Formation Des Biofilms Chez Les Bactéries Du Genre Bacillus Dans Les Aliments Fermentés

UNIVERSITE MARIEN NGOUABI
FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

Année 2021 No d’ordre :…….
MEMOIRE
Pour l’obtention du Diplôme
de Master ès Sciences et Techniques
Mention : Biologie
Parcours : Sciences Biologiques
Spécialité : Biologie Cellulaire et Moléculaire
Option : Biochimie et Microbiologie Appliquées
Présenté et soutenu publiquement
Par
NKANGOU Andra Valaire Amour
Titulaire d’une Licence en Biologie Cellulaire et Moléculaire
Le 13/08/2021
TITRE :
Formation des biofilms chez les bactéries du genre

Bacillus dans les aliments fermentés
SUPERVISEUR SCIENTIFIQUE
Etienne NGUIMBI, Maître de Conférences CAMES, Université Marien NGOUABI
DIRECTEUR DE MEMOIRE
Aimé Christian KAYATH, Maître-Assistant CAMES, Université Marien NGOUABI
JURY
Président :
Raoul AMPA, Maître de Conférences CAMES, FST/UMNG (Congo)

Membres :
Alain Brice VOUIDIBIO MBOZO, Maître-Assistant CAMES, FST/UMNG (Congo)
Aimé Christian KAYATH, Maître-Assistant CAMES, FST/UMNG (Congo)

Dédicaces
Aimer c’est trouver sa richesse hors de soi...

Ainsi avec un cœur ouvert, je dédie ce travail à :
A mon père NKANGOU Blaise pour sa confiance indéfectible, son
extraordinaire dévouement à faire de moi un jeune homme instruit et accompli.
A ma mère KIBONGUI Marie Josée Edwige, à qui je voue tant de sentiments,
car tu m’as donné la vie, de l’affection à revendre, du courage et de précieux
conseils pour réussir dans mes études.
Amour Valaire Andra NKANGOU : Mémoire de Master / Faculté des Sciences et Techniques / UMNG i
Remerciements
Je remercie Monsieur Basile Guy Richard BOSSOTO, Professeur Titulaire CAMES, Doyen
de la Faculté des Sciences et Techniques pour m’avoir donné l’autorisation de défendre ce
mémoire.
J’adresse mes vifs remerciements à Monsieur Etienne NGUIMBI, Maitre de Conférences
CAMES, pour avoir marqué ces travaux de mémoire de sa culture scientifique, son suivi et son
apport multiforme, en qualité de superviseur scientifique de ce travail.
Il m’est tellement agréable d’exprimer ma profonde gratitude à mon directeur de mémoire ,
Monsieur Aimé Christian KAYATH, Maître-Assistant CAMES. J’ai été séduit
jusqu’aujourd’hui par sa rigueur scientifique, son altruisme et son sens de pédagogie pour
l’obtention des résultats. Grâce à votre investissement personnel dans ce travail, vous avez été
comme le grain de sel qui manquait dans la préparation de ma carrière académique.
Des remerciements sincères sont formulés à l’égard des membres du jury d’avoir accepté
d’évaluer ce travail, en l’occurrence Monsieur Raoul AMPA, Maître de Conférences CAMES,
en sa qualité de Président du jury, et Monsieur Alain Brice VOUIDIBIO MBOZO, Maître-
Assistant CAMES en sa qualité d’examinateur.
A Monsieur Joseph GOMA-TCHIMBAKALA, Maître de Conférences CAMES, Directeur

Général de l’Institut national de Recherche en Sciences Exactes et Naturelles (IRSEN), je vous
remercie pour m’avoir donné l’occasion de réaliser mes travaux de recherche au sein de la
structure dont vous avez la charge.
Je profite aussi de remercier particulièrement tous les enseignants du Département de Biologie,
de la Faculté des Sciences et Techniques qui ont contribué à ma formation pendant mon cursus
universitaire.
Cordialement, mes sincères remerciements vont à l’endroit de mes ancien(ne)s ELENGA
Paola, KAYA-ONGOTO Moïse Doria, KINOUANI Duchel, OKOUAKOUA Yannick et
MOUELLET Effort, pour leurs qualités de travail en équipe.
Un grand merci à mes collègues du laboratoire MAYEYENDA LOUMP Arnie Sermelle,

PASSY MAMBOU Marie Vincent, LIKIBI Trésor, LEMINGOU Cliff, KIYINDOU
Nandolge, MADZOU Sincère et MAHOUNGOU Francisca.
Une pensée gratifiante à toute la famille NKANGOU et KIBONGUI, plus spécifiquement à

mon frère aîné NKANGOU Clyde, ainsi qu’à mon petit frère NKANGOU Eminent Joy. Que
ce travail vous renouvelle toutes mes pensées positives.
Amour Valaire Andra NKANGOU : Mémoire de Master / Faculté des Sciences et Techniques / UMNG ii
Présentation de la structure d’accueil
L’Institut national de Recherche en Sciences Exactes et Naturelles (IRSEN) où a été réalisé le
présent travail, est situé dans l’enceinte de la Cité Scientifique de Brazzaville (Ex-Orstom) au
château d’eau dans le premier arrondissement Makélékélé.
Cadre institutionnel et juridique
Créé par la Loi N° 26-2012 du 24 septembre 2012, l’Institut national de Recherche en Sciences
Exactes et Naturelles est un établissement public administratif à caractère scientifique et
technique.
Missions assignées :
L’Institut national de Recherche en Sciences Exactes et Naturelles a pour mission :
 D’organiser, conduire et exécuter toutes recherches fondamentales et appliquées visant

la promotion du développement national dans les champs disciplinaires constitutifs des
sciences exactes et naturelles ;
 De mettre en œuvre une programmation scientifique autour des axes prioritaires pour le
développement du pays à partir des besoins réels des populations et des utilisateurs ;
 De faire les inventaires de la flore, de la faune, de leur écosystème et des facteurs
météorologiques du Congo ;
 D’étudier les propriétés des ressources animales, végétales en vue de la valorisation de
leur utilisation ;
 Contribuer à l’élaboration de la politique nationale de recherche dans les domaines
relevant de sa compétence ;
 Publier et diffuser les résultats de ses travaux et concourir au développement des
connaissances et de l’information scientifique et technologique dans les domaines des
sciences exactes et naturelles ;
 Apporter son concours à la formation, à la recherche et par la recherche ; effectuer des
expertises scientifiques dans son champ de compétence.
L’institut national de Recherche en Sciences Exactes et Naturelles (IRSEN) est organisé

selon les statuts approuvés par le Décret n° 2016-61 du 26 février 2016.
Amour Valaire Andra NKANGOU : Mémoire de Master / Faculté des Sciences et Techniques / UMNG iii
ORGANISATION ADMNISTRATIVE DE L’INSTITUT NATIONAL
DE RECHERCHE EN SCIENCES EXACTES ET NATURELLES
(IRSEN)
Amour Valaire Andra NKANGOU : Mémoire de Master / Faculté des Sciences et Techniques / UMNG iv
Liste des figures
Figure 1. Développement et structure d’un biofilm bactérien.. ....................................... 15
Figure 2. Voie de signalisation Spo0A menant à la formation de biofilm chez B. subtilis16
Figure 3. Induction de la formation de matrice extracellulaire par la surfactine............ 17
Figure 4. Aspect macroscopique des isolats de Bacillus spp. sur milieu Mossel. ............. 37
Figure 5. Aspects macroscopiques de deux isolats de Bacillus spp. purifiés sur le milieu
Mossel. ............................................................................................................................. 37
Figure 6. Résumé du nombre d'isolats de Bacillus spp. obtenus par aliment fermenté... 38
Figure 7. Résumé des caractéristiques phénotypiques et biochimiques des isolats de
Bacillus spp. ..................................................................................................................... 39
Figure 8. Profil phénotypique des isolats de Bacillus spp. producteurs (coloration noire)
ou non (coloration rouge) de biofilms sur GRC............................................................... 39
Figure 9. Bilan des isolats de Bacillus spp. producteurs ou non de biofilms.................... 40
Figure 10. Bilan des isolats de Bacillus spp. producteurs de biofilms selon les phénotypes
++ (fort) ou + (modéré). ................................................................................................... 40
Figure 11. Criblage des isolats de Bacillus spp. producteurs de biofilm selon les
phénotypes ++ (fort) ou + (modéré) par aliment.............................................................. 40
Figure 12. Profil phénotypique des isolats de Bacillus spp. producteurs et non producteurs
de biofilms après coloration au cristal violet à 2%. ......................................................... 41
Figure 13. Criblage de la production de biofilms par la méthode de tube à essai des isolats
positifs sur milieu GRC.................................................................................................... 41
Figure 14. Criblage de la production de biofilms par la méthode de tube à essai des isolats
négatifs sur milieu GRC................................................................................................... 42
Figure 15. Emulsion de l’essence par quelques isolats de Bacillus spp. .......................... 43
Figure 16. Index d'émulsification avec la culture cellulaire et le surnageant acellulaire..
......................................................................................................................................... 43
Figure 17. Extrait du biosurfactant obtenu après précipitation à l'HCl.......................... 44
Figure 18. Comportement des extraits de biosurfactant dans la l’inhibition des bactéries
pathogènes........................................................................................................................ 44
Figure 19. Diamètres des halos d’inhibition d’extraits de biosurfactants obtenus .......... 45
Figure 20. Alignement des séquences de trois espèces (B. subtilis, B. pumilus et B.
licheniformis) avec des amorces spécifiques qui s’hybrident. .......................................... 46
Figure 21. Profil électrophorétique de l’ADN génomique de quelques isolats de Bacillus
spp. sur gel d’agarose à 1 %. ........................................................................................... 47
Figure 22. Profil électrophorétique sur gel d’agarose à 1% des amplicons de la PCR du
gène fibE des isolats de Bacillus spp................................................................................. 48
Figure 23. Profil électrophorétique sur gel d’agarose à 1% des produits PCR du gène de
l’ARNr 16S des isolats de Bacillus. .................................................................................. 49
Figure 24. Profil électrophorétique de digestion enzymatique sur gel d’agarose à 1 % des
produits PCR du gène fibE. ............................................................................................. 50
Figure 25. Profil électrophorétique sur gel d’agarose à 2 % des produits PCR des gènes
eps, tasA, ymcA et yfiQ des isolats de Bacillus.................................................................. 51
Amour Valaire Andra NKANGOU : Mémoire de Master / Faculté des Sciences et Techniques / UMNG v
Liste des tableaux
Tableau I: Classification des bactéries du genre Bacillus ..................................................9
Tableau II: Biosurfactants et origines bactériennes. ....................................................... 11
Tableau III: Composition du biofilm bactérien............................................................... 14
Tableau IV: Nature, provenance et codification des échantillons.................................... 20
Tableau V: Présentation du matériel de laboratoire ....................................................... 21
Tableau VI: Mélange réactionnel de la PCR du gène fibE .............................................. 30
Tableau VII: Séquences d’oligonucléotides utilisées pour l’amplification du gène fibE . 31
Tableau VIII: Programme d’exécution de l’amplification par PCR du gène de fibE ..... 31
Tableau IX: Mélange réactionnel de la PCR du gène de l'ARNr 16s .............................. 32
Tableau X: Séquences d’oligonucléotides utilisées pour l’amplification du gène ARNr 16S
......................................................................................................................................... 32
Tableau XI: Programme d’exécution de l’amplification par PCR du gène de l’ARNr 16S
......................................................................................................................................... 33
Tableau XII: Mélange réactionnel de la R.F.L.P ............................................................. 34
Tableau XIII: Séquences d’oligonucléotides utilisées pour l’amplification des gènes
impliqués dans la formation des biofilms ........................................................................ 35
Tableau XIV: Programme PCR des gènes impliqués dans la formation des biofilms ..... 35
Tableau XV: Composition des milieux de culture ........................................................... 68
Tableau XVI: Caractéristiques macroscopiques et microscopiques des isolats............... 69
Amour Valaire Andra NKANGOU : Mémoire de Master / Faculté des Sciences et Techniques / UMNG vi
Abréviations, sigles et symboles
°C Degré Celsius
% Pour cent
µL Microlitre
ADNg Acide Désoxyribonucléique génomique
ARNr 16S Acide Ribonucléique ribosomique 16S
BET Bromure d’éthidium
bp « base pair » (paire de base, en Français)
dNTP désoxyribonucléotide triphosphate
EDTA Ethylène Diamine Tétra-Acétique
EPS ou eps Exopolysaccharide ou gène codant pour les exopolysaccharides
fibE Gène codant pour une enzyme fibrinolytique
g Gramme
GRC Gélose au rouge congo
IE Index d’émulsification
Kb Kilobase
kDa Kilodalton
KOH hydroxyde de potassium
L Litre
min Minutes
mL Millilitre
mm Millimètre
MP Marqueur de poids moléculaire
NCBI National Center for Biotechnology Information
PBS Phosphate Buffer Saline (tampon phosphate salin, en français)
PCR Polymerase Chain Reaction (Réaction de polymérisation en chaîne, en
Français)
pH potentiel hydrogène
rpm rounds per minute (tours par minute, en français)
s secondes
sp. specie. Fait référence à une espèce non précisée
spp. Pluriel de specie. Fait référence à plusieurs espèces non précisées
TAE Tris-Acétate-EDTA
TSB Bouillon trypticase soja
UV Ultraviolet
Amour Valaire Andra NKANGOU : Mémoire de Master / Faculté des Sciences et Techniques / UMNG vii
Table des matières
Dédicaces .............................................................................................................................i
Remerciements .................................................................................................................... ii
Présentation de la structure d’accueil ................................................................................... iii
Liste des figures...................................................................................................................v
Liste des tableaux ............................................................................................................... vi
Abréviations, sigles et symboles ......................................................................................... vii
Introduction .........................................................................................................................1
1. Contexte et justification .............................................................................................2
2. Problématique ...........................................................................................................3
3. Objectifs ...................................................................................................................3
4. Hypothèses de travail.................................................................................................4
Chapitre I : Revue bibliographique .......................................................................................5
I.1 La fermentation......................................................................................................6
I.2 Les aliments et boissons fermentés traditionnels en République du Congo ...............6
I.2.1 Les aliments traditionnels fermentés ....................................................................7
I.2.2 Les boissons traditionnelles fermentées ...............................................................7
I.3 Le genre Bacillus : .................................................................................................8
I.3.1 Caractéristiques générales ...................................................................................8
I.3.2 Phylogénie du genre Bacillus ..............................................................................9
I.3.3 Importance biotechnologique du genre Bacillus ...................................................9
I.4 Les biosurfactants bactériens : .............................................................................. 10
I.4.1 Définition......................................................................................................... 10
I.4.2 Classification.................................................................................................... 10
I.4.3 Biosynthèse ...................................................................................................... 11
I.4.4 Pouvoir antimicrobien du biosurfactant ............................................................. 12
I.5 Bacillus et biofilm :.............................................................................................. 12
I.5.1 Généralités ....................................................................................................... 12
I.5.2 Composition du biofilm .................................................................................... 13
I.5.3 Etapes de formation du biofilm ......................................................................... 14
I.5.4 Voies de signalisation et gènes impliqués dans la formation des biof ilms............ 15
I.6 Gènes de ménage et identification moléculaire ...................................................... 18
Chapitre II : Matériel et méthodes ...................................................................................... 19
II.1 Cadre d’étude......................................................................................................... 20
Amour Valaire Andra NKANGOU : Mémoire de Master / Faculté des Sciences et Techniques / UMNG viii
II.2 Matériel ................................................................................................................. 20
II.2.1 Matériel biologique ............................................................................................ 20
II.2.2 Matériel de laboratoire ....................................................................................... 20
II.3 Méthodes ................................................................................................................. 22
II.3.1 Isolement et purification des bactéries du genre Bacillus à partir des différents
aliments et boissons fermentés .................................................................................... 22
II.3.2 Caractérisation phénotypique des isolats ............................................................. 22
II.3.3 Détection de la capacité de formation des biofilms .............................................. 24
II.3.4 Test d’émulsification ......................................................................................... 25
II.3.5 Extraction du biosurfactant ................................................................................ 26
II.3.6 Tests d’inhibition avec l’extrait de biosurfactants ................................................ 27
II.3.7 Confirmation moléculaire de l’identité des isolats par des techniques de biologie
moléculaire................................................................................................................. 27
Chapitre III : Résultats et discussion ................................................................................... 36
III.1 Résultats................................................................................................................. 37
III.1.1 Etudes microbiologique et biochimique ............................................................. 37
III.1.2 Test de production des biofilms ......................................................................... 39
III.1.3 Test d’émulsification ........................................................................................ 42
III.1.4 Extraction du biosurfactant ............................................................................... 44
III.1.5 Tests d’inhibition avec des extraits de biosurfactants ......................................... 44
III.1.6 Analyses de Biologie Moléculaire ..................................................................... 46
III.2 Discussion .............................................................................................................. 52
Conclusion et Perspectives ................................................................................................. 59
Références bibliographiques............................................................................................... 61
Annexes ............................................................................................................................ 67
Amour Valaire Andra NKANGOU : Mémoire de Master / Faculté des Sciences et Techniques / UMNG ix
Introduction
Amour Valaire Andra NKANGOU : Mémoire de Master / Faculté des Sciences et Techniques / UMNG 1
1. Contexte et justification
Présent dans tous les environnements et associées à des surfaces minérales, végétales ou
animales, le biofilm est défini comme un ensemble d’agrégats multicellulaires, maintenus
ensemble par une matrice extracellulaire, composée de polymères biologiques (Santosh Pandit
& Tiina Nypelö 2020). La majorité des bactéries possèdent la faculté de former le biofilm
(Mielich-Süss, 2015), car plus de 99 % des bactéries se développent en biofilms (R.M. Donlan,
2002) sur une grande variété de surfaces telles que les métaux, les plastiques, les tissus vivants
(humains, feuilles et racines des végétaux), les surfaces minérales. Le plus souvent inoffensifs,
les biofilms peuvent représenter également une importante source de nuisance tant dans le
domaine médical, qu’industriel (MELCHIOR MB, 2006). Cependant il est également possible
de tirer profit des biofilms, notamment quand ils sont constitués des bactéries bénéfiques telles
que certaines espèces du genre Bacillus ; d’autant plus que l’éventail de leurs applications reste
encore largement à explorer.
D’une manière générale, les biofilms jouent un rôle écologique capital et contribuent très
largement au bon fonctionnement de la plupart des écosystèmes, en participant notamment au
cycle du carbone, de l’eau. De plus ils jouent aussi un rôle essentiel dans de nombreux
processus, en contribuant : à la production et à la dégradation de la matière organique, au
recyclage de l’azote, du soufre et de nombreux métaux (Roux & Ghigo, 2006). Dans l’industrie,
les biofilms servent au traitement des déchets par un mécanisme appelé « bioremédiation »
(Cohen, 2002). Les microorganismes composant les biofilms peuvent en effet utiliser des
matériaux polluants comme source de carbone et d’énergie. Ainsi, les biofilms sont employés
pour traiter les eaux usées et les décharges, pour dépolluer des sites contaminés et enfin, pour
mobiliser les métaux lourds d’un sol ou d’un déchet par le procédé de biolixiviation (Roux &
Ghigo, 2006).
Les biofilms d’origine bactérienne ont été caractérisés en partie grâce aux études effectuées sur
l’organisme modèle Bacillus subtilis, une bactérie à Gram positif ubiquitaire du sol (Zhu &
Stülke, 2018). Prouvées et reconnues comme des organismes GRAS (Generally Recognized
As Safe) (Joshi, Suthar, Yadav, Hingurao, & Nerurkar, 2013), les Bacillus font l’objet
d’utilisation diverses notamment : comme agents de contrôle biologique, de détoxification et
aussi comme additifs alimentaires (Cutting, 2011). C’est le cas par exemple de B. subtilis qui
est utilisée comme un biofertilisant et un agent de contrôle biologique en agriculture, car elle
favorise la croissance des plantes et protège celles-ci contre des agents pathogènes par le biais
du biofilm qu’il forme au niveau de la rhizosphère (Mielich-Süss, 2015).
En outre, les bactéries organisées en biofilm sont capables de produire des substances
extracellulaires de protection (EPS) suscitant un réel intérêt industriel. En effet, les
exopolysaccharides produits par exemple par le genre Bacillus possèdent entre autres des
activités anti tumorale et antivirale ; ces derniers offrent également une alternative à l’utilisat ion
d’émulsifiants synthétiques dans l’industrie alimentaire (Abid et al., 2019).
En raison du large éventail d’applications non explorées, de l’intérêt biotechnologique,

