Chromatographie 

:
I. Introduction :
La chromatographie est une technique d'analyse chimique de la
chimie analytique pouvant être couplée à un détecteur en vue d'une analyse
qualitative et/ou quantitative. En chromatographie, l'échantillon contenant
une ou plusieurs espèces est entraîné par un courant de phase mobile
(liquide, gaz ou fluide supercritique) le long d'une phase stationnaire (papier,
gélatine, silice, polymère, silice greffée etc). Chaque espèce se déplace à une
vitesse propre dépendant de ses caractéristiques et de celles des deux phases.

I-1.Histoire
Le botaniste russe Mikhail Tswett (1872-1919) fut, en 1960, le
premier à utiliser le terme chromatographie.
partir de 1903, Tswett utilisa des colonnes d'adsorption pour séparer
des pigments de plantes. On spécula donc l'étymologie du mot
« chromatographie » à partir du grec khrôma- pour couleur et donc pigment.
Toutefois, Tswett ne donna jamais cette explication, mais tswett est le mot
russe pour « couleur ».
En 1952, Martin et Synge reçurent le prix Nobel de chimie pour leur

invention de la chromatographie de partage].

I-2.Terminologie
Le mot chromatographie vient du grec ancien Khrôma qui signifie
"couleur" et Graphein qui signifie "écrire"
 I-3.Définitions:
la Chromatographie est une méthode physique de séparation basée
sur les différences d'affinités des substances à analyser à l'égard de deux
phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. Selon la technique
chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par
la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption
successive sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans
chaque phase.

 Phase stationnaire : phase fixe soit sur la surface intérieure

d'une colonne soit sur une surface plane.

 Phase mobile : phase qui se déplace à travers la phase

stationnaire, en entraînant les 1analytes. La phase mobile ne doit
pas interagir avec la phase stationnaire mais uniquement avec les
analytes.

 Chromatogramme : graphique d’une fonction de la

concentration en analyte en fonction du temps (ou du volume)
d’élution.

I-3-1 .La chromatographie analytique

Est utilisée pour identifier ou doser les composés chimiques d'un

mélange et apprécier leur concentration.

I-3-2.La chromatographie préparative

Est utilisée pour purifier assez de produit pour d'autres utilisations.
Son but est d'obtenir de la substance ; c'est pourquoi, à toute échelle, elle
implique de collecter des fractions.
 I-4 Principe général de tous les types de
chromatographie
La chromatographie repose sur l'entraînement d'un échantillon dissous
par une phase mobile à travers une phase stationnaire. Celle-ci retient plus
ou moins fortement les substances contenues dans l'échantillon dilué selon
l'intensité des forces d'interactions de faible énergie (comme les forces de
Van der Waals, les liaisons hydrogène, etc.) réalisées entre les différentes
espèces moléculaires et la phase stationnaire.
Les différents composants de l'échantillon ont généralement une
vitesse caractéristique qui permet de les séparer, voire de les identifier. Cette
vitesse de séparation est fortement dépendante de la nature de la phase
mobile et de la phase stationnaire.
Souvent, l'échantillon est analysé par comparaison avec des substances déjà
connues dans l'échantillon ou par comparaison avec les résultats de l'analyse
d'une solution-étalon (solution commerciale contenant des substances
connues, à des concentrations bien connues). Ces substances servent de
références et permettent d'identifier ou de doser chaque espèce par
comparaison des vitesses de séparation (et éventuellement d'autres
renseignements donnés par la détection). Il s'agit de chromatographie
analytique.
Dans d'autres cas, on se contente de séparer les fractions, de les récolter
pour les identifier par d'autres techniques : c'est la chromatographie
préparative.
Il existe de nombreux types de chromatographie ; on peut notamment les
classer selon la nature de la phase mobile :
· la chromatographie sur couche mince (CCM ou TLC en anglais) ;
 · la chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC en anglais)
également appelée CPV (chromatographie en phase vapeur) ;
· la chromatographie en phase liquide (CPL ou LC en anglais) ;
· la chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP ou
HPLC en anglais) ;
· la chromatographie en phase supercritique (CPS ou SFC en anglais).

