TP 25

DEFÉVRIER
CONTROLE
MICROBIOLOGIQUE 2022
DE DENRÉES
ALIMENTAIRES
PRODUIT LAITIERD’UN
: CAS

Travaillé par :
TAZI SALIM 41
HAMDOUN HAJAR 19
BOUKHELKHAL MERYEM
08
Introduction :

Le lait est un produit fragile, susceptible d’être altéré par de

nombreuses réactions chimiques, biochimiques et microbiologique,
s’il n'est pas bien conservé. L’analyse bactériologique a porté sur
FMAT, coliformes totaux, Salmonella et Staphylococcus aureus et les
sulfito-réducteurs. Dans ce rapport, nous allons effectuer l’analyse
microbiologique du « Lben » afin de contrôler sa qualité
microbiologique.

Il existe plusieurs tests à effectuer selon la norme marocaine, dans ce

TP nous allons s’intéresser aux tests identifiant la pathogénie de cet
aliment ainsi que sa salubrité. En effet, il faut conclure si ce produit
est commercial ou impropre à la consommation.
 Table des matières

I. Bibliographie 5

1. Produit laitier : Lben 5

2. Composition du Lben 5

3. Analyse microbiologique 6

4. Analyses microbiologiques normalisées 6

5. Critères microbiologiques fixés par la norme marocaine 6

II. Matériels et méthodes 8

1. Aperçu 8

2. Évaluation de la Flore Mésophile Total 8

a. Principe 8

b. Mode opératoire 9

3. Recherche des coliformes 10

a. Principe 10

b. Mode opératoire 10

4. Recherche des salmonelles 12

a. Principe 12

b. Mode opératoire 13

5. Recherche des Staphylocoques 14

a. Principe 14

b. Mode opératoire 14

6. Recherche des sulfito-réducteurs 15

a. Principe 15

b. Mode opératoire 15
III. Résultats et discussion 17

1. FMAT 17

2. Staphylococcus Aureus 18

3. Salmonelles 20

a. Kligler 20

b. Lysine décarboxylase 21

4. Staphylococcus 22
 I. Bibliographie

1. Produit laitier : Lben

Le Lben marocain est une boisson préparée par fermentation spontanée du lait cru jusqu’à
coagulation, suivie d’un léger mouillage, puis d’un barattage, permettant de recueillir une
part plus ou moins importante de matière grasse sous forme de beurre dit ({beldi})

Sa préparation, très simple, est demeurée au stade familial ou artisanal : le lait est
abandonné à lui-même dans une jarre en terre cuite ou une outre en peau de chèvre jusqu’à
sa coagulation. Celle-ci se fait à température ambiante et dure 24 à 48 h suivant la saison.

Le barattage qui lui succède est réalisé soit dans l’outre, qu’un manipulateur doit secouer
énergiquement avec les deux mains, soit dans une jarre, en utilisant un instrument constitué
d’un manche long portant à son extrémité inférieure deux disques en bois de diamètres
différents (photo Dans un cas comme dans l’autre, cette opération dure 30 à 40 min. A la fin
du barattage, on ajoute généralement un certain volume d’eau (environ 10 % du volume du
lait), chaude ou froide, suivant la température ambiante, de façon à ramener la température
de l’ensemble à un niveau convenable au rassemblement des grains de beurre. Celui-ci est
récupéré, généralement à la main, mais certains fabricants filtrent le Lben sur une toile, dans
le but de recueillir le maximum de beurre ({beldi}) produit de grande valeur marchande.

L’objet du présent travail est de déterminer les caractéristiques microbiologiques du Lben.

2. Composition du Lben

La composition chimique du lben marocain varie considérablement, suivant la localité et la

ferme de production. On observe toutefois que le pH descend sous 4,7 et la concentration
en lactose à moins de 3,7 g/100g.

Le métabolisme microbien produit des composés carbonylés volatils qui participent à la

richesse aromatique du rayeb et du leben : acétaldéhyde (éthanal) à l'odeur fruitée, le
diacétyle à odeur de fromage et d'aisselles, l'acétoïne. Ces composés volatils se trouvent
aussi dans les yaourts du commerce en France. Mais dans le lben, ils sont associés à la
présence d'alcool (éthanol) à une concentration significative (autour de 0,02 %) susceptible
de contribuer à l'arôme typique du lben. En prenant en compte les seuils de perception
comparés à la concentration du composé, on constate que c'est le diacétyle qui de loin
caractérise le mieux le lben marocain.

