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Agence Fédérale pour la Sécurité de la Chaîne Alimentaire

DIRECTION GENERALE DES LABORATOIRES


TECHNIQUES D’ANALYSE EN LABORATOIRE

Formation Certifiée
Niveau B/C
Version 2 du 28/03/2014
Editeur responsable : Geert De Poorter
AVANT-PROPOS

En 2010, dans le cadre des formations certifiées, l’Administration des Laboratoires avait organisé des
formations techniques pour les niveaux A, B et C et édité un syllabus comme document de base. Les
thèmes abordés concernaient les principaux paramètres analysés et les méthodes les plus
importantes utilisées dans nos propres laboratoires. Mais les aspects qualité, environnement et
sécurité étaient également évoqués. Enfin le syllabus faisait également référence à la loi
d’application.

Ce syllabus a été réactualisé en 2013 dans le but de redonner des formations, pour maintenir le
niveau élevé des connaissances techniques du personnel des laboratoires de l’Agence.

ir. Geert De Poorter


Directeur-general
Direction des Laboratoires AFSCA
Table des matières

1 INTRODUCTION ........................................................................................................................................ 1

1.1 LES RISQUES SANITAIRES ÉVOLUENT.................................................................................................................. 1


1.2 LE RISQUE MICROBIOLOGIQUE ........................................................................................................................ 1
1.2.1 Les micro-organismes et les aliments les plus souvent incriminés .................................................. 2
1.3 LE RISQUE CHIMIQUE .................................................................................................................................... 4
1.3.1 Les contaminants ............................................................................................................................ 4
1.3.2 Les résidus ....................................................................................................................................... 4

2 TECHNIQUES BIOLOGIQUES ...................................................................................................................... 6

2.1 MICROBIOLOGIE .......................................................................................................................................... 6


2.1.1 Contexte .......................................................................................................................................... 6
2.1.2 Analyses microbiologiques .............................................................................................................. 8
2.1.3 Aperçu des principales analyses microbiologiques ....................................................................... 23
2.1.4 Méthode TEMPO ........................................................................................................................... 52
2.1.5 Recherche des Escherichia coli shigatoxines positives (STEC) ....................................................... 55
2.2 PHYTOPATHOLOGIE ............................................................................................................................... 58
2.2.1 Les organismes phytopathogènes ................................................................................................. 58
2.2.2 Les méthodes d’analyse en phytopathologie ................................................................................ 65
2.2.3 Exemples d’application dans le contexte AFSCA............................................................................ 71
2.3 PCR ET OGM ........................................................................................................................................... 73
2.3.1 Fondements de la biologie ............................................................................................................ 73
2.3.2 PCR : Polymerase Chain Reaction.................................................................................................. 88
2.3.3 PCR et OGM ................................................................................................................................ 114

3 MATRICES – PARAMETRES .................................................................................................................... 122

3.1 INTRODUCTION........................................................................................................................................ 122


3.2 COMPOSANT : STRUCTURE, EFFET ET TOXICITÉ, TECHNIQUES D’ANALYSE............................................................... 123
3.2.1 Stilbenes et dérivés ..................................................................................................................... 123
3.2.2 Agents antithyroïdiens ................................................................................................................ 124
3.2.3 Stéroïdes: substances à effet androgène, oestrogène ou gestagène .......................................... 128
3.2.4 Zéranol et dérivés........................................................................................................................ 133
3.2.5 ß-agonistes.................................................................................................................................. 134
3.2.6 Les composés Annexe IV.............................................................................................................. 139
3.3 ANTIBIOTIQUES ....................................................................................................................................... 143
3.3.1 Introduction ................................................................................................................................ 143
3.3.2 Sulfamides et Triméthoprime ..................................................................................................... 143
3.3.3 ß-lactamines ............................................................................................................................... 144
3.3.4 Fluoroquinolones ........................................................................................................................ 147
3.3.5 Macrolides .................................................................................................................................. 147
3.3.6 Florfénicol et Substances apparentées ........................................................................................ 148
3.3.7 Tétracyclines................................................................................................................................ 149
3.3.8 Lincosamides ............................................................................................................................... 149
3.3.9 Aminoglycosides ......................................................................................................................... 150
3.3.10 Polypeptides ................................................................................................................................ 151
3.3.11 Glycopeptides.............................................................................................................................. 151
3.3.12 Nitrofurans et Nitro-imidazoles .................................................................................................. 152
3.3.13 Origine des résidus antibiotiques dans la chaîne alimentaire ..................................................... 152
3.3.14 Les effets nocifs des résidus d'antibiotiques ............................................................................... 153
3.3.15 L'évaluation des risques et la fixation de LMR ............................................................................ 153
3.3.16 Détection des substances à effet bactériostatique dans les produits d'origine animale............. 154
3.4 ACRYLAMIDE ........................................................................................................................................... 156
3.4.1 Structure et/ou les groupes principaux ....................................................................................... 156
3.4.2 Techniques d’analyse................................................................................................................... 157
3.4.3 Toxicité pour l'être humain et/ou l’animal .................................................................................. 157
3.5 DIOXINES ............................................................................................................................................. 158
3.5.1 Introduction ................................................................................................................................ 158
3.5.2 Structure et/ou groupe principaux .............................................................................................. 159
3.5.3 Téchniques d’analyse................................................................................................................... 160
3.5.4 Toxicité pour l’homme et / ou l’animal ........................................................................................ 161
3.6 MÉTAUX LOURDS ET ARSENIC...................................................................................................................... 163
3.6.1 Groupes principaux ..................................................................................................................... 163
3.6.2 Techniques d’analyse................................................................................................................... 163
3.6.3 Toxicité pour l’homme et/ou l’animal.......................................................................................... 163
3.7 COCCIDIOSTATICA..................................................................................................................................... 173
3.7.1 Généralités .................................................................................................................................. 173
3.7.2 Structure et/ou groupes principaux ............................................................................................ 174
3.7.3 Les différents techniques d’analyse ............................................................................................. 177
3.7.4 Toxicité pour l’homme et/ou l’animal.......................................................................................... 178
3.8 MYCOTOXINES......................................................................................................................................... 182
3.8.1 Nature et origine ......................................................................................................................... 182
3.8.2 Les risques associés aux mycotoxines ......................................................................................... 182
3.8.3 Mycotoxicose .............................................................................................................................. 183
3.8.4 Conditions de production des mycotoxines ................................................................................. 184
3.8.5 Ochratoxine A (OA) ..................................................................................................................... 186
3.8.6 Deoxynivalenol (DON) ................................................................................................................. 188
3.8.7 Fumonisines ................................................................................................................................ 190
3.8.8 Trichothécènes ............................................................................................................................ 192
3.8.9 Zéaralénone ................................................................................................................................ 194
3.8.10 Aflatoxines .................................................................................................................................. 196
3.8.11 Ergot de seigle............................................................................................................................. 198
3.8.12 La patuline .................................................................................................................................. 200
3.9 LES ALLERGÈNES ...................................................................................................................................... 202
3.9.1 Les allergènes alimentaires ......................................................................................................... 202
3.9.2 L’histamine .................................................................................................................................. 205
3.10 MATÉRIAUX AU CONTACT DES DENRÉES ALIMENTAIRES ..................................................................................... 207
3.10.1 Introduction ................................................................................................................................ 207
3.10.2 Migrations spécifiques ................................................................................................................ 208
3.11 VITAMINES ............................................................................................................................................. 216
3.11.1 Introduction ................................................................................................................................ 216
3.11.2 Vitamines, carence et excès ........................................................................................................ 217
3.11.3 Types de vitamines ...................................................................................................................... 218
3.11.4 Techniques d’analyse des vitamines ............................................................................................ 242

