PR-REITORIA ADJUNTA DE PESQUISA E PS-GRADUAO PROGRAMA INSTITUCIONAL DE BOLSAS DE INICIAO CIENTFICA PIBIC 2010/2011 FORMULRIO PARA RELATRIO PARCIAL

Nome Completo: Thiago Couto Silva Curso: Medicina E-mail: thiagocouto.med@gmail.com Ttulo do Projeto: ANLISE COMPARATIVA DO TRATAMENTO COM FATOR DE CRESCIMENTO INSULNICO (IGF) A 1% E 3% SOBRE A CICATRIZAO DE FERIDAS EM RATOS DIABTICOS E NO DIABTICOS .

Nome do Bolsista: Thiago Couto Silva Voluntrio (s):

1. Resumo do Projeto. No Brasil estima-se que 3% da populao seja portadora de algum tipo de leso crnica, e que cerca 2,7% dos brasileiros apresente ulceras crnicas nos ps e/ou nas pernas, o que representa a segunda causa de afastamento do trabalho no Brasil. Essa porcentagem maior nos diabticos chegando a 10%(3). Mais de 100 fatores fisiolgicos conhecidos contribuem para a deficincia na cicatrizao de feridas em indivduos com diabetes. Estes incluem a diminuio da produo ou dificuldade de produo do fator de crescimento, a resposta angiognica, a funo dos macrfagos, o acmulo de colgeno, funo de barreira da epiderme, a quantidade de tecido de granulao, a quantidade de queratincitos e migrao e proliferao de fibroblastos, nmero de nervos epidrmicos, a cicatrizao ssea e o equilbrio entre o acmulo de componentes do meio extracelular e sua remodelao por metaloproteinases de matriz. A cicatrizao ocorre como uma resposta celular leso e envolve a ativao dos queratincitos, fibroblastos, clulas endoteliais, macrfagos e plaquetas. Muitos fatores de crescimento e citocinas liberadas por esses tipos de clulas so necessrios para coordenar e manter a cicatrizao. Estudos evidenciaram que a insulina exerce um papel na cicatrizao de feridas. Nosso estudo se prope a relatar com detalhes

todos os procedimentos e intervenes realizadas e incluir em sua discusso a anlise das intercorrncias, avaliando a eficcia e a segurana da aplicao do fator de crescimento insulnico como terapia adjuvante ao tratamento multidisciplinar convencional de feridas 2. Resultados encontrados (at atual data): At o momento no obtivemos nenhum resultado quanto ao objetivo do estudo 3. Etapas concludas (at atual data): Foram feitos quatro grupos cobaias para induo ao diabetes, por injeo endovenosa de aloxana (5,6 Dioxiuracil monohidrato) diluda em soluo aquosa a 2%, em dose nica de 42mg/kg, e acompanhamento da glicemia com jejum de 12 horas das mesmas, nos 14, 21 e 28 aps a data da induo segundo demontrado nas tabelas: LEGENDAS M Cobaia morta D Cobaia descartada HI Glicemia > 600 mg/dL 14 dias aps induo Grupo 1 (25/08/10) Grupo 2 (01/09/10) Grupo 3 (23/09/10) Grupo 4 (20/10/10) GRUPO 1 Induo 25/08/2010 Caixa 1 AFERIO Rato n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Peso 275 305 280 285 275 295 305 250 250 255 Dose 588 651 588 609 588 630 651 525 525 546 Peso 275 270 270 285 275 280 295 250 200 240 08/09 Glicemia 80 216 220 67 78 79 87 80 250 91 Peso D 230 265 D D D D D 180 D 15/09 Glicemia D 484 352 D D D D D 454 D Peso D 220 240 D D D D D 180 D 22/09 Glicemia D 235 289 D D D D D 423 D 08/09 15/09 07/10 03/11 21 dias aps induo 15/09 22/09 14/10 10/11 28 dias aps induo 22/09 29/09 21/10 17/11

GRUPO 2 Induo 01/09/2010 - Caixa 1 Rato n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Peso 255 280 295 300 285 280 280 295 265 265 Dose 472 588 619 630 598 588 588 619 556 556 Peso 240 335 235 235 280 215 M M 270 330 15/09 Glicemia 112 67 398 332 81 124 M M 67 89

AFERIO Peso 235 D 230 215 D M M M D D 22/09 Glicemia 593 D 310 250 D M M M D D Peso 235 D 235 220 D M M M D D 29/09 Glicemia 384 D 420 414 D M M M D D