3. Analyse microbiologique

Le lait cru utilisé pour fabriquer le lben contient une flore microbienne abondante et
complexe qui comporte des bactéries lactiques mais aussi des micro-organismes
indésirables. Des études du lben marocain ont détecté des Escherichia coli des
Staphylococcus aureus et même des Listeria monocytogenes....

Une caractérisation microbiologique du lait cru, du « Lben » et du « Jben » a été réalisée par
dénombrement de la flore mésophile aérobie totale (FMAT), des coliformes totaux (CT), des
germes de contamination fécale (coliformes fécaux (CF) et entérocoques intestinaux (EI)),
des germes d’altération (levures et moisissures), des bactéries lactiques (BL), des germes
pathogènes (Staphylococcus aureus, Anaérobies Sulfito-Réducteurs (ASR) et Salmonella).

4. Analyses microbiologiques normalisées

La préparation des échantillons et les dilutions décimales ont été réalisées selon la norme
marocaine NM 08.0.100 [12]. Les milieux de culture et les conditions d’incubation pour les
différents germes étudiés sont résumés dans le tableau 1.

5. Critères microbiologiques fixés par la norme marocaine 

Les critères microbiologiques fixés par la réglementation marocaine pour le lait cru, le « Lben
» et le « Jben » sont retracés selon l’Arrêté ministériel n° 624-04 du 17 Safar 1425 (2004)
[22]. D’après cet Arrêté seuls quelques germes sont à rechercher dans les produits laitiers.
Dans le lait cru la FMAT (<3.106 ufc/ml), les CF (<103 ufc/ml) et les salmonelles (absence
dans 250 ml) sont les seuls à rechercher. Pour le « Lben », seule la recherche des CT
(<5ufc/g) et des salmonelles (absence dans 250 ml) est demandée. Dans le « Jben »seuls les
Coliformes (<105 ufc/g), E. Coli (<104 ufc/g), (les staphylococcus aureus (absence par g) et
les salmonelles (absence dans 250 ml) sont à rechercher.

6.
 II. Matériels et méthodes

1. Aperçu

Dans le cadre de notre formation d’ingénieur en Industries Agricoles et Alimentaires, nous

avons effectué des Travaux Pratiques en microbiologie afin de maîtriser le contrôle de la
qualité hygiénique d’un produit laitier en général en travaillant sur le « LBEN » comme
exemple à évaluer.

Nous avons consacré ce TP aux tests microbiologiques les plus utilisés afin d’étudier la
conformité avec la réglementation Marocaine.

En effet, le TP s’est étalé sur 5 jours, vu la différence des durées d’incubation pour chaque
microorganisme, alors que la dernière journée était dédiée à la lecture des résultats obtenus.

Le but de ce TP est d’analyser la qualité hygiénique du produit en question en se basant sur

plusieurs tests.

2. Évaluation de la Flore Mésophile Total

a. Principe

Il s’agit d’un indicateur hygiénique primordiale, applicable à tous les produits alimentaires
qu’ils soient solides ou liquide, la différence réside au niveau du milieu de culture (suspension
mère).

En fait, on va considérer que chaque bactérie va donner naissance à une colonie après
incubation dans un milieu de culture gélosé, dans notre cas il s’agit du PCA (Plate Count
Agar).

Il faut noter que le nombre de colonies obtenu après incubation est une estimation du le
nombre d'UFC (Unité Formant colonie) présent dans un produit.
 b. Mode opératoire

i. Matériels et produits

Milieu de culture Plate Count Agar

Diluant Eau physiologique

Verrerie 5 Boites de Petri et pipettes stériles, tubes à essai

ii. Préparation et ensemencement

● Le milieu de culture et l’eau physiologique sont préparés au préalable

● Préparer 5 dilutions décimales dans l’eau physiologique à partir du « lben » à

analyser; on prend 1 ml à l’aide d’une pipette de l’échantillon et on le verse dans le

premier tube qui contient déjà 9ml d’eau physiologique. Depuis ce premier tube, on
prend 1ml du mélange pour le verser dans le 2 ème tube etc. (Cette pre1paration se fait
à côté du bec Bunsen)

● Le milieu préalablement préparé doit être chauffé et refroidi pour l’utilisation sur les

boites de Petri.

● Prélever un volume de 1 ml de chaque dilution à l’aide d’une pipette et le déposer

dans une boîte de Petri (de la moins concentrée en microorganismes)

● Couler la gélose fondue sur l’ensemble des boîtes (5 Boites)

● Laisser refroidir jusqu’à solidification du milieu gélosé

N.B : Plus on dilue plus on a des colonies séparées

 iii. Incubation

On place les Boîtes de Petri à l’envers dans un incubateur à 37oC pendant 72h.

