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Licence  de  biochimie                    UE  Biochimie  Structurale  et  Fonctionnelle  1

ELIMINATION RAPIDE D’UN AGENT REDUCTEUR D’UNE

SOLUTION PROTEIQUE PAR FILTRATION-CENTRIFUGATION

BUT ET PRINCIPE DU TP
Vous disposez d’une solution protéique dans du Tris-HCl 10 mM, pH 7,4 contenant un agent réducteur (le
dithiothréitol, DTT) que vous désirez éliminer. La méthode utilisée sera une filtration sur gel de Sephadex mettant
ici à profit la capacité d’exclusion de ce type de gel. Elle sera effectuée suivant le protocole de Penefsky H. S.
(1979) qui permet d’échanger rapidement par centrifugation au travers d’un gel poreux le milieu dans lequel se
trouvent les macromolécules. Afin de déterminer le rendement de cette étape, les protéines seront dosées par la
méthode de Lowry avant et après le passage sur colonne. De plus, un dosage de l’agent réducteur dans
l’échantillon de départ et dans le filtrat permettra de vérifier son élimination.

DEROULEMENT DU TP
1. Etape de filtration : remplissage de la colonne avec le gel, première centrifugation pour éliminer l’excès de
tampon d’équilibration, deuxième centrifugation après dépôt de l’échantillon. Mesure du volume de filtrat recueilli.
2. Dosage des protéines par la méthode de Lowry : préparation des réactifs et de la solution étalon de sérum
albumine bovine (BSA). Précipitation des protéines au TCA puis dosage proprement dit.
3. Dosage spectrophotométrique de la concentration exacte de la BSA.
4. Dosage spectrophotométrique du DTT par le DTNB [acide 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoique)].

PRINCIPES ET PROTOCOLES
1. Etape de filtration sur gel
Généralités
La filtration sur gel (ou tamisage moléculaire) permet de séparer les molécules en fonction de leur taille et
de leur forme. La phase stationnaire est constituée de billes d'un matériel hydraté poreux. Si une solution aqueuse
traverse une colonne contenant ces tamis moléculaires, les molécules qui sont trop larges pour entrer dans les
pores du gel sont exclues du volume de solvant à l'intérieur des billes. Elles traversent la colonne plus rapidement
que les molécules plus petites qui pénètrent dans les pores et peuvent ainsi être séparées. La masse moléculaire
de la plus petite molécule incapable d'entrer dans les pores d'un gel donné constitue la limite d'exclusion du gel.
Un certain nombre de gels sont commercialisés qui diffèrent par la nature du polymère et par son degré de
réticulation. Vous utiliserez ici du Sephadex G-50 qui est un polymère de dextrane permettant de fractionner des
molécules de masses moléculaires comprises entre 1 et 30 kDa. En deçà d’1 kDa, les molécules sont dans le
volume total du gel alors qu’au-delà de 30 kDa, elles sont exclues des pores.
La méthode de centrifugation-élution de Penefsky est une chromatographie d'exclusion effectuée au cours d’une
centrifugation. Elle permet de dessaler des solutions de macromolécules, de les placer dans un autre tampon ou
encore d'éliminer un réactif chimique et ce, sans les dénaturer. Par rapport à une filtration sur gel classique, elle a
l'avantage de diluer relativement peu les macromolécules d’intérêt et d'être très rapide.

Mode opératoire
Du Sephadex G-50 préalablement gonflé dans un large excès du tampon désiré (ici, du Tris-HCl 10 mM,
pH 7,4) est placé dans une seringue de tuberculine de 1 ml au fond de laquelle un petit disque de polypropylène
poreux est mis pour retenir le gel. La seringue est introduite dans un tube en plastique de telle manière que le bout
de la seringue ne touche pas le fond du tube. L'ensemble est placé dans un rotor à godets oscillants et centrifugé 2
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minutes à 500 g (position 10%) afin d'éliminer l'excès de tampon. Après avoir placé la colonne dans un autre
tube, 120 µl de votre solution inconnue sont déposés à la surface du gel. Une centrifugation de 2 minutes à 500 g
permet de récupérer le filtrat. Mesurez son volume avec une pipette automatique.

2. Dosage des protéines par la méthode de Lowry

Généralités
La gamme de sensibilité de cette méthode est de 10 à 100 µg de protéines. La coloration qui apparaît en
présence de protéines est due à la réduction du réactif de Folin-Ciocalteu par le complexe protéine-cuivre. Ce sont
essentiellement les groupements aromatiques de la tyrosine et du tryptophane qui sont impliqués dans la réaction.
Le dosage est donc dépendant de la présence de ces acides aminés dans les protéines. De nombreuses
substances non protéiques peuvent interférer dans le dosage. La méthode initiale a donc été modifiée : les
protéines sont précipitées par l’acide trichloroacétique (TCA), le culot étant ensuite repris dans de la soude 0,2 M.

Préparation des produits

Le TCA 72%, la soude 5 M, le CuSO4 1%, le tartrate de potassium 2%, le réactif de Folin-Ciocalteu pur, le
Na2CO3 et la BSA (tous deux en poudre), vous sont fournis.
Vous devez préparer les produits suivants : solution standard de BSA 1 mg/ml dans de l'eau distillée, NaOH 0,2 M,
Na2CO3 2% (poids/volume) dans de la soude 0,1 M et du réactif de Folin-Ciocalteu dilué de moitié dans de l’eau
distillée (à conserver à l’abri de la lumière).
Préparez les quantités qui vous sont nécessaires et suffisantes pour effectuer le dosage.