écologique et économique que présentent les biofilms formés par le genre Bacillus, il est
absolument nécessaire de bien cerner leurs propriétés biologiques particulières, d'acquérir une
bonne connaissance de tous les facteurs favorisant leur développement ou croissance pour
mieux comprendre l’étendue de leur impact par rapport à leur omniprésence dans certains
aliments fermentés.
2. Problématique
En République du Congo, les aliments fermentés couvrent au quotidien les besoins alimentaires
de la population (Kayath et al., 2016). Dans l’industrie agro-alimentaire, on trouve différents
micro-organismes selon les aliments manipulés et/ou transformés. Ces derniers auraient la
capacité à former des biofilms dans tout type d’aliments. Or, la présence de biofilm peut être
un atout majeur pour la valorisation des aliments fermentés retrouvés au niveau local. Il sied de
noter que plusieurs études menées sur les aliments fermentés, rapportent la présence des
souches potentiellement biotechnologiques telles que B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis,
B. mojavensis et B. safensis (Mbozo et al., 2017). La formation des biofilms, bénéfique en
industrie biotechnologique des aliments fermentés, est peu connue dans la base de données des
plateformes de recherche scientifique.
Par conséquent, dans l’optique de valoriser les produits fermentés locaux, une attention
particulière est portée sur quelques aliments fermentés en l’occurrence le vin de gingembre, vin
de palme, vin de banane et les feuilles fermentées de manioc, afin de mettre en évidence
l’implication des bactéries du genre Bacillus dans le processus de formation des biofilms, aussi
bien que le mécanisme d’inhibition des autres bactéries pathogènes.
3. Objectifs
L'objectif général de cette étude est de montrer la capacité pour les bactéries du genre Bacillus
à former des biofilms dans les aliments fermentés.
Plus spécifiquement, il s’agit de :
caractériser phénotypiquement les isolats purifiés par les techniques classiques de

microbiologie et de biochimie ;
sélectionner les isolats capables de former les biofilms et évaluer leur potentialité à
produire des biosurfactants ;
utiliser les technologies de l’ADN pour l’identification des isolats et la caractérisation
moléculaire des gènes codants pour des facteurs participant dans la biosynthèse des
biofilms.
4. Hypothèses de travail
Les aliments fermentés tels que : le vin de gingembre, le vin de palme, le vin de
banane et le ntoba mbodi, renferment des bactéries du genre Bacillus.
Les bactéries du genre Bacillus forment des biofilms dans les aliments fermentés tout
en produisant des biosurfactants ;
Les bactéries du genre Bacillus hébergent des gènes qui codent pour les facteurs
participant dans la biosynthèse des biofilms.
Ce travail s’articule autour de quatre parties ;
La première partie est consacrée à la revue bibliographique incluant des connaissances axées
sur les aliments fermentés déjà étudiés en République du Congo, sur le genre Bacillus et sur la
formation des biofilms en général chez le genre Bacillus (processus, molécules et voies de
signalisation impliquées).
La deuxième partie évoque la stratégie mise en place pour réaliser notre étude. Le matériel et
les procédés appliqués pour atteindre nos objectifs.
La troisième partie présente et discute les résultats obtenus à l’issue de la phase expérimentale.
Enfin, une conclusion des différents résultats obtenus dans ce travail et la présentation des
principales perspectives envisagées en vue d’une poursuite de cette thématique de recherche.
Chapitre I : Revue bibliographique
I.1 La fermentation
Du latin fermentare signifiant « levain », le terme fermentation peut être définie sous différentes
formes en fonction du domaine dans lequel il est utilisé ; par exemple en biochimie cela
représente un processus métabolique occasionnant la génération d'énergie par le catabolisme
des composés organiques sous un contrôle enzymatique ; tandis qu’une définition large dans
l'industrie alimentaire stipule qu'elle est « la transformation biochimique des aliments par
diverses bactéries, champignons et enzymes qu'ils produisent » (Katz, 2012). Il est à noter qu'en
plus de la définition donnée selon Katz, les processus de fermentation utilisent les moisissures
ainsi que les levures pour la transformation des aliments et des boissons (Shokri & Terefe,
2019). La fermentation a été longtemps utilisée comme méthode de transformation des
aliments, généralement pour prolonger la durée de conservation des denrées périssables ; mais
en plus de la conservation des denrées, aujourd’hui elle est largement utilisée pour améliorer la
qualité sensorielle et nutritionnelle des aliments (Azokpota, 2015), et par conséquent dans le
but de produire des variétés uniques et nouvelles d'aliments (Rodgers, 2008). Bien que la
pratique de la fermentation alimentaire soit enracinée dans une myriade de normes culturelles,
partout dans le monde la fermentation s'est étendue des systèmes de production traditionnelle à
des systèmes de production industrielle destinés au marché de masse. La fermentation peut être
fortement représentée dans le produit final, comme avec le vin de banane (Mbavou) et les
feuilles fermentées de manioc (Ntoba mbodi) ou être simplement une étape de la préparation,
telle qu’avec la farine de manioc (foufou) et du gari. Dans les deux cas, la fermentation est une
étape de développement importante qui peut être responsable de la création de motifs d’arômes,
et d'odeurs, ainsi que des propriétés sanitaires propres à chaque produit fini. Cependant, lors
d'un processus de fermentation, différentes espèces de micro-organismes entrent en compétition
et le produit final est donc le résultat de plusieurs types de fermentation.
I.2 Les aliments et boissons fermentés traditionnels en République du Congo

En République du Congo, les aliments et boissons fermentés couvrent au quotidien les besoins
alimentaires de la population (Kayath et al., 2016). Ces derniers sont produits aux moyens des
techniques traditionnelles qui varient d'une culture à une autre ; motivé surtout par : la
disponibilité des matières premières généralement végétales ou animales, des préférences
gustatives et des conditions environnementales.
I.2.1 Les aliments traditionnels fermentés
I.2.2 Les feuilles fermentées de manioc ou « Ntoba mbodi »
Préparé selon diverses recettes culinaires, le « Ntoba mbodi » est le fruit d’une fermentation de
type alcalin des feuilles de manioc (Manihot esculenta Crantz) et constitue un des plats de
légumes les plus consommés en alimentation humaine au Congo (Vouidibio Mbozo A., 2016:).
Du point de vue nutritionnel, ces légumes contiennent en poids sec 17 à 34 % de protéines
brutes et 16 à 26 % de fibres (Louembe, Kobawila, Bouanga-Kalou, & Kéléké, 2003). Produit
de façon artisanale, comme tout procédé empirique la fermentation du « Ntoba mbodi » se fait
sous l’action de certains micro-organismes fortuitement présents sur les feuilles de manioc ;
tels que les bactéries du genre Bacillus avec les espèces comme Bacillus subtilis, Bacillus
pumilus, Bacillus megaterium, Bacillus licheniformis, B. amyloliquefasciens (Louembe et al.,
2003; Mbozo et al., 2017).
I.2.3 Autres aliments fermentés

Outre les feuilles fermentées de manioc, on retrouve au Congo d'autres types d’aliments
fermentés utilisant principalement comme matières premières : les céréales, les fruits, les
légumes, les tubercules et les poissons. On peut citer les aliments comme le « Pilipili » (piment
fermenté), les « Bikedi » (tubercules de manioc rouies), le « Foufou » (farine de manioc), la «
Chikwangue » (pain de manioc ou masse cuite de pâte fermenté de manioc), le «Poto-poto»
(pâte fermentée de maïs), le « Tsiya » (pulpe fermentée d’une baie de Landolphia jumelei), le
« Mbala-mpinda », « le Pandé », les poissons fermentés (Kayath et al., 2016).
I.2.4 Les boissons traditionnelles fermentées

I.2.5 Vin de palme ou « Nsamba »
Considérée en République du Congo comme la plus consommée et la plus représentée des
boissons fermentées traditionnelles, le vin de palme est le fruit d'une fermentation naturelle de
la sève sucrée du palmier à huile (Elaeis guineensis). Avec un pH acide compris entre 4-5, il
contient environ 1,5 à 2,1 % d'alcool (Bassir, 1962), 12 à 15 % de sucre soluble (saccharose),
de petites quantités de glucose, de fructose, de raffinose, de maltose, de polysaccharides,
d'acides organiques et d'acides aminés (Van Pee, 1971). En plus, des bactéries lactiques,
bactéries acétiques, et des levures, des espèces comme Bacillus subtilis, B. sphaericus et B.
pumilus (Kayath et al., 2016) ont été retrouvées dans le vin de palme.
I.2.2.2 Vin de Gingembre ou « Tangawiss »
Le vin de gingembre est la boisson traditionnelle fraiche la plus consommée en République du
Congo. Fait à base d’une plante appelé gingembre (Zingiber officinale Roscoe), le gingembre
peut en effet être consommé sous forme brute (rhizome) ou sous forme de boisson (jus ou vin
de gingembre). La fermentation du gingembre se fait sous l’action de certains micro-organismes
tels que : Saccharomyces cerevisiae ainsi que les bactéries du genre Bacillus comme B.
licheniformis, B. safensis et Bacillus pumilus ; jouant ainsi un rôle primordial dans la production
des polyphénols et des flavonoïdes (Kayath et al., 2020).
I.2.2.3 Vin de Banane ou « Mbavou »

Le vin de Banane est fait à base de plantain (Musa spp.) qui à l’instar de la banane dessert est
plus rigide quant à sa pulpe. Fruit des régions tropicales, la banane plantain est riche en
composés phénoliques, en caroténoïdes, en flavonoïdes et en amines biogènes (Singh, Singh,
Kaur, & Singh, 2016). Il est également enrichi en minéraux, tels que le Phosphore, le Sodium,
le Potassium, le Calcium, le Magnésium, le Fer, le Cuivre, le Zinc et le Manganèse (Forster,
2003). Bien que peu d’études ont été faites sur le vin de banane, néanmoins la fermentation du
« Mbavou » se déroule à un pH acide et implique des microorganismes comme les bactéries
lactiques (Lactobacillus plantarum), les Bacillus spp. et les levures à orientation
Saccharomyces.
I.2.2.4 Autres boissons fermentées

En plus des boissons mentionnées ci-dessus, en République du Congo, on retrouve d’autres
variétés de boissons fermentées traditionnelles parmi lesquelles le vin de canne à sucre
«loungwila», le vin de miel «duma» et les vins d’orange «malala», d’ananas et de
pamplemousse (Kayath et al., 2016).
I.3 Le genre Bacillus :

I.3.1 Caractéristiques générales
Les bactéries du genre Bacillus sont hétérogènes et caractérisées par des cellules en croissance
aéro-anaérobie facultatif à Gram positif, formant des spores, très souvent mobiles (Multon,
Linden, Bourgeois, & Leveau, 1991) exceptées B. anthracis et B. mycoïdes. Ubiquitaires de
l’environnement, au microscope ces bactéries présentent des cellules en forme de bâtonnet droit
ou légèrement recourbé de taille variable, que l'on retrouve seul ou en pair, parfois en chaine et
occasionnellement en long filament (Vos et al., 2011). Appartenant à l’embranchement des
Firmicutes, à la classe des Bacilles (Bacilli), à l’ordre des Bacillales, et à la famille des
Bacillaceae (Maughan & Van der Auwera, 2011), le genre Bacillus est moins exigeant et se
cultive facilement sur gélose ordinaire (Zeigler & Perkins, 2008).
I.3.2 Phylogénie du genre Bacillus

Basée jadis sur les caractéristiques physiologiques, phénotypiques et biochimiques (Maughan
& Van der Auwera, 2011), la phylogénie classique de nos jours, a complètement été
révolutionnée suite aux approches moléculaires comme le séquençage de l’ARNr 16S, faisant
ainsi place à une phylogénie moléculaire (Das, Dash, Mangwani, Chakraborty, & Kumari,
2014). Sur la base donc du séquençage de l’ARNr 16S, les bactéries du genre Bacillus ont été
classées selon neuf groupes phylogénétiques distincts (Wang & Sun, 2009) comme le montre
le tableau I.
Tableau I: Classification des bactéries du genre Bacillus
Groupes Quelques espèces
I B. amyloliquefasciens, B. aerophilus, B. altidinus, B. licheniformis, B. mojavensis,

B. pumilus, B. subtilis, B. safensis, B. sonorensis
II B. anthrancis, B. cereus, B. thuringiensis, B. finiuilus, B. megaterium
III B. infermus, B. simplex
IV B. aeolus, B. methanolicus
V B. fastidious, B. indicus
VI B. clausii, B. halodurans
VII B. arsenicus, B. barbaricus
VIII B. clarkii, B. cellulolyticus
IX B. halophilus, B. thermocloacae
I.3.3 Importance biotechnologique du genre Bacillus

Connues pour leur capacité à croître rapidement, à atteindre de hautes densités cellulaires et à
sécréter un grand nombre de molécules, les bactéries du genre Bacillus constituent un outil,
suscitant l’intérêt dans différents secteurs industriels tant pour leurs enzymes, que pour leurs
molécules à large spectre d’activités biologiques, dont les antibiotiques (Sonenshein, Hoch, &
Losick, 2001). En plus des nombreuses enzymes synthétisées par le genre Bacillus, ces bactéries
sont également capables de produire des métabolites secondaires comme les biosurfactants,
utilisés dans les industries pharmaceutique et alimentaire (Rani, Weadge, & Jabaji, 2020). En
effet, ces biosurfactants produits par les Bacillus sont de nature lipopeptidique, comprenant
entre autres la surfactine, l’iturine, la fengycine, la lichenysine ; qui sont dotés d’activités
antibactériennes, antivirales, et permettent également de lutter contre des tumeurs (Roy, 2017).
Plus récemment, un produit de soin à activité anticoronavirus, dont le SARS-CoV-2, à base de
surfactine lipopeptidique (Green Butterfy-Galatec; https://www.galavon.com/) a été
développé. Le brevet PCT / CN2020 / 085779 sera publié prochainement. En outre, les Bacillus
possèdent aussi un grand potentiel de production d’exopolysaccharides qui de nos jours
suscitent un réel intérêt industriel. Il a été montré que les exopolysaccharides produits par le
genre Bacillus possèdent des activités anti tumorale, antivirale et immunostimulante ; ces
derniers peuvent donc être utilisé comme potentiels épaississants, agents gélifiant et émulsifiant
offrant ainsi une alternative à l’utilisation d’émulsifiants synthétiques dans l’industrie
alimentaire (Abid et al., 2019). De plus certains exopolysaccharides produits par Bacillus
sonorensis peuvent être utilisés dans la bioremédiation ainsi que comme prébiotiques
(Palaniyandi, Damodharan, Suh, & Yang, 2018).
I.4 Les biosurfactants bactériens :

I.4.1 Définition
Les biosurfactants sont des molécules amphiphiles (à la fois hydrophiles et hydrophobes),
dotées des propriétés tensioactives ; capables ainsi de réduire la tension superficielle et
interfaciale entre deux fluides (solution aqueuse et un mélange d'hydrocarbures). Les
biosurfactants peuvent être d’origine microbienne ou synthétisés par des plantes et des animaux.
En effet les biosurfactants microbiens, sont produits sous forme de métabolites secondaires qui
restent accolés sur la membrane des cellules microbiennes ou sont sécrétés dans le milieu
extracellulaire. La biodégradabilité, la faible toxicité et la solubilité des composés hydrophobes
sont les caractéristiques des biosurfactants qui ont attiré l'attention de l'industrie (Jahan,
Bodratti, Tsianou, & Alexandridis, 2020).
I.4.2 Classification
Les biosurfactants sont classés selon leur nature chimique et leur origine microbienne. De plus
ces molécules amphiphiles sont divisées en deux grandes classes en fonction de leur poids
moléculaire : il existe les biosurfactants à faibles poids moléculaires (Lipopeptides,
glycolipides et phospholipides) et les biosurfactants à poids moléculaire élevés (biosurfactants
polymériques…) (Jahan et al., 2020). Le tableau ci-dessous donne un aperçu sur la nature des
différents biosurfactants caractérisés dont les voies de synthèse sont bien connues à ce jour ainsi
que leur origine bactérienne (la liste n’est pas exhaustive).
Tableau II: Biosurfactants et origines bactériennes.