Induo 01/09/2010 - Caixa 3 Rato n 12 15 3 4 5 6 7 8 9 10 Peso 280 285 265 270 265 250 290 265 275 280 Dose 588 598 556 567 556 525 609 556 577 588 Peso 320 240 185 305 320 M 270 M 340 260 15/09 Glicemia 73 584 353 72 78 M 180 M 69 284

AFERIO Peso D 220 190 D D M 270 M D 260 22/09 Glicemia D 570 HI D D M 357 M D 261 Peso D 205 180 D D M 270 M D 255 29/09 Glicemia D 561 549 D D M 169 M D 377

Induo 01/09/2010 - Caixa 4 Rato n 1 2 16 4 5 6 7 8 9 10 Peso 245 255 285 270 280 255 260 265 245 275 Dose 514 535 598 567 588 535 546 556 514 577 Peso 285 M 330 215 320 220 235 220 M 300 15/09 Glicemia 60 M 74 488 75 428 156 325 M 82

AFERIO Peso D M D 205 D 200 250 215 M D 22/09 Glicemia D M D 317 D 540 565 407 M D Peso D M D 205 D 190 235 205 M D 29/09 Glicemia D M D 493 D 527 413 493 M D

Induo 01/09/2010 - Caixa 5 Rato n 14 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Peso 230 290 275 250 230 250 275 275 270 270 Dose 483 609 451 525 483 525 577 577 567 567 Peso 240 340 320 270 265 305 185 230 210 335 15/09 Glicemia 72 72 68 76 76 75 349 348 244 74

AFERIO Peso D D D D D D 170 220 200 D 22/09 Glicemia D D D D D D 380 286 362 D Peso D D D D D D 155 220 200 D 29/09 Glicemia D D D D D D 525 577 358 D

AFERIO Induo 01/09/2010 - Caixa 6 Rato n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Peso 295 290 295 285 310 320 310 320 285 285 Dose 619 609 619 598 651 672 651 672 598 598 Peso 270 260 M 255 275 255 230 370 M 280 15/09 Glicemia 237 358 M 88 112 417 338 67 M 74 Peso 290 235 M D 275 235 215 D M D 22/09 Glicemia 582 411 M D 196 541 448 D M D Peso 275 240 M D 280 240 200 D M D 29/09 Glicemia 403 535 M D 204 479 585 D M D

GRUPO 3 Induo 23/09/2010 - Caixa 1 Rato n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Peso 280 295 285 305 305 275 305 280 300 290 Dose 588 678 598 640 640 577 640 588 630 609 Peso M 315 295 270 300 M 230 M 280 250 07/10 Glicemia M 81 96 71 71 M 65 M 66 208

AFERIO Peso M D 300 D D M D M D 250 14/10 Glicemia M D 170 D D M D M D 285 Peso M D 330 D D M D M D 265 21/10 Glicemia M D 99 D D M D M D 435

GRUPO 4 Induo 20/10/2010 - Caixa 1 Rato n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Peso 280 295 350 375 300 320 305 280 300 290 Dose 588 678 598 640 640 577 640 588 630 609 Peso M 215 355 455 350 320 M M M M 03/11 Glicemia M 245 61 72 76 70 M M M M

AFERIO 10/10 Peso Glicemia M M 190 325 D D D D D D D D M M M M M M M M AFERIO

Peso M 180 D D D D M M M M

17/10 Glicemia M 257 D D D D M M M M

Induo 20/10/2010 - Caixa 2 Rato n 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Peso 230 290 275 250 230 250 275 275 270 270 Dose 483 609 451 525 483 525 577 577 567 567 Peso M M 210 M M 310 M 180 200 M 03/09 Glicemia M M 288 M M 58 M 166 483 M

Peso M M 206 M M D M 188 190 M

10/11 Glicemia M M 320 M M D M 203 380 M

Peso M M 192 M M D M 173 185 M

17/11 Glicemia M M 240 M M D M 200 310 M

At o momento do incio do tratamento contabilizamos: Ratos induzidos: 90 Ratos Descartados: 38 Ratos mortos: 24 Ratos diabticos: 28