On peut aussi les nommer selon les interactions développées par la phase
stationnaire :

· la chromatographie d'adsorption/d'affinité ;
· la chromatographie de partage ;
· la chromatographie à échange d'ions ;
· la chromatographie chirale (qui est, soit de la CPG, soit de la CPL) ;
· la chromatographie d'exclusion stérique (CES ou SEC en anglais) ;

Ou selon le support de la phase stationnaire :

· la chromatographie sur colonne (regroupant notamment HPLC et

CPG) : la phase stationnaire est dans un tube étroit et la phase mobile
progresse par gravité ou différence de pression ;
· la chromatographie planaire (qui recouvre CCM et chromatographie
sur papier) : la phase stationnaire est sur la surface d'un support plat
(CCM) ou dans une feuille de cellulose poreuse (chromatographie
papier) et la phase mobile se déplace par capillarité ou par gravité.
II. Chromatographie sur couche
mince
II-1.Définition
La chromatographie sur couche mince ou chromatographie planaire
(CCM, en anglais TLC pour Thin layer chromatography) est une technique
de chromatographie couramment utilisée pour séparer des composants dans
un but d'analyse (CCM analytique) ou de purification (CCM préparative).

Elle comprend :

 une phase stationnaire : une couche mince de matériel adsorbant

(usuellement du gel de silice, de l'oxyde d'aluminium ou de la
cellulose)

 une phase liquide, dite phase mobile ou 399999éluant : un solvant

ou un mélange de solvants qui va entraîner les composés à séparer
le long de la phase stationnaire.

Le phénomène d’adsorption est prépondérant

(Mais il y a également partage si le solvant est un mélange).

II-2.Constitution d'une plaque de CCM

Une plaque de CCM est un support en verre, en aluminium ou en
plastique sur lequel a été étalée une phase stationnaire en couche uniforme.
L'épaisseur de cette couche est de l'ordre de 0,2 mm pour une plaque
analytique et 1-3 mm pour une plaque préparative. Avant étalement, la
phase stationnaire est une poudre fine et elle doit donc être mélangée à un
liant qui assure la bonne cohésion de la couche et une bonne adhérence au
support. On utilise le plus fréquemment un liant inorganique comme du
sulfate de calcium hémihydraté, ou un liant organique (par exemple l'alcool
polyvinylique) notamment lorsque la phase stationnaire est hydrophobe.

On ajoute souvent un pigment fluorescent pour permettre une détection

des produits à la lumière ultraviolette à 254 nm ou 366 nm ; à cette longueur
d'onde, le pigment de la phase stationnaire émet une lumière, verte en
général, sauf aux endroits où un produit absorbe le rayonnement UV ce qui
provoque l'apparition de taches sombres.

II-3. Principe de la technique

Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l'échantillon est placée dans
la cuve, l'éluant monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par
capillarité. En outre, chaque composant de l'échantillon se déplace à sa
propre vitesse derrière le front du solvant.
Cette vitesse dépend d'une part, des forces électrostatiques retenant le
composant sur la plaque stationnaire et, d'autre part, de sa solubilité dans la
phase mobile.
Les composés se déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à
la phase mobile, l'action de rétention de la phase stationnaire étant
principalement contrôlée par des phénomènes d'adsorption. Généralement,
en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarité
migrent plus rapidement que les composants polaires.

II-4.Calcul de Rf (rapport frontal)

Le rapport Rf permet de caractériser une espace chimique dans un
éluant donné.
Le rapport frontal entre di et ds. Rf=di / ds
di : distance parcourue par le composé (mesure au centre de la tache)
ds : distance parcourue par le front d u solvant
di et sont exprimes de même unité, Rf sans unité.
Rf est toujours indépendant de la longueur de bande utilisée.