4 TECHNIQUES D’ANALYSE ....................................................................................................................... 247

4.1 CHROMATOGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE ........................................................................................................ 247


4.1.1 Aspects généraux ........................................................................................................................ 247
4.1.2 Classification selon la nature des phases .................................................................................... 247
4.1.3 Classification selon le phénomène chromatographique ............................................................. 247
4.1.4 Classification selon le procédé utilisé .......................................................................................... 248
4.1.5 Classification selon les phénomènes intervenants dans la séparation ....................................... 248
4.1.6 Phases stationnaires en HPLC ..................................................................................................... 248
4.1.7 Choix de la méthode HPLC ......................................................................................................... 262
4.1.8 Aspects instrumentaux ................................................................................................................ 266
4.1.9 Application pratique ................................................................................................................... 276
4.2 CHROMATOGRAPHIE IONIQUE..................................................................................................................... 279
4.2.1 Principe ....................................................................................................................................... 279
4.2.2 Applications ................................................................................................................................ 279
4.2.3 Choix de l'éluant.......................................................................................................................... 279
4.2.4 Préparation de l'échantillon ........................................................................................................ 280
4.2.5 Colonnes...................................................................................................................................... 280
4.2.6 Détection..................................................................................................................................... 281
4.2.7 Le suppresseur d’ions de l’électrolyte.......................................................................................... 281
4.3 LA CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE ................................................................................................... 282
4.3.1 Généralités .................................................................................................................................. 282
4.3.2 Dérivatisation.............................................................................................................................. 283
4.3.3 Injection de l’échantillon ............................................................................................................. 283
4.3.4 La séparation .............................................................................................................................. 289
4.3.5 Les détecteurs ............................................................................................................................. 290
4.4 SPECTROMÉTRIE DE MASSE ........................................................................................................................ 295
4.4.1 Généralités .................................................................................................................................. 295
4.4.2 Principe ....................................................................................................................................... 295
4.4.3 Introduction de l’échantillon ....................................................................................................... 296
4.5 ICP / OES .............................................................................................................................................. 298
4.5.1 Principe de l’ICP-OES ................................................................................................................... 298
4.5.2 Emission ...................................................................................................................................... 298
4.5.3 L’origine du plasma ..................................................................................................................... 300
4.5.4 Le processus de transformation de l’échantillon en particules rayonnantes .............................. 301
4.5.5 Générateur RF et puissance ........................................................................................................ 302
4.5.6 Plasmas axial et radial ................................................................................................................ 303
4.5.7 Détection..................................................................................................................................... 304
4.6 DOSAGE DES MÉTAUX LOURDS ET AUTRES ÉLÉMENTS PAR AMA, SAAFG, SAA GH, ICP-OES ET ICP-MS ................ 305
4.6.1 Quels éléments dans quelles matrices ........................................................................................ 305
4.6.2 Préparation des échantillons ...................................................................................................... 305
4.6.3 Détection du mercure avec l’AMA ............................................................................................... 306
4.6.4 Détection des métaux par SAA four graphite .............................................................................. 307
4.6.5 Détection des métaux par ICP-MS............................................................................................... 308
4.6.6 Detection d'éléments par la technique de SAA Génération d’Hydrure ....................................... 309
4.6.7 Detection des éléments par ICPOES ............................................................................................ 309
4.7 IMMUNO-ASSAYS ..................................................................................................................................... 310
4.7.1 Introduction ................................................................................................................................ 310
4.7.2 Principe général .......................................................................................................................... 310
4.7.3 RIA ............................................................................................................................................... 310
4.7.4 ELISA ........................................................................................................................................... 311
4.8 MICROSCOPIE ......................................................................................................................................... 315
4.8.1 Généralités .................................................................................................................................. 315
4.8.2 Microscopie optique.................................................................................................................... 315
4.8.3 Le microscope ............................................................................................................................. 316
4.8.4 Méthodes de contraste ............................................................................................................... 320
4.8.5 Application pratique ................................................................................................................... 322
4.9 L’IONISATION DES ALIMENTS ....................................................................................................................... 333
4.9.1 Définition et objectifs .................................................................................................................. 333
4.9.2 Réglementation européenne....................................................................................................... 333
4.9.3 Réglementation nationale........................................................................................................... 334
4.9.4 Les contrôles de l’AFSCA .............................................................................................................. 335
4.9.5 Technique de détection ............................................................................................................... 335
4.9.6 La thermoluminescence (MET-LFSAL-033) .................................................................................. 335

5 QUALITÉ ............................................................................................................................................... 339

5.1 SYSTÈME DE GESTION DE LA QUALITÉ............................................................................................................ 339


