TD HPLC

Exercice 1
Colonne longueur 50 mm, diamètre 4,1 mm, diamètre des particules 5µm, viscosité de la phase
mobile 0,156 cP ((1 cP = 10-3 Pa.s et 1 Pa = 10-5 bar), Vitesse linéaire de la phase mobite 0,16 cm/S,
facteur de résistance à l’écoulement  = 10000.

Séparation de 3 composés A,B et C conduit aux résultats suivants :

Les temps de rétention tr et les largeurs à min hauteur  des pics sont mesurés sur le
chromatogramme

Composé Tr (min)  (sec)

A 2,5 11,4
B 5,2 24,6
C 10 51,6

Calculez :

- Le temps de rétention nul

- Le facteur de rétention k pour chaque composé
- L’efficacité N (on suppose les pics gaussiens) pour chaque composé
- La sélectivité pour chaque couple A-B, B-C et A-C
- La résolution Rs avec les 2 équations, les valeurs sont-elles identiques ? quel est le couple le
plus difficile à séparer
- La perte de charge dans la colonne

Exercice 2

Colonne : longueur 25 cm, diamètre 4,6 mm, diamètres des

particules 5 µm, Phase mobile vitesse linéaire 0,134 cm/S,
Débit 1mL/min, Température 25°C

On fait varier le % de méthanol dans l’eau

%meoH Tr 2-BHA (min) Tr 3-BHA (min)

0 - -
5 96,0 47,8
10 30,4 21,6
15 17,2 13,3
20 10,7 9,0
25 8,2 7,0
30 6,8 6,0
Calculez pour chaque composé

1) Le Facteur de rétention

2) La sélectivité

3) On veut une résolution de 1,25 entre les 2 pics calculer pour les différents % méthanol l’efficacité
minimale pour atteindre cette résolution

4) Sachant que le constructeur donne une hauteur de plateau théorique de 500 µm pour la colonne,
quelle est la meilleure proportion de méthanol pour la séparation des 2 isomères.

5) Comment évolue la pression dans la colonne en fonction du % de méthanol, comment pourrait-on

la diminuer et quelle influence cela aurait sur le chromatogramme.

6) Quel type de détecteur est utilisable pour la détection de ces composés

Exercice 3

Le composé 1 est un anti-convulsant préparé selon le schéma de synthèse ci-dessus

Afin de suivre la réaction de synthèse L’analyse des composés est faite par chromatographie de
partage à polarité de phase inversée. La phase stationnaire est une colonne C18, la phase mobile un
mélange acétonitrile –eau (45/55 V/V).

1- En comparant les constantes de Rekker des composés 1,2 et 3 prévoir l’ordre d’élution de
composés

Lors de l’analyse du composé 1 on détecte la présence du composé 4 que l’on peut caractériser
comme étant l’acide carboxylique du composé 1

2- Selon les constantes de rekker, quelle devrait être sa position sur le chromatogramme par
rapport au composé 1.

3- L’expérience montre qu’il est élué avant le composé 1 comment justifiez-vous cette élution ?
Exercice 4 :

Le chromatogramme suivant montre la séparation d’un mélange de 14 étalons avec les conditions
suivantes : Phase Stationnaire : C18; Phase Mobile: A : H2O, B : acétonitrile.

1-Comment déterminer le volume mort de la colonne

2-Quels sont les différents problèmes observés sur ce chromatogramme ? les expliquer

3-Comment améliorer l’analyse de ces 14 composés

4-Que peut il se passer si on remplace l’acétonitrile par du méthanol

Exercice 5 :
HPLC d’un mélange réactionnel constitué des composés A et B en solution dans le toluène.
La séparation chromatographique a été obtenue sur une colonne de silice greffée NH2 de 15
cm de longueur à une température de 23°C. La phase mobile est utilisée avec un débit de 1,0
mL/min et la pression en tête de colonne est de 33.105 Pa. Le temps mort de la colonne est
0,6 minute.

1- Quelle type de colonne est utilisé ? Donner les principales caractéristiques de ce type de
colonne.
2- Quel système éluant doit-on utiliser avec ce type de colonne ? Proposer deux solvants
susceptibles de composer un système éluant acceptable pour ce type de colonne en
indiquant comment vous construiriez un gradient d’élution.
3- Quel type de détecteur classique utiliseriez vous ?
4- Calculer le facteur de résolution R entre les deux pics des composés A et B puis indiquer
s’ils sont correctement séparés. Justifier votre réponse.
Calculer également le facteur de séparation entre les deux pics des composés A et B
5- Si la séparation n’est pas correcte, sur quels paramètres pouvez vous influer pour
l’améliorer.
6- quels sont les propriétés physico-chimiques du composé B par rapport au composé A.
Proposez une structure possible pour le composé B

Exercice 6 : Etalonnage externe

- Justifier l’ordre de rétention des composés à partir de log P

 Aniline

Comment construire une gamme étalon adapté à l’analyse quantitative de cet échantillon ?

Exercice 7 : Etalonnage par la Méthode des ajouts dosés

On veut vérifier la composition d’un comprimé d’aspirine et doser la quantité d’aspirine par
la méthode des ajouts dosés en HPLC
La Boite de comprimés indique que chaque comprimé contient 1g d’aspirine.
On dissout un comprimé dans 100 mL d’eau
On dispose d’une solution étalon d’aspirine à 20g/L
Compléter la composition de chaque solution étalon

Solution 1 Solution 2 Solution 3 Solution 4 Solution 5

V échant 1 mL
V sol Asp
V solvant
V Total 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL 5 mL
Si l’on souhaite faire le même étalonnage mais en ajoutant dans l’échantillon un faible
volume de solution étalon pour ne pas préparer plusieurs solutions

V échantillon = 5 mL Vajouté max 50 µL (soit 1% du volume total pour être considéré

négligeable)
A quelle concentration doit-on préparer la solution de standard de d’aspirine ?

Annexes : table de Rekker