II-5.Description par ccm selon l ordre

chronologique
II-5-1.Préparation de la cuve
chromatographique :
• Introduire l'éluant ou le mélange de solvants.
• Ajuster le niveau à environ 0,5 cm du fond de la cuve.
• Fermer le récipient (la cuve doit être saturée de vapeur de solvant). Pour
que la
saturation et l'élution soient plus rapides, on peut placer une bande de papier
filtre
contre les parois de la cuve chromatographique.

II-5-2.Dépôt de l'échantillon sur la plaque :

• Procéder au nettoyage de la plaque si nécessaire.
• Dissoudre l'échantillon dans un solvant approprié en solution de 2 à 5 % .
• Déposer environ 0,5 μl de la solution en un point situé à 1 cm de
l'extrémité
inférieure de la plaque; le diamètre de la tache doit être d'environ 2 mm
pour la disposition de plusieurs produits.
• Sécher à l'aide d'un séchoir; éventuellement faire de nouvelles applications

II-5-3.Développement du chromatogramme :
• Placer la plaque dans la cuve en position verticale.
• Refermer le récipient.
• Lorsque le front du solvant se trouve à environ 1 cm de l'extrémité
supérieure de la
plaque, la retirer et marquer cette position.(le trait peut être tracé à l'avance
et servir
de repère pour arrêter l'élution).

II-5-4.Révélation et calcul de Rf :

• Sécher la plaque à l'aide d'un séchoir
• Révéler les taches sous une lampe U V ou à l'aide d'un révélateur
• Cercler les taches et pointer leur centre.
• Calculer les R
Figure- 1- :chromatographie sur couche mince ccm.

III. Chromatographie sur papier

III-1.Principe de la technique et applications:
La technique ressemble à celle de la CCM mais le principe repose sur
des phénomènes de partage. La phase mobile est le plus souvent un solvant
organique et l'eau; la phase stationnaire est constituée par l'eau elle-même
adsorbée sur la cellulose du papier ou liée chimiquement à elle. Comme en
chromatographie sur couche mince, l'échantillon, mis en solution, est déposé
en un point repère du papier et le solvant, qui se déplace par capillarité, fait
migrer les composants de l'échantillon à des vitesses variables selon leur
solubilité. Généralement, les composés les plus solubles dans l'eau ou ceux
qui forment facilement des associations par liaisons hydrogène sont
fortement retenus par la phase stationnaire et migrent donc lentement.
Lorsque l'eau est un des solvants de la phase mobile, le ou les solvants
organiques doivent y être assez solubles. Des produits comme l'acide
éthanoïque, le propanol, le phénol ou la pyridine sont les solvants les plus
fréquemment utilisés en mélange avec de l'eau pour développer un
chromatogramme.
La chromatographie sur papier est employée principalement pour
l'analyse de composés très polaires, tels les acides aminés, les sucres et les
composés polyfonctionnels.
Ses plus grands inconvénients par rapport à la CCM sont:
• Une durée de développement beaucoup plus longue
• Une séparation généralement moins bonne.
III-2.Papier:
On peut utiliser du papier filtre ordinaire, mais il est préférable de se
procurer du papier conçu pour cet usage, ayant un faible taux d'impuretés et
dont les caractéristiques sont uniformes. Les marques principales sont
Whatman, Schleicher et Schüll, Durieux, Arches. Il existe huit catégories de
papier Whatman, classés selon leur épaisseur, la texture de leur surface et la
vitesse avec laquelle l'eau y diffuse. Par exemple le papier Whatman n° 1 est
le plus utilisé, mais si on désire une grande vitesse d'écoulement, on
emploiera le n° 4; le papier n° 20 est très lent, mais il permet une meilleure
séparation , donnant des taches très denses et uniformes.
La description de l'analyse par chromatographie sur papier est identique à
celle sur couche mince.

