CdS/Cd(OH)2, para marcaes biolgicas inespecficas, assim como intermedirio para a funcionalizao dos NCs com biomolculas para marcaes especficas, como anticorpo contra hemcias tipo A e lectina do tipo Concanavalina-A. 4.3 Anticorpos e Lectinas: biomolculas direcionadoras. Dentre as biomolculas de escolha para a obteno de sistemas hbridos para marcao biolgica, os anticorpos so as molculas preferidas dentre a maioria dos pesquisadores [4,9,13-14,20]. Anticorpos so molculas responsveis pelo
reconhecimento de corpos estranhos, antgenos, no organismo de mamferos. So constitudos de pores bsicas: uma poro constituda de duas cadeias polipeptdicas curtas, chamadas de cadeias leves (L); e por outra poro constituda por duas cadeias longas de polipeptdios chamadas de cadeias pesadas (H). As cadeias L se ligam s cadeias H por pontes dissulfeto, assim como as cadeias H se ligam entre si por este
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mesmo tipo de ligao [15]. Como ilustrado na Figura 4.5, os anticorpos podem ser divididos em suas estruturas funcionais: a poro chamada Fab, responsvel pela ligao efetiva com os antgenos e, tambm a poro que possui uma elevada variabilidade de composio peptdica, o que confere uma especificidade inigualvel no reconhecimento antignico; e a outra poro, chamada Fc, que possui uma menor variabilidade peptdica e que responsvel pelas diferentes finalidades biolgicas dos anticorpos [15].
Fragmentos Fab
Fragmento Fc
Figura 4.5 Estruturas funcionais de um anticorpo
Alguns tipos de anticorpos so produzidos para o reconhecimento de antgenos especficos e esta peculiaridade que fez com que estas biomolculas possibilitassem um grande avano nas reas de imunologia e biologia celular. Atualmente, h indstrias especializadas na produo sob encomenda de anticorpos monoclonais para um dado antgeno de interesse. Devido a todas essas propriedades brevemente descritas, os anticorpos so utilizados como agentes funcionalizantes para a criao de sistemas hbridos com uma alta especificidade biolgica, permitindo estudos de processos biolgicos atravs da marcao individual de biomolculas participantes de tais processos. Outra classe de biomolculas que tambm vem sendo amplamente utilizada na marcao biolgica so as lectinas. Lectinas so protenas produzidas por vegetais, que so capazes de reconhecer especificamente resduos de acares (resduos glicdicos) presentes em diferentes estruturas biolgicas [16-17]. Embora possuam uma especificidade semelhante aos anticorpos, as lectinas no so produzidas pelo sistema
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imunolgico, como so os anticorpos. As lectinas conhecidas possuem, no mnimo, dois locais de reconhecimento de acares e, por esta caracterstica, so capazes de aglutinar hemcias e outras clulas, atravs da formao de redes de ligao tridimensionais. Por estas propriedades, as lectinas vem sendo utilizadas para o estudo de perfil de acares presentes na superfcie de tecidos e correlacionar estes perfis com alteraes patolgicas, como transformaes tumorais de clulas. Uma lectina muito utilizada para este tipo de estudo a Concanavalina-A, capaz de se ligar a resduos de -manose e glicose presente nas superfcies celulares.
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4.4 Procedimentos experimentais: 4.4.1 Funcionalizao de NCs de CdS/Cd(OH)2: 4.4.1.1 Funcionalizao com glutaraldedo:
Em um erlenmeyer de 100mL adicionou-se 10mL de uma suspenso recm passivada (ver Captulo 2 para maiores detalhes) de NCs de CdS/Cd(OH)2. Ajustou-se o pH da suspenso para um valor de pH 8,0 com a utilizao de solues de 0,1 M de HClO4 e NaOH. Mantendo a suspenso sob agitao, temperatura ambiente, adicionou-se lentamente 100L de uma soluo aquosa 0,1% de glutaraldedo. Manteve-se o sistema sob agitao por aproximadamente 30 minutos.
4.4.1.2 Funcionalizao com glutaraldedo/Anticorpo:
Iniciou-se o procedimento como descrito na Seo 4.4.1.1. Em seguida, adicionou-se 10L de anticorpo monoclonal (DiaMed AS, Cressier s/ Morat, Switzerland) contra eritrcitos do tipo sanguneo A (Anti-A) a 100L de suspenso funcionalizada com glutaraldedo,. A suspenso foi ento encubada a uma temperatura de 37C por cinco horas, em tampo do tipo PBS, com pH igual a 7,2.
4.4.1.3 Funcionalizao com glutaraldedo/Concanavalina-A:
Iniciou-se o procedimento como descrito na Seo 4.4.1.1. Em seguida, coletouse 200L da suspenso funcionalizada com glutaraldedo e a esta alquota adicionou-se 600L de tampo do tipo PBS, com pH aproximadamente igual a 7,0. A esta suspenso tamponada, adicionou-se 200L de uma soluo 1mg/mL de Concanavalina-A (Sigma). A reao de funcionalizao ocorreu durante 24 horas. Aps este tempo, a suspenso foi mantida congelada at utilizao.
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4.4.2 Caracterizao das suspenses funcionalizadas:
Tendo em vista que as aplicaes as quais se destinam os NCs funcionalizados baseiam-se na fotoluminescncia destas partculas, caracterizou-se os sistemas funcionalizados quanto s alteraes em sua luminescncia, comparando-se com as suspenses originais, sem funcionalizao. Alm disso, para os NCs funcionalizados apenas com glutaraldedo, realizou-se uma caracterizao estrutural atravs de MET, com o objetivo de se avaliar possveis alteraes nos NCs. Nesta caracterizao, realizou-se a coleta de imagens de campo claro e imagens obtidas com feixe de eltrons de baixa energia. As micrografias de baixa energia so bastante utilizadas para a verificao de material orgnico presente nas amostras analisadas. Para obteno das imagens utilizou-se um microscpio modelo Carl Zeiss CEM 908, com microssonda, operado com energia de 80kV. As imagens de baixa energia foram obtidas com feixe de eltrons com energia de 20eV. As caracterizaes espectroscpicas foram realizadas utilizando-se um espectrofluormetro ISS K2, com resoluo de 1,0 nm e lmpada de Xennio de 300W como fonte de excitao.
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4.5.1 Sistema funcionalizado com glutaraldedo: 4.5.1.1 Caracterizao estrutural:
A Figura 4.6 exibe uma micrografia de campo claro e a Figura 4.7 outra com feixe de eltrons de baixa energia, dos NCs funcionalizados com glutaraldedo.
Figura 4.6 Micrografia de campo claro de uma amostra de NCs de CdS/Cd(OH)2 funcionalizada com glutaraldedo. A barra de escala equivale a 40nm.
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Figura 4.7 Micrografia de baixa energia (20eV) de uma amostra de NCs de CdS/Cd(OH)2 funcionalizada com glutaraldedo. A barra de escala equivale a 40nm.
Observando-se as micrografias acima, constata-se a presena de uma camada de material pouco eletrondenso, com espessura uniforme, recobrindo todos os NCs exibidos. Esta camada de recobrimento se apresenta de forma diferente e em quantidade superior a camada do estabilizante polifosfato utilizado na sntese dos NCs (ver micrografias do Captulo 2 para melhor comparao). Isto sugere que este recobrimento observado seja composto de poliglutaraldedo produzido durante o processo de funcionalizao. Esta hiptese corroborada pelas condies nas quais a funcionalizao foi realizada (meio alcalino) que so bastante favorveis polimerizao do glutaraldedo. As observaes feitas acima indicam satisfatoriamente que a metodologia utilizada foi favorvel para o processo sugerido de funcionalizao dos NCs.
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4.5.1.2 Caracterizao espectroscpica:
A Figura 4.8 exibe os espectros de emisso de uma amostra de NCs de CdS/Cd(OH)2 funcionalizados com glutaraldedo e no funcionalizados.
CdS/Cd(OH)2 CdS/Cd(OH)2 + Glutaraldedo