Type de biosurfactant Nature chimique Microorganismes Référence
Surfactine Lipopeptide Bacillus subtilis
Lichenysine Lipopeptide Bacillus licheniformis
Fengycine Lipopeptide Bacillus subtilis
Iturine Lipopeptide Bacillus subtilis
plipastatin A1 Lipopeptide Bacillus subtilis

(Kubicki et al.,
polymyxine B Lipopeptide Paenibacillus polymyxa 2019)
fusaricidine B Lipopeptide Paenibacillus polymyxa
didemnin B Lipopeptide Tistrella mobilis
Massetolides Lipopeptide Pseudomonas

fluorescens
Rhamnolipides Glycolipide Pseudomonas

aeruginosa
I.4.3 Biosynthèse
Les biosurfactants présentent une gamme de structures amphiphiles différentes. Cependant tout
biosurfactant quel que soit l’espèce, présente dans sa molécule des groupements hydrophobes
et hydrophiles, ce qui signifie qu'au moins deux voies de synthèse différentes doivent être
considérées : une conduisant au groupement hydrophile et une autre au groupement
hydrophobe. L’un des systèmes bactériens relativement bien compris en ce qui concerne le
mécanisme biosynthétique du biosurfactant est la formation de la surfactine par les Bacillus
spp. (Sineriz, Hommel, & Kleber, 2001). La surfactine est un lipopeptide produit par divers
microorganismes dont Bacillus spp., qui est principalement reconnue comme l'un des
biosurfactants les plus efficaces car elle réduit la tension superficielle à des concentrations
faibles (Kubicki et al., 2019).
En effet, dans le cas par exemple de la surfactine lipopeptidique cyclique produite par des
souches spécifiques de Bacillus subtilis et Bacillus mojavensis, la biosynthèse est pilotée par
l'opéron srfA. Cet opéron code quatre cadres de lecture ouverts nécessaires à la construction du
complexe surfactine synthétase qui par conséquent est constitué de quatre sous-unités
enzymatiques : les enzymes srfA (E1A, 402 kDa), SrfB (E1B, 401 kDa), srfC (E2, 144 kDa) et
la SrfD (E3, 40 kDa). Ce complexe reconnaît les sept acides aminés présentent dans la molécule
de surfactine. Ainsi, srfAA incorpore les acides aminés Glu, Leu et D-Leu ; srfAB incorpore
Val, Asp et D-Leu ; tandis que le srfAC fonctionne dans l'incorporation de Leu. De plus, srfAD
ou srfD code une thioestérase qui initie la biosynthèse de la surfactine. L'activation de l'opéron
srfA est régulé par le gène comA, qui est un activateur transcriptionnel capable de se lier à
l'ADN (Gutnick & Shabtai, 2017).
I.4.4 Pouvoir antimicrobien du biosurfactant

D’un point de vue physiologique, le biosurfactant confère entre autres au microorganisme qui
en produit une activité antimicrobienne vis-à-vis de divers agents pathogènes (Roy, 2017). En
raison de leurs propriétés antimicrobiennes, les biosurfactants présentent un grand potentiel
dans diverses applications biopharmaceutiques. Celles-ci résultent principalement de la
capacité de certains biosurfactants tels que des lipopeptides à perturber la structure et les
fonctions des membranes biologiques, entraînant une augmentation de la perméabilité de la
membrane. De plus, ces molécules amphipatiques modifient l'hydrophobicité de la surface
bactérienne, stimulant le processus de dispersion des biofilms. Bacillus subtilis TR47II isolée
de L'île de Trinidad, au Brésil a été caractérisée pour coproduire la surfactine, l'iturine et la
fengycine qui présentent une forte activité antibactérienne contre les agents pathogènes
opportunistes à Gram négatif (de Souza Freitas et al., 2020). De même chez Bacillus
methylotrophicus, les biosurfactants protègent contre Salmonella enterica et Xanthomonas
campestris, qui sont respectivement des agents pathogènes spécifiques à l’homme et aux plantes
(Rani et al., 2020).
I.5 Bacillus et biofilm :

I.5.1 Généralités
Le biofilm est défini comme un ensemble d’agrégats multicellulaires, maintenus ensemble par
une matrice extracellulaire, composée de polymères biologiques (Santosh Pandit & Tiina
Nypelö 2020). Il est un mode de vie utilisé par de nombreux microorganismes pour proliférer
sur des substrats inanimés ou biologiques inertes, passant ainsi d'un état de vie libre à une
communauté multicellulaire , impliquant de multiples changements qui conduisent à une
reprogrammation cellulaire et des modifications des profils d'expression des molécules de
surface cellulaire, des voies d'utilisation des nutriments et des facteurs de virulence qui facilitent
la croissance dans des conditions défavorables (Saxena, Joshi, Rawat, & Bisht, 2019). En effet,
un biofilm peut être constitué d’une (homogène) ou plusieurs espèces bactériennes
(hétérogène), qui sont capables d’opérer des changements phénotypiques (qu’elles soient de
souche identique ou différente).
Dans le cas par exemple du biofilm formé par Bacillus subtilis, les cellules se différencient
d’abord phénotypiquement en producteurs de biosurfactants (capables de réduire la tension
superficielle exhibant ainsi la motilité), transitent ensuite vers un phénotype où elles sont
immobiles et produisent de la matrice extracellulaire, permettant d'élargir la colonie pour
former et explorer de nouveaux territoires. Grâce à leur nature polymérique, les biofilms
présentent des caractéristiques mécaniques à la fois élastiques et visqueuses ; qui, y compris
lors de leur dynamique de croissance, sont cruciales pour la survie du biofilm dans de nombreux
environnements. Ainsi ce microenvironnement complexe qui est le biofilm, offre donc un degré
de protection aux cellules bactériennes, permettant de survivre à une exposition à différents
types de stress environnemental. Et cette protection est basée entre autres sur : la limitation de
la pénétration d'agents toxiques dans le biofilm, la résistance aux contraintes mécaniques. Par
ailleurs, il a été reporté que la formation du biofilm est déclenchée par la détection du quorum
sensing ainsi que par d'autres phénomènes régulateurs complexes qui détectent la disponibilité
des nutriments (Santosh Pandit & Tiina Nypelö 2020) ; mais aussi certains produits de
fermentation tels que l'acétoïne et l'éthanol chez B. cereus, peuvent agir comme de petits ligands
et interagir directement avec des cibles dans les cellules pour modifier l'expression des gènes,
dont les activités contribuent à leur tour à la formation du biofilm (Yan et al., 2017).
I.5.2 Composition du biofilm

L’architecture des biofilms bactériens est en grande partie lié à la production de la matrice
extracellulaire, et est très complexe car différents micro-organismes génèrent différents types
de composants de matrice de biofilm. En effet, les constituants les plus courants sont les
polysaccharides, les protéines et l’ADN (Fuqua, Filloux, Ghigo, & Visick, 2019). Néanmoins
dans le cas des biofilms de Bacillus subtilis la matrice extracellulaire se compose
majoritairement de deux composants : des polysaccharides EPS (extracellular polymeric
substance) et des protéines (TasA, TapA et BslA) (Santosh Pandit & Tiina Nypelö 2020).
Cependant la matrice extracellulaire qui maintient les biofilms ensemble peut être auto-produite
par les microorganismes formant le biofilm ou peut également être fournie par leur
environnement (Fuqua et al., 2019).
Tableau III: Composition du biofilm bactérien (Muhsin, Ufaq, Tahir, & Saadia, 2015).
Composants Pourcentage dans la matrice
Cellules microbiennes 2-5 %
Protéines 1-2 %
Polysaccharides <1-2 %
ADN/ARN <1-2 %
Eau Supérieur à 97 %
I.5.3 Etapes de formation du biofilm

Il existe une biodiversité considérable parmi les biofilms formés par différentes espèces
bactériennes. Néanmoins, B. subtilis est largement utilisée comme organisme modèle pour
étudier la formation et les caractéristiques des biofilms bactériens (Santosh Pandit & Tiina
Nypelö 2020), notamment grâce à l’avantage qu’a cette bactérie d’avoir un génome entièrement
séquencé, en plus d’être facilement manipulable du point génétique ; ce qui favorise la
compréhension des gènes impliqués dans la formation du biofilm (Zhu & Stülke, 2018). En
effet la formation d’un biofilm est un processus hautement complexe, s’effectuant en une série
d’étapes conduisant à l’adaptation à une multitude de conditions nutritionnelles et
environnementales (Rivera, Ramos, & Desgarennes, 2007). Dans ce processus, les
microorganismes subissent des changements après leur adhésion à une surface passant de la
forme planctonique à la forme sessile. La figure 1 modifiée de (Lebeaux & Ghigo, 2012),
résume les différentes étapes du cycle d’un biofilm se formant sur des surfaces solides.
Figure 1. Développement et structure d’un biofilm bactérien. Après les phases d’attachement
réversible puis irréversible, la bactérie crée une microcolonie qui produit une matrice extracellulaire (en
jaune) et qui peut accueillir d’autres espèces microbiennes par accrétion. Le biofilm mature est le site de
gradients inverses en nutriments (flèche bleue) et en déchets (flèche rouge) définissant des niches
physiques et chimiques. Il peut se disperser et libérer des bactéries mobiles (dispersion active) ou des
agrégats bactériens entourés de matrice (dispersion passive).
I.5.4 Voies de signalisation et gènes impliqués dans la formation des biofilms

En fonction des conditions environnementales, plusieurs signaux extracellulaires et/ou
intracellulaires peuvent réguler la production de la matrice extracellulaire. Par conséquent
plusieurs voies de signalisation peuvent être activées, dont la plus importante est la voie du
régulateur majeur Spo0A ; qui s’amorce notamment par l’activation d’une ou plusieurs kinases
(KinA, KinB, KinC ou KinD). Une fois activées, ces dernières vont initier un phospho-relais
en phosphorylant Spo0B, qui va ensuite transférer son phosphate à Spo0F puis à Spo0A
(Spo0A-P). En effet, cette protéine phosphorylée va permettre l’activation de la transcription
du gène codant SinI, un anti-répresseur de la protéine SinR qui réprime lui-même l’expression
des gènes de la matrice extracellulaire. La protéine SlrR vient aussi jouer un rôle de répression
sur la protéine SinR. Finalement, Spo0A-P réprime AbrB qui n’est plus en mesure de réprimer
efficacement l’expression des gènes de la matrice (Figure 2). Les gènes exprimant la matrice
extracellulaire sont composés de deux principaux opérons soit epsA-O et tapA-sipW-tasA aussi
nommé eps et tapA. L’opéron eps comprend 15 gènes (A à O) et est responsable de la
fabrication d’exopolysaccharides, un des composants majeurs de la matrice extracellulaire.
Tandis que l’opéron tapA encode pour des protéines structurales nécessaires à la formation de
la matrice du biofilm. La protéine TasA forme des fibres amyloïdes qui sont assemblées par la
protéine TapA et ancrées dans la paroi cellulaire. Et lors de leur sécrétion, ces deux dernières
protéines sont modifiées par la protéine SipW qui quant-à elle est une peptidase signal.
Toutefois, les signaux capables d’induire l’activité des kinases peuvent provenir de la bactérie
elle-même, par exemple la surfactine qui est sécrétée par certaines bactéries du biofilm, où ils
peuvent être extérieurs, comme les polysaccharides présents à la surface des cellules de plantes
(Mielich-Süss, 2015).
Figure 2. Voie de signalisation Spo0A menant à

la formation de biofilm chez B. subtilis
 Signaux environnementaux : Polysaccharides de plantes
Composants majeurs de la paroi cellulaire des cellules végétales, les polysaccharides de plantes
font partie des différents signaux environnementaux capables d’induire la formation du biofilm.
Cependant, la voie d’activation menant à la formation du biofilm par les polysaccharides de
plantes reste inconnue. Néanmoins il a été démontré que la pectine peut induire la formation de
biofilm. D’autant plus que les polysaccharides végétaux peuvent être utilisés comme source de
carbone pour la biosynthèse de la matrice extracellulaire (Beauregard, Chai, Vlamakis, Losick,
& Kolter, 2013) (Habib et al., 2017).
 Signaux cellulaires : Surfactine
En plus d’être une molécule antimicrobienne pouvant inhiber le processus de développement

des autres bactéries, la surfactine est un biosurfactant de nature lipopeptidique qui aide à la
mobilité des cellules bactériennes sur une surface solide (Aleti et al., 2016). Finalement, la
surfactine est aussi une molécule de quorum sensing qui a un effet positif sur la formation des
biofilms notamment chez B. subtilis (Santosh Pandit & Tiina Nypelö 2020). En effet, une fois
produite et sécrétée hors des cellules, la surfactine va se lier à la membrane cellulaire des
bactéries pour former des pores ; ce qui va induire une fuite de potassium à l’extérieur des
cellules puisque ces pores sont sélectifs pour ce cation. Cette fuite va engendrer une différence
de potentiel (ddp) de potassium dans la cellule causée par le changement de concentration
intracellulaire de potassium. La kinase KinC, mentionnée ci-dessus comme étant une protéine
transductrice du signal de formation du biofilm, va répondre au changement de concentration
de potassium intracellulaire en phosphorylant Spo0A (Figure 3). La phosphorylation de Spo0A
va mettre en marche la voie de signalisation permettant l’expression de la matrice
extracellulaire, soit du biofilm (López, Fischbach, Chu, Losick, & Kolter, 2009).
Figure 3. Induction de la formation de matrice extracellulaire par la

surfactine
I.6 Gènes de ménage et identification moléculaire
Encore appelés gènes domestiques, les gènes de ménage ("house-keeping genes") sont des
gènes pratiquement retrouvés chez tous les microorganismes et existant en un seul exemplaire,
à l’exception du gène de l’ARNr 16S (Adékambi T, 2008). Ces gènes codent pour des protéines
indispensables aux fonctions cellulaires de base qui sont cruciales à la survie des
microorganismes. Présentant une diversité intra-spécifique, cette qualité a fait que ces gènes
soient utilisés comme biomarqueurs de référence pour les examens de typage moléculaire
(Multi-Locus Sequence Typing : MLST) (Adékambi T, 2008) (Maeda T, 2000). De nos jours,
il est évident que l’utilisation de ces gènes est plus qu’indispensable à l’identification et la
classification des espèces bactériennes ; il existe toute une gamme de gènes de référence connus
et utilisés pour identifier et classifier les microorganismes (Das et al., 2014).
Ainsi parmi les différents gènes de ménage utilisés pour l’identification moléculaire, figure le
gène de l’ARNr 16S qui code pour l’Acide ribonucléique ribosomique 16S, constituant de la
petite sous-unité des ribosomes des procaryotes. Le gène de l’ARNr 16S a une longueur
standard d’environ 1500 pb, avec 9 régions hypervariables qui permettent la distinction de
l’espèce et remplit la même fonction chez tous les procaryotes (Petti, 2007). Ce gène est présent
en plusieurs copies au sein de chaque organisme (Case, 2007),ce qui facilite son amplification
par PCR. Goto et al (2000) ont employé le séquençage partiel du gène de l’ARNr 16S pour
l'identification rapide des bactéries du genre Bacillus (Goto, 2000.). Cependant, ce critère est
insuffisant pour certaines espèces (Bavykin & Cherni, 2004).En effet, la classification des
espèces bactériennes étroitement proches peut être très difficile car les gènes des ARNr 16S
sont hautement conservés. Par exemple, au sein de la famille des Bacillaceae, ils présentent une
similitude de l'ordre de 99% (Ash, 1991).
D’autres marqueurs moléculaires ont été utilisés pour surmonter les limites présentées suite à
l’utilisation du gène de l’ARNr 16S. C’est le cas par exemple du gène fibE codant pour les
enzymes fibrinolytiques, d’autant plus qu’il a récemment été démontré par Kaya-Ongoto que
ce gène peut être utilisé comme biomarqueur dans l’identification moléculaire des bactéries du
genre Bacillus appartenant au groupe phylogénique I (Kaya-Ongoto et al., 2019). Cette
méthode est fiable, rapide et possède un grand pouvoir discriminatoire comparé à celui des
gènes ribosomaux. Les gènes codant les enzymes fibrinolytiques diffèrent d’une espèce à une
autre, une différence répertoriée même jusqu’au niveau des sous-espèces (Nguimbi et al.,
2014). La taille du gène est variable entre 800 et 900 pb selon l’espèce. Ce gène est conservé à
travers les Bacillus spp. du groupe I et possède un pourcentage d’homologie de près de 90%.
Chapitre II : Matériel et méthodes
II.1 Cadre d’étude
Cette étude a été réalisée dans le laboratoire de microbiologie appliquée et de biologie
moléculaire de l’Institut national de Recherche en Sciences Exactes et Naturelles (IRSEN) de
Brazzaville situé sur l’avenue de l’Auberge Gascogne, dans l’enceinte de la Cité Scientifique
(Ex-ORSTOM), à Château d’eau (Makélékélé), pendant la période allant de Novembre 2020 à
Juin 2021.
II.2 Matériel
II.2.1 Matériel biologique
Dans ce travail, le matériel biologique utilisé pour isoler les bactéries du genre Bacillus est
constitué de différents aliments et boissons fermentés collectés à Brazzaville, ces derniers sont
présentés dans le tableau IV.
Cependant, il sied de signifier que certains isolats du genre Bacillus préalablement isolés des
mêmes aliments et boissons fermentés dans notre laboratoire, ont été également utilisés dans le
cadre de cette étude. De plus, une souche de Bacillus subtilis, isolée et identifiée dans notre
laboratoire dans le cadre d’une étude antérieure nous a été fournie pour servir contrôle positif
pour les technologies de l’ADN.
Tableau IV: Nature, provenance et codification des échantillons
Echantillon Nom Provenance Codification Nature
E1 Ntoba mbodi Marché total (Bacongo) NM Solide
E2 Vin de Fabriqué au laboratoire G Liquide

gingembre
E3 Vin de palme Mayanga (Mabidou) VP Liquide
E4 Vin de banane Fabriqué au laboratoire VB Liquide
II.2.2 Matériel de laboratoire