Mode opératoire du dosage

Toutes les opérations sont à effectuer à température ambiante.
Préparez 12 tubes Eppendorf que vous traiterez en même temps : 1 servant de blanc réactif, 7 constituant une
gamme étalon allant de 10 à 70 µg de protéine (effectuée avec la solution standard de BSA, en considérant dans
un premier temps qu’elle est à une concentration de 1 mg/ml), 2 contenant chacun 30 µl de la solution inconnue et
2 contenant chacun 30 µl de filtrat.
Amenez tous vos prélèvements à un volume final de 500 µl avec de l'eau distillée. Après avoir ajouté dans tous les
tubes 50 µl de TCA 72 %, centrifugez 5 minutes à 10 000 g. Les surnageants sont éliminés à la trompe à vide et
les culots dissous dans 20 µl de NaOH 0,2 M en agitant énergiquement au Vortex.
On ajoute alors 1 ml du mélange suivant, préparé extemporanément :
- 25 ml de Na2CO3 2 % dans NaOH 0,1 M
- 250 µl de tartrate de potassium 2 %
- 250 µl de CuSO4 1 %
Après 10 minutes d'incubation à température ambiante, introduire 100 µl du réactif de Folin-Ciocalteu dilué en
agitant immédiatement après l’ajout. Laissez la coloration se développer 30 minutes (au minimum) à l’obscurité
avant de lire l'absorbance à 750 nm.

3. Dosage spectrophotométrique de la concentration exacte de la BSA.

Comme toutes les protéines, la BSA absorbe à 280 nm. Vous déterminerez la concentration exacte de la solution
standard de BSA que vous avez préparée connaissant son coefficient d'extinction pondéral à 280 nm : εBSA = 6,6
-1 -1
% .cm , où 1% signifie 1 g dans 100 ml. Calculez la DO lue théorique que vous auriez si votre BSA (sans dilution)
était effectivement 1 mg/ml. Choisissez en conséquence les volumes de BSA à utiliser pour préparer 4 dilutions de
votre standard (dans de l’eau) avec un volume final de 3 ml. Lisez l’absorbance à 280 nm.
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4. Dosage du DTT par le DTNB
Généralités
Le DTT (dithiothréitol) est un agent réducteur couramment utilisé notamment pour rompre les ponts
disulfures (-S-S-) et pour maintenir les groupements sulfhydryls (-SH) des protéines à l'état réduit. Sa structure est
la suivante :

Pour le doser, on fait réagir le DTT avec un excès de DTNB [acide 5,5'-dithio-bis (2-nitrobenzoique)] de structure :

Le produit de la réaction, le thionitrobenzoate, absorbe à 412 nm avec un coefficient d'absorption moléculaire de

3 -1 -1
13,6.10 litre.mole .cm .

Mode opératoire
Commencez par doser le DTT dans votre solution inconnue de départ. Placez dans une cuve :
- Tris-HCl 10 mM, pH 7,4 .......q.s.p. 3 ml
- DTNB 10 mM ........................300 µl.
Faites le zéro du spectrophotomètre à 412 nm sur ce mélange puis opérez à 5 ajouts successifs de 5 µl de la
solution protéique inconnue en relevant l'absorbance (après stabilisation) à chaque fois. Videz la cuve et
renouvelez l'opération une deuxième fois avec la solution inconnue puis une fois avec le filtrat.
Un témoin est nécessaire pour vérifier qu’aucun artéfact ne fausse votre dosage du DTT dans la solution inconnue.
En quoi cette expérience témoin peut elle consister?

REMARQUES GENERALES
- Préparez les protocoles de dosage et vos tableaux avant de venir en TP.
- Réfléchissez à l’avance à la manière dont vous allez traiter vos résultats expérimentaux.
- Ne vous trompez pas de cuves: vous avez une cuve en quartz de 3 ml pour lire les absorbances dans l’UV (cuves
fragiles et onéreuses) et des cuves en plastique de 1 ml et de 3 ml pour les lectures dans le visible.

PRESENTATION DES RESULTATS

- Dans la partie « Principes », présentez uniquement celui de la chromatographie d’exclusion-diffusion classique
puis celui du protocole de Penefsky.
- Pas de partie « Protocole ».
- Dans la partie « Résultats », n’oubliez pas de spécifier la lettre correspondant à votre solution inconnue et le
volume de filtrat que vous avez recueilli. Donnez un détail de calcul par calcul différent.
- Commencez par tracer la courbe A280 nm = f(volume de la prise d'essai de BSA) et déduisez en sa concentration
réelle. Légitimez le choix des volumes choisis. Utilisez cette valeur réelle pour tracer la gamme étalon du dosage
de Lowry.
- Pour le dosage du DTT écrivez l'équation de la réaction entre le DTT et le DTNB (formules semi-développées).
Tracez les courbes Absorbance = f(volume de prise d'essai).
- Calculez les concentrations protéiques et les concentrations en DTT dans la solution de départ et dans le filtrat.
Déduisez en les rendements de filtration.
- Dans la partie « Conclusions-discussion », rappelez vos rendements et commentez les. Indiquez quelles sont à
votre avis les conditions clés qui permettent une bonne efficacité́ de la méthode de Penefsky.
- En « Annexe » précisez les pesées et les volumes lors de la préparation des produits du dosage de Lowry.
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