1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0 400 450 500 550 600 650
Figura 4.8 Espectros de emisso de uma amostra de NCs de CdS/Cd(OH)2 com e sem a funcionalizao com glutaraldedo.
Como se pode observar nos espectros acima, o processo de funcionalizao com o glutaraldedo no altera o perfil de banda de emisso dos NCs funcionalizados, embora resulte em uma diminuio considervel na intensidade da emisso destes. Atribui-se a diminuio na intensidade da emisso dos NCs diminuio do pH da suspenso aps a adio do glutaraldedo que pode ocasionar a corroso parcial da camada de passivao dos NCs, interferindo diretamente na eficincia do processo de fotoluminescncia [18].
4.5.2 Sistema funcionalizado com glutaraldedo/Anticorpo:
A Figura 4.9 exibe os espectros de emisso de duas amostras de NCs de CdS/Cd(OH)2: uma funcionalizada apenas com glutaraldedo e outra com o conjugado glutaraldedo/Anti-A (para o conjugado, a figura mostra espectros obtidos em diferentes intervalos de tempo).
75
1,0
486
CdS/Cd(OH)2/glut/anti-A(51h) CdS/Cd(OH)2/glut/anti-A(4h) CdS/Cd(OH)2/glut/anti-A(1h) CdS/Cd(OH)2/glut
0,8
0,6
0,4
0,2
489
Excitao em 337 mn
0,0 400 450 500 550 600 650
Figura 4.9 Evoluo temporal dos espectros de emisso de uma amostra de NCs funcionalizada com glutaraldedo (CdS/Cd(OH)2/glut) e com glutaraldedo/Anti-A (CdS/Cd(OH)2/glut/Anti-A).
Como j observado nos NCs funcionalizados com glutaraldedo, h uma diminuio da luminescncia dos NCs aps a funcionalizao com glutaraldedo/AntiA. Alm disso, com o decorrer do tempo, observa-se que a emisso da suspenso de NCs tambm sofre alteraes na sua intensidade, indicando que o processo de conjugao dos anticorpos camada de glutaraldedo no se encerra nas primeiras horas de incubao, mas continua se desenvolvendo no decorrer de vrias horas. Alm da alterao do pH do meio aps a funcionalizao, como j discutido na Seo 4.5.1, a diminuio da luminescncia dos NCs tambm pode estar relacionada a processos no-radiativos de transferncia de energia, dos NCs para as molculas de Anti-A. Uma explicao possvel deste fenmeno a gerao de novos estados eletrnicos, no presentes nos NCs nem nos anticorpos mas sim no sistema conjugado, alterando os processos de recombinao excitnica nos NCs. Os espectros de emisso apresentados na Figura 4.10 reforam estes indcios. Com o intuito de verificar as alteraes espectrais possivelmente advindas da interao NC-glut-Anti-A variou-se a regio de excitao do conjugado e observou-se que ao ser excitado em torno de =488 nm surgiu uma segunda banda de emisso no verde e, quando excitada em =543 nm surge uma banda de discreta intensidade na regio do vermelho, com mximo em torno de 660 nm. A Figura 4.9 apresenta o espectro da suspenso sob excitao em 488 e a
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evoluo temporal desta banda. Observa-se que, enquanto a banda de emisso sob excitao em 337 nm diminui com o passar do tempo, a banda na regio de energia mais baixa aumenta em intensidade com o tempo, corroborando que a dinmica do processo de funcionalizao continua mesmo aps sete dias decorridos desde o momento inicial de incubao.
Intensidades Normalizadas (u.a.)
1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 400 450
Excitao em 543 nm
500
550
600
650
700

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 400 450 500
Excitao em 337 nm
1h 4h 51h 7d
550
600
650
700