L’équipement de laboratoire ci-dessous a été utilisé dans le cadre de ce travail.
Tableau V: Présentation du matériel de laboratoire
Matériel Réactifs et Produits
Verreries (marque Pyrex), micropipettes, Eau distillée stérile, eau oxygénée, KOH à 3 %,
Embouts + portoir + marqueurs indélébiles Rouge Congo, saccharose, glucose, cristal violet
Centrifugeuse, Lampe ultra violette, Lysozyme 10 mg/L ; Agarose

Lunettes de protection et casque.
Gants en latex, Autoclave, Stabilisateur, Tampon TAE (Tris Acétate EDTA), PBS à 0,01
Balance, M, pH 7,4
Vortex, bec bunsen, papier Alu, Solution EP (solution de lyse), Solution d’élution,
microscope, SDS 10 %
Four à micro-ondes, pipette pasteur, Tampon de charge (Dye),

congélateur Bromure d’éthidium
Incubateur, agitateur magnétique, tubes à Solution de lyse, l’éthanol (95 %) à froid

Eppendorf de 1,5 mL
Tubes à PCR, thermocycleur (Bio –Rad) Primers (ARNr 16S, fibE et exopolysaccharides)
Moules, cuve à électrophorèse, papier Master mix, Marqueur moléculaire 2-log (Bioké)
parafilm, peignes et fenêtres à
électrophorèse.
 Milieux de culture
Pour l’accomplissement de ce travail, nous avons utilisé des milieux tels que :
 milieu Mossel : milieu solide sélectif utilisé pour l’isolement des bactéries du genre
Bacillus.
 milieu Lysogeny Broth (LB) : milieu à large spectre pouvant être utilisé pour la
purification, la conservation des isolats et la réalisation de différents tests dans ce travail.
 milieu PCA (Plate Count Agar) : milieu à large spectre pouvant être utilisé pour la
purification des isolats et la réalisation de différents tests.
 gélose au Rouge Congo (GRC) : milieu solide utilisé pour détecter de façon qualitative
la formation des biofilms.
 Bouillon trypticase soja (TSB) : milieu riche à large spectre convenant à l'isolement, la
culture, l'identification des bactéries particulièrement exigeantes et également utilisé
pour détecter de façon qualitative la formation des biofilms dans ce travail.
Les compositions des différents milieux de culture cités ci-dessus sont mentionnées dans le
tableau XV en annexe.
II.3 Méthodes
II.3.1 Isolement et purification des bactéries du genre Bacillus à partir des différents
aliments et boissons fermentés
II.3.1.1 Isolement
II.3.1.1.1 Préparation du milieu Mossel
45 g du milieu Mossel ont été pesés et transférés dans 950 mL d’eau distillée. Le mélange a été
chauffé puis stérilisé à l’autoclave à 121 °C pendant 15 minutes. Après refroidissement autour
de 50 °C, 50 mL d’émulsion de jaune d’œuf ont été ajoutés au milieu de culture de façon
aseptique.
II.3.1.1.2 Dilutions décimales et préparation de l’inoculum

Pour les échantillons liquides (vin de gingembre, vin de palme, vin de banane) 1 mL et 1 g pour
l’échantillon solide (Ntoba Mbodi), ont été transférés de façon séparée dans un tube à essai
contenant au préalable 9 mL d’eau physiologique stérile. Pour chaque échantillon, 5 dilutions
décimales (10-1 à 10-5) ont été effectuées constituant ainsi l’inoculum.
II.3.1.1.3 Ensemencement par étalement des dilutions et incubation

Un volume de 100 µL de l’inoculum de chaque dilution et de la solution mère a été prélevé
dans les conditions stériles à l’aide d’une micropipette puis déposé sur la surface du milieu
gélosé Mossel. Ensuite, l’inoculum a été étalé sur la gélose. La boîte ainsi ensemencée a été
incubée dans une étuve à 37 °C pendant 24 h en aérobiose.
II.3.1.2 Purification des isolats par repiquage

Après 24 h d’incubation, les boîtes de Pétri montrant les colonies isolées ont été sélectionnées
pour la purification. Les isolats ont été repiqués sur le milieu Mossel puis PCA pour le 3ème
repiquage en utilisant la technique des quadrants et incubées à nouveau à 37 °C, pendant 24 h
en aérobiose. Ceci a été réalisée autant de fois jusqu’à obtenir des colonies pures (identiques).
II.3.2 Caractérisation phénotypique des isolats

La caractérisation phénotypique des isolats a été réalisée sur la base des caractéristiques
morphologiques (morphologie des colonies, morphologie cellulaire) et biochimiques (type de
Gram et production de la catalase) de ces derniers. A l’issue de la caractérisation, les isolats
purs obtenus et orientés vers le genre Bacillus ont été conditionnés dans des tubes à Eppendorf
contenant du LB additionné de 50 % de Glycérol (v/v), puis ont été stockés à -20 oC pour une
conservation de longue durée et à -4 oC sans glycérol pour une brève durée.
II.3.2.1 Caractérisation morphologique des isolats

II.3.2.1.1 Aspect macroscopique
La caractérisation morphologique des isolats (forme, taille, contour et couleur des colonies) a
été réalisée par observation directe à l’œil nu sur des colonies préalablement incubées pendant
24 h à 37 °C sur le milieu gélosé Mossel.
II.3.2.1.2 Aspect microscopique

La forme, la mobilité et l’arrangement cellulaire ont été appréciés à l’état frais des jeunes
cultures, en prélevant une fraction de la colonie sur boite puis la déposer dans une goutte d’eau
physiologique sur une lame. Ensuite une lamelle a été déposée sur la suspension liquide, enfin
le tout a été visualisé au microscope optique à l’objectif 40 (G×400).
II.3.2.1.3 Test de sporulation

Le test de sporulation est un test effectué dans le but de montrer la capacité qu’ont les bactéries
du genre Bacillus à former des spores. En effet, la culture liquide de 24 h de chaque isolat
purifié a été soumise à un choc thermique à 90 °C pendant 10 min dans un bain marie puis
étalée sur le milieu gélosé Mossel. Ensuite, les boîtes ont été placées à l’étuve à 37 °C entre 24
à 72 h. L’isolat est déclaré sporogène après croissance et non sporogène lorsqu’il n’y a pas
croissance.
II.3.2.2 Caractérisation biochimique

II.3.2.2.1 Test de Gram (KOH)
Ce test permet de différencier les bactéries à Gram positif de celles à Gram négatif, en utilisant
le réactif de KOH à 3 %. Pour ce faire, il suffit de mettre en contact sur une lame stérile une
colonie isolée avec une goutte de KOH à 3 %, prélevée à l’aide d’une pipette Pasteur. Puis le
mélange est tiré vers le haut. L’isolat testé est déclaré bactérie à Gram négatif si la suspension
présente un caractère visqueux et filant. Par contre, l’absence du caractère visqueux et filant
montre que l’isolat correspond à une bactérie à Gram positif.
II.3.2.2.2 Test de catalase
La catalase est une oxydoréductase qui catalyse la dismutation du peroxyde d'hydrogène en eau
et dioxygène, selon la réaction suivante :
2 H2 O 2 O2 + 2 H2O
Pour ce faire, une fraction de la colonie de l’isolat à tester a été ajoutée et mélangée avec une
goutte d’eau oxygénée à 10 volumes déposée au préalable sur une lame stérile. La présence de
l’enzyme se traduit par l’observation d’une effervescence notamment pour les bactéries étant
catalases positives.
II.3.3 Détection de la capacité de formation des biofilms

II.3.3.1 Méthode de culture sur la Gélose au Rouge Congo (GRC)
La capacité à former des biofilms a été évaluée par la méthode de culture sur Rouge Congo,
selon un protocole modifié et adapté d’après celui préconisé par Freeman (1989). Cette méthode
consiste à mettre en culture des isolats sur ce milieu gélosé puis à incuber pendant 24 h à 37 °C
en condition aérobie. Le milieu Gélosé au Rouge Congo (GRC) est composé de : 23,5 g/L de
milieu PCA, 50 g/L de saccharose, et 0,8 g/L de colorant de Rouge Congo. Notons que le Rouge
Congo a été préparé séparément des autres constituants du milieu sous forme de solution
aqueuse concentrée puis autoclavé à 121 °C pendant 15 minutes ; ensuite il a été ajouté lorsque
la gélose s’est refroidie à 55 °C. La formation de biofilms est révélée par la présence des
colonies noires.
II.3.3.2 Méthode des tubes à essai en verre

Il s’agit d’une évaluation qualitative de la formation de biofilms selon la méthode de
Christensen (1985). Dans un premier volet, chaque isolat a été cultivé dans 10 mL de bouillon
trypticase soja additionné à 2 % de glucose dans les tubes et incubé à 37 °C pendant 24 h. Les
tubes ont été ensuite décantés en tapotant doucement et lavés avec du PBS (Phosphate Buffer
Saline) pH=7,3, puis colorés au cristal violet à 2 %. Après incubation à 37 °C pendant 15
minutes, les tubes ont été rincés avec de l’eau distillée et séchés en position inverse. Dans un
second volet, nous avons refait le test dans les mêmes conditions en substituant le glucose par
le saccharose notamment pour les différents isolats avérés négatifs sur GRC mais positifs au
premier volet de la méthode tube à essai utilisant du TSB additionné du glucose. Dans les deux
cas, la formation du biofilm a été considérée comme positive lorsqu’un film visible bordait la
paroi et le fond du tube. Les tubes sont examinés et la formation de biofilms a été notée comme
absent (-), modérée (+) et forte (++).
II.3.4 Test d’émulsification

Pour ce faire, seuls les isolats capables de former le biofilm sur gélose au Rouge Congo ont été
sélectionnés pour ce test. Le test d’émulsification consiste en effet, à mettre en évidence dans
des tubes à essai l’aptitude de production des biosurfactants par des isolats en présence
d’hydrocarbures (l’essence). L’index d'émulsification (IE) est mesuré après 24 h ou 48 h
d’incubation et les isolats ayant un fort pourcentage d’émulsification ont fait l’objet d’une
extraction.
II.3.4.1 Préparation du bouillon Lysogeny Broth (LB)

20 g de LB ont été pesés et transférés dans 1 L d’eau distillée. Le mélange a été homogénéisé
et chauffé sous agitation magnétique. Ensuite, le milieu a été autoclavé à 121 °C pendant 15
minutes dans des flacons stériles. Après refroidissement du milieu, les isolats à tester ont été
inoculés dans des flacons contenant du LB puis mis à l’incubation à 37 °C sous agitation toute
la nuit.
II.3.4.2 Procédure
Dans un premier temps, les cultures de nuit des différents isolats à tester ont été lancées. Après
24 h d’incubation sous agitation, la densité optique des isolats a été mesurée. Ensuite 2 mL
d’essence ont été ajoutés à volume égal au bouillon de culture, puis le mélange a été
homogénéisé au vortex à vitesse maximale pendant 5 min et laissé au repos sur paillasse à
température ambiante pendant 24 h. Dans un second temps, après avoir lancé les cultures de
nuit, ces dernières ont été centrifugées à 6.000 rpm pendant 12 minutes. Après centrifugation,
2 mL du surnageant ont été mélangés à volume égal avec de l’essence contenu dans des tubes
à essai stériles. Le mélange a ensuite été homogénéisé au vortex à vitesse maximale pendant 5
min et laissé au repos sur paillasse à température ambiante pendant 24 h. Dans les deux cas, la
hauteur totale de l’hydrocarbure (H t ) et la hauteur de l’émulsion (H E) ont été mesurées à l’aide

d’une règle graduée (en cm) ; et les valeurs obtenues ont permis à calculer l’index
d’émulsification E24 selon la formule :
𝑯𝒆
E24%= 𝑯𝒕 × 100
E24%= taux d’émulsification après 24 h ; He= Hauteur de l’émulsification ; Ht= Hauteur totale.
II.3.5 Extraction du biosurfactant
Seuls les isolats présentant un index d’émulsification ≥ 50 % ont été sélectionnés pour
l’extraction du biosurfactant.
II.3.5.1 Préparation du bouillon Lysogeny Broth (LB)

20 g de LB ont été pesés et transférés dans 1 L d’eau distillée. Le mélange a été homogénéisé
et chauffé sous agitation magnétique. Ensuite, le milieu a été autoclavé à 121 °C pendant 15
minutes dans des flacons stériles. Après refroidissement du milieu, les isolats à tester ont été
inoculés dans des flacons contenant du LB puis mis à l’incubation à 37 °C sous agitation toute
la nuit.
II.3.5.2 Procédure
Après 24 h d’incubation sous agitation, la densité optique des cultures a été prise et cette
dernière devrait être supérieure ou égale à 0,6 pour que l’isolat fasse l’objet d’une extraction.
Dans un premier volet, la suspension bactérienne a été centrifugée à 13 000× g pendant 15
minutes puis environ 5 mL du surnageant ont été prélevés et placés dans un tube à essai stérile.
Ensuite, 2 à 3 gouttes d’HCl concentré ont été ajoutées jusqu’à obtenir un pH=2,0 en vue de
d’obtenir un précipité et les tubes ont été incubés à -4 °C pendant 24 h. Après incubation, on
observait un dépôt au fond du tube traduisant la présence de l’extrait du biosurfactant. Le
mélange de nuit a été de nouveau centrifugé à 13000× g pendant 15 minutes et une fois
débarrassé du surnageant, le précipité a été collecté par élution dans 1 mL de PBS et conservé
au frais en vue de réaliser le test d’inhibition. Dans un second volet, après avoir lancé les
cultures overnight des différents isolats à tester, ces dernières ont été centrifugées à 13 000× g
pendant 15 minutes. Après centrifugation, le surnageant a été jeté puis le culot a subi un lavage
à deux reprises en utilisant de l’eau distillée stérile à un volume 20 mL tout en centrifugeant à
chaque lavage et en jetant le surnageant. A l’issue du dernier lavage, le culot a été élué dans un
volume de 4 à 8 mL de PBS (volume dépendant de l’importance du culot) et le mélange a été
laissé sous agitation à température ambiante pendant 7 h. Par la suite, le mélange a été à nouveau
centrifugé en jetant cette fois ci le culot. 3 gouttes d’HCl concentré ont été ajoutées au
surnageant jusqu’à pH=2,0 en vue de précipiter puis les tubes ont été incubés à -4 °C pendant
24 h. Après incubation, le mélange de nuit a été de nouveau centrifugé à 13000× g pendant 15
minutes et une fois débarrassé du surnageant, le précipité a été récolté par élution dans 1 mL de
PBS et conservé au frais en vue de réaliser le test d’inhibition.
II.3.6 Tests d’inhibition avec l’extrait de biosurfactants
II.3.6.1 Préparation du Bouillon Lysogeny Broth (LB)
Le milieu liquide LB a été préparé dans des flacons tel que décrit ci-haut. Après refroidissement
du milieu, les bactéries pathogènes (E. coli, Staphylococcus aureus et Salmonella sp.) ont été
inoculées dans des tubes à essai contenant du LB liquide puis mis en incubation à 37 °C sous
agitation toute la nuit. Après 24 h, on observait un aspect trouble traduisant la croissance
bactérienne.
II.3.6.2 Procédure
Le milieu gélosé PCA a été préparé et coulé sur boites de Pétri. Après solidification du milieu,
les différentes suspensions des bactéries pathogènes ont été diluées en utilisant de l’eau
physiologique afin d’avoir une D.O autour de 0,5 pour les différents inocula. Ces inocula sont
par la suite ensemencés en réalisant des stries serrées dans les trois directions de la boite de
Pétri à l’aide d’un écouvillon. Les boites de Pétri inoculées ont été laissées à l’étuve pour
séchage pendant environ 30 min ; puis 20 µL d’extrait de biosurfactant ont été déposés sur les
différentes boites préalablement inoculées. Les boites ont été ensuite incubées à 37 °C pendant
24 h. La présence des zones claires ou halos clairs autour du lieu du dépôt de l’extrait du
biosurfactant indique une activité inhibitrice positive.
II.3.7 Confirmation moléculaire de l’identité des isolats par des techniques de biologie
moléculaire
Seuls les isolats capables de produire les biofilms et présentant à la fois un index
d’émulsification ≥ 50 % ont été sélectionnés pour les analyses de biologie moléculaire.
II.3.7.1 Etude in silico