Figure -2-. Schéma d'une chromatographie sur papier

 Figure -3-. Résultat d'une chromatographie de base sur papier filtre. Fait
avec des feuilles d'épinard

La chromatographie sur papier peut aussi constituer une technique

micro-préparative : pour récupérer les produits ainsi séparés, les portions du
papier où ils se situent sont découpées et redis soutes ensuite. Les quantités
récupérables sont de l'ordre du milligramme ou moins.
IV Chromatographie en phase liquide
IV-1. Définition

IV -2.Les différents types de

chromatographie en phase liquide

Ils sont classés ici selon les interactions des analyses avec la phase
stationnaire.

 Chromatographie d'adsorption

Dans cette chromatographie, la phase stationnaire consiste en une

matière solide à grand pouvoir d'adsorption, tel que l'oxyde d'aluminium, les
silicates de magnésium, les gels de silice. Les composants sont simplement
plus ou moins retenus à la surface de la phase stationnaire par adsorption
physique. C'est une technique qui prend en compte la polarité des
composants.

 Chromatographie de partage

Dans cette chromatographie les analytes sont séparés en fonction de

leur affinité avec les phases stationnaire et mobile. L'affinité dépend de la
polarité des analytes et des phases. En mode normal la phase stationnaire est
polaire, en mode inverse elle est apolaire. Il y a deux types de
chromatographie de partage :

 liquide - liquide : la phase stationnaire consiste en une très fine couche

de liquide répartie par adsorption physique à la surface du matériau
support le plus inerte possible. Les composants sont séparés comme
dans une extraction liquide-liquide, sauf que la répartition des
composants se fait lors du passage dans la phase liquide et non par
agitation.

 liquide - solide ou liquide - phase greffée : la phase stationnaire

consiste en une espèce organique liée par des liaisons chimiques à la
surface des particules du matériau support.

 Chromatographie par échange d'ions

La phase solide est une résine insoluble munie de groupes

fonctionnels capable de dissocier. Ce sont, habituellement, des groupes «
acide sulfonique » (SO3H) pour les échangeurs de cations et « ammonium
quaternaire » (N(R)3) pour les échangeurs d'anions.

 Chromatographie d'exclusion stérique

Les composants sont séparés selon leur dimension moléculaire. La

phase stationnaire est composée d'un matériau poreux (petites particules de
silice ou de polymères), les molécules dont le diamètre est supérieur à celui
des pores ne peuvent pénétrer et ne sont pas retenues. La durée de séjour
dans la colonne augmente lorsque la taille des analytes diminue.

 Chromatographie chirale

Cette technique de chromatographie consiste en la formation de liaisons

non covalentes entre les énantiomères du substrat et l'absorbant
chromatographique chiral donnant des complexes diastéréoisomères ayant
des affinités de liaisons différentes. Elle sert donc en particulier à séparer des
énantiomères.

IV-3.Chromatographie en phase
liquide à haute performance
IV-3-1Définition

La chromatographie en phase liquide à haute performance (CLHP)

mais on trouve plus fréquemment l'abréviation anglaise HPLC (high
performance liquid chromatography) depuis les années 1990 . est une
technique de séparation analytique en fonction de l'hydrophobicité et
préparative des molécules d'un composé ou d'un mélange de composés. Pour
certains, HP signifie « haute pression ».

Cette forme de chromatographie est fréquemment utilisée en biochimie,

ainsi qu'en chimie analytique.

IV-3-2.Principe

L'échantillon à analyser est poussé par un liquide (appelée phase

mobile) dans une colonne remplie d'une phase stationnaire de fine
granulométrie (les « grains » sont de très petite taille). Le débit d'écoulement
de la phase mobile est élevé ce qui entraîne une augmentation de la pression
dans le système. Ce débit élevé diminue le temps nécessaire pour séparer les
composants le long de la phase stationnaire. La fine granulométrie de la
phase stationnaire permet une meilleure séparation des composants. En effet,
pour un même volume de phase stationnaire la surface d'échange augmente
si les « grains » qui la composent sont de diamètre plus petit. Les pics
obtenus sont plus étroits donc la résolution est améliorée (les pics sont bien
séparés, on peut donc bien les différencier), le seuil de détection est
également plus bas (des pics étroits et hauts sont plus faciles à isoler du bruit
de fond que des pics larges et bas). La combinaison de ces attributs - rapidité
et résolution élevées - conduit à l'appellation « haute performance ».