1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 400 450 500 550
Excitao em 488 nm
600
650
700
Figura 4.10 Evoluo temporal das bandas de emisso geradas pela excitao em 337, 488 e 543 nm.
Este conjunto de observaes sugere que h processos de transferncia de energia entre os NCs e as molculas de anticorpos, podendo estes processos se estenderem aos sistemas biolgicos que sero monitorados utilizando estes NCs funcionalizados [19]. Se este for realmente o caso, ento este fenmeno no deve se restringir apenas aos anticorpos, mas tambm a outras protenas que possam vir a serem utilizadas para a funcionalizao dos NCs.
4.5.3 Sistema funcionalizado com glutaraldedo/Concanavalina-A:
No foi possvel a caracterizao espectroscpica dos sistemas funcionalizados com a Concanavalina-A. Devido pequena quantidade de lectina disponvel para a
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funcionalizao, a quantidade de material funcionalizado, no que diz respeito a concentrao final de NCs possui luminescncia com intensidade inferior sensibilidade do espectrofluormetro utilizado. J se tem como perspectiva deste trabalho a tentativa de caracterizao espectroscpica deste sistema funcionalizado em um aparelho de maior sensibilidade e inclusive utilizando-se a tcnica de espectroscopia de correlao de fluorescncia (FCS) que detecta a fluorescncia de biomolculas em volumes da ordem de nanolitros.
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4.6 Referncias
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Captulo 5 Aplicao de NCs de CdS/Cd(OH)2 como sondas luminescentes para estudos em sistemas biolgicos
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Captulo 5 Aplicao de NCs de CdS/Cd(OH)2 como sondas luminescentes para estudos em sistemas biolgicos:
5.1 - Marcao dos sistemas biolgicos:
Nos estudos de marcao biolgica, utilizou-se os NCs de CdS/Cd(OH)2 no funcionalizados e funcionalizados descritos no Captulo 4. Os sistemas biolgicos escolhidos para estes estudos foram: Parasitas do tipo Leishmania amazonensis: a partir da utilizao de NCs sem funcionalizao e funcionalizados com glutaraldedo, objetivou-se a marcao dos parasitas para posterior uso em infeco de clulas hospedeiras. Hemcias de tipos sanguneos diferentes: a partir da utilizao de NCs funcionalizados com anticorpo Anti-A, tentou-se verificar a expresso diferenciada dos antgenos do grupo sanguneo tipo A+ e O+ . Fibroadenomas: a partir da utilizao de NCs funcionalizados com Concanavalina-A, tentou-se verificar expresses diferenciadas de glicose e manose neste tipo de tumor mamrio, comparando-se com tecido mamrio saudvel.
Todos os trabalhos descritos a seguir foram realizados sob colaborao com os seguintes centros de pesquisa e seus respectivos pesquisadores: Centro de Hematologia, Transfuso e Hemoterapia, Campinas-SP. Colaboradores: Vagner Castro, Maria de Lourdes Barjas-Castro e Paulo R. Moura Lima. Departamento de Parasitologia, UNICAMP. Colaboradores: Selma Giorgio, Diana C. Ayres e Maira C. Bosetto. Departamento de Eletrnica Quntica, UNICAMP. Colaboradores: Carlos Lenz Csar, Adriana Fontes e Andr A. de Thomas. Laboratrio de Imunopatologia Keizo Asami (LIKA), UFPE.
Colaborador: Eduardo I. C. Beltro. Centro de Pesquisas Aggeu Magalhes FIOCRUZ. Colaboradora: Regina Clia B. Q. Figueiredo.
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Os sistemas biolgicos marcados com os NCs luminescentes foram caracterizados atravs da gerao de imagens destes sistemas aps as marcaes. Para isto, utilizou-se os seguintes equipamentos: Microscpio confocal modelo LSM 510 da Carl Zeiss, utilizando-se uma objetiva de imerso a base de gua, com um aumento de 63x e uma abertura numrica de 1.2. Utilizou-se como comprimentos de onda de excitao do laser os valores = 488 e 543 nm. Este equipamento foi utilizado para os estudos com as hemcias e com as leishmanias. Microscpio confocal modelo TSC SP2 AOBS da Leica, utilizando-se uma objetiva de imerso a base de leo, com um aumento de 40x e uma abertura numrica de 1.2. Utilizou-se como comprimentos de onda de excitao do laser os valores = 488 e 543 nm. Este equipamento foi utilizado para o estudo com o fibroadenoma.
Em ambos equipamentos, as micrografias foram coletadas utilizando-se dois canais emisso: canal 1 correspondendo a emisso no vermelho (com filtro para coleta em 560-750 nm) e canal 2 correspondendo a emisso no verde (com filtro para coleta em 500-560 nm).
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5.2 Sistemas biolgicos estudados:
5.2.1 Leishmania amazonensis
5.2.1.1 Introduo
A leishmaniose uma parasitose comum em pases de clima tropical. No Brasil, apresenta-se como uma doena endmica em praticamente todo territrio nacional. causada por parasitas protozorios do gnero Leishmania, sendo transmitido para os seus hospedeiros por um vetor, normalmente um mosquito flebtomo, isto , que se alimenta de sangue [1]. No Brasil as leishmanioses apresentam-se na forma tegumentar e mucotegumentar (LT) e visceral (LV). As formas tegumentares no Brasil caracterizam-se pela diversidade das apresentaes clnicas e das espcies causadoras da doena (seis diferentes espcies descritas). Algumas destas espcies causam sndromes associadas a fenmenos imunopatognicos, como por exemplo, a forma difusa causada por Leishmania (Leishmania) amazonensis e a forma mucosa causada pela Leishmania (Viannia) braziliensis. A Leishmania visceral causada essencialmente por uma nica espcie, a Leishmania (Leishmania) chagasi [2]. Os parasitas da leishmaniose apresentam duas formas durante o seu ciclo de vida: a forma infectante, ou promastigota, na qual se apresentam quando alojados dentro do seu vetor; e a forma de proliferao no seu hospedeiro, chamada de amastigota. Em mamferos, a forma amastigota como este parasita se prolifera dentro das clulas de defesa conhecidas como macrfagos. A forma promastigota apresenta a caracterstica interessante da locomoo do parasita por meio de um flagelo frontal, permitindo a migrao dos parasitas do local de entrada no hospedeiro, at a entrada nos macrfagos, quando passam para a forma amastigota. O movimento deste flagelo se d pelo consumo de energia produzida por uma estrutura conhecida como cinetoplasto, localizado prximo do flagelo (Figura 5.1).
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Figura 5.1 Esquema representativo de uma leishmania na forma promastigota.