Dans le but de prédire des informations à l’issue des travaux expérimentaux effectués, une étude
in silico a été préalablement réalisée sur trois (3) espèces de Bacillus notamment : B. subtilis,
B. licheniformis, et B. pumilus.
Pour ce faire, nous avons en premier lieu recherché les séquences génomiques des bactéries
supra mentionnées dans la base de données NCBI (National Center for Biotechnology
Information, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/); avant de rechercher en second lieu les différents
gènes impliqués dans la formation des biofilms. Dans le cadre de notre étude, il s’agit des gènes
eps, tasA, ymcA et yfiQ, codant chacun pour des protéines particulières dont certaines
participent dans les chainons métaboliques des exopolysaccharides. Nous avons par la suite
utilisé le logiciel pDRAW32 (http://www.acaclone.com/download/download.htm) pour
l’analyse bio-informatique (retrouver le bon cadre de lecture, créer les amorces, faire des PCR
in silico). Les amorces ont été enfin générées en se servant des séquences d’ADN génomiques
de ces trois espèces supra mentionnées.
II.3.7.2 Extraction d’ADN génomique

C’est une technique permettant d’isoler l’ADN génomique (ADNg) des cellules. Le principe
d’extraction de l’ADNg se résume en trois étapes : Lyse de la cellule bactérienne, élimination
des impuretés notamment des protéines et d’autres acides nucléiques (ARN) et enfin
concentration de l’ADN par précipitation à l’alcool.
II.3.7.2.1 Protocole
Une culture de nuit de l’isolat pur à tester a été lancée dans du bouillon LB sous agitation (200
rpm). Puis à l’aide d’une micropipette un volume de 3 mL de cette culture a été prélevé et
transféré dans un tube à Eppendorf stérile. Le tube à Eppendorf a ensuite subi une centrifugation
à 10000 rpm (Labnet, USA) pendant 1 min et le surnageant obtenu a été jeté. Par la suite, un
volume de 200 μL de solution de lyse EP, constitué du Chlorure de sodium (200 mM) + l’acétate
de sodium (300 mM) et 20 μL de lysozyme à 10 mg /mL, a été ajouté au culot bactérien contenu
dans le tube à Eppendorf. Le mélange a été incubé dans une étuve (INCU-Line VMR) à 37 °C
pendant 10 min, avant d’ajouter un volume de 400 μL de solution de lyse (lysis binding buffer
: High pure RNA isolation kit Roche) au mélange ; le tout a été d’abord agité à l’aide d’un
vortex (VELP Scientifica), puis centrifugé pendant 20 min à 10000 rpm. Cette fois ci le
surnageant a été prélevé et transféré dans un autre tube à Eppendorf stérile et un volume de 600
μL d’éthanol (95 %) à froid a été ajouté au surnageant. Le mélange a été incubé pendant 20 min
à froid à une température de -20 °C. Après cela, une centrifugation a encore été faite pendant
20 min à 10000 rpm et le surnageant a ensuite été jeté avant d’ajouter un volume de 1 mL
d’éthanol (95 %) à froid et d’incuber de nouveau le mélange à froid à une température de -20
°C pendant 10 min. Après incubation, une centrifugation du mélange a été faite à 10000 rpm
pendant 10 min et le surnageant a été jeté. Ensuite, les tubes à Eppendorf ont été séchés sur
paillasse pendant 20 min. Enfin, un volume de 40 μL du tampon d’élution a été ajouté pour
diluer l’ADN. Après extraction, une électrophorèse sur gel d’agarose a été réalisée pour
contrôler les produits issus de l’extraction.
II.3.7.3 Electrophorèse d’ADN sur gel d’agarose
L’électrophorèse d’ADN sur gel d’agarose consiste à faire migrer différents fragments d’ADN
sur gel d’agarose pur, immergé dans un tampon de migration et sous l’influence d’un champ
électrique. La migration des fragments d’ADN se fait alors en fonction de leur poids
moléculaire et du maillage du gel. Enfin, la visualisation de l’ADN se fait grâce à l’addition
d’agents fluorescents comme le bromure d’éthidium (BET) en utilisant une lampe à UV. La
taille des fragments analysés peut ainsi être estimée en faisant usage d’un marqueur de poids
moléculaire.
 Réactifs utilisés
Tampon de charge (dye)

Marqueur de poids moléculaire 2-Log (BIOKÉ)
Agarose
Bromure d’éthidium (BET)
242 g Tris-HCl
Tris-Acétate-EDTA concentré 50X
100 mL EDTA (0,5 M pH=8,57)
1 mL Acide Acétique Glacial
 Préparation du gel d’agarose à 1 %

1 g d’agarose a été pesé et dissout dans 100 mL du tampon TAE concentré à 1X. Le mélange a
été par la suite chauffé au four à microonde jusqu’à dissolution complète de l’agarose. Après
chauffage, le mélange obtenu est refroidi à température ambiante pendant 5 min environ, puis
5 μL de BET ont été ajoutés au mélange avant de l’homogénéiser. La solution de gel tiède a
ensuite été coulée dans un moule contenant un peigne préalablement disposé et servant à créer
des puits. Une fois solidifié, le peigne et les supports des moules ont été délicatement retirés.
Le moule a alors été placé dans la cuve à électrophorèse contenant le tampon de migration TAE
(1X). 4 µL des échantillons d’ADN extrait de chaque isolat, préalablement mélangé avec 2 µL
de dye (solution de charge) sur du papier parafilm et 3 µL du marqueur de poids moléculaire
ont ensuite été déposés à l’aide d’une micropipette dans les puits du gel. La migration a été
réalisée à 100 Volts pendant 45 min environ avec un générateur (Pierron, France). L’ADN a
ensuite été visualisé à partir d’une lampe à UV (UVP TM-20E), grâce à la fluorescence du BET.
II.3.7.4 Réaction de polymérisation en chaine ou Polymerase Chain Reaction (PCR)
Permettant de cibler et d’amplifier spécifiquement une séquence d’ADN à partir d’une très
faible quantité de matériel génétique, la PCR se fait par action cyclique de la Taq polymérase
(ADN polymérase) qui succède à la synthèse initiée par des amorces spécifiques à la séquence
d’ADN à amplifier.
II.3.7.4.1 Amplification par PCR du gène fibE

La réaction PCR a été réalisée dans un volume final de 50 µL contenant 19 µL d’eau distillée
stérile, 2 µL d’ADN, 2 µL de chaque amorce (sens et anti sens) ainsi que 25 µL de master mix
(tableau VI). Pour chaque isolat, trois réactions PCR ont été réalisées en utilisant les amorces
spécifiques à chaque espèce. Les microtubes de 0,2 mL sont ensuite placés dans un
thermocycleur (Biorad, Singapour). Le programme utilisé pour l’amplification de ce gène est
consigné dans le tableau VIII.
Tableau VI: Mélange réactionnel de la PCR du gène fibE
Composition Volume de réaction Concentration finale
Volume finale = 50 µL
ADN matriciel 2 µL environ 2 ng/µL
Amorces sens et anti-sens 2 µL de chaque 0,4 µM de chaque
Master mix 25 µL
Ajuster avec de l’eau distillée stérile jusqu’à obtenir un volume final de 50 μL.
Tableau VII: Séquences d’oligonucléotides utilisées pour l’amplification du gène fibE
Noms des Séquences 5’……3’ Taille Espèces cibles Référen
amorces (pb) ce
Bs.Id.Ma-F GCGCAATCTGTTCCTT ATGGCAT B. subtilis (Kaya-

Ongoto
Bs.Id.Ma-R TTATTGTGCAGCTGCTTGT ACGTTG 835 et al.,
A 2019)
Bl.Id.Ma-F GCGCAAACCGTTCCTT ACGGCAT 825 B. licheniformis
Bl.Id.Ma-R TTATTGAGCGGCAGCTTCGAC
Ba.IdMa-F GCGCAGTCCGTGCCTT ACGGCGT 828 B.

amyloliquefasciens
Ba.IdMa-R TTACTGAGCTGCCGCCTGT ACG
Bp.Id.Ma-F GCACAAACCGTCCCTT ATGGAAT 828 B. pumilus
Bp.Id.Ma-R TTAGTTAGAAGCCGCTTGAGCG
Bsa.Id.Ma-F GCACAAACCGTCCCTT ATGGAAT 828 B. safensis
Bsa.Id.Ma-R TTAGTTAGAAGCCGCTTGAACGTT
G
Tableau VIII: Programme d’exécution de l’amplification par PCR du gène de fibE

Etapes Prédénaturation Dénaturation Hybridation Elongation Elongation
Finale
Températures 95 95 55 72 72
(°C)
Temps 5 min 30 s 30 s 1 min 7 min
30 cycles
Les amplicons résultant de cette PCR ont été contrôlés sur gel d’agarose à 1 %. Toutefois les
isolats ayant amplifié le gène fibE ainsi que ceux n’ayant pas amplifié le gène fibE, ont été
retenus pour l’amplification de l’ARNr 16S. De même, les produits PCR de l’ARNr 16S des
isolats identifiés par fibE ont également servi à réaliser une digestion enzymatique en utilisant
l’enzyme de restriction PstI.
II.3.7.4.2 Amplification par PCR du gène de l’ARNr 16S
La réaction PCR a été réalisée dans un volume final de 50 µL contenant 32,75 µL d’eau distillée
stérile, 2 µL d’ADN, 2 µL de chaque amorce (sens et anti sens), ainsi que 25 µL de master mix
(tableau IX). Pour chaque isolat, trois réactions PCR ont été réalisées en utilisant les amorces
spécifiques à chaque espèce. Les microtubes de 0,2 mL sont ensuite placés dans un
thermocycleur (Biorad, Singapour). Le programme utilisé pour l’amplification de ce gène dure
environ 2 h et est consigné dans le tableau XI.
Tableau IX: Mélange réactionnel de la PCR du gène de l'ARNr 16s
Composition Volume de réaction Concentration finale
Volume finale = 50 µL
ADN matriciel 2 µL environ 2 ng/µL
Amorces sens et anti-sens 2 µL de chaque 0,4 µM de chaque
Master mix 25 µL
Ajuster avec de l’eau distillée stérile jusqu’à obtenir un volume final de 50 μL.
La PCR du gène codant pour l’ARNr 16S a été réalisée avec les amorces standards « sens »
(fD1) et « anti sens » (rP2).
Tableau X: Séquences d’oligonucléotides utilisées pour l’amplification du gène ARNr

16S
Amorces Séquences nucléotidiques
fD1 5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
rP2 5’-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’
Tableau XI: Programme d’exécution de l’amplification par PCR du gène de l’ARNr 16S
Etapes Prédénaturation Dénaturation Hybridation Elongation Elongation

Finale
Températures 95 95 55 72 72
(°C)
Temps 5 min 30 s 30 s 1 min 30 s 5 min
35 cycles
Les amplicons résultant de cette PCR ont été contrôlés par électrophorèse sur gel d’agarose à 1
% et révélés au Bromure d’Ethidium (BET) à l’aide d’une lampe à UV, avant le séquençage.
II.3.7.5 La méthode RFLP ou Digestion enzymatique

La RFLP est une technique qui consiste à générer des fragments de différentes tailles à partir
d’une séquence d’ADN, grâce à des enzymes dites enzymes de restriction coupant l’ADN en
des sites appelés palindromes. Pour cette étude, une recherche des séquences génomiques
complètes des bactéries du genre Bacillus (B. pumilus et B. safensis) utilisés dans ce travail a
été faite dans la banque de données américaine NCBI (National Center for Biotechnology
Information http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), pour une identification préalable des sites au
niveau desquels l’enzyme de restriction peut couper. Pour cela, une analyse bio-informat ique
en utilisant le logiciel pDRAW32 a été faite pour identifier le site de coupure, déterminer le
nombre de fragments générés, faire des cartes graphiques.
La digestion enzymatique a été réalisée dans un volume final de 15 µL du mix, contenant

notamment 2,5 µL d’eau distillée stérile, 10 µL du produit PCR du gène de l’ARNr 16S, 1,5
µL du tampon de l’enzyme de restriction concentré à 10 X et 1 µL de l’enzyme de restriction
PstI (tableau XII). Les tubes à Eppendorf ont été ensuite incubés à 37 °C pendant 30 min afin
de faciliter la digestion. La réaction est arrêtée en ajoutant 3 µL de solution dye 6X. Par la suite
une migration du mix a été réalisée sur un gel d’agarose. Les produits ont été révélés au BET
en utilisant un appareil UV.
Tableau XII: Mélange réactionnel de la R.F.L.P
Composition Volume finale de réaction = 15 µL
Produit PCR 10 µL
Eau distillée stérile 2,5 µL
Cutsmart Buffer 10X 1,5 µL
Enzyme de restriction (PstI-HF) 1 µL
Incuber le mélange pendant 15 à 30 min à 37 °C
II.3.7.6 Amplification des gènes de biofilms (eps, tasA, ymcA et yfiQ) chez les Bacillus
spp. par PCR multiplex sur colonie
Les gènes impliqués dans la formation des biofilms ont également été amplifiés dans le cadre
de ce travail en utilisant l’approche de la PCR multiplex sur colonie. Pour y parvenir, une
fraction de colonie de chaque isolat a été raclée sur boîte et transférée dans un tube à PCR
contenant 15 µL d’eau distillée stérile. Le tube a été ensuite chauffé à 95 °C dans un
thermocycler pendant 15 min, dans le but de casser les cellules bactériennes afin de libérer le
matériel génétique qui servira de matrice pour l’amplification. Cependant, le mélange
réactionnel utilisé pour cette réaction PCR est similaire à celui utilisé pour l’amplification du
gène fibE, avec un même volume final de 50 µL. La différence réside sur le nombre de couples
d’amorces, qui est de 5 couples ici, d’où le terme de PCR multiplex. Ces amorces spécifiques
ont été générées à partir des séquences téléchargées sur le portail NCBI. Ces différentes
amorces sont consignées dans le tableau XIII ci-après :
Tableau XIII: Séquences d’oligonucléotides utilisées pour l’amplification des gènes
impliqués dans la formation des biofilms
Noms des Séquences 5’……3’ Taille Espèces cibles

amorces (pb)
BPymcAF ACGCTTTATTCAAAAAAAGAGATTG
BPymcAR TCATTTAATGGAGCAACTTGGT 435 Bacillus pumilus
BLymcAF GTGACGCTTTATACGAAAAAAGAGATT
BLymcAR TTATAGAGAACAGCTCGGTGAT 432 Bacillus

licheniformis
BLyfiQF TTTTGCTTCATGCGATAT CAAT GG
BLyfiQR TTAACCTGCATGATGGCGC 1089
BStasA1F ATGGGTATGAAAAAGAAATTGAGTT
BStasA2R TTAATTTTTATCCTCGCT ATGCG 786 Bacillus subtilis
BSepsHF AAACACCTGCGGTT AGTCT G
BSepsHR TCACCCTCTGTTTCTCATTTTGTA 1035
Les amplicons résultants de cette PCR ont été contrôlés par électrophorèse sur gel d’agarose à
2 % et révélés au Bromure d’Ethidium (BET) à l’aide d’une lampe à UV.
Tableau XIV: Programme PCR des gènes impliqués dans la formation des biofilms
Etapes Prédénaturation Dénaturation Hybridation Elongation
Températures 95 °C 95 °C 55 °C 72 °C
(°C)
Temps 5 min 30 s 1 min 1 min 30 s
30 cycles
Chapitre III : Résultats et discussion
III.1 Résultats
III.1.1 Etude s microbiologique et biochimique
III.1.1.1 Isolement bactérien
A l’issue des vingt-quatre heures (24 h) d’incubation à 37 oC, divers profils de colonies sont
observés, sur des boites de Pétri contenant le milieu Mossel ensemencé avec différents
échantillons d’étude, notamment des colonies rouges, rosâtres, et des colonies jaunâtres.
Figure 4. Aspect macroscopique

des isolats de Bacillus spp. sur
milieu Mossel.
III.1.1.2 Purification des isolats

A la suite de l’isolement, les différentes colonies retenues supposées être des Bacillus spp., ont
été purifiées via la technique des quadrants par repiquage successif sur les milieux Mossel et
PCA en vue d’une caractérisation, ainsi que de la réalisation de différents tests susmentionnés,
suivie d’une identification moléculaire.
Figure 5. Aspects macroscopiques de deux isolats de Bacillus spp.