5.1.1 ISO 9001 / ISO 17025 .................................................................................................................. 340
5.1.2 Accréditation ............................................................................................................................... 342
5.1.3 Contrôle de la qualité .................................................................................................................. 343
5.1.4 Validation des méthodes............................................................................................................. 352
5.1.5 Incertitude de mesure pour les analyses chimiques quantitatives .............................................. 359
5.1.6 Le scope d’accréditation : méthodologie DG Labo ...................................................................... 362
5.1.7 Etalonnage .................................................................................................................................. 366
5.2 EMAS / OHSAS ..................................................................................................................................... 381
5.2.1 Système de management de la sécurité au travail ..................................................................... 381
5.2.2 Système de management de l’environnement – ISO 14001 ........................................................ 384
5.2.3 Système de management environemental – EMAS.................................................................... 386
5.2.4 Certification ................................................................................................................................ 388
5.2.5 Système de management intégré ............................................................................................... 389
5.3 FOODLIMS ........................................................................................................................................... 392
5.3.1 Introduction ................................................................................................................................ 392
5.3.2 Foodlims (Unilab) ........................................................................................................................ 392
5.3.3 Intégration avec d'autres applications........................................................................................ 395
5.3.4 Des modules complémentaires adaptés ..................................................................................... 396
5.3.5 Software d’aide ........................................................................................................................... 397
1 INTRODUCTION

Les risques sanitaires en rapport avec la sécurité alimentaire peuvent appartenir à deux grandes
catégories : les risques microbiologiques, liés à des bactéries, des virus, des moisissures, des
parasites… et les risques liés à des substances chimiques, qui comprennent les produits chimiques
de l’environnement, les résidus de médicaments ou de pesticides, les métaux lourds ou tout autre
résidu qui se retrouve, de façon non voulue, dans la chaîne alimentaire au cours de la récolte, de
l’élevage, ou des opérations de transformation qui suivent.

1.1 Les risques sanitaires évoluent

Autrefois, les maladies infectieuses faisaient beaucoup plus de ravages, les conditions d’hygiène
étaient nettement moins bonnes, et de nombreux risques tout à fait «naturels» n’étaient ni connus, ni
maîtrisés. Aujourd’hui, de nombreuses maladies qui touchaient l’Homme via les animaux d’élevage
ont pratiquement disparues.

D’un autre côté, certains risques nouveaux sont apparus. C’est par exemple le cas de l’utilisation de
pesticides dans l’agriculture ou, d’une manière beaucoup plus large, de la pollution de
l’environnement et de ses retombées dans la chaîne alimentaire. Il s’agit, en dehors de certains
accidents, de risques généralement moins aigus (il n’y a pas de conséquences immédiates) que ceux
liés à l’hygiène (une intoxication alimentaire se manifeste généralement brutalement), mais plus
insidieux (ils deviennent évidents à plus long terme, comme c’est le cas du cancer). Les cancers ne
sont toutefois pas l’exclusivité des temps modernes, et l’on sait que certaines matières entièrement
naturelles qui existent depuis bien longtemps peuvent provoquer un cancer.

Les scientifiques s’accordent à reconnaître que le niveau de sécurité alimentaire est globalement plus
élevé de nos jours qu’autrefois.

1.2 Le risque microbiologique

Les micro-organismes représentent la principale cause d’intoxication alimentaire. Tous ne sont


cependant pas dangereux : certains sont parfaitement inoffensifs, d’autres sont même très utiles.
C’est le cas de ceux utilisés, par exemple, dans la fabrication du yaourt, de la choucroute, du pain, de
la bière, des fromages, des saucissons, etc. C’est aussi le cas d’une grande partie de bactéries
appartenant à la flore intestinale, qui se comptent par milliards en chacun de nous et contribuent
notamment au transit intestinal, à la protection contre des bactéries nuisibles et à nos défenses
naturelles.

Mais, à l’inverse, certains micro-organismes peuvent nous rendre malades, d’où le nom de
microorganismes pathogènes. Cela peut résulter d’un effet toxique direct du micro-organisme ingéré,
ou encore d’une substance (toxine) produite par un micro-organisme et qui se retrouve dans ce que
nous mangeons (alors que le micro-organisme n’est plus forcément présent).

Il existe plus de 250 types d’infections alimentaires, qui peuvent être causées par des dizaines
d’agents pathogènes. Actuellement, dans notre pays, les deux types de bactéries le plus souvent
incriminés sont les Salmonelles et les Campylobacter. Les Salmonelles sont très largement
répandues dans la nature et touchent de façon plus particulière la volaille et les oiseaux. L’ingestion

1
de denrées contaminées peut provoquer une intoxication appelée salmonellose. Les aliments les plus
souvent incriminés sont les oeufs crus ou insuffisamment cuits, ainsi que les préparations à base
d’œufs crus (comme le tiramisu), ainsi que la viande hachée.

De nombreuses préparations font appel à des aliments crus, qui peuvent présenter une menace, car
ils permettent la multiplication des bactéries.
C’est, par exemple, le cas des préparations à base d’œufs crus, comme le tiramisu, la mousse au
chocolat ou la purée «maison». Pour cette raison, on les considère comme des aliments «à risque».
La cuisson des aliments détruit les bactéries, ce qui permet de diminuer les risques alimentaires du
point de vue hygiénique.

À part certains aliments tels que les conserves, qui ont fait l’objet d’une stérilisation, presque tous les
aliments sont porteurs de micro-organismes. Les aliments peuvent être contaminés par des bactéries
pathogènes lors de la production, mais aussi à la maison, par manque d’hygiène (par exemple, les
mains ne sont pas lavées après un passage aux toilettes). Les mauvaises pratiques d’hygiène à la
maison sont considérées comme la première cause d’intoxication alimentaire. Ceci s’explique surtout
par un manque de connaissance de ce type de risque.

La contamination peut aussi être «croisée» : par exemple, il est fréquent de retrouver des salmonelles
sur la coquille des œufs. Cela ne posera pas de problème si l’œuf est consommé «à la coque», donc
ébouillanté (les salmonelles sur la coquille sont alors détruites par la chaleur). Par contre, si après
avoir touché des œufs crus, on prend un fruit sans se laver les mains, on peut retrouver des bactéries
de l’œuf sur le fruit. Et si les œufs ne sont pas conservés dans leur emballage ou dans le
compartiment prévu à cet effet dans le réfrigérateur, ils sont susceptibles de contaminer d’autres
aliments avec lesquels ils entrent, à un moment ou à un autre, en contact (contamination croisée).