Um dos focos de pesquisa na rea das leishmanioses a forma de sobrevivncia do parasita dentro dos macrfagos. Estes parasitas conseguem sobreviver e proliferar exatamente no local onde os macrfagos realizam a destruio de corpsculos estranhos: dentro de vacolos conhecidos como fagolisossomos, onde a condies extremas como baixo pH e a presena de enzimas com alto poder cataltico, conhecidas como enzimas lisossomais [3]. O correto entendimento deste mecanismo de sobrevivncia o que permite o desenvolvimento de novas teraputicas para o tratamento das leishmanioses. Dentre as metodologias descritas na literatura no estudo da infeco dos macrfagos citam-se vrias que utilizam sondas fluorescentes, como por exemplo a GFP (Green Fluorescent Protein) [3]. A marcao dos promastigotas amplifica a capacidade de deteco e monitoramento do processo invasivo quando estes so incubados com clulas hospedeiras. Nesta pesquisa objetivou-se a obteno de um protocolo de marcao dos NCs de CdS/Cd(OH)2 em promastigotas de Leishmania amazonensis que resultasse numa intensidade de luminescncia detectvel por tcnicas de microscopia de fluorescncia e ao mesmo tempo que mantivesse vivos os parasitas.
5.3.1.2 - Marcao das leishmanias
Uma alquota de 300L de NCs, recm preparada, foi adicionada a 100L de suspenso de parasitas em meio de cultura RPMI (Sigma), contendo 10% de soro bovino fetal, com aproximadamente 104 parasitas vivos (Leishmania amazonensis).
Este material foi incubado durante 18h a uma temperatura de 26C. Por fim, os parasitas foram lavados com uma soluo de soro fisiolgico 0,9% e ento centrifugados para a montagem das lminas para microscopia. Para os NCs funcionalizados com glutaraldedo (CdS/Cd(OH)2-Glut) utilizou-se o mesmo procedimento descrito.
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5.3.1.3 Resultados e discusso
Aps o perodo de incubao com os NCs a maioria dos parasitas encontrava-se viva, mantendo sua integridade celular, evidenciando a baixa toxicidade do material durante seu uso. As Figuras 5.2(a-c) exibem as micrografias coletadas da amostra de parasitas conjugados a (CdS/Cd(OH)2-Glut).
Figura 5.2 - Micrografias obtidas da luminescncia do parasita, aps marcao com os NCs funcionalizados com glutaraldedo. Micrografia da emisso coletada pelo canal 1 de filtro (a) e com excitao em 543 nm, coletada no canal 2 de filtro (b) e com excitao em 488. Sobreposio das duas micrografias (c).
Observa-se nas imagens da Figura 5.2 os parasitas marcados apresentaram emisso em duas regies espectrais: emisso de fluorescncia verde prpria dos NCs utilizados; e uma emisso na regio 560-750 m (descrita na imagem pela pseudocor vermelha). A natureza desta segunda emisso ainda est sendo elucidada. Sugerem-se, no entanto, duas hipteses possveis. A primeira delas assume algum tipo de processo de transferncia de energia entre os NCs e a biomolcula na qual houve a conjugao, provavelmente uma protena. A segunda leva em conta que a disperso de tamanhos dos NCs pode gerar populaes de partculas que apresentam emisso detectvel nesta faixa de comprimento de onda. O espectro de emisso caracterstico destes NCs em suspenso demonstra uma banda que se estende at a regio do vermelho (Figura 2.8, Seo 2.4.1.2 do Captulo 2).
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Figura 5.3 - Micrografias obtidas da luminescncia do parasita, aps marcao com os NCs no funcionalizados. Micrografia da emisso coletada pelo canal 1 de filtro (a) e com excitao em 543 nm, coletada no canal 2 de filtro (b) e com excitao em 488. Sobreposio das duas micrografias (c).
As micrografias da Figura 5.3 representam parasitas conjugados a NCs de CdS/Cd(OH)2 no-funcionalizados. Pode-se observar que, comparando-se as Figuras 5.2 e 5.3, observa-se uma grande diferena no padro de marcao. Os parasitas marcados com NCs/glutaraldedo apresentam luminescncia dual que se distribui uniformemente, enquanto que os parasitas marcados com NCs no funcionalizados exibem emisso diferenciada ao longo dos promastigotas. Observa-se que a emisso de maior energia encontra-se localizada em trs estruturas circulares no eixo central do parasita. Estas estruturas correspondem a trs organelas importantes do parasita: o ncleo, o cinetoplasto e a bolsa flagelar [4]. Elas assemelham-se por possurem uma membrana envoltria, permitindo que apenas pequenas molculas ultrapassem esta barreira, migrando para o interior das organelas. So tambm regies de alto consumo energtico e produo de DNA, que traduz-se num alto consumo de unidades contendo grupos fosfato. A possvel explicao para a diferenciao de emisses descrita no pargrafo anterior que os NCs funcionalizados com glutaraldedo ligam-se a estruturas proticas na membrana celular dos parasitas e do seu citoplasma inespecificamente, resultando em uma emisso homognea de todo o parasita. Por outro lado, os NCs no funcionalizados conseguem se difundir com maior facilidade no citoplasma dos parasitas, e aqueles com menor tamanho, tendo em vista a disperso de tamanho dos NCs, conseguem penetrar atravs de poros existentes nas membranas das trs organelas descritas, resultando em uma compartimentalizao destes NCs menores e gerando emisses localizadas. Mais ainda. A superfcie dos NCs rica em polifosfato (material estabilizante) pode se constituir num fator atrativo para sua entrada nas trs referidas
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micro-regies do parasita[5]. A anlise do perfil de emisso tridimensional dos parasitas (Figura 5.4) confirma a marcao diferenciada de estruturas internas e citoplasma.
Figura 5.4 Perfil tridimensional de marcao de Leishmania amazonensis com NCs de CdS/Cd(OH)2.
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5.3.2 Hemcias 5.3.2.1 - Introduo
Hemcias, ou eritrcitos, so clulas responsveis pela manuteno dos processos respiratrios dos animais superiores. uma clula altamente especializada que no possui ncleo, tendo o seu tempo de vida estimado em 120 dias. As trocas gasosas realizadas pelas hemcias so feitas graas a presena de uma protena conhecida como hemoglobina, capaz de se ligar tanto a molculas de oxignio quanto a molculas de dixido de carbono. Na superfcie das hemcias de alguns tipos de indivduos existem glicoprotenas que exibem para o meio extracelular, resduos de carboidratos. Esta apresentao destes resduos auxilia no reconhecimento das hemcias pelo sistema imunolgico do indivduo. Estes resduos de carboidratos so os responsveis pela determinao dos tipos sanguneos, segundo o sistema de classificao conhecido como sistema ABO, onde as hemcias do tipo A exibem resduos de carboidratos diferentes das hemcias do tipo B e as hemcias do tipo O no apresenta nenhum destes tipos de resduos. As hemcias do tipo AB apresentam resduos tanto do tipo A quanto do tipo B [6]. Esta diferena entre os tipos de hemcias o que determina se uma dada pessoa pode ou no receber uma transfuso sangunea de uma amostra de sangue de outra pessoa. Pessoas com tipos sanguneos diferentes geralmente apresentam
