UNIVERSITE DE BORDJ BOU ARRERIDJ

Faculté des Sciences et de la Technologie

Département Génie de l’Environnement

3ème année Génie des procédés

Dr. H.Faid
Chapitre 1 Méthodes chromatographiques

Contenu de la matière

Chapitre 1

Méthodes chromatographiques

Chapitre 2

Spectroscopie moléculaire UV-Visible

Chapitre 3

Spectroscopie Infrarouge (IR)

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Chapitre 1 Méthodes chromatographiques

Introduction
Les méthodes chromatographiques sont des méthodes d’analyse, utilisées pour la séparation
d'espèces chimiques qui permet l’identification et la quantification des différents composés d’un
mélange liquide ou gazeux.

1. Principe
Le principe repose sur les équilibres de concentration des composés présents entre les deux
phases ; une phase mobile (liquide ou gaz) le long d’une phase stationnaire (solide ou liquide fixé),
grâce à la répartition sélective des solutés entre ces deux phases.
L’entrainement à des vitesses différentes des composés présents dans la colonne par la phase
mobile conduit à leur séparation.
Ces derniers parcourent la phase stationnaire avec des temps proportionnels à leurs propriétés
intrinsèques (taille, structure, ...) ou à leur affinité avec la phase stationnaire (polarité, ...).
L’équilibre de répartition d’une substance entre les deux phases stationnaire et mobile s’exprime
par la relation :

𝐂𝐬
𝐊= K : Coefficient de distribution
𝐂𝐦

Cs: Concentration de la substance dans la phase stationnaire

Cm: Concentration de la substance dans la phase mobile
La phase stationnaire est emprisonnée dans une colonne ou fixée sur un support
La phase mobile se déplace au contact de la phase stationnaire

2. Classification des méthodes chromatographiques

2.1-La nature physique des phases (mobile ou stationnaire)

-La phase mobile est un fluide qui peut être soit liquide ou gazeux.
-La phase stationnaire peut être soit un solide finement pulvérisé, soit un liquide immobilisé sur
une phase fixe.
On distingue quatre types de chromatographie : Chromatographie liquide –liquide,
Chromatographie liquide –solide, Chromatographie gaz-liquide, Chromatographie gaz-solide
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Chapitre 1 Méthodes chromatographiques

2.2-Le principe de phénomène mise en jeu (type d’équilibre)

Chromatographie d’adsorption, Chromatographie de partage, Chromatographie d’échange d’ions
Chromatographie d’exclusion, Chromatographie d’affinité
*La chromatographie d’adsorption : La phase stationnaire est un milieu solide perméable sur
lequel les molécules adhèrent par un double effet de physisorption et de chimisorption. Le
paramètre physico-chimique concerné est le coefficient d’adsorption.
*La chromatographie de partage : le partage est basé sur la différence d’affinité du soluté entre la
phase mobile liquide et la phase stationnaire. Les phases stationnaires sont des polymères greffés
sur un matériau inerte poreux. Le coefficient de distribution entre les deux phases set le
coefficient de partage.
*La chromatographie d’échange d’ions : la distribution des espèces ioniques entre la phase mobile
et la phase stationnaire qui contient les ions échangeables qui sont fixés initialement sur les sites
ioniques de la phase stationnaire.
* La chromatographie d’exclusion : séparation par perméation de gel ; la phase stationnaire est
constituée d’un matériau comportant des pores dont les dimensions sont choisies selon la taille
espèces à séparer.
*La chromatographie d’affinité : la phase stationnaire est ici un substrat inerte sur lequel est greffé
un “effecteur” qui présente une affinité pour un soluté de l’échantillon à analyser (affinité
enzyme-substrat, ligand-récepteur, antigène-anticorps).