1.2.1 Les micro-organismes et les aliments les plus souvent incriminés

1.2.1.1 Bactéries

o Bacillus cereus : riz cuit réchauffé, viandes cuites, puddings à base de féculents, légumes
et poissons. Une mauvaise manipulation après la cuisson est une cause fréquente de
contamination à B. cereus.

o Clostridium perfringens : les aliments réchauffés, incluant les restes de buffets, la viande
et la volaille, les légumineuses, les sauces, les ragoûts et les soupes.
o Clostridium botulinum : boîtes de conserve artisanales (légumes, poisson, viande et
volaille).
o Escherichia coli (E.coli) : salades et légumes crus, viande insuffisamment cuite, lait non
pasteurisé, fromage.
o Campylobacter jejuni : lait cru, volaille.
o Listeria monocytogenes : lait non pasteurisé et laitages tels les fromages à pâte molle,
viande crue, volaille, fruits de mer, légumes, pâté, viande et poisson fumé, salade de
chou cru.
o Salmonella enteritidis : volaille insuffisamment cuite, viande, coquillages, salades, oeufs
et produits laitiers.

2
o Staphylococcus aureus : jambon, volaille, oeufs, crème glacée, fromages, salades, crème
anglaise et pâtisseries à base de crème, sauce. Une mauvaise manipulation après la
cuisson et une mauvaise hygiène sont des causes fréquentes de contamination.
o Vibrio parahaemolyticus et autres Vibrio marins : poisson cru et insuffisamment cuit,
coquillages.

1.2.1.2 Parasites

o Trichinella spiralis : viande de porc insuffisamment cuite.

o Toxoplasma gondii : viande insuffisamment cuite, volaille et lait cru.

1.2.1.3 Virus

o Hépatite A : coquillages, fruits et légumes crus sont les causes fréquentes d’hépatite A.
Celle-ci peut également se transmettre en cas de mauvaise manipulation de l’aliment.

3
1.3 Le risque chimique

1.3.1 Les contaminants

Par contaminant, on entend toutes les matières indésirables présentes de façon non désirées dans
les aliments (à la différence des additifs, dont l’ajout est volontaire). Les contaminants peuvent s’y
retrouver au cours des différents stades de la production, du conditionnement, du transport ou du
stockage, ou encore résulter d’une contamination de l’environnement.

Les contaminants constituent donc une grande famille extrêmement variée. Ils peuvent avoir une
origine parfaitement «naturelle», comme les mycotoxines. Ils peuvent être produits par l’Homme
(PCB et acrylamide) ou avoir une origine naturelle et humaine (dioxines). C’est bien entendu sur
l’activité humaine que l’on peut agir pour réduire la contamination des aliments. Notons cependant
que l’activité humaine, englobe tant les productions industrielles à grande échelle, que celles de
petites structures traditionnelles, ou tout simplement des pratiques familiales (par exemple la cuisson
au barbecue).

Les métaux lourds (le plomb, le cadmium et le mercure) et l’arsenic sont en grande partie des
polluants liés à l’activité industrielle. Le mercure contamine surtout les poissons. Mercure et plomb
sont toxiques pour le système nerveux. Des limites maximales dans les aliments ont été fixées afin de
limiter les risques pour la santé. Voir également 2.2.10. Métaux lourds et arsenic.

Les mycotoxines: il s’agit de toxines produites par certains champignons ou levures qui se
développent sur des aliments (aliments pour animaux et/ou pour l’Homme). Elles peuvent être
produites au cours de la croissance de la plante, mais aussi, plus tard, lors du stockage. Elles
peuvent se retrouver dans des aliments d’origine animale (viande, lait, œuf…) via la contamination de
l’alimentation des animaux. Les mycotoxines font l’objet d’une surveillance régulière.

1.3.2 Les résidus

La présence de certaines substances dans l’alimentation résulte d’une utilisation volontaire. C’est le
cas des résidus de pesticides, et des médicaments pour animaux dans les aliments d’origine animale.
Les pesticides (produits phytosanitaires) sont utilisés pour combattre les ennemis des plantes. Ils
doivent faire l’objet d’une évaluation toxicologique avant d’être autorisés, afin de montrer qu’ils n’ont
pas d’effets néfastes décelables sur la santé de l’Homme. Des résidus de pesticides se retrouvent
dans les aliments et des contrôles réguliers sont nécessaires pour s’assurer qu’ils respectent les
normes.

Les médicaments vétérinaires sont notamment les antibiotiques, utilisés pour prévenir ou traiter une
maladie chez l’animal. Ils ont été aussi utilisés pour accélérer la croissance des animaux, mais
l’Union Européenne a interdit cette utilisation depuis 2006. Des résidus de médicaments peuvent être
décelés dans des viandes, du lait…, sans que cela présente un risque direct pour la santé humaine.
Toutefois, chez l’animal comme chez l’homme, l’utilisation d’antibiotiques peut favoriser l’apparition de
bactéries résistantes (qui ont développé une résistance face à l’antibiotique administré), conduisant
ainsi à l’apparition de maladies de plus en plus difficiles à traiter (pour lesquelles il faut trouver
d’autres antibiotiques, conduisant à une sorte d’escalade).

4
Dans toute l’Europe les hormones données au bétail pour accélérer sa croissance ou augmenter la
production de lait chez la vache sont interdites depuis 1988, ce qui fait l’objet d’une controverse avec
les Etats-Unis, où certaines hormones sont autorisées à ces fin.

Pour autant que les prescriptions légales soient respectées, notamment la nature des produits
utilisés, les doses et les délais d’attente, les résidus de pesticides et de médicaments vétérinaires ne
posent pas de problème grave pour l’homme. Toutefois, on ne peut pas exclure l’existence de
certains effets néfastes à long terme.

5
2 TECHNIQUES BIOLOGIQUES

2.1 Microbiologie

2.1.1 Contexte

2.1.1.1 Les microorganismes : des êtres vivants !

Les micro-organismes se trouvent à peu près partout : dans


l'eau, dans les aliments, dans le sol, etc. De ce fait, tout produit
n'ayant pas subi un traitement particulier est par nature
contaminé par des bactéries, des levures, des moisissures, des
virus, etc.

Une différence importante avec les autres contaminations est


que les micro-organismes sont des êtres vivants : si les
conditions sont favorables, ils peuvent se développer et se
multiplier, alors qu'en des circonstances défavorables, leur
croissance s'arrête ou ils meurent. Ceci signifie que le degré de
contamination d'un aliment au moment de sa consommation est
non seulement déterminé par la contamination initiale, mais
aussi par les traitements qu'il a subis et les conditions dans
lesquelles il a été conservé jusqu'au moment de la consommation.

Quant à savoir si une contamination microbiologique initiale va augmenter ou diminuer, cela dépend
notamment des conditions environnementales suivantes:

O la disponibilité de l'eau (l'activité en eau) : sans eau, pas de développement.