incompatibilidades de transfuso, o que pode se apresentar, por exemplo, como a formao de grandes cogulos sanguneos dentro dos vasos de uma pessoa que recebeu uma transfuso de um tipo sanguneo incompatvel. Esta coagulao realizada pelo sistema imunolgico do indivduo transfusionado, que reconhece as hemcias de outro tipo sanguneo como corpos estranhos, atacando-as e promovendo a sua coagulao [6].
5.3.2.2 Marcao de hemcias A partir de amostras de sangue coletadas de doadores, de grupos sanguneos A+ e O+, preparou-se novas amostras diludas, com um hematcrito final de 5%, isto , do volume final das amostras diludas, 5% correspondem ao volume ocupado pelas hemcias. Estas diluies foram realizadas com soluo de soro fisiolgico a 0,9%. Em seguida, para cada tipo sanguneo utilizado, coletou-se 10L de amostra e incubou-se com 90L de suspenso de NCs funcionalizados com anticorpo
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(CdS/Cd(OH)2/glut/Anti-A) e completou-se o volume da mistura com 400L de tampo de fosfato (PBS). O material foi agitado levemente e levado ao banho trmico a 37oC por 30 minutos. Logo em seguida, o volume do material foi completado com PBS para cerca de 1 mL e levado para centrifugar por 2x30s a 3400 rpm. Formou-se o boto de sangue e o sobrenadante foi descartado. Colocou-se mais cerca de 1 mL de PBS e o sangue foi redispersado, centrifugando-se novamente nas mesmas condies anteriores. O sobrenadante foi descartado, restando aproximadamente 50L, nos quais foi redispersado o sangue. Para a preparao da lmina, foi pipetada uma alquota de 10L do material, na hora da visualizao com microscpio.
5.3.2.3 Resultados e discusso
O esquema geral da conjugao est descrito na Figura 5.5. As hemcias mantiveram sua forma original, mantendo sua integridade, como pode ser observado nas imagens de contraste das Figuras 5.6(c) e 5.7(c).
Figura 5.5 Descrio esquemtica da conjugao de CdS/Cd(OH)2-Glut-Anti-A membrana de hemcias, atravs de reao especfica antgeno-anticorpo.
A anlise das micrografias das hemcias A+ marcadas demonstra emisso dual de alta intensidade distribuda de maneira uniforme sobre a superfcie das hemcias. Apresentam emisso na regio do verde (500-560nm) e vermelho (560-750nm) sob excitao em 488 e 543 nm, respectivamente.
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As hemcias tipo O+ tambm apresentaram emisso dual semelhante observada para as hemcias A+ (Figura 5.7). Analisando-se os respectivos mapas de intensidade apresentadas na Figura 5.8 (obtidos de imagens nas mesmas condies experimentais de captura), no entanto fica claro que a emisso observada para hemcias tipo O+ bem menos intensa.
Figura 5.6 Micrografias obtidas da luminescncia das hemcias A+, aps marcao com os NCs/glut/Anti-A. Micrografia da emisso coletada pelo canal 1 de filtro (a) e com excitao em 543 nm, coletada no canal 2 de filtro (b) e com excitao em 488. Micrografia de contraste de fase (c) e superposio de todas as micrografias (d).
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Figura 5.7 - Micrografias obtidas da luminescncia das hemcias O+, aps marcao com os NCs/glut/Anti-A. Micrografia da emisso coletada pelo canal 1 de filtro (a) e com excitao em 543 nm, coletada no canal 2 de filtro (b) e com excitao em 488. Micrografia de contraste de fase (c) e superposio de todas as mirografias (d).
Mx
Mn
Figura 5.8 Mapas de intensidade de hemcias A+ (a) e O+ (b) mostrando a diferena entre as intensidades das emisses exibidas.
Como descrito no Captulo 4 (Seo 4.4.1.2) para a marcao direcionada das hemcias A+ utilizou-se a reao antgeno-anticorpo com a associao dos NCs ao Anti-
90
A. Baseado nisto existem duas consideraes a se fazer com relao aos perfis de marcao obtidos nas hemcias A+ e O+. A primeira relaciona-se marcao dos eritrcitos O+ e a segunda tange a emisso dual observada nos eritrcitos. Como as hemcias tipo O+ no possuem antgenos A em sua superfcie, outro processo deve estar sendo favorecido na associao entre os NCs e a membrana. Voltando ao protocolo desenvolvido para as marcaes, percebe-se que pode existir uma quantidade residual de NCs-Glut na suspenso preparada que no se ligou ao AntiA e que mantm-se ativa para associao direta aos resduos amina de protenas presentes na membrana citoplasmtica. Estas espcies podem inclusive fazer parte do equilbrio de conjugao descrito para a reao de conjugao. Um processo relativamente lento de associao de NC-Glut s molculas de Anti-A nas condies experimentais utilizadas foi de fato observado atravs de espectroscopia de emisso destes sistemas (Figura 4.9 Seo 4.5.2, Captulo 4). Para garantir que todos os NCs a serem utilizados na marcao sejam associados ao Anti-A, o processo de bioconjugao precisa ser otimizado. Ainda levando em considerao os espectros de emisso dos conjugados, observa-se que, com o passar do tempo, surge uma banda larga de emisso no verde e outra bem menos intensa na regio do vermelho que no existem no conjugado CdS/Cd(OH)2-Glut. Esta mudana espectral, que foi sugerida no Captulo 4 como sendo advinda de processos envolvendo transferncia de energia entre o CdS/Cd(OH)2 e o Anti-A mediado pelo glutaraldedo, pode ser a responsvel pelo padro de emisso observado nas hemcias A+. Por outro lado, um processo de mesma natureza pode tambm ser utilizado para explicar o padro observado para a emisso dos eritrcitos O+ [7].
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5.3.3 Carcinognese e a presena de carboidratos nas membranas celulares
5.3.3.1 Introduo
Carcinognese o termo utilizado para designar os complexos processos de transformao que uma clula saudvel sofre, tendo como resultado uma clula com elevada capacidade de proliferao e que capaz de invadir o espao de outras clulas, passando a agir como um organismo invasor. A esta clula pode-se denominar de clula tumoral e o conjunto ou aglomerado destas clulas denomina-se tumor. A capacidade de invaso do tumor em um dado tecido e sua velocidade de proliferao o que determina sua malignidade ou benignidade [8]. Um dos tumores comuns em mulheres adultas o chamado fibroadenoma. Este tumor constitudo por dois tipos de clulas: clulas fibrosas de sustentao e clulas glandulares. formado dentro do tecido de sustentao da mama, conhecido como estroma, resultando em massas tumorais bem delimitadas com uma cpsula fibrosa em torno do tumor. um tumor benigno, no se desenvolvendo de forma muito invasiva para os tecidos a sua volta [8]. Dentre os tipos de tumores existentes, sabe-se que alguns possuem uma super expresso de resduos de carboidratos, isto , apresentam estes carboidratos em quantidades superiores s clulas normais. Esta super expresso pode ser resultado da produo elevada de