Les solvants utilisés sont des combinaisons miscibles d'eau et de divers

liquides organiques (alcools, acétonitrile, dichlorométhane...).

Souvent, la composition de la phase mobile est modifiée au cours de

l'analyse, c'est le mode dit « gradient » ou « élution graduée » (en opposition
au mode « isocratique », pour lequel la composition de la phase mobile reste
la même tout au long de l'analyse). Par exemple, sur une colonne apolaire,
en utilisant un mélange eau/méthanol comme phase mobile, les composants
les plus hydrophobes sont élués avec une concentration élevée en méthanol
alors que les composants plus hydrophiles sont élués préférentiellement avec
une concentration faible en méthanol. Selon la nature de la phase
stationnaire, on commencera par une concentration élevée en méthanol ou le
contraire.

IV-3 .Appareillage et fonctionnement

a)La Pompe:

C'est la partie qui sert à stocker l'éluant et à l'injecter sous pression dans
la colonne. Elle est composée de :
  Deux pistons alternatifs

 Réservoirs de phase mobile

 Électrovannes

 Amortisseur de pulsations

 Système de purge et d'amorçage

 Capteur de pression

On utilise une pompe pour une élution isocratique ou plusieurs pour une
élution par gradient.

b)L'injecteur

Des tubes en acier inoxydable, en Teflon, en PEEK ou en silice fondue

permettent de relier la ou les pompes à l'injecteur chromatographique. Il y a
plusieurs types d'injecteurs :

 Boucle d'injection : permet la répétabilité du volume d'injection

 Injecteur seringue

 Extraction sur phase solide en ligne

c)La Colonne

Elle dépend du type de chromatographie en phase liquide que l'on veut faire
et donc de la nature et du nombre de composés que l'on veut séparer. Il peut
y avoir plusieurs colonnes parallèles. Donc Il y a plusieurs types de
chromatographies en phase liquide .

d) Détecteur
Il existe plusieurs types de détecteurs :
 Détecteur à absorption UV ou visible
  Détecteur à indice de réfraction
 Détecteur UV à barrette de diodes (DAD)
 Détecteur à fluorescence
 Détecteur de type spectromètre de masse (MS)
 Détecteur évaporatif à diffusion de la lumière (DEDL)
 Détecteur électro-chimique (DEC)

Figure -4-.principe de fonctionnement de l’HPLC

IV-3-4. Différentes phases stationnaires

a)Phase normale
Les colonnes en phase normale sont des colonnes dont la phase
stationnaire est polaire et acide.
La phase normale la plus utilisée est à base de gel de silice : à sa surface se
trouvent des groupes silanols (-OH) et des groupes siloxanes (-O-). Ces
groupes permettent à la silice de retenir les composés à analyser par des
liaisons hydrogènes.
Cette phase sert ainsi principalement à séparer des composés polaires.
b)Phase inverse
La base d'une phase inverse est une phase normale sur laquelle des
chaînes alkyles (ou autres selon la polarité recherchée) ont été greffées au
niveau des groupes silanols (end-capping). En général, la phase stationnaire
est majoritairement composée de petites particules de silice sur lesquelles on
a greffé des fonctions chimiques, le plus souvent de chaines alkyles à 8 ou
18 atomes de carbones.
Les fonctions silanols (Si-OH) qui subsistent engendrent des interactions
hydrophiles parasites, qui rendent les résultats non reproductibles surtout
pour les molécules basiques. Pour éviter cela, la surface de la silice est
généralement recouverte par une fonction méthyle et les fonctions silanols
ne sont plus libres mais sous la forme (Si-O-CH3), c'est cette étape que l'on
appelle « end-capping ». Les fonctions chimiques utilisées pour le end-
capping peuvent toutefois être de nature très diverses et les colonnes de
dernières générations résistant à des pH extrêmes sont généralement end-
capped avec des fonctions proposant une plus grande gène stérique, tel que
le tert-butyle (Si-O-C(CH3)3).
Selon le taux de greffage, on obtient une plus ou moins grande résolution.
Cette phase stationnaire est dite « inverse » car de polaire et hydrophile (sans
les « greffes »), la phase devient apolaire et hydrophobe.