(A, isolat NM6 et B, isolat VB22) purifiés sur le milieu Mossel.
Au total, cent trente-trois (133) isolats ont été obtenus dont, quarante-cinq (45) isolats obtenus
à partir de l’échantillon du vin de palme, trente-trois (33) isolats du vin de gingembre, vingt-
trois (23) isolats à partir du vin de banane et trente-deux (32) isolats à partir du Ntoba mbodi
(figure 6).
32
45
23
33
Vin de palme Vin de gingembre

Vin de banane Ntoba mbodi
Figure 6. Résumé du nombre d'isolats de Bacillus spp. obtenus par aliment fermenté.
III.1.1.3 Caractérisation des isolats

Les isolats purifiés ont été macroscopiquement et microscopiquement caractérisés. Sur les cent
trente-trois (133) isolats obtenus, tous soient 100 % ont présenté des cellules en forme de
bâtonnets à Gram +, pouvant être isolées et/ou en paires ou en chaines et étant capables de
produire des spores après choc thermique. Par ailleurs, l’examen macroscopique de ces derniers
a permis de distinguer des colonies de tailles variables, de formes distinctes et présentant des
contours réguliers ou non. De même, tous les isolats caractérisés ont été en majorité (87 %)
mobiles. Seuls 3 % des isolats sont à catalase négative. Les détails sur la caractérisation des
isolats sont illustrés dans le tableau XVI en Annexe.
100%
95%
90%
85%
80%
Bâtonnet KOH – Sporogène Catalase + Mobilité
Bâtonnet KOH
(Gram +) – Sporogène Catalase + Mobilité
Série1 100% 100% +)
(Gram 100% 97% 87%
100 % 100 % 100 % 97 % 87 %
Figure 7. Résumé des caractéristiques phénotypiques et biochimiques des

isolats de Bacillus spp.
III.1.2 Test de production des biofilms

III.1.2.1 Méthode Gélose Rouge Congo
Le test de la production de biofilms par la méthode Gélose Rouge Congo a montré que, sur les
cent trente-trois (133) isolats testés, 60 (soixante) isolats soit 45 % ont été positifs au test de
formation de biofilms ; présentant ainsi des colonies noires (coloration forte ou modérée) avec
un cristallin de consistance sèche sur Gélose Rouge Congo, après incubation de 24 h à 37 °C.
Cet aspect est dû à la réaction entre le Rouge Congo avec des exopolysaccharides produits par
les isolats testés. Tandis que 73 (soixante-treize) isolats soit 55 % étaient non producteurs des
biofilms, présentant des colonies rouges sur le même milieu. Les résultats sont illustrés par les
figures 8, 9 et 10.
Figure 8. Profil phénotypique des isolats de Bacillus spp.

producteurs (coloration noire) ou non (coloration rouge) de
biofilms sur GRC.
Positifs;
Négatifs; 60; 45% Forte
Positifs
73; 55% 30; 50% 30; 50%
Négatifs Modérée
Figure 9. Bilan des isolats de Bacillus spp. Figure 10. Bilan des isolats de Bacillus spp.
producteurs ou non de biofilms. producteurs de biofilms selon les phénotypes ++
(fort) ou + (modéré).
14
13
12
12 10
Nombre d'isolats
10
9
8
6
5
4 4
4
3
2
0
Vin de Vin de palme Vin de banane Ntoba mbodi
gingembre
Echantillons
Forte Modérée
Figure 11. Criblage des isolats de Bacillus spp. producteurs de biofilm selon
les phénotypes ++ (fort) ou + (modéré) par aliment.
III.1.2.2 Méthode des tubes à essai en verre
Pour réaliser ce test, nous avons sélectionné lors du premier volet (méthode tube à essai utilisant
du TSB additionné du glucose), 21 isolats positifs présentant un meilleur profil de formation de
biofilm sur GRC, ainsi que 25 isolats négatifs au test GRC. Toutefois sur les 21 isolats (positifs
sur GRC) testés, 81 % soit 17 isolats sont restés positifs (15 ++ et 2+) alors que 19 % soit 4
isolats ont été négatifs. Par contre sur les 25 autres isolats négatifs sur GRC, 36 % soit 9 isolats
ont été positifs (+) tandis que 64 % soit 16 isolats sont restés négatifs. Cependant les neuf (9)
isolats qui se sont avérés positif lors de la réalisation de la méthode tube à essai avec TSB
additionné du glucose, se sont à nouveau avérés négatifs pour la méthode tube à essai utilisant
du TSB additionné du saccharose. Les résultats sont illustrés par les figures 12, 13 et 14.
C- G19 VP21 C+
Figure 12. Profil phénotypique des isolats de Bacillus spp. producteurs et

non producteurs de biofilms après coloration au cristal violet à 2%.
Figure 13. Criblage de la production de biofilms par la méthode de tube à essai des
isolats positifs sur milieu GRC. Des scores de 50 et 100 % ont été respectivement
attribués aux phénotypes modéré (+) et fort (++).
Figure 14. Criblage de la production de biofilms par la méthode de tube à essai des
isolats négatifs sur milieu GRC. Un score de 50 % a été attribué au phénotype
modérée (+).
III.1.3 Test d’émulsification

Pour mettre en évidence la potentialité des isolats de Bacillus spp. à produire des biosurfactants,
nous avons évalué leur capacité à émulsifier un type d’hydrocarbure (Essence). Par le biais de
deux méthodes, nous avons ainsi déterminé l’index d’émulsification après 24 h (E 24) d’abord à
partir de la culture totale (sans centrifugation), puis à partir du surnageant acellulaire après
centrifugation. Par conséquent sur les 60 (soixante) isolats (capables de former le biofilm)
testés, 39 (trente-neuf) isolats soit 65 % ont pu émulsifier l’essence, avec un index
d’émulsification (E24) compris entre 5 % et 100 % après 24 h d’incubation à température
ambiante. Cependant sur les 39 isolats, 11 (onze) isolats ont obtenu un index d’émulsification
(E24) ≥ 50 % avec la culture totale, et 5 (cinq) autres isolats ont obtenu un index d’émulsification
(E24) ≥ 50 % avec le surnageant acellulaire.
C- C+ NM29 G7 VP13 VB15
Emulsion
Figure 15. Emulsion de l’essence par quelques isolats de Bacillus spp.
% IE
Figure 16. Index d'émulsification avec la culture cellulaire et le surnageant acellulaire.

Chaque cercle représente un pourcentage. G1, G2, G3, G4, G5, G7, G8, G9, G11, G12,
G15, G17, G19, G16, G23, G25 et G32 : Isolats du vin de gingembre. VP2, VP3, VP7, VP9,
VP11, VP12, VP13, VP16, VP17, VP21, VP32, VP34, VP35, VP36, VP37, VP38, VP41,
VP42 et VP43 : isolats du Vin de palme. VB4, VB7, VB11, VB15, VB18, VB22, VB23 :
isolats du vin de banane. NM4, NM6, NM7, NM11, NM12, NM14, NM15, NM17, NM20,
NM21, NM23, NM28, NM29, NM34, NM43, NM45 et NM53 : Isolats du Ntoba mbodi.
III.1.4 Extraction du biosurfactant
Les seize (16) isolats présentant un index d’émulsification ≥ 50 % soit avec la culture totale ou
avec le surnageant, ont été sélectionnés pour le test d’extraction du biosurfactant par
précipitation à l’acide chlorhydrique (HCl). Tous les isolats ont présenté un précipité au fond
du tube comme le montre la figure suivante.
Figure 17. Extrait du biosurfactant obtenu après

précipitation à l'HCl.
Pour évaluer l’activité inhibitrice du résidu biosurfactant extrait par précipitation à l’HCl, nous
avons récolté le précipité dans le PBS pour le solubiliser. L’activité inhibitrice a été évaluée.
III.1.5 Tests d’inhibition avec de s extraits de biosurfactants

Sur les seize (16) isolats testés, neuf (9) soit 56 % ont montré un pouvoir inhibiteur sur les
différentes bactéries pathogènes utilisés dans cette étude. En effet, six (6) isolats ont pu inhiber
la croissance de Staphylococcus aureus, cinq (5) isolats ont pu inhiber E. coli, et Salmonella
sp.
Halo clair Contrôle +

Contrôle -
Figure 18. Comportement des extraits de biosurfactant dans la l’inhibition des

bactéries pathogènes (A, E. coli ; B, S. aureus et C, Salmonella sp.).
La présence des zones claires ou halos autour du lieu du dépôt de l’extrait du biosurfactant
indique une activité inhibitrice positive (+) après 24 h d’incubation à 37 oC. La moyenne du
diamètre des halos de chaque isolat a été calculée. Ces différents diamètres sont représentés
dans la figure 20. Les extraits de biosurfactants issus des isolats VB15, VB4, NM11 et NM29
ont montrés un pouvoir inhibiteur intéressant.
Activité inhibitrice
25
20
Diamètre des halos (mm)
15
10
0
G1 G17 VP2 VP7 VB4 VB15 NM11 NM23 NM29
-5
Extraits de biosurfactants
E.coli Staphylococcus aureus Salmonella
Figure 19. Diamètres des halos d’inhibition d’extraits de biosurfactants obtenus
III.1.6 Analyses de Biologie Moléculaire
III.1.6.1 Identification moléculaire des isolats de Bacillus
III.1.6.1.1 Etude in silico
Différentes séquences des gènes impliqués dans la formation des biofilms chez trois espèces de
Bacillus (B. subtilis, B. pumilus et B. licheniformis) trouvées sur le portail de NCBI, ont été
alignées avec l’outil Multialin (http://multialin.toulouse.inra.fr/ multialin/cgi-bin/pl) ; ainsi que
leurs amorces s’hybridant à des régions spécifiques (figure 20).
Figure 20. Alignement des séquences de trois espèces (B. subtilis, B. pumilus et B. licheniformis) avec des
amorces spécifiques qui s’hybrident.
III.1.6.1.2 Extraction de l’ADN génomique

Soit un total de seize (16) isolats présentant à la fois de meilleurs profils quant à leur capacité
à produire les biofilms et à émulsifier l’essence avec un index d’émulsification ≥ 50 %, ont été
sélectionnés pour l’extraction de l’ADN génomique ; dans le but de réaliser leur identification
moléculaire. La révélation s’est faite sur gel agarose à 1% et en utilisant le BET.
MP 1 2 3 4 6 MP
10Kb
1Kb
0,5Kb
+
Figure 21. Profil électrophorétique de l’ADN génomique de quelques
isolats de Bacillus spp. sur gel d’agarose à 1 %. (MP= Marqueur de poids
moléculaire 2-Log, puit 1 : G1, puit 2 : VP2, puit 3 : VB15, puit 4 : NM29),
puit 6 : NM11).
En s’appuyant sur le marqueur de poids moléculaire, la figure 21 montre 5 (cinq) bandes qui
apparaissent au-dessus de 10 kb et correspondent aux ADN génomiques des isolats
sélectionnés.
III.1.6.1.3 Confirmation de l’identité des souches (Réaction de polymérisation en chaine)

III.1.6.1.3.1 Amplification par PCR du gène fibE
Afin de confirmer l’identité des seize (16) isolats présentant à la fois de meilleurs profils quant
à leur capacité à produire les biofilms et à émulsifier l’essence avec un index d’émulsification
≥ 50 %, une amplification du gène fibE a été réalisée. Le profil électrophorétique des isolats
ayant amplifié les gènes fibE montre que les bandes des produits PCR sont uniques et aux tailles
attendues. Une taille d’environ 850 pb pour les couples d’amorces des gènes fibEBs (ciblant B.
subtilis), fibEBp (ciblant B. pumilus), fibEBsa (ciblant B. safensis) et fibEBl (ciblant B.
licheniformis) a été obtenue. Un nombre total de sept (7) isolats ont été confirmés comme
Bacillus du groupe phylogénique I, dont 3 isolats (G23, VB15, NM11) confirmés comme étant
B. pumilus ; deux isolats (G7 et G26) confirmés comme étant B. subtilis, un isolat (G17)
confirmé comme étant B. safensis et enfin un dernier isolat (G33) confirmé comme étant B.
licheniformis.
MP 1 2 3 4 5
1000pb
≈ 850pb
500pb
Figure 22. Profil électrophorétique sur gel d’agarose à 1% des amplicons de la PCR
du gène fibE des isolats de Bacillus spp. (MP : Marqueur de poids moléculaire, puit 1:
G7, puit 2 :VB15, puit 3 : G17, puit 4 : G33, puit 5 : NM11).
III.1.6.1.3.2 PCR du gène de l’ARNr 16S

L’amplification du gène de l’ARNr 16S a été effectuée sur les différents isolats ayant ou pas
amplifiés le gène fibE. La figure 23 montre une bande d’amplification autour de 1500 pb
correspond à la taille standard du gène de l’ARNr 16S pour chacun de ces isolats.
1500 pb
1000 pb
500 pb
+
Figure 23. Profil électrophorétique sur gel d’agarose à 1% des produits PCR du gène de
l’ARNr 16S des isolats de Bacillus. (MP : Marqueur de poids moléculaire 2-Log, puit 1 :
G1, puit 2 : G5, puit 3 :VB22, puit 4 : VP2, puit 6 : NM29).
III.1.6.1.3.3 Digestion enzymatique ou méthode R.F.L.P