enzimas conhecidas como glicosil transferases, por mudanas ocorridas na organizao da membrana das clulas tumorais ou pela apresentao de resduos de carboidratos que normalmente encontram-se mascarados nas clulas. H vrias evidncias de que esta super expresso de carboidratos na superfcie das clulas tumorais possui um papel fundamental no processo de progresso e de metstase dos tumores, servindo como molculas de adeso entre as prprias clulas tumorais, assim como ancoras entre os tumores e tecidos saudveis [8,9]. Como j mencionado no Captulo 4, as lectinas possuem diversas aplicabilidades na rea de marcao biolgica, devido a sua capacidade de se ligar especificamente a resduos de carboidratos presentes em diversas estruturas celulares. Devido a esta caracterstica particular das lectinas, estas biomolculas so utilizadas nas pesquisas de imunohistoqumica, para a compreenso do processo de transformao tumoral, mediante acompanhamento das mudanas de expresso de carboidratos na superfcie das membranas celulares [9-12]. Dentre as lectinas utilizadas para este tipo de
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aplicao, a Concanavalina-A bastante utilizada para reconhecimento de resduos de glicose e manose situados na membrana celular de tecidos saudveis e seus respectivos tecidos tumorais, com o intuito de se estudar a diferena no perfil destes carboidratos.
5.3.3.2 Marcao de fibroadenomas
Amostras parafinizadas de tecido mamrio saudvel e de fibroadenoma foram obtidas no Banco de tecidos do laboratrio de Patologia do LIKA UFPE. Inicialmente, cortes dos tecidos foram desparafinizados, utilizando-se para isso solues de xilol e solues de lcool a concentraes variadas (70%-100%). Os cortes foram imersos sequencialmente nestas solues at que estivessem totalmente desparafinizados e rehidratados. Aps a desparafinizao, os cortes foram tratatados com uma soluo de tripsina a 0,1% por 2 minutos a 35C, para a retirada de parte do colgeno que envolve os tecidos, e ento foram encubados com a suspenso de NCs/glutaraldedo/Concanavalina-A (NCs/glut/ConA), durante um perodo de 2 horas a 35C. Esta incubao foi realizada ainda com a adio de uma soluo 5mg/100mL do composto conhecido como Azul de Evans (AE), utilizado para a supresso da auto fluorescncia dos tecidos [13]. Realizou-se o mesmo procedimento com NCs no funcionalizados, com o intuito de se avaliar a emisso dos cortes por marcao no especficas dos NCs.
93
5.3.3.3 Resultados e discusso A Figura 5.9 representa o esquema de conjugao especfica realizada nos tecidos de Fibroadenoma e normal.
Figura 5.9 Esquema representando o processo de marcao dos tecidos. As formas geomtricas descritas na cadeia de polissacardeo representam os carboidratos.
A Figura 5.10 mostra uma imagem tpica obtida dos tecidos marcados com CdS/Cd(OH)2/glut/ConA e tratados com Azul de Evans obtida atravs de microscopia confocal. Ela resulta da superposio de dois canais de excitao (488 e 543 nm) e mostra regies pontuais e difusas de emisso na regio verde (grupos de clulas) superpostas a uma regio de emisso no vermelho. Esta ltima regio caracterizada por fibras de colgeno, ricas em espcies que causam a autofluorescncia do tecido, como por exemplo, o triptfano. O Azul de Evans atua no sentido de deslocar a fluorescncia para regies de menor energia [13] possibilitando a visualizao de fluorforos emitindo no azul e no verde. Com o intuito de verificar as contribuies de fluorescncia na regio de maior energia, das espcies no tecido marcado e no marcado, realizou-se a anlise comparativa das contribuies coletadas na regio espectral 500-560nm, mostradas nas Figuras 5.11 e 5.12.
94
Figura 5.10 Imagem tpica de um corte de tecido de Fibroadenoma marcado com CdS/Cd(OH)2/glut/ConA e tratado com Azul de Evans obtida atravs de microscopia confocal sob excitao dual em 488 e 543 nm.
A Figura 5.10 exibe as micrografias obtidas dos cortes de fibroadenoma tratados com AE e seus respectivos mapas de intensidade. As micrografias correspondem aos
1a
2a
3a
1b
2b
3c
Figura 5.11 Cortes de fibroadenomas de tecidos mamrios. Corte tratado apenas com AE (1a); Corte marcado com NCs no funcionalizados e AE (2a); Corte marcado com NCs/glut/ConA e AE (3a). 1b, 2b e 3b so os respectivos mapas de intensidade.
cortes no marcados e marcados com os NCs e NCs/glut/ConA. A partir da anlise dos mapas de intensidade das trs micrografias, observa-se que os cortes que foram tratados apenas com AE e AE/NCs (1a-1b e 2a-2b) no
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apresentaram luminescncia significativa, mostrando que os NCs no funcionalizados no promovem uma marcao de intensidade aprecivel nos tecidos analisados. Entretanto, o corte marcado com NCs/glut/ConA exibe uma luminescncia localizada mais intensa, o que sugere-se tratar dos stios ricos em resduos de manose e/ou glicose capazes de serem reconhecidos pelas lectinas na superfcie dos NCs. Esta diferenciao um indcio de que a ConA direcionou a marcao dos NCs em locais selecionados nos cortes de fibroadenoma. A Figura 5.12 exibe as micrografias de um corte de tecido saudvel de mama e um corte de fibroadenoma, ambos tratados com AE e marcados com NCs/glut/ConA. Pode-se observar claramente que o tecido saudvel possui uma luminescncia inferior ao tecido tumoral. Uma explicao para esta emisso inferior a diferena entre a expresso de carboidratos entre os tecidos analisados, sendo esta maior no fibroadenoma, o que pode resultar em uma maior marcao dos tecido tumoral pelos NCs funcionalizados com a Concanavalina-A [14].
Figura 5.12 Cortes de tecido mama saudvel (a) e de fibroadenoma (b) tratados com AE e marcados com NCs/glut/ConA. Imagens coletadas na faixa entre 500-560nm. .
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5.4 Referncias
1. Hommel, M. J. Infec. 39 (1999) 101. 2. Manual de Recomendaes para Diagnstico, Tratamento e Acompanhamento da Co-infeco Leishmania-HIV, Srie A Normas e Manuais Tcnicos, Ministrio da Sade, Secretaria de Vigilncia em Sade Programa Nacional de DST e Aids, Editora MS, Braslia, 2004. 3. Rodrigues, N. E., Gaur, U., Wilson, M. E. Cell. Microbiol. 8 : 7 (2006) 1106. 4. Desjeux, P. Comp. Immunol. Microbiol. Infect Dis. 27 (2004) 305 5. Santos, B. S., Farias, P. M. A., Menezes, F. D., Ferreira, R. C., Giorgio, S., Bosetto, M. C., Ayres, D. C., Fontes, A., Cesar, C. L., Lima, P. R. M., Mariano, E. A. L., Thomaz, A. A. Spie, 6097 (2006) 06 6. Daniels, G. Human Blood Groups. Londres, Blackwell Science, 2002. 7. Farias, P. M. A., Santos, B. S., Menezes, F. D., Cesar, C. L., Fontes, A., Lima, P. R. M., Castro, M. L. B., Castro, V., Ferreira, R. C. Journal of Microscopy. 219 : 3 (2005) 103. 8. Franks, L. M., Teich, N. M. Introduction to the Cellular and Molecular Biology of Cancer. 3 Ed., Nova York, Oxford University Press Inc., 2001. 9. Ono, M., Hakomori, S. Glycoconjugate J. 20 (2004) 71. 10. Sharon, N., Lis, H. Glycobiology. 14: 11 (2004) 53. 11. Beltro, E. I C., Medeiros, P. L., Rodrigues, O. G., Silva, J. F., Valena, M. M., Coelho, L. C. B B., Carvalho Jr., L. B. Eur. J. Histochem. 47 (2003) 139. 12. Zhivko Zhelev, Hideki Ohba, Rumiana Bakalova, Rajan Jose, Satoshi Fukuoka, Toshimi Nagase, Mitsuru Ishikawa and Yoshinobu Baba. Chemical