O la température : tout organisme a une fourchette de températures donnée à l'intérieur de


laquelle le développement et la multiplication se déroulent de façon optimale; en dehors de
cet intervalle, soit le développement est arrêté (basse température), soit l'organisme meurt
(cuisson, congélation).
O les substances nutritives présentes (protéines, sucres, graisses, vitamines, minéraux, …).
Pour son développement, l'organisme prélève des substances dans son environnement et les
transforme en composés cellulaires ou les utilise comme source d'énergie. En l'absence de
ces substances nutritives, son développement est inhibé.
O la présence ou l'absence de substances nécessaires ou inhibitrices tels l'oxygène (nécessaire
pour les aérobies, nuisible pour les anaérobies) ou les antibiotiques (fortement inhibiteurs ou
mortel pour certains organismes).
O certains facteurs d'environnement, comme le pH, peuvent avoir un effet inhibiteur sur certains
organismes.

Quelles sont les valeurs optimales de ces facteurs ? Cela varie d'un organisme à l'autre; ainsi les
bactéries lactiques peuvent tolérer un pH assez bas, alors que chez les autres bactéries, le
développement est généralement fortement inhibé. Il est clair que les conditions de conservation d'un
produit sont extrêmement importantes si l'on veut éviter une augmentation fâcheuse de la
contamination au moment de la consommation.

6
Ces caractéristiques sont également importantes pour la réalisation des analyses microbiologiques :
la nature 'vivante' des organismes implique que les conditions de conservation d'un produit après
l'échantillonnage sont extrêmement importantes : si on ne prend pas les précautions adéquates
pendant tout le processus du prélèvement jusqu'au résultat de l'analyse, les dénombrements obtenus
peuvent très fortement différer des quantités réelles de microorganismes présents au moment du
prélèvement de l'échantillon.

Un facteur supplémentaire qui est souvent négligé est le fait que les micro-organismes ne sont pas
répartis uniformément dans un produit. Dans un produit, la multiplication des micro-organismes va
surtout avoir lieu là où ils rencontrent les conditions optimales de développement (température, eau,
substances nutritives,…). Un exemple : le beurre qui se compose surtout de graisse dans laquelle
sont réparties de petites gouttelettes d'eau. C'est seulement dans ces gouttelettes d'eau que les
micro-organismes se développent et peuvent se multiplier, et non dans la phase grasse. Cet aspect
est surtout important pour les denrées alimentaires très hétérogènes, d’où conséquence de ce
phénomène : certaines parties peuvent être fortement contaminées et d'autres peu.

2.1.1.2 Signification de la contamination par des micro-organismes

Dans la contamination des denrées alimentaires, nous pouvons considérer trois aspects :
o la santé publique, et ce qui nous intéresse surtout, ce sont les pathogènes, organismes qui
peuvent provoquer des maladies (Salmonella, Listeria,...) ou qui peuvent produire des toxines
(mycotoxines, entérotoxines,...),

o les conditions de production : certains organismes ne sont pas en soi des pathogènes
mais servent plutôt d'indice des conditions d'hygiène dans lesquelles le produit a été fabriqué.
Ainsi, la présence de E. coli dans des produits animaux constitue un indicateur de
contamination fécale, ce qui, si on retrouve cet organisme en grands nombres, augmente la
probabilité qu'il y ait également présence de pathogènes.
o la qualité du produit : il s'agit d'organismes qui provoquent des changements indésirables
dans le produit (dégradation), ce qui réduit sa conservation. Dans cette optique, c'est surtout
la flore totale qui est importante. Il faut toutefois tenir compte du fait que dans certains
processus technologiques, on ajoute sciemment des micro-organismes (levures, bactéries
lactiques, …) afin de donner au produit des propriétés caractéristiques (beurre, fromage,
yaourt, salami, …), et en pareils cas, la 'flore totale' ne donne aucun renseignement sur la
qualité du produit.

2.1.1.3 Procédés visant à prolonger la conservation

A l'échelle industrielle, différents procédés sont appliqués pour augmenter la conservation d'un produit
ou pour inhiber ou tuer les pathogènes présents. Ces procédés sont:

o dans la transformation de certains produits crus (beurre, fromage au lait cru,


saucisson…), une maturation qui a pour but d'une part de conférer au produit un goût ou
une texture caractéristique, et d'autre part, de modifier les conditions dans le produit de
telle manière qu'elles deviennent défavorables à la multiplication d'organismes
indésirables (il s'agit le plus souvent d'une acidification). Comme on n'applique pas de

7
procédé de destruction des organismes, il peut toujours y avoir présence de pathogènes
pathogèn
dans le produit.
o chauffage.. En fonction de la température et de la durée du traitement, ce dernier a pour
but soit de tuer les pathogènes éventuels (pasteurisation du lait) soit de stériliser
commercialement le produit pour prolonger sa durabilité (traitement
(traitement uht pour les boissons,
stérilisation en verre ou boîte à conserve).

o eau. En ajoutant du sel (saumurage) ou du sucre (confiserie),


diminution de l'activité en eau.
on diminue la disponibilité de l'eau dans les denrées alimentaires, ce qui a un effet
inhibiteur
iteur sur le développement des pathogènes.

o d'acidité. Comme la plupart des bactéries ne se plaisent guère à un


contrôle du degré d'acidité.
ph faible, les produits acides sont moins sensibles à la dégradation. On peut augmenter
l'acidité en ajoutant de l'acide (acide acétique, …) ou par fermentation (acide lactique,
acide propionique).

o l'atmosphère Le remplacement de l'oxygène dans l'atmosphère d'un


contrôle de l'atmosphère.
emballage par un autre gaz (azote, CO2) permet de freiner le développement de la flore
de dégradation, et de prolonger la conservation du produit.

2.1.2 Analyses microbiologiques

2.1.2.1 Principes

En raison des dimensions généralement très faibles des micro-organismes


micro organismes et de leur répartition
irrégulière dans
ns une denrée alimentaire, il n'est généralement pas facile de détecter ces cellules
directement, de les dénombrer et de les identifier. C'est pourquoi on a le plus souvent recours à 2
techniques pour établir leur présence de façon indirecte : la multiplication
multiplication et l'inhibition.