IV-3-5.Les Caractéristiques
 IV-3-5-1.Caractéristiques géométriques de la
phase stationnaire
 la longueur L et le diamètre interne dc de la colonne
 le diamètre des particules de phase stationnaire dp

IV-3-5-2.Caractéristiques opératoires de la
phase mobile
 la vitesse linéaire de l'écoulement u
 la perte de charge ou pression appliquée ΔP entre l'entrée et la sortie
de la colonne (la pression de sortie étant généralement
atmosphérique). Elle est donnée par la loi de Darcy

où η est la viscosité de la phase mobile et

Φ est le facteur de résistance à l'écoulement qui dépend de la forme des

particules et de la qualité du remplissage de la phase stationnaire.
Pour des colonnes bien remplies de particules sphériques ou irrégulières, la
formule empirique suivante, établie avec les unités usuelles, permet le calcul
commode d'une estimation de ΔP en fonction du débit F de la phase mobile
avec une incertitude inférieure à 25%
Remarque : la loi de Darcy est à l'hydraulique ce que la loi d'Ohm est à
l'électricité. La pression hydraulique est analogue au potentiel électrique, le
débit de liquide est analogue à l'intensité du courant, la perméabilité
hydraulique est analogue à la conductivité électrique, la pressurisation et la
dépressurisation d'une colonne chromatographique sont respectivement
analogues à la charge et à la décharge d'un condensateur électrique.

IV-3-6.Grandeurs caractéristiques en
chromatographie
Le résultat observable d'une analyse HPLC se présente sous la
forme d'une courbe du signal détecté en fonction du temps : c'est le
chromatogramme. Il comporte plusieurs pics de forme gaussienne, de
caractéristiques différentes :
 le temps de rétention ou tR, temps du maximum du pic. On appelle t0
ou temps de rétention nulle le temps correspondant à un composé non
retenu chromatographiquement.
 la largeur du pic, mesurée à mi-hauteur : ω1/2, ou à sa base, par
l'intersection des tangentes du pic à ses points d'inflexion avec la ligne
de base : ω.

De là peuvent être calculées plusieurs caractéristiques de la colonne pour la

séparation des pics :
 le facteur de rétention k' du pic, par la formule
  l' efficacité N ou nombre de plateaux théoriques, reliée à la largeur du
pic par la formule

Cette valeur mesure la finesse du pic. À partir de cette valeur peut être
calculée la hauteur équivalente à un plateau théorique (HEPT) H, qui permet
de comparer des colonnes de longueur différente

 la sélectivité α entre deux pics 1 et 2 (2 étant plus retenu que 1),

définie par le rapport de leurs deux facteurs de rétention

Elle mesure la capacité de la colonne à séparer les maxima des pics. Plus elle
est supérieure à 1, plus les temps de rétention sont éloignés.
 la résolution RS entre les pics 1 et 2

Cette valeur mesure la qualité de séparation et d'absence de recouvrement

entre les 2 pics considérés.

La résolution ainsi définie est l'objectif de la séparation chromatographique.

C'est une fonction des trois caractéristiques (efficacité, sélectivité et
rétention), elles-mêmes définies ci-dessus, dont l'expression est
Cette expression montre notamment qu'une même résolution peut être
obtenue dans des conditions chromatographiques ou bien très efficaces
(optimisation cinétique) ou bien très sélectives (optimisation
thermodynamique). Quoi qu'il en soit, la performance qui caractérise la
technique HPLC est définie par le pouvoir de résolution par unité de temps,
ce qui n'implique pas systématiquement l'utilisation de la pression la plus
haute possible.

v. Chromatographie en phase
gazeuse
v.1.Définition
La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est, comme toutes les
techniques de chromatographie, une technique qui permet de séparer des
molécules d'un mélange éventuellement très complexe de nature très
diverses. Elle s'applique principalement aux composés gazeux ou
susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans décomposition. Elle est de
plus en plus utilisée dans les principaux domaines de la chimie.