Communications. 15 (2005) 1980. 13. Brookner, C. K., Follen, M., Boiko, I., Galvan, J. Thomsen, S., Malpica, A., Suzuki, S., Lotan, R., Richards-Kortum, R. Photochemistry and Photobiology, 71:6 (2000) 730. 14. Santos, B. S., Farias, P. M. A., Menezes, F. D., Ferreira, R. C., Junior, S. A., Figueiredo, R. C. B. Q., Beltro, E. I. C. Spie. 6096 (2006) 1J
Captulo 6 Concluses e Perspectivas
97
Como concluses deste trabalho, pode-se afirmar que: Os processos empregados para a funcionalizao dos NCs de CdS/Cd(OH)2 mostraram-se satisfatrios para a utilizao desse material como marcador luminescente para os sistemas biolgicos estudados; Estudos ainda precisam ser realizados para a diminuio da disperso de tamanho dos NCs de CdS sintetizados pela metodologia descrita; H uma necessidade de se utilizar tcnicas mais sensveis e que trabalhem com pequenos volumes de amostras, para a correta avaliao da fotoluminescncia dos NCs funcionalizados, visto que para o caso estudado dos NCs funcionalizados com Concanavalina-A no foi possvel a caracterizao espectroscpica dos cristais funcionalizados; As marcaes biolgicas realizadas demonstraram a viabilidade de utilizao dos NCs funcionalizados como marcadores biolgicos, embora o
comportamento das emisses observadas para cada sistema biolgico estudado mostrou-se nitidamente diferente dos NCs isolados, o que requer estudos mais aprofundados sobre os processos fsicos envolvidos nas alteraes
espectroscpicas dos NCs, quando estes encontram-se conjugados a sistemas biolgicos. Os estudos realizados sobre as metodologias de reduo do telrio e de obteno de NCs luminescentes de CdTe mostraram que vivel a sntese desses nanocristais diretamente em meio aquoso, empregando-se mtodos simples e de baixo custo. Os NCs obtidos mostraram propriedades estruturais e
espectroscpicas semelhante aos materiais descritos na literatura, justificando a dedicao de esforos futuros para a melhoria das metodologias empregadas; Como perspectivas, tem-se os estudos de aplicao dos NCs de CdTe obtidos pelas metodologias desenvolvidas neste trabalho, para fins de marcao biolgica, alm do melhoramento das metodologias de obteno dos dois tipos de NCs estudados neste trabalho (CdS/Cd(OH)2 e CdTe/CdS) com o intuito de se obter populaes de NCs com tamanhos mdios menos dispersos, podendo-se ainda empregar mtodos de precipitao seletiva para esta finalidade. Ainda
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como perspectiva, tem-se a realizao de caracterizaes mais adequadas para os estudos dos processos envolvidos na fotoluminescncia dos NCs conjugados a sistemas biolgicos, sendo a medio do tempo de decaimento da fotoluminescncia uma das tcnicas a serem empregadas.
99 ANEXOS
Artigos publicados referentes aos trabalhos desenvolvidos durante a dissertao:
1. FARIAS, Patrcia Maria Albuquerque de ; SANTOS, B. S. ; MENEZES, Frederico Duarte de ; FERREIRA, Ricardo de Carvalho ; CARVALHO, H. F. ; OLIVEIRA, F. J. M. ; ROMO, Luciana ; AMARAL, Jane C O F ; MOURA NETO, Vivaldo ; FONTES, Adriana ; CESAR, Carlos Lenz . Application of colloidal semiconductor quantum dots as fluorescent labels for diagnosis of brain glial cancer. Spie, v. 6096, p. 60961, 2006.
2. SANTOS, B. S. ; FARIAS, Patrcia Maria Albuquerque de ; MENEZES, Frederico Duarte de ; FERREIRA, Ricardo de Carvalho ; ALVES JUNIOR, Severino ; FIGUEIREDO, Regina C B Q ; BELTRO, Eduardo I C . Lectin functionalized quantum dots for recognition of mammary tumours. Spie, v. 6096, p. 1J, 2006.
3. SANTOS, B. S. ; FARIAS, Patrcia Maria Albuquerque de ; MENEZES, Frederico Duarte de ; FERREIRA, Ricardo de Carvalho ; GIORGIO, Selma ; BOSETTO, Maira Cegatti ; AYRES, Diana Copi ; FONTES, Adriana ; CESAR, Carlos Lenz ; LIMA, Paulo Roberto Moura ; MARIANO, Erick Antnio Leite ; THOMAZ, Andr Alexandre de . Molecular Differentiation of Leishmania Protozoarium using CdS Quantum Dots as Biolabels. Spie, v. 6097, p. 06, 2006.
4. FARIAS, Patrcia Maria Albuquerque de ; SANTOS, B. S. ; MENEZES, Frederico Duarte de ; FERREIRA, Ricardo de Carvalho ; BRASIL JNIOR, Aluzio Gonalves ; VIEIRA, A. A. S. ; SILVA, D. C. N. ; LIMA, L. B. ; ALMEIDA, D. ; FONTES, Adriana ; BARBOSA, Luis Carlos ; CESAR, Carlos Lenz . Monitoring activity of living cells marked with colloidal semiconductor quantum dots. Spie, v. 6088, p. 0G, 2006.
5. FARIAS, Patrcia Maria Albuquerque de ; SANTOS, B. S. ; MENEZES, Frederico Duarte de ; CESAR, Carlos Lenz ; FONTES, Adriana ; LIMA, Paulo Roberto Moura ; CASTRO, Maria de Lourdes Barjas ; CASTRO, Vagner ; FERREIRA, Ricardo de Carvalho . Core-shell CdS/Cd(OH)2 quantum dots: synthesis and
100 bioconjugation to target red cells antigens. Journal of Microscopy-Oxford, Londres, v. 219, n. 3, p. 103-108, 2005.
6. FARIAS, Patrcia Maria Albuquerque de ; SANTOS, B. S. ; MENEZES, Frederico Duarte de ; FERREIRA, Ricardo de Carvalho ; FONTES, Adriana ; CASTRO, Maria de Lourdes Barjas ; CASTRO, Vagner ; LIMA, Paulo Roberto Moura ; CESAR, Carlos Lenz . High fluorescent and stable semiconductor quantum dots for red blood cells labeling. Spie, San Jose, v. 5704, p. 265-270, 2005.
7. MOREIRA, Wendel Lopes ; FONTES, Adriana ; THOMAZ, Andr Alexandre de ; NEVES, Antnio A R ; BARBOSA, Luis Carlos ; MENEZES, Frederico Duarte de ; FARIAS, Patrcia Maria Albuquerque de ; SANTOS, B. S. ; CESAR, Carlos Lenz . Synthesis and characterization of CdTe nanocrystals for applications as Biolabels. Spie, v. 5704, p. 36-40, 2005.
8. FARIAS, Patrcia Maria Albuquerque de ; SANTOS, B. S. ; MENEZES, Frederico Duarte de ; FERREIRA, Ricardo ; CASTRO, Maria de Lourdes Barjas ; CASTRO, Vagner ; LIMA, Paulo Roberto Moura ; FONTES, Adriana ; CESAR, Carlos Lenz . Investigation of Blood Red Cells Antigens with Highly Fluorescent and Stable Semiconductor Quantum Dots. Journal of Biomedical Optics, New York, v. 10, n. 4, p. 44023-44026, 2005.
9. MENEZES, Frederico Duarte de ; BRASIL JNIOR, Aluzio Gonalves ; MOREIRA, Wendel Lopes ; BARBOSA, Luis Carlos ; CESAR, Carlos Lenz ; FERREIRA, Ricardo ; FARIAS, Patrcia Maria Albuquerque de ; SANTOS, B. S. . CdTe/CdS core shell quantum dots for photonic applications. Microelectronics Journal, Londres, v. 36, p. 989-991, 2005.