A l’issue de la PCR de l’ARNr 16S, les produits PCR des sept (7) isolats ayant amplifié le gène
fibE, ont subis une digestion enzymatique dans le but de vérifier les bactéries identifiées par la
technique utilisant le gène fibE. En effet des séquences génomiques de deux (2) espèces de
Bacillus dont Bacillus pumilus et Bacillus safensis, ont été préalablement recherchées dans la
base de données NCBI. Par la suite les séquences obtenues ont été introduites dans le logiciel
pDRAW 3.2 pour rechercher les sites de restriction coupant l’ADN une fois. Enfin après
identification des sites de restriction, nous avons procédé à la digestion des produits PCR puis
révélé le résultat sur gel d’agarose à 1 % (figure 24).
MP 1 2 3 MP 1 2 3
Figure 24. Profil électrophorétique de digestion enzymatique sur gel d’agarose à 1 % des
produits PCR du gène fibE.
A- (MP : Marqueur de poids moléculaire 2-Log, puits 1 : produit PCR de G23 non digéré,
puits 2 : digestion de G23 par PstI, puits 3 : digestion de NM11 par PstI)
B- (MP : Marqueur de poids moléculaire 2-Log, puits 1 : produit PCR de VB15 non
digéré, puits 2 : digestion de VB15 par PstI, puits 3 : digestion de G17 par PstI)
III.1.6.2 PCR multiplex sur colonie des gènes impliqués dans les biofilms
Afin de démontrer les aspects moléculaires de la présence des gènes impliqués dans la
formation des biofilms, une PCR gradient multiplex sur colonie des gènes eps, tasA, ymcA et
yfiQ a été réalisée. Etant donné que lors de l’identification moléculaire ciblant le gène fibE les
isolats G23, VB15 et NM11 ont été identifiés comme B. pumilus ; G7 et G26 comme B.
subtilis ; et enfin G33 comme B. licheniformis ; par conséquent ces deniers ont servi à amplifier
les gènes eps et tasA répertoriés chez B. subtilis ; les gènes ymcA et yfiQ répertoriés chez B.
licheniformis ; et le gène ymcA chez B. pumilus. Ainsi tous les gènes ciblés ont été amplifiés et
obtenus aux tailles attendues comme présenté sur la figure 25.
≈1089pb (yfiQ)
≈1035 pb (eps)
1000pb
≈786 pb (tasA)
500pb
≈435pb (ymcA)
≈432 pb (ymcA)
Figure 25. Profil électrophorétique sur gel d’agarose à 2 % des produits PCR des
gènes eps, tasA, ymcA et yfiQ des isolats de Bacillus. (MP : Marqueur de poids
moléculaire 2-Log, puit 1 : G33, puit 2 : G7, puit 3 : VB15, puit 5 : Bacillus subtilis
(C+).
III.2 Discussion
Ce travail s’est intéressé à la capacité des bactéries du genre Bacillus à former des biofilms dans
les aliments fermentés.
Quatre (4) aliments fermentés (le vin de palme, le vin de gingembre, le vin de banane et les
feuilles fermentées de manioc) ont servis de niches écologiques pour l’isolement des bactéries
orientées vers le genre Bacillus. Un nombre total de 133 (cent trente-trois) isolats ont été
obtenus et rattachés au genre Bacillus, suite à une caractérisation basée sur la morphologie des
colonies, la forme des cellules, le test de Gram, la production des endospores, la mobilité des
cellules et la présence de la catalase. 13 % d’isolats étaient immobiles, s’agissant probablement
des souches appartenant aux espèces Bacillus anthracis et Bacillus mycoïdes. Ainsi, il a été
clairement démontré que les bactéries du genre Bacillus sont ubiquitaires (Zeigler & Perkins,
2008) et peuvent être isolées de différents aliments fermentés (Kim et al., 2009).
La composition de l’architecture des biofilms bactériens est en grande partie liée à la synthèse
de la matrice extracellulaire. Chez Bacillus sp., la matrice extracellulaire comprend
majoritairement deux composants : les polysaccharides (EPS : extracellular polymeric
substance) et les protéines (TasA, TapA et BslA) (Santosh Pandit & Tiina Nypelö 2020). Dans
ce travail, la mise en évidence de la formation du biofilm a été évaluée en premier temps par la
méthode de la gélose au Rouge Congo additionnée du saccharose (GRC), une méthode qui met
évidence les EPS. En effet, ici le saccharose est utilisé comme substrat spécifique qui est clivé
en glucose et fructose et polymérisé en glucane et fructane par la glucane sucrase et la fructane
sucrase (enzymes impliquées dans la biosynthèse des EPS). Par conséquent, à l’issue de ce test,
60 (soixante) isolats (dont 17 issus du vin de gingembre, 19 issus du vin de palme, 7 issus du
vin de banane et 17 issus du « Ntoba mbodi ») soit 45 % ont été positifs au test de production
de biofilm ; présentant ainsi des colonies noirâtres (forte ou modérée), aspect qui est dû à la
réaction entre le Rouge Congo avec des exopolysaccharides produits par les isolats testés. Les
résultats obtenus de cette étude corroborent ceux de MAHAMAT démontrant que 60 % des
bactéries d’origine alimentaire dont certaines bactéries du genre Bacillus étaient capables de
produire des biofilms sur la GRC (MAHAMAT et al., 2013). En outre, la différence de
phénotype observée à savoir la coloration noire forte ou modérée pourrait s’expliquer par le
niveau d’expression (élevé ou faible) des gènes impliqués dans la biosynthèse des
exopolysaccharides, en fonction du substrat utilisé ainsi que par le temps d’incubation ; car
nous avons remarqué qu’au-delà de 24 h le phénotype coloration noire forte ou modérée
s’améliorait. Ce qui justifierait les deux étapes de la formation des biofilms: une adhésion à la
surface suivie d’une production des exopolysaccharides (MAHAMAT et al., 2013).
Dans un second temps, une évaluation de la formation du biofilm par la méthode de tube à essai
utilisant du TSB additionné du glucose a été réalisée, pour tester l’aptitude d’adhésion de
quelques isolats sur des surfaces abiotiques (verre ou polystyrène) : soit 21 isolats positifs et 25
isolats négatifs sur la GRC ont été testés. Toutefois sur les 21 isolats testés qui ont été positifs
sur GRC, 81 % soit 17 isolats ont demeuré positif : dont 15 isolats (5 issus du vin de gingembre,
4 issu du vin de palme, 3 issus du vin de banane et 3 issus du « Ntoba mbodi ») présentant un
phénotype (++) et deux isolats issus du vin de palme présentant un phénotype (+) ; tandis que
19 % soit 4 isolats restant issus du vin de gingembre se sont révélés négatif. Par contre sur les
25 autres isolats négatifs sur GRC, 36 % soit 9 isolats (dont 3 issus du vin de gingembre, 1 issu
du vin de palme, 4 issus du vin de banane et 1 issu du « Ntoba mbodi ») ont été positifs avec un
phénotype (+) tandis que 64 % soit 16 isolats (dont 5 issus du vin de gingembre, 6 issus du vin
de palme, 2 issus du vin de banane et 3 issus du « Ntoba mbodi ») sont restés négatifs.
Parallèlement, les neuf (9) isolats qui se sont avérés positifs lors de la réalisation de la méthode
tube à essai avec TSB additionné du glucose, se sont à nouveau confirmés négatifs pour la
méthode tube à essai utilisant du TSB additionné au saccharose. Ces résultats pourraient
s’expliquer par le fait que la formation du biofilm ou la production d’exopolysaccharides, peut
être conditionnée par le type de substrat métabolisé, d’autant plus que lors de ce test le
saccharose a été substitué par le glucose. En effet à l’instar du saccharose qui peut être clivé en
glucose et fructose pour être respectivement polymérisé en glucane et fructane, le glucose est
automatiquement polymérisé en glucane conduisant ainsi à la production d’un seul type
d’exopolysaccharides ; ce qui pourrait expliquer le fait que certains isolats positifs au test sur
la GRC additionné du saccharose deviennent négatifs au test de tubes à essai utilisant du TSB
additionné du glucose tout simplement parce que ces isolats ont besoin du fructose contenu
dans le saccharose pour synthétiser leur exopolysaccharides. Cependant pour les isolats
devenus positifs pour la méthode de tubes à essai utilisant du TSB additionné du glucose qui
étaient négatifs sur la GRC et ce sont à nouveau confirmés négatifs pour la méthode de tubes
à essai utilisant du TSB additionné cette fois ci du saccharose, ces derniers ne possèderaient
peut-être pas de bagage enzymatique soit de saccharase (saccharase-isomaltase, invertase,
saccharose alpha-glucosidase) approprié pour métaboliser le saccharose qui est un diholoside,
comparé au glucose qui est plus facile à métaboliser. Ce qui pourrait expliquer pourquoi ces
isolats ne sont positifs que pour la méthode tube à essai utilisant du TSB additionné du glucose.
Par ailleurs, la négativité du test de production du biofilm dans tous les cas (méthodes GRC et
tube à essai), pourrait aussi respectivement s’expliquer soit par le fait que chaque espèce a une
température optimale à laquelle elle dégrade un type de macromolécule donnée (Kim et al.,
2009) ; soit par les interactions probablement faibles (Van Der Walls ou électrostatiques)
pouvant s’établir entre les exopolysaccharides produits et le support utilisé en l’occurrence
abiotique ; d’autant plus que l’interprétation pour la méthode des tubes à essai est basée sur la
fixation bactérienne ou non sur les parois des tubes après coloration au cristal violet. Ces
résultats indiquent que la capacité de formation des biofilms est dépendante des facteurs
environnementaux (Xu, Zou, Lee, & Ahn, 2010).
Réputés pour leur aptitude à produire les biosurfactants (Rani et al., 2020), les Bacillus
produisent des biosurfactants de nature lipopeptidique, comprenant entre autres la surfactine,
l’iturine, la fengycine, la lichenysine (Roy, 2017). Cependant, il a été reporté que la surfactine
est aussi une molécule de quorum sensing qui a un effet positif sur la formation des biofilms
notamment chez B. subtilis (Santosh Pandit & Tiina Nypelö 2020). Ainsi dans le but de
démontrer que les isolats capables de produire les biofilms étaient également capables de
produire le biosurfactant, un test d’émulsification a été réalisé. Etant donné que le biosurfactant,
une fois produit peut rester accolé sur la membrane des cellules bactériennes ou sécrétés dans
le milieu extracellulaire, deux méthodes ont permis de déterminer l’index d’émulsification
après 24 h (E24) d’abord à partir de la culture totale puis à partir du surnageant acellulaire après
centrifugation. Il en ressort de ce test, que sur les 60 (soixante) isolats (capables de former le
biofilm) testés, 39 (trente-neuf) isolats (dont 14 issus du vin de gingembre, 10 issus du vin de
palme, 5 issus du vin de banane et 10 issus du « Ntoba mbodi ») soit 65 % ont pu émulsifier
l’essence, avec un index d’émulsification (E24) compris entre 5 % et 100 % après 24 h
d’incubation à température ambiante. Ce phénomène d’émulsification a été également observé
chez les bactéries comme P. aeruginosa, B. subtilis et B. licheniformis qui ont été largement
utilisées dans la bioremédiation des sols pollués (Cooper & Goldenberg, 1987; Satpute,
Banpurkar, Dhakephalkar, Banat, & Chopade, 2010). Cependant sur les 39 isolats, 11 (onze)
isolats (dont 4 issus du vin de gingembre, 3 issus du vin de palme, 2 issus du vin de banane et
2 issus du « Ntoba mbodi ») ont obtenu un index d’émulsification (E24) ≥ 50 % avec la culture
totale, et 5 (cinq) autres isolats (dont 3 issus du vin de gingembre, 1 issu du vin de banane et 1
issu du « Ntoba mbodi ») ont obtenu un index d’émulsification (E24) ≥ 50 % avec le surnageant
acellulaire. En ce qui concerne les isolats qui n’ont pas pu émulsifier l’essence, on ne pourrait
confirmer leur incapacité à produire le biosurfactant, ni à former les biofilms d’autant plus que
la production des biosurfactants est liée à la densité bactérienne, donc au Quorum Sensing
(Santosh Pandit & Tiina Nypelö 2020) ; mais aussi le biosurfactant excrété par une autre
bactérie peut se fixer sur une autre non productrice et induire le processus de formation des
biofilms (Bose & Ghosh, 2016).
Les isolats présentant un index d’émulsification ≥ 50 % ont été sélectionnés pour l’extraction
du biosurfactant, par précipitation à l’acide chlorhydrique. Ce qui a permis de confirmer
que ces biosurfactants sont extractibles comme montré dans les travaux réalisés par Abd-Al-
Hussan sur Bacillus subtilis (Abd-Al-Hussan, Mejbel, & Jassim, 2016).
Par la suite nous avons montré que ces biosurfactants extraits sont capables d’inhiber la
croissance des bactéries pathogènes telles que E. coli, Staphylococcus aureus, et Salmonella
sp. ; car confrontés à de nombreuses manipulations lors de leur processus d’élaboration, les
aliments et boissons fermentés pourraient être le siège de nombreuses contaminations par des
bactéries potentiellement pathogènes, mais la présence des Bacillus spp. jouerait un rôle
important dans la conservation des produits fermentés locaux par le biais de leurs
biosurfactants, en raison de leurs propriétés antimicrobiennes. Ainsi Sur les seize (16)
biosurfactants extraits, neuf (9) (dont 2 issus de deux isolats du vin de gingembre, 2 issus de
deux isolats du vin de palme, 2 issus de deux isolats du vin de banane et 3 issus de trois isolats
du « Ntoba mbodi ») soit 56 % ont montré un pouvoir inhibiteur sur les différentes bactéries
pathogènes utilisés dans cette étude. En effet, six (6) extraits ont pu inhiber la croissance de
Staphylococcus aureus, cinq (5) extraits ont pu inhiber celle de E. coli, et de Salmonella. Ces
résultats confirment ceux de de Souza Freitas, montrant que les lipopeptides de B. subtilis
présentaient une activité antibactérienne et anti biofilm contre les bactéries opportunistes ou
agents pathogènes tels que : Alcaligenes faecalis ATCC 8750, Achromobacter xylosoxidans
ATCC13138, Pseudomonas alcaligenes ATCC 14909 et Pseudomonas putida ATCC 15175 ;
avec une inhibition partielle également observée contre Klebsiella aerogenes ATCC13048 (42
%), Escherichia coli ATCC 25922 (16 %) et Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 (47 %)
(de Souza Freitas et al., 2020). De même qu’il a été reporté par Rani, que Bacillus
methylotrophicus par le biais l’activité antibactérienne de son biosurfactant protège contre
Salmonella enterica et Xanthomonas campestris, qui sont respectivement des agents
pathogènes spécifiques à l’homme et aux plantes (Rani et al., 2020).
Il a été récemment démontré que le gène fibE peut être utilisé dans l’identification moléculaire
des Bacillus du groupe I (Kaya-Ongoto et al., 2019). Cette méthode est fiable, rapide et possède
un grand pouvoir discriminatoire. Raison pour laquelle, afin de confirmer l’identité des seize
(16) isolats (dont 7 issus du vin de gingembre,3 issus du vin de palme, 3 issus du vin de banane
et 3 issus du « Ntoba mbodi ») présentant à la fois de meilleurs profils quant à leur capacité à
produire les biofilms et à émulsifier les hydrocarbures avec un index d’émulsification ≥ 50 %,
une amplification du gène fibE a été réalisée. Sur les 16 isolats caractérisés, 43 % soit sept (7)
isolats ont pu être identifiés dont 12 % ont amplifié le gène fibEBs (ciblant B. subtilis), 18 %
ont amplifié le gène fibEBp (ciblant B. pumilus), 6 % ont amplifié le gène fibEBsa (ciblant B.
safensis) et enfin 6 % ont amplifié le gène fibEBl (ciblant B. licheniformis). Ce travail a donc
permis l’identification de B. pumilus (G23, VB15 et NM11), B. subtilis (G7 et G26), B.
safensis(G17) et B. licheniformis (G33), bactéries fréquemment isolées des aliments et boissons
fermentés en République du Congo. Nos résultats sont similaires à ceux obtenus par (Kaya-
Ongoto et al., 2019), (Mbozo et al., 2017) et (Kayath et al., 2020) témoignant de la présence de
ce type de bactéries.
Etant donné que l’identification moléculaire par amplification du gène fibE ne cible que les
bactéries du genre Bacillus appartenant au groupe phylogénétique I, d’autant plus que le genre
Bacillus renferme neuf (9) groupes phylogénétique, il a été parallèlement réalisé une
amplification de l’ARNr 16S qui est un biomarqueur ultra conservé chez toutes les bactéries.
La PCR de l’ARNr 16S a été réalisée sur tous les isolats retenus, cependant seuls les produits
PCR du gène de l’ARNr 16S des sept (7) souches ayant préalablement amplifié le gène fibE ont
été soumis à une digestion enzymatique, ceci, dans le but d’une confirmation partielle des
résultats prédits. En effet, chaque enzyme de restriction se définit par une séquence génomique
cible au niveau de laquelle elle clive l’ADN et les fragments obtenus renseignent dès lors sur
l’espèce bactérienne en présence. Les fragments générés par l’enzyme de restriction PstI
correspondent bien évidemment en nombre comme en taille aux prédictions faites grâce au
logiciel pDRAW 3.2. Ainsi sur les sept (7) isolats, quatre (4) isolats ont été digérés par l’enzyme
PstI dont G23, NM11 et VB15 considérés comme B. pumilus ainsi que G17 considéré comme
B. safensis. Toutefois, les produits PCR de l’ARNr 16S des 9 (neuf) autres isolats n’ayant pas
préalablement amplifié le gène fibE ont été conservés dans le but d’être ultérieurement
séquencés. Ces résultats confirment les prédictions émises ainsi que les résultats issus de
l’amplification du gène fibE.
Parmi les gènes impliqués dans le processus de formation de la matrice extracellulaire formant
le biofilm chez le genre Bacillus, figurent les gènes yfiQ, eps (impliqués dans la biosynthèse
des EPS), ymcA et tasA (codant pour des protéines particulières et formant des fibres
d’amyloïdes). Ainsi dans le but de corréler les résultats issus du test de formation de biofilm
sur la GRC à l’implication moléculaire, nous avons réalisé une amplification des gènes de
biofilms (eps, tasA, ymcA et yfiQ) par PCR multiplex sur colonie. Pour ce faire, une étude in
silico a été préalablement réalisée sur trois (3) espèces de Bacillus notamment : B. subtilis, B.
licheniformis, et B. pumilus ; ce qui nous a permis de générer des amorces spécifiques aux gènes
de biofilms ciblant chacune des trois espèces mentionnées. Toutefois, lors de la précédente
identification moléculaire ciblant le fibE certains isolats ont été identifiés comme appartenant à
chacune de ces trois espèces, par conséquent ces isolats ont servi à amplifier les gènes de
biofilms. A l’issue de ces amplifications, nous avons obtenu des bandes respectives aux tailles
attendues avec notamment l’amplification de B. pumilus (G23, VB15 et NM11) présentant une
seule bande autour de 435 pb ; B. subtilis (G7 et G26) présentant deux bandes autour de 1035
et 786 pb ; enfin B. licheniformis (G33) présentant également deux bandes une autour de 1089
pb et l’autre à 432 pb. Ces résultats confirment les prédictions émises mais aussi témoignent
une fois de plus la fiabilité de la technique d’identification par le gène fibE.
Conclusion et perspectives
Conclusion et Perspectives
Cette étude rentre dans le cadre de la valorisation des produits fermentés locaux, mais contribue
aussi à la compréhension moléculaire dans le processus de formation des biofilms des bactéries
du genre Bacillus. Nous avons identifié cinq (7) souches notamment G23, VB15, et NM11
comme étant B. pumilus ; G7 et G26 comme étant B. subtilis, G17 comme étant B. safensis et
enfin G33 comme étant B. licheniformis. Ces souches identifiées (B. pumilus, B. subtilis et B.
licheniformis) ont parallèlement démontré leur aptitude au niveau moléculaire à produire les
biofilms en utilisant l’amplification des gènes eps, tasA, ymcA et yfiQ.
Les objectifs fixés ont été atteints, ce qui permettrait de dire que dans les produits fermentés
locaux il y a bien présence des bactéries du genre Bacillus comme Bacillus subtilis, B. safensis,
B. pumilus et B. licheniformis capables donc de former les biofilms entre elles et/ou avec
d’autres microorganismes comme les levures et les bactéries lactiques dont elles partagent
ensemble les mêmes niches écologiques. Par rapport aux résultats obtenus de cette étude,
diverses perspectives ont été ouvertes. Dans le but d’approfondir ce travail, nous envisageons
de :
 cibler d’autres gènes impliqués dans la formation du biofilm à travers le genre Bacillus ;
 faire le screening d’autres microorganismes capables de former les biofilms dans les
aliments fermentés ;
 caractériser le type de biosurfactant produit par les bactéries du genre Bacillus ;
 étudier le niveau d’expression des gènes du biofilm via la technologie de RT-PCR.
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Annexes
Annexe I
Tableau XV: Composition des milieux de culture
Usage Milieu nutritif servant à la culture de tout type de bactérie.

