CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE

(HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)

1) INTRODUCTION

La chromatographie en phase liquide est caractérisée par le fait que la phase

mobile est un liquide et la phase stationnaire est immobilisée dans une colonne.
C'est la plus ancienne des techniques chromatographiques. L’approche classique
fut basée sur l'utilisation de colonne de diamètre relativement large et de vitesse de
passage de phase mobile très lente. Les séparations étaient très longues et les
fractions devaient être recueillies pour être analysées séparément; ce qui augmentait
considérablement le temps de l'analyse et rendait donc cette technique peu
attrayante.
Ce n'est qu'après l'apparition et le développement de la CPG et de l'acquis tant
théorique qu'instrumental de cette dernière que la HPLC s'est développée. Cette
technique peu rivaliser avec la CPG car elle permet de réaliser des séparations aussi
fines et aussi rapides. Tous les types de chromatographie (adsorption, partage,
échange d'ions, etc..) sont adaptables à la HPLC à condition que le soluté soit
soluble dans la phase mobile.

2) APPAREILLAGE

Un HPLC se présente comme un appareil compact répondant au

schéma de n'importe quel système chromatographique.

-1-
2.1) Un réservoir de solvant (éluant) qui contient la phase mobile en quantité
suffisante. Plusieurs flacons d'éluants (solvants de polarités différentes) sont
disponibles pour pouvoir réaliser des gradients d'élution (mélange de plusieurs
solvants à des concentrations variables) à l'aide de la pompe doseuse.

2.2) La pompe : elle doit permettre d'introduire la phase mobile dans la colonne sous
une pression pouvant atteindre 300 bars. De telles pressions sont nécessaires
compte tenu du remplissage des colonnes et de la viscosité plus grande des liquides
par rapport à celle des gaz. Elle est muni d'un système de gradient permettant
d'effectuer une programmation de la nature du solvant. Les pompes actuelles ont un
débit variable de quelques ml à plusieurs ml/min. Elles permettent de travailler:

- en mode isocratique, c'est-à-dire avec 100% d'un même éluant tout au long de
l'analyse.

- en mode gradient, c'est-à-dire avec une variation de la concentration des

constituants du mélange d'éluants

2.3) Vanne d'injection : c'est un injecteur à boucles d'échantillonnage. Il existe des

boucles de différents volumes, nous utiliserons une boucle de 20μl. Le choix du
volume de la boucle se fait en fonction de la taille de la colonne et de la
concentration supposée des produits à analyser. Le système de la boucle d'injection
permet d'avoir un volume injecté constant, ce qui est important pour l'analyse
quantitative.

-2-
2.4) La colonne

Une colonne est un tube construit dans un matériau le plus possible inerte aux
produits chimiques, souvent en acier inox ou en verre. Sa section est constante, de
diamètre compris entre 4 et 20 mm pour des longueurs généralement de 15 à 30 cm.
Au delà, les importantes pertes de charges exigeraient des pressions de liquide
beaucoup trop élevés. Le contrôle de la température n'est pas nécessaire à moins de
travailler à des températures élevées ou quand le détecteur est un réfractomètre;
dans ce cas la colonne est placée dans une enceinte thermostatée. Quand elles ne
sont pas utilisées elles doivent être lavées au méthanol avant d'être scellées aux
deux extrémités. Leur durée de vie et d'environ 6 mois mais peut être prolongée en
utilisant une pré colonne placéeentre l'injecteur et la colonne analytique.

2.5) La phase stationnaire

2.5.1 La phase normale:

La phase normale est constituée de gel de silice. Ce matériau est très polaire. Il faut
donc utiliser un éluant apolaire. Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits
polaires sont retenus dans la colonne, contrairement aux produits apolaires qui
sortent en tête. L'inconvénient d'une telle phase, c'est une détérioration rapide au
cours du temps du gel de silice, ce qui entraîne un manque de reproductibilité des
séparations.

2.5.2 La phase inverse :

La phase inverse est majoritairement composée de silice greffées par des chaînes
linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C 8 et C18). Cette phase est apolaire et
nécessite donc un éluant polaire (ACN, MeOH, H 20). Dans ce cas, ce sont les
composés polaires qui seront élués en premier. Contrairement à une phase normale,
il n'y a pas d'évolution de la phase stationnaire au cours du temps, et la qualité de la
séparation est donc maintenue constante.

2.6 - La phase mobile :

L'interaction plus ou moins forte entre la phase mobile et la phase stationnaire

normale ou à polarité inversée se répercute sur les temps de rétention des solutés.
La polarité de la phase stationnaire permet de distinguer deux situations de principe :

si la phase stationnaire est polaire, on utilisera une phase mobile peu polaire la
chromatographie est dite en phase normale ; si la phase stationnaire est très peu
polaire, on choisira une phase mobile polaire ( le plus souvent des mélanges de
méthanol ou d'acétonitrile avec de l'eau), c'est la chromatographie en phase inverse.
En modifiant la polarité de la phase mobile, on agit sur les facteurs de rétention k des
composés.

-3-
Les silices greffées conduisent en général à une perte importante de polarité. Avec
une phase greffée, l'ordre d'élution est opposé à celui auquel on est habitué avec les
phase normales. Ainsi avec un éluant polaire, un composé polaire migre plus vite
qu'un composé apolaire. Dans ces conditions les hydrocarbures sont fortement
retenus. On réalise des gradients d'élution en diminuant au cours de la séparation la
polarité de l'éluant (ex : mélange eau /acétonitrile dont la concentration en
acétonitrile va en croissant au cours de l'élution).