Dissertacao 11 01 2007

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM QUMICA

FREDERICO DUARTE DE MENEZES

RECIFE, AGOSTO DE 2006

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

Co-orientadores: Prof. Patrcia M. A. de Farias Prof. Ricardo de Carvalho Ferreira

RECIFE, AGOSTO DE 2006

Aos meus amigos do Aikid.

As professoras Ivone e Valdnia, pela amizade e trabalhos desenvolvidos.

CNPq pelo apoio financeiro.

Obrigado a todos vocs!

fluorescentes, biomarcadores, funcionalizao, semicondutores, confinamento quntico.

5.2.1 Leishmania amazonensis ..................................................................................81 5.2.1.1 Introduo ......................................................................................................81

Captulo 6 Concluses e Perspectivas .......................................................................97 Anexos ..........................................................................................................................99

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Orbitais Anti Ligantes

Orbitais Ligantes Orbitais Anti Ligantes Banda de Conduo tomos A tomos B

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Tabela 1.1 Valores de band gap de alguns semicondutores do tipo II-VI

Semicondutor CdTe CdSe CdS ZnSe ZnO ZnS

Band gap (eV) 1.60a 1.84a 2.5b 2.82a 3.4b 3.68b

Gaponenko [3]. [4].

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

1.1.2 Confinamento Quntico

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

1.2 Breve histrico sobre nanocristais de semicondutores

1.3 Motivao: aplicaes de NCs de semicondutores como biomarcadores

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

1.6 Apresentao da dissertao

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Alfassi, Z., Bahnemann, D., Henglein, A. J. Phys. Chem. 86 (1982) 4656.

Captulo 1 Nanocristais de semicondutores

Captulo 2 Sntese e Caracterizao de suspenses coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2

Captulo 2 Sntese e Caracterizao de suspenses coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2 :

Captulo 2 Sntese e Caracterizao de suspenses coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2

2.1.1 Estabilizao de NCs: utilizao do Polifosfato

Figura 2. 1 Representao esquemtica de uma cadeia de polifosfato

Captulo 2 Sntese e Caracterizao de suspenses coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2

Captulo 2 Sntese e Caracterizao de suspenses coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2

Captulo 2 Sntese e Caracterizao de suspenses coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2

BC CC Band gap BV CV CdS Cd(OH)2

BC CC Band gap BV CV CdS

Captulo 2 Sntese e Caracterizao de suspenses coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2

2.3 Procedimentos experimentais:

Captulo 2 Sntese e Caracterizao de suspenses coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2

2.3.2 Estudo da influncia da concentrao do polifosfato na sntese de NCs de CdS:

Volume de [(NaPO3)n] 0,0051 g/mL

Concentrao final de Fosfato (PO3-) 0,001M 0,0025M 0,0035M 0,0045M 0,0065M

Captulo 2 Sntese e Caracterizao de suspenses coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2

Captulo 2 Sntese e Caracterizao de suspenses coloidais de CdS e CdS/Cd(OH)2