Para o experimento foram utilizados 24 ratos da linhagem Wistar (Ratus norvegicus albinus), machos, pesando entre 250 e 300g divididos em 6 grupos: Grupo 1: diabtico tratado com IGF creme 1% Grupo 2: diabtico tratado com IGF creme 3% Grupo 3: diabtico sem tratamento Grupo 4 : no diabtico tratado com IGF creme 1% Grupo 5 : no diabtico tratado com IGF creme 3% Grupo 6 : no diabtico sem tratamento Aps a separao dos grupos fizemos a anestesia geral dos animais e realizados os procedimentos cirurgicos, onde foi retirado atravs da utilizao de punch um fragmento de 0,9 cm . A partir de ento foi realizado tratamento dirio das feridas de acordo com os grupos que foram previamente separados, grupos 1 e 4 foram trados com creme IGF 1%, grupos 2 e 5 com creme IGF 3% e os grupos 3 e 6 ,os animais no tratados, receberam aplicao de soluo salina 0,9% diariamente. Foi realizada eutansia de um animal de cada grupo no 3, 7, 14, 21 dias aps a leso e foram retiradas amostras e fixao das mesmas em soluo de formol 10% para confeco das laminas e anlise histolgica. Para a confeco das laminas foi necessrio fixao em formol a 10% tamponado para preservar a morfologia e a composio dos tecidos por cerca de 12h, logo aps o material foi analizado, anotando-se identificao da amostra, tamanho, caracterirstica da leso e posteriormente seccionado. O material passou por um processamento em aparelho histotcnico que submete o material a diversas etapas que possibilitam a confeco do bloco de parafina, estas etapas so desidratao, em lcool etlico de concentraes crescentes, comeando com lcool a 70% e terminando com lcool absoluto para remover a gua dos tecidos por cerca de 6h. Etapa de clareamento ou diafanizao em xilol solventes do lcool e da parafina, que embebem o material em xilol tornando-a miscvel em parafina durante 2h. A etapa seguinte a impregnao pela parafina fundida, para que a parafina seja impregnada nas estruturas teciduais, para facilitar a obteno dos cortes no micrtomo dura cerca de 2h. A ultima etapa a incluso, onde as secces da pea colocada num molde contendo parafina fundida, para ser cortado no micrtomo. O bloco de parafina ento submetido a microtomia, a etapa em que se obtm delgadas fatias de peas includas na parafina,atravs de cortes relizados por um aparelho, micrtomo, que realiza cortes de 5 a 10 um (micrmetros), onde o resultado final uma fita com diversos cortes, que passa pela etapa de extenso,onde colocam-se as seces a flutuar em banho-maria para desfazer as rugas, so esticados num banho de gua fria e posteriormente em soluo alcoolica a 30% a 58C, e pescados com uma lmina. Leva-se ento, estufa a 37C, por 2 horas, para que se d a colagem do corte lmina e o derretimento da parafina . As laminas foram subtidas a coloraes que tem a finalidade de dar contraste aos componentes dos tecidos, tornando-os visveis e destacados uns dos outros, para este estudo foram utilizadas as coloraes de HE e de Tricromio de Masson. Para corar peas includas em parafina necessria a retirada da parafina e a hidratao da pea. Este procedimento realizado a partir de uma seqncia de banhos em xilol, lcool e gua, inversamente ao procedimento executado na etapa de incluso. Aps a hidratao, os cortes so corados de acordo com o procedimento mais apropriado para a anlise que ser realizada posteriormente. O material utilizado para a soluo de Hematoxilina de Harris:

- Hematoxilina 2,5g - lcool 100% 25ml - Almen de amnio ou potssio 50g - gua destilada 500ml - xido vermelho de mercrio 1,25g - cido actico 20ml Inicialmente, a Hematoxilina foi dissolvida no lcool e o almen na gua destilada (previamente aquecida). Posteriormente, as duas solues foram misturadas e aquecidas at a fervura. O xido de mercrio adicionado soluo que posteriormente deve ser resfriada, mergulhando-se o frasco em gua fria. O cido actico ento colocado na soluo fria para finalmente ser filtrada. O Material utilizado para a Eosina : - Eosina solvel em gua 1g - gua destilada 100ml A eosina solvel foi dissolvida em agua e posta para banho de luz por 24h. Embora as etapas possam ser definidas, o tempo em cada fase depende da qualidade e da idade das solues dos corantes. Deste modo, poder ser acontecer uma variao em relao ao tempo que pode ter sido ajustado durante o procedimento no laboratrio. As etapas para a realizao da colorao de HE foram 1. Desparafinizao em xilol e hidratao dos cortes com alcool de concetrao decrescente; 2. Imersso em hematoxilina entre 5 e 15min; 3. Lavagem em gua corrente por 10min; 4. Imersso em eosina entre 1 e 10min; 5. lavagem em gua e desidratao em lcool 70%; 6. diafanizao com xilol e montagem, este processo consiste em depositar uma gota de ERV-MOUNT , resina lquida, sobre o corte que est aderido lmina de vidro e cobrilo com uma lamnula. Para posterior estudo histolgico da cicatrizao e visualizao dos depsitos de colgeno foi utilizada a tcnica do Tricromio de Masson onde foram utilizados quatro diferentes corantes: hematoxilina frrica de Weigert para ncleos, cido pcrico para eritrcitos, uma mistura de corantes cidos (fucsina cida-vermelho de xilidina) para citoplasma e azul de anilina para tecido conjuntivo. Na qual obtemos o seguinte resultado final: Ncleos e gametas............................................................................. preto Citoplasma, ceratina, fibras musculares, acidfilo....................... vermelho Colgeno, muco, grnulos basfilos da hipfise.................................. azul Grnulos das clulas delta da hip..........................................................azul Eritrcitos.......................................................................................amarelo Para a confeco das laminas com a colorao histoquimica de masson se segui o seguinte mtodo: 1. Desparafinizao das lminas em xilol por 5 minutos. Posterior, Hidratao das lminas em lcool 99, 95, 70 lavagem das laminas em gua corrente; 2. Secagem da lmina em estufa a 70 C; 3. Cobertura do lamina com hematoxilina frrica de Weigert embebendo o corte em corante por 10 minutos; 4. Lavagem da lmina em gua corrente, e secagem da mesma;