On peut, en mélangeant plusieurs solvants, ajuster le pouvoir d'élution de la phase

mobile.

6) Détecteurs

Plusieurs types de détecteurs sont utilisées en HPLC. Ils doivent tous répondre aux
caractéristiques suivantes:

- réponse rapide et reproductible, gamme linéaire de concentration aussi large

que possible, haute sensibilité‚ et stabilité d'opération.

-4-
 Les deux moyens de détection les plus universellement utilisés sont ceux qui
sont basés sur l'absorption de lumière UV/visible et ceux qui mesurent les
différences d'indice de réfraction. D'autres détecteurs tels que le détecteur à
fluorescence et ampérométrique présentent l'avantage d'être plus sélectifs et
plus sensibles.

réfractomètre : il est appelé détecteur universel il mesure les changements d'indice

de réfraction de l'éluant provenant de la présence de solutés. Ce type de détecteur
ne peut être employé ni avec un solvant dont l'indice de réfraction est proche de celui
des solutés ni avec un gradient d’élution ( il n'est donc possible de travailler qu'en
mode isocratique avec ce détecteur). La gamme de concentration est de l'ordre de 1
à 10 ppm. L'inconvénient est sa sensibilité aux variations de température.

détecteur spectrophotométrique (UV/visible) : Non seulement il n'est pas sensible

aux fluctuations de température et peut donc être utilisé avec un gradient d’élution
mais il a une meilleure sensibilité (limite de détection 0,01 ppm). Il est peut coûteux
et représente près de 80% des moyens de détection en HPLC. L'inconvénient est
qu'il ne peut être utilisé avec des solvants absorbants dans UV ou le visible. La
lampe à Deuterium est utilisée pour des longueurs d'ondes variant de 190-350 nm et
la lampe à vapeur de mercure est utilisé à la longueur d'onde non variable de 254
nm.

détecteur à fluorescence c’est le plus sélectif car moins de composés fluorescent.

détecteur ampérométrique Il est utilisé pour déterminer des composés électroactifs

à une électrode. Sa sensibilité est aussi bonne que celle du détecteur à fluorescence
mais doit être utilisé avec une phase mobile conductrice d'électricité.

CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE

1) Principe
La chromatographie est une technique permettant de séparer et d’identifier les espèces
chimiques constituant un corps. On dépose une goutte de la substance à analyser sur un
support appelé phase fixe (souvent une plaque recouverte de silice) dont le bas trempe dans
un liquide appelé "éluant" (par exemple un mélange cyclohexane-éther ) qui migre le long de
la phase fixe par capillarité. Les constituants de la substance analysée sont entraînés par
l’éluant et migrent à des vitesses différentes selon leur nature.

2) Mise en oeuvre

On appelle cuve à élution le récipient qui contient une hauteur d’environ 5mm
d’éluant. Fermer hermétiquement la cuve ainsi elle sera saturée en vapeurs
d’éluant. La phase fixe se prépare à l’aide d’une plaque d’aluminium recouverte de
silice. On utilise des plaques d’environ 5 cm sur 7cm.(Attention : ne pas y poser les
doigts sinon on l’abîme).
 -5-

On trace au crayon à papier un trait horizontal à environ 1 cm du bas de la plaque.

C’est «la ligne de base ». qui indique où les échantillons sont déposés et qui
permet d’identifier les dépôts à l'aide d'une lettre ou d'un numéro. A l’aide de tubes
capillaires, on dépose une microgoutte des échantillons à analyser sur la ligne de
base. Les dépôts sont séparés d’environ 1 cm l’un de l’autre et ensuite on laisse
sécher.

2.1 Elution (= "migration")

On place la plaque verticalement dans la cuve à élution de manière à ce que l'éluant

n'atteigne pas les dépôts d'échantillon sur la ligne de base. Et ensuite on attend
l'élution . On retire la plaque de la cuve lorsque l'éluant arrive à environ 2 cm du
haut de la plaque. Et on trace au crayon à papier le front du solvant et le tout est
laissé sécher.

2.2 Révélation

Parfois les différents constituants ne sont pas colorés. Il faut donc faire apparaître ou
révéler les tâches qui leur correspondent. Pour cela on peut utiliser 2 techniques :
-soit on expose la plaque aux UV
-soit on utilise un produit chimique qui fait apparaître les taches (permanganate de
potassium, vapeurs de diiode…)
Il faut ensuite repérer la position des taches au crayon à papier sur la plaque.

3) Rapport frontal

Soit H la distance entre la ligne de base et le front du solvant. Soit h la distance entre
la ligne de base et la tâche. On définit le rapport frontal comme suit :
Rf= h/H
Les hauteurs h et H sont exprimées dans la même unité. R f n'a pas d'unité.
Le rapport frontal rend compte de la manière dont a migré l'espèce considérée. Pour
une espèce donnée le rapport frontal dépend de la nature de l'éluant et de la nature
de la phase fixe.

4) Interprétation d'un chromatogramme

Si le chromatogramme issu d'un dépôt contient n taches, c'est que le dépôts

contenait n espèces chimiques différentes. Si les chromatogrammes issus de deux
dépôts présentent chacun une tache à la même position c'est qu'ils contiennent la
même substance. Ainsi la chromatographie permet de déterminer le nombre
d'espèces composant un échantillon et d'identifier des espèces contenues dans
l'échantillon en comparant les rapports frontaux avec ou avec d'autres échantillons
analysés.
-6-