3. Recherche des coliformes

Indice de Contamination Fécale (ICF)

a. Principe

Il existe deux types de coliformes, que nous allons procéder à leur recherche et par la suite à
leur identification, il s’agit bien des coliformes totaux et fécaux. En effet, on les distingue par
la température d’incubation vu que le milieu de culture est le même.

Les coliformes totaux sont des entérobactéries qui incluent des espèces bactériennes qui
vivent dans l’intestin des animaux homéothermes, mais aussi dans l’environnement en général
(sols, végétation et eau). La température d’incubation est généralement à 37 oC.

Les coliformes fécaux ou thermotolérants indiquent généralement la contamination fécale du

produit à analyser et donc c’est un critère de qualité hygiénique. Leur étude comporte le
dénombrement de tous les coliformes totaux et fécaux, ainsi que la recherche d’Escherichia
coli et l’identification des autres bactéries. Ils sont généralement des bacilles à Gram négatif,
non sporulés, aérobies ou non Aero-anaérobies qui fermentent le lactose avec production
d’acide et de gaz en 48 heures à une température de 44oC.

L’ensemencement se fait sur le milieu de culture EMB (Eosin Methylene Blue), c’est un
milieu de culture sélectif et différentiel pour l'isolement et l'identification des bacilles Gram
négatifs (le cas des coliformes fécaux). Ce milieu comporte un indicateur qui détecte la
consommation du lactose.
 b. Mode opératoire

i. Matériels et produits

Milieu de culture Eosin Methylene Blue

Diluant Eau physiologique

Verrerie 10 Boites de Petri et pipettes stériles, tubes à

essai

ii. Préparation et ensemencement

● Le milieu de culture et l’eau physiologique sont préparés au préalable

● Préparer 5 dilutions décimales dans l’eau physiologique à partir du « lben » à

analyser; on prend 1 ml à l’aide d’une pipette de l’échantillon et on le verse dans le

premier tube qui contient déjà 9ml d’eau physiologique. Depuis ce premier tube, on
prend 1ml du mélange pour le verser dans le 2 ème tube etc. (Cette pre1paration se fait
à côté du bec Bunsen)

● Le milieu préalablement préparé doit être chauffé et refroidi pour l’utilisation sur les

boites de Petri.

● Prélever un volume de 1 ml de chaque dilution à l’aide d’une pipette et le déposer

dans une boîte de Petri (de la moins concentrée en microorganismes)

● Couler la gélose fondue sur l’ensemble des boîtes (5 Boites)

● Agiter et Laisser solidifier le milieu gélosé

iii. Incubation

On place les Boîtes de Petri à l’envers dans un incubateur à 44 oC pendant 48h pour les
coliformes fécaux et à 37oC pour les coliformes totaux.

iv. Indentification
 ⮚ Production d’indole :

On incube des tubes d’eau péptonée après ensemencement par les colonies des coliformes
apparues pendant 48h après on ajoute quelques gouttes du réactif d’Erhlich-Kovacs et on agite
puis on laisse reposer.

⮚ Milieu kligler (fermentation du lactose et du glucose) :

Le milieu de Kligler est un milieu de culture permettant la recherche simultanée de :

● L'utilisation du lactose

● La fermentation du glucose

● La production d'H2S

● La production de gaz

On incube les tubes du milieu La pente doit être abondamment ensemencée (stries serrées),
de plus le culot est ensemencé par simple piqûre.

⮚ Test IMVIC :

Les tests IMViC sont un groupe de tests individuels utilisés dans les tests de laboratoire de
microbiologie pour identifier un organisme dans le groupe des coliformes. Un coliforme est
un bâtonnet anaérobie Gram -, aérobie ou facultatif, qui produit du gaz à partir
du lactose dans les 48 heures. La présence de certains coliformes indique une contamination
fécale.

Le terme «IMViC» est un acronyme pour chacun de ces tests. "I" est pour le test d’indole ;
"M" est pour le test au rouge de méthyle ; "V" est pour le test de Voges Proskauer, et "C" est
pour le test de citrates.

Le test triple sucre fer (TSI) , le test uréase et le test malonate sont également inclus dans ce
test.
Ces tests sont utiles pour distinguer les membres des entérobactéries.

4. Recherche des salmonelles

a. Principe

Les salmonelles sont des bactéries pathogènes pour l’Homme ou les animaux. De ce fait, il
s’agit d’un critère de salubrité de l’aliment, donc on exige l’absence des salmonelles dans un
échantillon de 25 g ou ml.