2.1.2.1.1 Multiplication

Lorsqu'un micro-organisme
organisme se trouve dans des conditions optimales pour son développement et sa
multiplication (température, pH, substances nutritives, …), le temps nécessaire au dédoublement
d'une seule cellule peutt être très court, de 20 – 30 minutes à quelques heures. Ainsi, si une cellule a
un temps de dédoublement de 1h, elle donne naissance après 24h à 16 millions de cellules. De ce
fait, une seule cellule, invisible à l'œil nu, peut donner naissance après quelques
quel heures de
développement illimité, à des dizaines de millions de descendants. Dans un fluide, ceci se manifeste
par un aspect trouble, sur une surface solide, cela entraîne
l'apparition d'un petit amas de cellules visible à l'oeil nu : une
colonie. Faire
re se développer une cellule en une colonie visible est
l'un des principes de base des analyses microbiologiques
classiques.

A cet égard, il convient de bien faire remarquer que l'hypothèse


selon laquelle chaque colonie visible provient d'une seule cellule
cellu
ne représente pas la réalité. Souvent il est impossible de séparer
entièrement les cellules l'une de l'autre pendant l'analyse, si bien
qu'une colonie peut se former à partir d'un petit groupe de cellules,

8
et non pas d'une seule cellule (par ex. staphylocoques, qui se trouvent par nature en petits groupes).
De là vient l’expression
d' ’unité formant colonie' (ufc, cfu – colony forming unit) et non pas de 'cellule formant colonie'.

2.1.2.1.2 Inhibition sélective

Dans un échantillon, il y a généralement de nombreuses espèces différentes de micro-organismes,


dont un nombre limité seulement est important, comme un pathogène spécifique ou un groupe
d'organismes indicateurs. Pour sélectionner l'organisme ou le groupe recherché, on doit, d'une part,
appliquer les conditions de développement auxquelles les organismes recherchés peuvent se
multiplier, et d'autre part, freiner (inhiber) le développement d'autres organismes qui pourraient gêner
l'analyse, de telle sorte qu'après un certain temps, l'organisme recherché prenne le dessus sur tous
les autres (survival of the fittest).

L'inhibition d'organismes qui pourraient perturber l'analyse peut se faire par le contrôle de
l'atmosphère (aérobies – anaérobies), du pH, de la température de développement, des substances
nutritives présentes ou de la présence de composés inhibiteurs tels que les antibiotiques. Ces
paramètres doivent évidemment être contrôlés de telle manière que la croissance de l’organisme
recherché en soit le moins possible perturbée.

2.1.2.2 Dénombrement et détection

Dans une analyse microbiologique, on peut poser deux questions :

o combien de cellules d'un organisme donné sont présentes dans une quantité donnée
d'échantillon ? C'est important lorsqu'une limite maximum a été fixée à la présence d'un
organisme ou d’un groupe donné dans un produit (ex. : moins de 100 par gramme).

o pour y donner une réponse, on doit effectuer un dénombrement du nombre d'organismes


recherchés. Avec cette technique, on commence par disperser les cellules pour les
séparer, après quoi on laisse ces cellules se développer en colonies et on compte le
nombre de colonies caractéristiques. Donc d'abord disperser, ensuite multiplier.
o une variante est la méthode du nombre le plus probable (NPP) (MPN, Most probable
Number), dans laquelle on ne compte pas des colonies mais on observe le
développement ou l’absence de développement sur plusieurs sous-échantillons.
o un organisme donné est-il présent dans une quantité donnée d'échantillon ? C'est
important pour les pathogènes, pour lesquels a été fixée une norme disant que
l'organisme doit être absent dans une quantité donnée de l'échantillon (par ex. absent
dans 25 g de produit).

o dans ce cas, on procède à une détection de l'organisme dans la quantité en question de


l'échantillon. Comme le nombre de cellules présentes n'est pas important (peu importe s'il
y en a 1 ou 100 dans la quantité donnée du produit), on procède d'abord à un
enrichissement, et ensuite à une confirmation pour voir si l'organisme est bien présent.
Donc d'abord multiplier et ensuite confirmer.

9
2.1.2.3 Techniques microbiologiques standards

Dans l'analyse microbiologique, on applique une série de techniques standards; une méthode
d'analyse microbiologique (classique) est une combinaison dans un ordre bien déterminé de ces
techniques, axé sur l'organisme ou le groupe d'organismes à analyser. On trouve ci-après un aperçu
de ces techniques.

2.1.2.3.1 Enrichissement

But : multiplier un petit nombre d'organismes présents dans un échantillon pour obtenir un grand
nombre d’organismes afin de pouvoir déterminer facilement leur présence.

Principe : mettre une prise d’essai de l'échantillon (homogénéisé) dans un milieu nutritif liquide et le
conserver un certain temps dans les conditions optimales de développement. En cas
d'enrichissement simple, tous les organismes se développant dans ces conditions vont se multiplier !
On appelle donc cela un enrichissement non sélectif.

2.1.2.3.2 Pré-enrichissement

But : donner la possibilité aux organismes stressés (p.e. après un choc de température) de récupérer
afin qu’ils puissent tolérer les conditions de stress aux étapes suivantes (surtout la présence des
substances inhibitrices).

Principe : mettre une prise d’essai de l'échantillon (homogénéisé) dans un milieu nutritif liquide et le
conserver un certain temps (souvent < 24 h) dans les conditions optimales de développement. Le
milieu est non-sélectif ou faiblement sélectif, ceci (avec le court temps d’incubation) pour éviter la
croissance d’autres organismes.

2.1.2.3.3 Enrichissement sélectif

But : multiplier un petit nombre d'organismes présents dans un échantillon pour obtenir un grand
nombre d’organismes afin de pouvoir déterminer facilement leur présence, mais de telle manière que
cette multiplication ne concerne que l'organisme ou le groupe recherché.

Principe : réalisation d'un enrichissement, mais dans un milieu nutritif liquide qui contient des
substances inhibitrices qui entravent le développement des autres organismes (p.ex. sels biliaires
dans le cas de coliformes). De ce fait, ce sont surtout les organismes recherchés qui vont se
multiplier, et/ou des organismes qui leur sont apparentés.

2.1.2.3.4 Dilution

But : diluer de grandes quantités de cellules de telle sorte que leur nombre se retrouve dans une
gamme où un dénombrement fiable devienne possible. C'est donc en fait l'inverse d'un
enrichissement.