- - Tryptone (pancreatic digest of casein): 10 g
Composition pour -1 - Extrait de levure : 5 g
Lysogeny Broth Litre - - NaCl : 5 g
- - pH= 7.0
(LB)
Usage Milieu nutritif servant à la culture de tout type de bactérie

- Peptone de caséine : 17 g
Composition pour 1 - Peptone de farine de soja : 3 g
litre de milieu - Nacl : 5 g
TSB - K2 HPO4 : 2,5 g
- D (+) glucose : 2,5 g
Milieu utilisé pour le dénombrement bactérien.

Usage
Plate Count Agar - - Tryptone : 5 g
(PCA) - - Extrait autolytique de levure : 2,5 g
Composition pour -1 - Glucose : 1 g
- - Agar-agar bactériologique : 12 g
litre de milieu
- - pH= 7.0 ± 0.2
Usage Milieu utilisé pour la détection des spores et des formes

végétatives de Bacillus cereus.
- - Peptone : 10 g
- - Extrait de viande : 1 g
Composition pour - - Mannitol : 10 g
Mossel 950 mL de milieu - - Chlorure de sodium : 10 g
- - Rouge phénol : 0,025 g
- - Agar : 14 g
- - pH= 7.2
Annexe II
Tableau XVI: Caractéristiques macroscopiques et microscopiques des isolats.

Isolats Macroscopie Microscopie Sporula Test
KOH Catalase tion Biofilm
Contour Elévation Consistance Forme Taille Couleur Aspect Mobilité
G1 Régulier Bombée Sèche Ronde Grosse Rosâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif ++
bâtonnets
G2 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Petite Beige Courts Mobile Négatif Positif Positif ++
bâtonnets
G3 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Jaunâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif ++
bâtonnets
G4 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Beige Courts Mobile Négatif Positif Positif +
bâtonnets
G5 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Jaunâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif +
bâtonnets
G7 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Jaunâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif ++
bâtonnets
G8 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Moyenne Rosâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif +
bâtonnets
G9 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Petite Rosâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif ++
bâtonnets
G10 Irrégulier Plate Sèche Ovale Grosse Blanchâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif Négatif
bâtonnets
G11 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Jaunâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif +
bâtonnets
G12 Irrégulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Rosâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif ++
bâtonnets
G15 Régulier Plate Pâteuse Ronde Moyenne Jaune Courts Mobile Négatif Positif Positif ++
bâtonnets
G17 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Petite Jaunâtre Bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
G18 Régulier Plate Crémeuse Ronde Grosse Blanchâtre Longs Mobile Négatif Positif Positif Négatif
bâtonnets
G19 Régulier Plate Gluante Ronde Grosse Jaunâtre Bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif ++
en
chaînette
G20 Régulier Plate Sèche Ronde Grosse Beige Bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
adhérente
G21 Régulier Bombée Sèche Ronde Moyenne Rosâtre Bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
G22 Irrégulier Plate Crémeuse Ronde Grosse Blanchâtre Bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
en
chaînette
G6 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Blanchâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif Négatif
bâtonnets
G13 Régulier Bombée Crémeuse Ronde Grosse Blanchâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif Négatif
bâtonnets
G14 Régulier Bombée Crémeuse Ronde Petite Beige Bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
G16 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Moyenne Blanchâtre Courts Immobile Négatif Positif Positif ++
bâtonnets
G23 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Blanchâtre Bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif ++
G24 Régulier Bombée Crémeuse Ronde Grosse Beige Courts Mobile Négatif Positif Positif Négatif
adhérente bâtonnets
G25 Régulier Bombée Gluante Ronde Grosse Jaunâtre Bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif ++
G26 Régulier Plate Sèche Ronde Grosse Blanche Courts Mobile Négatif Positif Positif Négatif
G27 Régulier Bombée Crémeuse Ronde Moyenne Rosâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif Négatif
bâtonnets
G28 Régulier Bombée Crémeuse Ronde Moyenne Jaunâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif Négatif
bâtonnets
G29 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Moyenne Rosâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif Négatif
bâtonnets
G30 Régulier Plate Sèche Ovale Grosse Blanchâtre Longs Immobile Négatif Positif Positif Négatif
G31 Régulier Bombée Crémeuse Ronde Moyenne Blanchâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif Négatif
bâtonnets
G32 Irrégulier Plate Sèche Envahissan Grosse Beige Courts Mobile Négatif Positif Positif ++
adhérente te bâtonnets
G33 Régulier Plate Gluante Ronde Grosse Blanchâtre Courts Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Longs
VP1 Régulier Plate Pâteuse Ronde Grosse Rosâtre bâtonnets Immobile Négatif Positif Positif Négatif
Bâtonnets
VP2 Régulier Plate Pâteuse Ronde Grosse Jaune isolés Mobile Négatif Positif Positif +
Courts
VP3 Régulier Bombée Crémeuse Ronde Grosse Jaunâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
Courts
VP4 Régulier Plate Crémeuse Ronde Grosse Jaune bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Bâtonnets
en
VP5 Régulier Bombée Sèche Ronde Grosse Blanchâtre chaînette Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Bâtonnets
en
VP6 Régulier Bombée Pâteuse Ovale Grosse Jaunâtre chaînette Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Bâtonnets
en
VP7 Irrégulier Bombée Crémeuse Ronde Grosse Blanchâtre chaînette Mobile Négatif Positif Positif +
VP8 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Jaune Bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VP9 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Petite Jaune bâtonnets Mobile Négatif Négatif Positif ++
VP10 Régulier Plate Crémeuse Ronde Grosse Blanchâtre Bâtonnets Immobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VP11 Régulier Plate Crémeuse Ronde Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
VP12 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Jaunâtre Bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
Bâtonnets
en
VP13 Régulier Plate Crémeuse Ronde Grosse Blanchâtre chaînette Immobile Négatif Positif Positif +
Envahissan Courts
VP14 Irrégulier Bombée Pâteuse te Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Envahissan Courts
Envahissan Longs
VP16 Irrégulier Plate Pâteuse te Grosse Jaunâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif ++
Envahissan Longs
VP17 Régulier Bombée Pâteuse te Grosse Jaunâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
Envahissan Courts
Envahissan Courts
Envahissan Courts
Envahissan Longs
VP21 Irrégulier Bombée Pâteuse te Grosse Jaunâtre bâtonnets Immobile Négatif Positif Positif ++
Envahissan Courts
VP22 Irrégulier Bombée Pâteuse te Grosse Pâteuse bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VP23 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Moyenne Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Envahissan Courts
Envahissan Courts
Envahissan Courts
Envahissan Courts
Envahissan
VP28 Irrégulier Bombée Pâteuse te Grosse Blanchâtre Bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Envahissan Courts
Envahissan Courts
Envahissan Courts
VP31 Irrégulier Plate Pâteuse te Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Envahissan Longs
en
chaînette
Envahissan Courts
Envahissan Courts
VP34 Irrégulier Bombée Pâteuse te Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
Envahissan Courts
VP35 Irrégulier Plate Pâteuse te Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif ++
Envahissan Longs
Envahissan Courts
VP37 Irrégulier Bombée Pâteuse te Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
Bâtonnets
Envahissan en
VP38 Irrégulier Plate Pâteuse te Grosse Jaunâtre chaînette Mobile Négatif Positif Positif ++
Courts
VP39 Régulier Bombée Crémeuse Ronde Petite Blanchâtre bâtonnets Immobile Négatif Positif Positif Négatif
Envahissan Courts
Envahissan Longs
Envahissan Longs
Longs
VP43 Irrégulier Plate Pâteuse Ronde Grosse Jaunâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif ++
Longs
bâtonnets
Envahissan en
VP44 Régulier Plate Sèche te Grosse Jaunâtre chaînette Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Bâtonnets
Envahissan en
VP45 Irrégulier Bombée Pâteuse te Grosse Blanchâtre chaînette Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VB1 Régulier Bombée Gluante Ovale Grosse Rosâtre bâtonnets Immobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VB2 Régulier Bombée Gluante Ovale Grosse Rosâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Crémeuse Courts
VB3 Régulier Bombée adhérente Ronde Moyenne Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VB4 Régulier Bombée Crémeuse Ronde Petite Jaunâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
Courts
VB5 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Moyenne Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Bâtonnets
Envahissan en
VB6 Irrégulier Bombée Pâteuse te Grosse Blanchâtre chaînette Immobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VB7 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif ++
Courts
VB8 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Moyenne Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VB9 Régulier Plate Gluante Ovale Grosse Beige bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VB10 Irrégulier Bombée Crémeuse Ronde Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VB11 Régulier Bombée Gluante Ovale Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif ++
VB12 Régulier Plate Gluante Ovale Grosse Beige Bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VB13 Irrégulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Bâtonnets
en
VB14 Irrégulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Blanchâtre chaînette Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VB15 Régulier Plate Gluante Ovale Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif ++
Sèche Courts
VB16 Irrégulier Plate adhérente Fusiforme Grosse Beige bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VB17 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VB18 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif ++
Courts
VB19 Irrégulier Plate Sèche Fusiforme Grosse Beige bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Bâtonnets
Envahissan en
VB20 Irrégulier Bombée Pâteuse te Grosse Blanchâtre chaînette Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VB21 Régulier Plate Gluante Ronde Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
VB22 Régulier Bombée Crémeuse Ronde Petite Jaunâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
Bâtonnets
en
VB23 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Blanchâtre chaînette Immobile Négatif Positif Positif +
NM1 Irrégulier Plate Gluante Ovale Grosse Blanchâtre Bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Longs
NM2 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Moyenne Rosâtre bâtonnets Immobile Négatif Positif Positif Négatif
Bâtonnets
Envahissan en
NM3 Irrégulier Bombée Pâteuse te Grosse Blanchâtre chaînette Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
NM4 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Beige bâtonnets Mobile Négatif Négatif Positif +
NM6 Irrégulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Jaunâtre Bâtonnets Immobile Négatif Positif Positif +
Bâtonnets
Envahissan en
NM7 Irrégulier Bombée Crémeuse te Grosse Blanchâtre chaînette Mobile Négatif Positif Positif +
Longs
bâtonnets
en
NM11 Irrégulier Bombée Crémeuse Ovale Grosse Rosâtre chaînette Immobile Négatif Positif Positif +
Envahissan Courts
NM12 Irrégulier Plate Gluante te Grosse Rosâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
Courts
NM13 Régulier Bombée Gluante Ovale Grosse Beige bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
NM14 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Moyenne Blanchâtre bâtonnets Immobile Négatif Positif Positif +
Courts
NM15 Régulier Plate Crémeuse Ronde Grosse Beige bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif ++
NM16 Régulier Bombée Gluante Ovale Grosse Beige Bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
NM17 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Moyenne Rosâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
Crémeuse Courts
NM18 Régulier Bombée adhérente Ronde Moyenne Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
NM19 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Moyenne Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
NM20 Irrégulier Bombée Pâteuse Ovale Grosse Beige bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
Courts
NM21 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Moyenne Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
Longs
NM22 Irrégulier Concave Sèche Ovale Grosse Beige bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Longs
NM23 Régulier Concave Pâteuse Ronde Grosse Jaunâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif ++
Bâtonnets
en
NM28 Irrégulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Beige chaînette Immobile Négatif Positif Positif +
Longs
NM29 Irrégulier Plate Pâteuse Ronde Grosse Rosâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
Courts
NM31 Irrégulier Bombée Crémeuse Ronde Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
NM34 Irrégulier Bombée Crémeuse Ronde Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
Courts
NM38 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Courts
NM39 Régulier Bombée Gluante Ronde Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
NM41 Irrégulier Plate Sèche Ronde Grosse Beige Bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Longs
NM43 Régulier Bombée Pâteuse Ronde Grosse Jaune bâtonnets Mobile Négatif Négatif Positif ++
Courts
NM45 Irrégulier Plate Pâteuse Ronde Grosse Blanchâtre bâtonnets Mobile Négatif Positif Positif +
Bâtonnets
en
NM51 Irrégulier Plate Pâteuse Ovale Grosse Blanchâtre chaînette Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Bâtonnets
en
NM53 Régulier Convexe Pâteuse Ronde Grosse Beige chaînette Immobile Négatif Positif Positif ++
Bâtonnets
en
NM56 Régulier Concave Sèche Ronde Grosse Beige chaînette Mobile Négatif Positif Positif Négatif
Bâtonnets
Arborescen en
NM58 Irrégulier Plate Sèche te Grosse Beige chaînette Immobile Négatif Positif Positif Négatif
Résumé
Dans le but de montrer l’implication moléculaire des bactéries du genre

Bacillus dans le processus de formation des biofilms, nous avons
procédé par un isolement, puis une caractérisation des bactéries par des
techniques de microbiologie classiques. Au total, 133 isolats ont été
obtenus. Sur la base des tests réalisés, 45 % de ces isolats ont montré la
capacité de former les biofilms sur GRC, ainsi que 65 % ont été aptes à
produire les biosurfactants, dont 16 ont été sélectionnés pour une identification en utilisant les
technologies de l’ADN. Afin de parvenir à l’identification moléculaire, une amplification par
PCR a été réalisée en utilisant le gène fibE, gène codant pour une enzyme fibrinolytique. Sur
les 16 isolats caractérisés, 43 % ont été identifiés dont 12 % ont amplifié le gène fibEBs (ciblant
B. subtilis), 18 % ont amplifié le gène fibEBp (ciblant B. pumilus), 6 % ont amplifié le gène
fibEBsa (ciblant B. safensis) et 6 % ont enfin amplifié le gène fibEBl (ciblant B. licheniformis).
En s’appuyant sur les études in silico réalisées sur B. pumilus, B. subtilis, B. licheniformis,
chacun des isolats identifiés et affiliés à ces trois espèces ont moléculairement démontré leur
aptitude à produire les biofilms en amplifiant spécifiquement par plusieurs PCR gradient
multiplex les gènes spécifiques impliqués dans la formation des biofilms.
Mots clés : Bacillus, implication moléculaire, biofilm
Abstract
In order to show molecular involvement of bacteria of the genus Bacillus in biofilm formation,
we proceeded by isolating and characterizing the bacteria by classical microbiology techniques.
A total of 133 isolates were obtained. Based on the tests performed, 45 % of these isolates
showed the ability to form biofilms on GRC, as well as 65 % were able to produce
biosurfactants, among 16 were selected for identification using DNA technologies. In order to
achieve molecular identification, PCR amplification was performed using the fibE gene, a gene
encoding fibrinolytic enzyme. Of the 16 isolates characterized, 43 % were identified of which
12 % amplified the fibEBs gene (targeting B. subtilis), 18 % amplified the fibEBp gene
(targeting B. pumilus), 6 % amplified the fibEBsa gene (targeting B. safensis) and finally 6 %
amplified the fibEBl gene (targeting B. licheniformis). Based on in silico studies performed on
B. pumilus, B. subtilis, B. licheniformis, each of the identified isolates affiliated to these three
species molecularly demonstrated their ability to produce biofilms by specifically amplifying
by several multiplex gradient PCR the specific genes involved in biofilm formation.
Keywords: Bacillus, molecular involvement, biofilm

Formation Des Biofilms Chez Les Bactéries Du Genre Bacillus Dans Les Aliments Fermentés

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I.2 Les aliments et boissons fermentés traditionnels en République du Congo

I.2.3 Autres aliments fermentés

I.2.4 Les boissons traditionnelles fermentées

I.2.2.3 Vin de Banane ou « Mbavou »

I.2.2.4 Autres boissons fermentées

I.3 Le genre Bacillus :

I.3.2 Phylogénie du genre Bacillus

Tableau I: Classification des bactéries du genre Bacillus

Groupes Quelques espèces

I B. amyloliquefasciens, B. aerophilus, B. altidinus, B. licheniformis, B. mojavensis,

II B. anthrancis, B. cereus, B. thuringiensis, B. finiuilus, B. megaterium

III B. infermus, B. simplex

VII B. arsenicus, B. barbaricus

VIII B. clarkii, B. cellulolyticus

I.3.3 Importance biotechnologique du genre Bacillus

I.4 Les biosurfactants bactériens :

Tableau II: Biosurfactants et origines bactériennes.

Surfactine Lipopeptide Bacillus subtilis

Lichenysine Lipopeptide Bacillus licheniformis

Fengycine Lipopeptide Bacillus subtilis

Iturine Lipopeptide Bacillus subtilis

plipastatin A1 Lipopeptide Bacillus subtilis

fusaricidine B Lipopeptide Paenibacillus polymyxa

didemnin B Lipopeptide Tistrella mobilis

Massetolides Lipopeptide Pseudomonas

Rhamnolipides Glycolipide Pseudomonas

I.4.4 Pouvoir antimicrobien du biosurfactant

I.5 Bacillus et biofilm :

I.5.2 Composition du biofilm

Cellules microbiennes 2-5 %

I.5.3 Etapes de formation du biofilm

I.5.4 Voies de signalisation et gènes impliqués dans la formation des biofilms

Figure 2. Voie de signalisation Spo0A menant à

 Signaux environnementaux : Polysaccharides de plantes

 Signaux cellulaires : Surfactine

En plus d’être une molécule antimicrobienne pouvant inhiber le processus de développement

Figure 3. Induction de la formation de matrice extracellulaire par la

Tableau IV: Nature, provenance et codification des échantillons

Echantillon Nom Provenance Codification Nature

E1 Ntoba mbodi Marché total (Bacongo) NM Solide

E2 Vin de Fabriqué au laboratoire G Liquide