Le tableau suivant présente pour chaque équilibre le facteur de séparation

Type d’équilibre Facteur de séparation

Adsorption Polarité
Partage solubilité
Exclusion Taille des molécules
Echange d’ions Charge ionique
Affinité Structure d’échantillon

3-Le procédé opératoire : immobilisation de la phase stationnaire

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Chapitre 1 Méthodes chromatographiques

3. Paramètres généraux de la chromatographie

* Chromatogramme
Le chromatogramme est une courbe qui traduit la variation au cours du temps d’un paramètre
relié à la concentration instantanée du soluté en sortie de colonne. Le temps (ou très rarement le
volume d’élution) est porté en abscisse et l’intensité du signal de détection en ordonnée. La ligne
de base correspond au tracé obtenu en l’absence de composé élué. La séparation est complète
quand le chromatogramme présente autant de pics chromatographiques revenant à la ligne de
base qu’il y a de composés dans le mélange à analyser.

* Elution : entraînement d’un soluté à travers la phase stationnaire par le mouvement de la phase
mobile. Pour la chromatographie (colonne ou CCM), la phase mobile peut être appelée éluant.
Temps de rétention (tr) : C'est le temps que met le soluté à sortir de la colonne c'est à dire le
temps écoulé entre l'injection et le maximum du pic du composé élué.
Volume de rétention Vr : Correspond au volume de phase mobile nécessaire à l'élution.
Vr = 𝑡𝑟 × 𝐷 Avec D le débit du gaz vecteur
Temps mort tm: C'est le temps que met un soluté non retenu

Temps de rétention réduit t'r correspond au temps de séjour du composé en contact avec la
phase stationnaire. t′r = 𝑡𝑟 − 𝑡𝑚
Facteur de rétention
𝑡𝑟 − 𝑡𝑚
k=
𝑡𝑚
-Facteur de séparation ou de rétention: Il définit la position relative de 2 pics, le pic du soluté a
sortant avant le pic du soluté b
t′r(a)
α=
t′r(b)

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Chapitre 1 Méthodes chromatographiques

-Plateaux théoriques
Chaque étape correspond à un nouvel état d’équilibre de toute la colonne. Ces équilibres
successifs sont à la base de la notion de plateau théorique selon lequel la colonne de longueur L
est découpée en N petits disques fictifs de même hauteur H, numérotés de 1 à n. Pour chacun
d’eux, la concentration du soluté dans la phase mobile est en équilibre avec la concentration dans
la phase stationnaire de ce soluté. À chaque nouvel équilibre le soluté a progressé d’un petit
disque supplémentaire dans la colonne, appelé plateau théorique.
La hauteur équivalente à un plateau théorique est donnée par la relation :
L
H=
N
-Facteur de résolution
La résolution est une mesure de la qualité d’une
séparation
La valeur de R=1.5 présente une meilleure résolution

5-Types de chromatographie

1-Chromatographie en phase liquide (CPL)

La chromatographie liquide repose sur la séparation de composés entraînés par un liquide (phase
mobile) à travers un solide divisé (phase stationnaire) qui est soit placé dans un tube (colonne
chromatographique), soit fixé sur une surface inerte. La séparation s'opère suivant les interactions
chimiques ou physiques des analytes avec la phase mobile ainsi qu'avec la phase stationnaire.
-Appareillage

a) Chromatographie sur couche mince (CCM)

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La chromatographie sur couche mince s’effectue généralement sur une fine couche de silice
(phase stationnaire) déposée sur un support (une plaque de verre ou sur papier, matière plastique
ou d'aluminium)
Le mélange à étudier est ensuite posé à l’aide d’un capillaire (pipette Pasteur par exemple ou
micropipette) à environ 1 cm du bord puis placé dans une cuve contenant l’éluant. Le niveau de
l’éluant devant être en dessous du produit déposé.
La cuve de chromatographie est ensuite refermée par un couvercle. L’éluant migre sur la plaque
de silice par capillarité et entraîne les composés du mélange étudié. Si les vitesses de migration des
composés sont différentes, ils seront séparés.
b) Chromatographie sur colonne

La chromatographie sur colonne, elle utilise une phase stationnaire introduite dans une colonne.