Le mélange à analyser est vaporisé à l'entrée d'une colonne, qui renferme

une substance active solide ou liquide appelée phase stationnaire, puis il est
transporté à travers celle-ci à l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les
différentes molécules du mélange vont se séparer et sortir de la colonne les
unes après les autres après un certain laps de temps qui est fonction de
l'affinité de la phase stationnaire avec ces molécules.

V-2. Principe de la
chromatographie en phase gazeuse
Le principe de la séparation chromatographique est illustré sur le
schéma suivant. Le mélange de composés est introduit à l’aide d’une
seringue de façon à ce qu’il entre dans la colonne sous forme vapeur. La
phase mobile est un gaz chimiquement inerte, appelé gaz vecteur. Celui-ci
entraîne avec lui le mélange de composés à travers la colonne qui contient
une phase stationnaire. Les composés du mélange traversent la colonne à des
vitesses différentes. Lorsqu’ils arrivent à la sortie de la colonne, ils sont
détectés par un détecteur qui transmet un signal électrique à un enregistreur.
Les résultats apparaissent sur le chromatogramme sous forme de pics.

V-3. Appareillage et matériaux

Quel que soit le chromatographe à gaz, on retrouve toujours les
principales composantes suivantes :
 Figure -5-. Chromatographie en phase gazeuse

V-3-1. Phase mobile

La phase mobile entraînant les composés dans la colonne est un gaz
de préférence chimiquement inerte. Les principaux sont l’hélium, l’argon,
l’azote et le dioxyde de carbone. Ils sont livrés dans des bonbonnes
surmontées d’un régulateur de pression. Ces gaz doivent être de pureté
analytique, car les impuretés sont responsables des bruits de fond sur le
chromatogramme. Le choix du gaz vecteur dépend principalement du type
de détecteur de l’appareil.

V-3-2. Chambre d’injection

La chambre d’injection est un compartiment placé entre la bonbonne du gaz
vecteur et le four principal contenant la colonne. Elle est munie d’éléments
pouvant chauffer le compartiment à des températures très élevées.
L’injection des échantillons se fait à l’aide d’une seringue graduée en
microlitres qui est introduite dans la chambre à travers une rondelle en
caoutchouc. À cause de la température élevée dans le compartiment, les
composés passent instantanément à l’état vapeur et sont poussés par le gaz
vecteur vers la colonne chromatographique.

V-3-3. Four principal

Le four principal est un compartiment, placé entre la chambre d’injection et
le détecteur, qui contient la colonne chromatographique. Il est muni
d’éléments chauffants pouvant contrôler la température du four avec une très
grande précision. Des contrôles permettent également de travailler à
température programmée pour la séparation de mélanges de composés ayant
des capacités de rétention très différentes sur la phase stationnaire.

V-3-4. Colonnes
Les colonnes sont des tubes de 4 à 6 mm de diamètre, en acier
inoxydable, en cuivre ou en verre.
Leur longueur varie habituellement de 1 à 4 mètres. Elles sont repliées en U
ou en hélice pour en diminuer l’encombrement dans la four.
Le remplissage de la colonne est fait d’un matériau solide pour la
chromatographie par adsorption ou d’un liquide fixé sur un support solide
pour la chromatographie par partition. Des compagnies se spécialisent dans
la vente de colonnes déjà remplies de la phase stationnaire et il suffit de
consulter les catalogues de compagnies pour commander la colonne
appropriée à nos besoins. On retrouve dans ces catalogues la température
maximale d’utilisation de la phase stationnaire, ainsi que ses principaux
champs d’application.