5. Aplicao de soluo alcolica de cido pcrico na seo de tecido o suficiente apenas para cobrir o corte por 6 minutos; 6. Lavagem rapida das sees em gua destilada no deixando sair totalmente a colorao amarelada do tecido, secagem da lmina e aplicao de 10 gotas fucsina ponceau cida segundo Mallory na seo de tecido e por 4 minutos; 7. Lavagem das lminas em gua corrente e aplicao de 10 gotas de soluo cida fosfomolbdica na seo de tecido ou o suficiente apenas para cobrir o corte por 5 minutos; 8. Secagem das lminas sem lav-las e aplicao de 10 gotas de Azul de anilina de Masson ou o suficiente apenas para cobrir o corte por 5 minutos. 9. Lavagem em gua destilada e desidratada em srie de lcool ascendente at o xilol e posterior montagem das lminas com ERV-MOUNT e laminula. As laminas de ambas coloraes foram identificadas de acordo com a tabela abaixo, afim de preservar a avaliao histolgica, fazendo com que as amostras no sejam identificados por seus grupos pertencentes. AMOSTRAS COM 3 DIAS 16/12 /2010 DIBTICOS TRATADOS IGF 3% AMOSTRA 1 DIBTICOS TRATADOS IGF 1% AMOSTRA 2 DIBTICOS NO TRATADOS AMOSTRA 3 NO DIABTICOS TRATADOS IGF 3% AMOSTRA 4 NO DIABTICOS TRATADOS IGF 1% AMOSTRA 5 NO DIABTICOS NO TRATADOS AMOSTRA 6 AMOSTRAS COM 7 DIAS 20/12/2010 DIBTICOS TRATADOS IGF 3% DIBTICOS TRATADOS IGF 1% DIBTICOS NO TRATADOS NO DIABTICOS TRATADOS IGF 3% NO DIABTICOS TRATADOS IGF 1% NO DIABTICOS NO TRATADOS AMOSTRAS COM 14 DIAS 27/12/2010 DIBTICOS TRATADOS IGF 3% DIBTICOS TRATADOS IGF 1% DIBTICOS NO TRATADOS NO DIABTICOS TRATADOS IGF 3% NO DIABTICOS TRATADOS IGF 1% NO DIABTICOS NO TRATADOS AMOSTRAS COM 21 DIAS 03/01/2011 DIBTICOS TRATADOS IGF 3% DIBTICOS TRATADOS IGF 1% DIBTICOS NO TRATADOS NO DIABTICOS TRATADOS IGF 3% NO DIABTICOS TRATADOS IGF 1% NO DIABTICOS NO TRATADOS AMOSTRA 7 AMOSTRA 8 AMOSTRA 9 AMOSTRA 10 AMOSTRA 11 AMOSTRA 12 AMOSTRA 13 AMOSTRA 14 AMOSTRA 15 AMOSTRA 16 AMOSTRA 17 AMOSTRA 18 AMOSTRA 19 AMOSTRA 20 AMOSTRA 21 AMOSTRA 22 AMOSTRA 23 AMOSTRA 24

5. Etapas a concluir: Exame histolgico das laminas; Lanamento dos resultados; Concluso baseada nos resultados obtidos. 6. Necessidade de re-adequao do Plano de Atividades do Bolsista proposto anteriormente: Sem mais. 7. Necessidade de re-adequao do Cronograma de Execuo do Projeto proposto anteriormente: Sem mais. 8. Demais informaes relevantes: Sem mais 9. Anexos Relatrio de Acompanhamento de orientao

So Paulo,

de

de 2011.

_________________________ Assinatura do Aluno

________________________ Assinatura do Orientador