Afin de rechercher les salmonelles dans un aliment, il faut procéder d’abord à un pré
enrichissement. Cette étape permet aux salmonelles présentes à l’état latent ou qui sont
affaiblies ou endommagées de reprendre leur viabilité et se multiplier pour être facilement
détectables dans les étapes à suivre. L’incubation se fait à 37 oC pendant 24 heures dans BCS
(Bouillon Caséino-soja)

Après, il y a l’enrichissement, qui se fait dans un milieu sélectif qui va permettre aux
salmonelles de se multiplier beaucoup plus activement que les autres bactéries apparues après
pré enrichissement. L’incubation se fait à 37oC pendant 72 heures.

Ensuite, l’isolement se fait par la technique d’épuisement de la semence des milieux gélosés
sélectifs. A cause du manque de milieux sélectifs très fiables, on utilise généralement, la
gélose Salmonella-Shiguella (S.S) et la gélose au Désoxycholate-Citrate-Lactose-Saccharose
(DCLS). Ces milieux inhibent la croissance des bactérie Gram +.

b. Mode opératoire

i. Matériels et produits

Pré enrichissement Enrichissement Isolement

Milieu de Bouillon Caséino-soja Bouillon au Gélose Salmonella-Shiguella

culture tetrathionate (S.S)
+jaune d’œuf
 Gélose au Désoxycholate-
Citrate-Lactose-Saccharose
(DCLS).

Verrerie Pipette stérile, Flacon Pipette stérile 4 Boites de Petri stériles,

250ml Anse de platine

ii. Préparation et enrichissement

● Dans un flacon contenant 225ml de BCS on ajoute 25ml du Lben, on l’incube dans

37oC pendant 24 heures. Il s’agit du pré enrichissement.

● Prendre 10ml du Flacon pré enrichi et l’ajouter au bouillon tetrathionate + jaune

d’œuf, on l’incube 37oC pendant 24 heures. C’est l’enrichissement.

● Strier avec l’anse de platine les 2 milieux S.S et DCLS préalablement coulés et

solidifiés.

iii. Incubation

Incuber les boites ensemencées à 37oC pendant 24 heures.

iv. Identification

On identifie la présence des salmonelles par inoculation des deux milieux des souches de
salmonelles préalablement isolées. L’inoculation se fait au niveau de la tranche par striation
et au niveau du culot par en pénétrant l’anse.

Milieu De Culture :

● Milieu Kligler : Milieu coulé en demi -culot : glucose, lactose, indicateur de pH et

système mettant en évidence la production d'H2S par le thiosulfate réductase

 ● Milieu Lysine Iron Agar.

5. Recherche des Staphylocoques

a. Principe

Les staphylocoques sont des indicateurs de pathogénicité d’un aliment (M.O d’altération),
c’est la raison pour laquelle quand on prévoit que le produit contiendrait un nombre élevé
de staphylocoques, on peut procéder directement au dénombrement en milieux gélosés
sélectifs.

Dans notre cas, nous allons utiliser le milieu Baird Parker pour la culture de ces bactéries.

b. Mode opératoire

i. Matériels et produits

Milieu de Baird Parker

culture

Verrerie Pipette stérile, Boîtes de

Petri

ii. Préparation

● Le milieu de culture et l’eau physiologique sont préparés au préalable

● Préparer 4 dilutions décimales dans l’eau physiologique à partir du « lben » à

analyser; on prend 1 ml à l’aide d’une pipette de l’échantillon et on le verse dans le

premier tube qui contient déjà 9ml d’eau physiologique. Depuis ce premier tube, on
prend 1ml du mélange pour le verser dans le 2 ème tube etc. (Cette préparation se fait
à côté du bec Bunsen)

● Le milieu préalablement préparé doit être chauffé et refroidi pour l’utilisation sur les

boites de Petri.

● Prélever un volume de 1 ml de chaque dilution à l’aide d’une pipette et le déposer

dans une boîte de Petri (de la moins concentrée en microorganismes)

 ● Couler la gélose fondue (Baisur l’ensemble des boîtes (5 Boites)

● Laisser refroidir jusqu’à solidification du milieu gélosé

iii. Identification

On prend à l’aide d’une anse une partie de la colonie apparue pour l’appliquer sur de l’eau
oxygéné.

6. Recherche des sulfito-réducteurs

a. Principe

Les bactéries anaérobies sulfito-réducteurs (ASR) est un groupe de bactéries se développant

uniquement en absence d'oxygène et qui possèdent des caractéristiques biochimiques
particulières, notamment la production de sulfure d'hydrogène.