10
Principe : on démarre avec une certaine quantité d'échantillon (1 g, 25 g, …). Cette quantité est
mélangée avec une quantité de diluant stérile qui n'endommage pas les micro-organismes,
micro après
quoi l'ensemble est homogénéisé. Ensuite, on fait à partir de cet homogénat une gamme de dilutions
décimales (1 ml d'homogénat + 9 ml de diluant frais, mélanger, prélever 1 ml du mélange + 9 ml de
diluant frais, etc.), de telle sorte que chaque dilution ne contienne qu'un dixième du nombre de
cellules de la dilution précédente.

Figure 2.1.1 : principe de dilutions décimales

Si l'on dilue suffisamment, on obtient finalement 1 ou 2 dilutions contenant un nombre d'organismes


donnant lors de la suite de l'analyse (étalement et dénombrement) un résultat dénombrable.

2.1.2.3.5 Etalement

But : étaler les cellules individuelles contenues dans une quantité d'échantillon sur un milieu nutritif
solide, de telle sorte que ne puisse se développer à partir de chaque cellule qu'une colonie
particulière distincte des autres colonies. Les colonies particulières peuvent soit être dénombrées,
soit servir de matériel de départ pour la suite de l'analyse.

Principe : une quantité de milieu de dilution (p.ex. 0,1 ml) est étalée sur un milieu nutritif solide,
généralement dans une boîte de Petri. Ce milieu mili se compose de gélose – un polysaccharide qui ne
se dégrade pas et sert donc de matrice solide – qui contient des substances nutritives et
éventuellement des indicateurs (par ex. indicateur du changement de pH). Pendant le
développement, toutes les cellules ules issues d'une seule cellule restent au contact de cette première
cellule; lorsque la dilution utilisée est assez grande, les cellules individuelles sont dispersées de façon
suffisamment éloignées les unes des autres pour que se forment des colonies isolées iso distinctes.
Le développement peut entraîner des changements dans le milieu nutritif (acidification, formation
d'un dépôt, dégradation de certains composants, …) qui peuvent se manifester par des changements
de couleur etc. autour de la colonie (changement
(changement du pH par la formation d'acides comme produits de
dégradation lors du développement, le dépôt de FeS noir lors de la dégradation d'acides aminés
sulfureux en H2S en présence de sels de fer, apparition d'une zone claire lors de la dégradation par
exemple
ple de lécithine, etc.). De ce fait apparaissent des colonies ayant un aspect caractéristique
(couleur, aspect, brillance, zone…), que l'on peut distinguer des colonies provenant d'autres
organismes que l'organisme recherché.

11
2.1.2.3.6 Etalement sur milieu sélectif

But : étalement sur un milieu auquel ont été ajoutées une ou plusieurs substances inhibitrices afin
d'empêcher le développement de groupes d'organismes indésirables (par ex. : sels biliaires en cas de
coliformes).

2.1.2.3.7 Dénombrement

But : déterminer combien d'organismes d'un groupe ou d'une espèce donné(e) sont présents dans
une quantité donnée d'échantillon.

Il y a deux méthodes de base pour déterminer ce nombre : le dénombrement direct sur un milieu
solide (comptage par boîte) et la méthode MPN ou méthode du nombre le plus probable.

Principe du comptage par boîte : si dans une boîte, il y a des colonies bien distinctes les unes des
autres (voir 2.3.4) et que l'on sait à quelle quantité d'échantillon cela correspond (par ex. 0,1 ml
ensemencé sur boîte d'une dilution centésimale provenant de 25 ml d'un homogénat de 1 g
d'échantillon), on peut compter le nombre de colonies – qu'elles soient ou non typiques – sur cette
boîte et les rapporter à la quantité d'échantillon prélevé. Dans notre exemple : nous avons 1g
-2
d’échantillon dans 25ml de diluant, soit par ml de diluant 1/25 = 0,04 = 4 x 10 g d'échantillon; la
-4
dilution centésimale contient 100 x moins d’échantillon, soit 4 x 10 g/ml, et 0,1 ml de cette dilution
-5
correspond encore à 10 x moins d’échantillon donc à 4 x10 g d'échantillon. Si on compte sur la boîte
-5
20 colonies typiques, elles provenaient de 4 x 10 g d'échantillon, ou l'échantillon contient par
-5 5
gramme 20/(4 x 10 )= 5 x 10 = 500 000 ufc (unité formant colonie, voir 2.1.1) par gramme.

Principe du MPN (most probable number) : dans la technique du nombre le plus probable, on travaille
avec un milieu liquide dans des tubes à essais. On établit une gamme de dilutions et par dilution on
ensemence plusieurs tubes à essais (généralement 3 ou 5). Après incubation durant un temps
prescrit, on vérifie dans combien de tubes à essais un développement s'est produit (visible au fait que
le milieu nutritif initialement clair est devenu trouble). Su base du nombre de tubes à essais où il y a
un développement et de la dilution correspondante, on peut estimer à partir de tableaux combien
d'organismes se trouvaient dans l'échantillon.

2.1.2.3.8 Isolement d'une colonie

But : s'assurer qu'une colonie qui va servir à confirmer la nature de l'organisme provient effectivement
d'une seule cellule et n'est donc pas un mélange de deux ou plusieurs organismes différents.

Principe : dans le cas idéal, une colonie isolée sur une boîte provient d'une seule cellule et toutes les
cellules de cette colonie en sont des clones. En pratique, il peut se trouver à proximité de cette cellule
des cellules d'autres organismes, qui dans les conditions données ne se développent guère voire pas
du tout, mais qui ne meurent pas non plus. Si l'on repique cette colonie sur un autre milieu nutritif (par
exemple pour identification), on court le risque que ces cellules 'étrangères' se développent et
faussent le résultat des tests. C'est pourquoi il est nécessaire de commencer par isoler une colonie
après développement avant de procéder aux tests supplémentaires. Pour ce faire, on repique une
colonie isolée sur un autre milieu, généralement non sélectif (ensemencement par stries).

12
La boîte est incubée jusqu'à ce qu'apparaissent des colonies distinctes, et on continue l’analyse avec
une de ces colonies isolées. Les chances qu'une colonie après isolement soit encore contaminée par
une cellule étrangère sont alors devenues très minimes.

2.1.2.3.9 Confirmation

But : contrôler si la colonie isolée est effectivement l'organisme recherché ou déterminer l'identité
d'une colonie isolée (généralement au niveau de l'espèce).