V-3-5. Détecteurs
Le détecteur du chromatographe à gaz est situé dans un compartiment
immédiatement à la sortie de la colonne. Comme la chambre d’injection, la
chambre à détection peut être chauffée à des températures très élevées. Son
rôle est de détecter les composés à la sortie de la colonne et de transmettre
l’information sous forme d’un signal électrique à l’enregistreur. Comme les
pulsions électriques sont très faibles, un amplificateur est branché au
détecteur pour multiplier ou diviser l’intensité des signaux d’un certain
facteur, généralement des multiples de 10 (bouton RANGE ou
ATTENUATOR sur le chromatographe).
Un détecteur est caractérisé principalement par sa sensibilité et sa capacité
de donner une réponse proportionnelle à la concentration du composé
détecté :
a) SENSIBILITÉ
La sensibilité d’un détecteur est sa capacité de réagir à la présence d’un
composé. Plus un détecteur détecte de petites quantités de substance, plus il
est sensible. La plus petite quantité de substance qu’un détecteur peut
détecter se nomme le seuil de détection.
b) LINÉARITÉ DE LA RÉPONSE
Un détecteur doit émettre un signal proportionnel à la concentration
de la substance détectée, et cela sur une gamme de concentration la plus
élevée possible. La courbe d’étalonnage d’un composé sert à déterminer une
zone de concentration où la réponse est linéaire.
Les principaux détecteurs de chromatographe à gaz sont le détecteur à
ionisation de flamme et le détecteur à conductivité thermique.
• Détecteur à ionisation de flamme (FID)
C’est un détecteur universel, parce qu’il est sensible à tous les composés
combustibles, donc à presque tous les composés organiques. Il émet
également une réponse linéaire sur une gamme de concentration très élevée.
Il nécessite cependant l’emploi, en plus du gaz vecteur,
de deux autres gaz dont l’hydrogène, avec lequel il faut prendre des
précautions particulières. Le gaz carburant (O2) est une bonbonne d’air
comprimé.
Le principe de la détection est le suivant : lorsque le gaz vecteur circule dans
le détecteur, l’hydrogène brûlé produit un courant ionique constant (ligne de
base sur l’enregistreur).
Lorsqu’un composé se présente au détecteur, il est brûlé mais le courant
ionique produit est supérieur à celui de l’hydrogène pur. Cette différence de
courant, normalement proportionnelle à la quantité de composé, est
transmise à l’enregistreur sous forme de pic.
• Détecteur à conductivité thermique
C’est un détecteur très répandu, mais qui est moins sensible que le détecteur
à ionisation de flamme. On l’utilise surtout en analyse qualitative pour
l’identification des composés. Pour certains composés qui ont une
conductivité thermique semblable à celle du gaz vecteur, la réponse cesse
d’être linéaire.
Le détecteur mesure la conductivité thermique des composés qui sortent de
la colonne et la convertit en signal électrique. Comme la conductivité
thermique est sensible aux variations de température et de débit de gaz
vecteur, on utilise toujours deux colonnes, dont l’une sert à la séparation du
mélange inconnu et l’autre, dans laquelle on fait passer uniquement le gaz
vecteur, sert à compenser les variations de débit et de température,
particulièrement lorsqu’on travaille à température programmée.

V-3-6. Enregistreurs
Relié au chromatographe, l’enregistreur reçoit les impulsions électriques
venant du détecteur et les transmet sur un papier déroulant à une vitesse
donnée sous forme de pics. On obtient un chromatogramme et c’est sur
celui-ci que sont données toutes les informations nécessaires à l’analyse
qualitative et quantitative. Actuellement, l’informatique tend à supplanter
l’enregistreur, grâce aux logiciels d’applications (ex. : Millenium). Ces
logiciels sont capables, non seulement de conserver les signaux du détecteur
dans un fichier de données, mais également d’en faire l’analyse qualitative
(temps de rétention) et quantitative (calcul de surface de pic, courbe
d’étalonnage, etc.).