Nous allons procéder à leur identification par des chauffage à dilution, le principe repose sur
le choc thermique, dans un milieu RCA.

b. Mode opératoire

i. Matériels et produits 

Milieu de RCA
culture

Verrerie Pipette stérile,3 tubes

stériles

ii. Préparation

● Le milieu de culture (RCA) et l’eau physiologique sont préparés au préalable

● Préparer 3 dilutions décimales dans l’eau physiologique à partir du « lben » à

analyser dans des tubes.

● Mettre les tubes dans des béchers et remplir par le milieu RCA.
Ensemencement :

● Prendre 1 ml de chaque dilution et de l'échantillon du lait un tube du milieu RCA

fondu.

● Ajouté de sulfate de fer et de sulfate de sodium.

● Homogénéiser après chaque inoculation.

● Laisser solidifier.

iii. Incubation

Incuber à 44°C pendant 24 à 48 h.

III. Résultats et discussion

1. FMAT

Les résultats obtenus après incubation se présentent comme suit :

Apres préparation des multiples dilutions (de 10-1 à 10-5), ensemencement et incubation on a
réussi à trouver deux boites comptables correspondante a une dilution de 10-4 et 10-5. Une fois
le dénombrement établi on a trouvé 129 et 30 colonies.

Nombre de cellules formant colonie pour la dilution de 10-4 correspond à 129*104 UFC/ml

Nombre de cellules formant colonie pour la dilution de 10-5 correspond à 30*104 UFC/ml

2. Staphylococcus Aureus

Apres ensemencement dans milieu de BAIRD PARKER et incubation on a obtenu les résultats
suivants :

Apres ensemencement dans milieu de BAIRD PARKER et incubation on a obtenu les résultats
suivants :

D’après les résultats ci-dessus, on

constate une pousse des
staphylocoques.
A partir de cette boite, on a repiqué le staphylocoque dans une boite contenant le milieu de
CHAPMAN.

Le virage vers la couleur jaune est dû à la diminution du ph causée par le staphylocoque.

⮚ Identification

On remarque un développement sous forme d’un cercle noir entouré d’une ombre
correspondant à la croissance du staphylocoque doré.

⮚ Coloration gram

On

remarque un regroupement de Cocci

sous forme de grappes d’une couleur
violette correspondante à des
bactéries gram positif (Staphylococcus
aureus).

⮚
 3. Salmonelles

Après pré enrichissement, enrichissement, ensemencement et incubation dans les milieux :

SS et DCLS, on a obtenu les résultats suivants :

⮚ Identification

a. Kligler

La coloration jaune indique la consommation du

lactose et du glucose par les salmonelles, donc
lactose+ et glucose +.

L’apparition des fissures au niveau de la gélose

révèle l’échappement du gaz.

⮚
 b. Lysine décarboxylase

Culot violet ; glucose probablement

fermenté mais masqué par LDC+

La pente violette ; LDA –

Précipité noir ; H2S

⮚ Coloration gram

On remarque un regroupement de bacilles dispersées d’une couleur rose correspondante à

des bactéries gram négatif (Salmonelles).

⮚ Spores des micro-organismes anaérobies Sulfito-réducteurs :

On n’a eu aucun résultat, contrairement au groupe 4 qui ont eu le résultat suivant :

NB : La couleur noire est due à la réduction du sulfure d’hydrogène par les clostridiums qui
sont des micro-organismes anaérobies ; sulfito-réducteurs.

4. Coliformes
Les boites que nous avons obtenues sont incomptables, les résultats obtenus sont
représentés dans les images suivantes :
Identification

⮚ Kligler

Il apparait pour les 2 tubes :

● Pentes jaunes : Lactose+

● Culot jaune : glucose +

● Culot rouge : glucose –

● Avec H2S- dégagement gazeux

Il est donc nécessaire d’identifier autrement.

⮚ Test IMVIC

D’après l’image on remarque la présence d’un anneau violet, donc on a une production
d’indole.
 ⮚

Utilisation du Citrate
 ● Dans le premier tube on remarque une coloration verte, dans on n’a pas une

production du citrate (citrate-)

● Dans le deuxième tube on a une coloration bleue, donc on a citrate+

Conclusion :

D’après ces tests effectués, in peut déduire si ce produit est

commercial et répond aux normes. En effet, cette analyse
microbiologique met en évidence les différentes méthodes à
effectuer afin de détecter la présence des salmonelles et coliformes
totaux et fécaux, car il s’agit bien d’un indice de salubrité de
l’aliment. On a procéder aussi au comptage des colonies dans le
même but qui est le contrôle de la qualité du produit « Lben ».