Le principe est basé sur des phénomènes d'adsorption. La phase solide, le plus souvent l'alumine
ou la silice, remplit une colonne de longueur et de section variables; l'échantillon, en solution
concentrée, est déposé en haut de la colonne et la séparation des composants résulte de
l'écoulement continu d'un éluant, traversant la colonne par gravité ou sous l'effet d'une faible
pression.
On peut utiliser comme éluant (phase mobile) un solvant unique ou bien accroître
progressivement la polarité de l'éluant de façon à accélérer le déplacement des composés.
Les composants sont entraînés vers le bas à des vitesses variables selon leur affinité pour
l'adsorbant et leur solubilité dans l'éluant, ils seront séparés et recueillies.

2-Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

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La CPG repose sur l’équilibre de partage des composés entre une phase stationnaire et une phase
mobile gazeuse. La séparation des composés repose sur la différence d’affinité de ces composés
pour la phase mobile et pour la phase stationnaire. Le mélange à analyser est vaporisé puis
transporté à travers une colonne renfermant une substance liquide ou solide qui constitue la
phase stationnaire. Le transport se fait à l'aide d'un gaz inerte, appelé « gaz vecteur », qui constitue
la phase mobile.

1-Principe
-Le gaz vecteur est le gaz qui circule à l’intérieur du chromatographe, entraînant les analytes à
travers la colonne, depuis l’injecteur jusqu’au détecteur.

Le mélange à éluer est injecté à l’aide d’une seringue. Une fois vaporisés par l’injecteur, les
composés sont entraînés dans la colonne par le gaz vecteur (le plus souvent He ou N2). Suivant
l’affinité avec la phase stationnaire, les composés sont séparés avant d’être détectés en sortie de
colonne.
2-Appareillage (Chromatographe)
Il est constitué de : 1-Chambre d’injection (injecteur), 2-Colonne, 3- Détecteur

1-Chambre d’injection
La chambre d’injection permet à la fois l’introduction de l’échantillon dans la colonne du
chromatographe, ainsi que la volatilisation des composés. La température de l’injecteur doit être
réglée de manière à entraîner la vaporisation de tous les composés de l’échantillon.

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Chapitre 1 Méthodes chromatographiques

Plus la molécule a d’affinité pour la phase stationnaire, moins

elle est entraînée par le gaz vecteur et donc plus elle est retenue
sur la colonne.

2-Colonne
Elle est constituée d'un tube généralement métallique de diamètre intérieur de l'ordre du
millimètre. Ce tube contient la phase stationnaire constituée par un liquide adsorbant fixé sur un
solide inerte.

*Les colonnes remplies sont un diamètre de quelques millimètres et une longueur de l’ordre du
mètre. Elles sont remplies de granules de support inerte, généralement de la silice, dont la surface
est imprégnée ou greffée avec la phase stationnaire.
*Les colonnes capillaires sont de simples tubes d’acier inoxydable, de verre ou de silice fondue
(matériau inerte vis-à-vis de la phase stationnaire et des échantillons) de diamètre intérieur
compris entre 0,1 et 0,5 mm, et d’une longueur typique de plusieurs dizaines de mètres, pouvant
aller jusqu’à 100 m.

Remplie de 2 mm de diamètre colonne capillaire « 530 » de 0,53 mm

3-Détecteur
Le détecteur transforme le signal à un chromatogramme, qui donne la concentration de chaque
constituant. Tous les détecteurs donnent une réponse qui dépend de la concentration molaire ou
massique du soluté dans le gaz vecteur.
Détecteur à conductibilité thermique (TCD), Détecteur à ionisation de flamme (FID)

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Chapitre 1 Méthodes chromatographiques

Détecteur thermoionique (NPD), Détecteur à capture d’électrons (ECD), Détecteur à photo-

ionisation (PID),

*Détecteur à ionisation de flamme (FID)

La phase mobile pénètre dans un brûleur alimenté par un
mélange H2 +air pour la combustion de l’échantillon. La
production d’ions et d’électrons produit un faible courant
électrique amplifié par un électromètre. La valeur du courant
est transformée à un signal.

*Phase greffée

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