Introduction 

:
La chromatographie est une technique permettant de
séparer plusieurs constituants d'un mélange en les faisant
migrer, sur une phase immobile, par une phase liquide ou
gazeuse ou solide.
Principe :
L'échantillon à analyser est poussé par un liquide (appelé phase
mobile) dans une colonne remplie d'une phase stationnaire (les «
grains » sont de très petite taille). Ce débit élevé diminue le
temps nécessaire pour séparer les composants le long de la phase
stationnaire.

En effet, pour un même volume de phase stationnaire la surface

d'échange augmente si la granulométrie est fine. Les pics
obtenus (via un détecteur à UV [1] (les protéines absorbent à
275-280 nm) relié à un système d'intégration et de calcul) sont
plus étroits donc la résolution est améliorée (les pics sont bien
séparés, on peut donc bien les différencier), le seuil de détection
est également plus bas (des pics étroits et hauts sont plus faciles
à isoler du bruit de fond que des pics larges et bas).
Souvent, la composition de la phase mobile est modifiée au
cours de l'analyse, c'est le mode dit « gradient » ou « élution
graduée » (en opposition au mode « isocratique », pour lequel la
composition de la phase mobile reste la même tout au long de la
séparation).
 But de TP :
- Se familiariser à l’équipement et connaitre son
fonctionnement.
- Savoir interpréter les chromatogrammes de HPLC .
- Savoir choisir le mode de fonctionnement de
l’équipement selon notre besoin .
Schéma du HPLC :

Enregistreur
Injecteur
Pompe

Colonne

Réservoir de la Détecteur Amplificateur

phase mobile
Les réponses aux questions  :

La réponse à la question 1 :

a)- la nature de la phase mobile est liquide polaire car on
utilise un mélange de acetonitrile-eau (40 : 60 ) et les 2
solvants sont polaire.
b)- la phase stationnaire est liquide apolaire car la
colonne se constituant de carbone c18 greffé.
La réponse à la question 2 :

C’est le mode inverse car la phase stationnaire est

apolaire est la phase mobile est polaire donc la molécule
élue dans le même sans de son polarité.

La réponse à la question 3 :

Le temps de rétention de chaque compose :

Les composés Tr (min)
Phénol 3.085
nitro-Phénol 5.645
benzène 8.861
La réponse à la question 4 :

Le temps de rétention de benzène est plus grande que

phénol :
Justification
La benzène est une molécule apolaire et le phénol est une
molécule polaire.
Le phénol a une grande affinité avec la phase mobile
( interaction Van der Walls (polaire-polaire) – liaison
hydrogène ) que avec la phase stationnaire mais le
benzène est plus retenu avec la phase stationnaire à cause
de interaction Van der Walls ( apolaire- apolaire ).
La réponse à la question 5 :

- Le temps de rétention de nitro benzène est plus grande

que celui du phénol :
Le nitro-Phénol est une molécule moins polaire que le
phénol , car le doublet non liant de groupement (OH) est
moins localise dans nitro-Phénol que dans Phénol à
cause de l’effet mésomère attracteur dans nitro-Phénol
( due au la présence de groupement NO2 )
Donc le phénol crée plus des liaisons hydrogène que
nitro-Phénol .
Donc le phénol a un plus d’affinité que nitro-Phénol avec
la phase mobile .
La réponse à la question 6 :

Les longueurs d’onde choisies pour l’analyse du

mélange de nitro-Phénol et Phénol et benzène est 203 nm
et 211 nm.

La réponse à la question 7 :

L’effet de la longueur d’onde dans la détection :

Il faut choisir la bonne longueur d’onde pour avoir des
pics bien résolues , car si on utilise des longueurs d’onde
où la molécule n’absorbe pas on atteinte des pics à faible
intensité et résolution moins adéquate .
Conclusion :
Le long de ce TP on a arrivé à comprendre et
interpréter les chromatogrammes.
A la fin de l’analyse on arrive à identifier l’influence
de la polarité et l’affinité sur le Tr de la molécule.
On a pu connaitre les différents modes de
fonctionnent et les avantage et les limites du HPLC.
On a confirmé que le choix des meilleures
conditions opératoires conduit à des bons résultats.