Principe d'une confirmation biochimique : un certain nombre de tests biochimiques est effectué sur
une colonie isolée. A cette occasion, on contrôle le développement dans différentes conditions et sur
différents milieux nutritifs afin de vérifier s'il se produit des réactions typiques telles qu’acidification,
fermentation de certains sucres, dégradation d'un composé donné, etc. Le tableau des réactions (par
ex. la galerie API) permet de déduire si l'on est en présence de l'organisme recherché ou d'identifier
un organisme (espèce) à l'intérieur d'un groupe (par ex. déterminer l'espèce à l'intérieur du genre
Listeria).

2.1.2.3.10 Sérotypage

But : l'identification d'un organisme à un niveau inférieur à celui de l'espèce (détermination de


sérovars).

Principe : dans ces tests, on mélange une colonie avec des anticorps spécifiques à certains
composants cellulaires (paroi cellulaire, flagelle, …). L'agglutination indique la présence de ces
composants.

Le sérotypage est plus précis que les tests biochimiques (niveau du sérovar plutôt que de l'espèce).
Le sérotypage est effectué d'une part pour déterminer la traçabilité d'une contamination (comme pour
les sérotypes de Salmonella) et d'autre part pour déterminer la présence de facteurs de virulence et
ainsi aussi la possibilité de provoquer une maladie (comme la présence de l'antigène H7 chez E. coli
O157).

2.1.2.4 Déroulement d'une analyse microbiologique

La détection d'un organisme ou d'un groupe d'organismes se déroule en plusieurs étapes :


l'échantillonnage, l'analyse proprement dite, l’expression du résultat et son interprétation. Chacune de
ces étapes est importante et peut influencer fortement l'évaluation finale.

2.1.2.4.1 L'échantillonnage

Sous bien des aspects, l'échantillonnage est le facteur le plus critique ! En effet, il est absurde
de se casser la tête sur l'interprétation d'un résultat d'analyse si les problèmes ont débuté dès le
prélèvement de l'échantillon. Les aspects importants à cet égard sont :

13
o la représentativité d'un échantillon ou le degré dans lequel l'échantillon est représentatif
du produit qui se retrouve dans l'assiette du consommateur. Il va de soi que la 'partie non
consommée' d'une denrée alimentaire ne procurera pas d'informations. Quoique cela ne
soit pas toujours aussi simple : la croûte d'un fromage fermenté ou persillé doit-elle être
considérée comme consommable ? Les opinions à ce sujet sont fort divergentes…
o l'homogénéité concerne la répartition des micro-organismes dans le produit. Pour les
produits liquides ou en poudre, cela ne pose généralement guère de problèmes, mais
pour certains produits solides (salades, certains types de fromage, pâté…), l'endroit du
prélèvement (tout près de la surface ou au cœur du produit, quantité plus ou moins
grande d'un ingrédient particulier) peut avoir un effet important sur le résultat. De ce fait,
un échantillon peut donner une valeur faible pour un paramètre donné, et un autre
échantillon prélevé juste à côté une valeur élevée pour ce même paramètre. On peut
remédier à ce problème en prélevant plusieurs échantillons à des endroits différents, que
l'on rassemble en un échantillon unique ou que l'on analyse chacun séparément. Dans ce
dernier cas, la dispersion des résultats peut donner une indication sur l’hétérogénéité de
la contamination à plus grande échelle.

Surtout lors de la recherche de très faibles nombres d'un organisme (ex. Salmonella), l'homogénéité
de l'échantillon constitue un point critique. Si le produit est peu homogène, les chances de trouver
effectivement ces quelques bactéries présentes sont en corrélation directe avec la probabilité de
prélever l'échantillon au 'bon' endroit.

2.1.2.4.2 La conservation de l'échantillon

Voilà un autre point critique, à savoir la conservation de l'échantillon entre le moment de son
prélèvement et le début de l'analyse. Pendant la conservation, il faut empêcher la multiplication des
organismes sans pour autant les tuer. Il est dès lors extrêmement important de ne pas interrompre la
chaîne du froid depuis l'échantillonnage jusqu'à l'analyse, surtout pour les produits dans lesquels un
développement est possible; d'où l'allégation générale disant qu'une analyse microbiologique doit être
entamée dans les 24 heures suivant l'échantillonnage. Pour des raisons évidentes, c'est moins
important pour les produits stérilisés, surgelés ou secs.

2.1.2.4.3 L'analyse

La réalisation d'analyses microbiologiques classiques suit un déroulement standard qui est basé sur
la réalisation des techniques standards (4.2.3) dans un ordre bien défini.
Quelles techniques utilise-t-on ? Cela dépend si l'on veut effectuer un dénombrement ou bien une
détection.

Pour un dénombrement, les étapes suivantes sont réalisées :

o homogénéisation d'une quantité d'échantillon (1g, 25g,...) Dans une quantité de diluant
stérile – but : répartition homogène des cellules dans l'homogénat,

o établissement d'une gamme de dilutions décimales – but : obtention d'une dilution qui
fournira des quantités dénombrables,

14
o étalement, à partir d'une série de dilution, d'une quantité sur une boîte contenant un
milieu nutritif solide. But : disperser les cellules. Ce milieu nutritif peut être sélectif ou non
sélectif, en fonction de l'organisme recherché.
o incubation des milieux nutritifs ensemencés durant un temps bien déterminé à une
température bien définie (par ex. 48 h. à 37°C) – but : développement le plus rapide
possible jusqu'à la formation de colonies visibles,
o dénombrement du nombre de colonies (typiques) sur les boîtes,

o au besoin : sélection d'une ou plusieurs colonies typiques, isolement et confirmation


qu'elles proviennent de l'organisme recherché,

o calcul du résultat.

Remarque : pour un dénombrement, l'étalement se fait directement après l'homogénéisation de


l'échantillon, de telle sorte qu'il ne puisse se produire de développement dans l'intervalle.

Pour une détection, les étapes de l'analyse sont les suivantes :

o homogénéisation d'une quantité d'échantillon avec une quantité de milieu nutritif liquide
non sélectif – but : dispersion homogène des cellules dans l'homogénat,
o incubation du milieu nutritif durant un temps bien déterminé à une température bien
définie (par ex. 18 h. à 37°C). But : donner aux cellules, éventuellement légèrement
endommagées, le temps de se remettre et de se développer,

o transfert d'une partie du milieu nutritif incubé dans un milieu d'enrichissement liquide
sélectif. But : inhibition des organismes autres que l'organisme recherché lors de
l'incubation qui suit,

o incubation du milieu d'enrichissement durant un temps bien déterminé et à une


température bien définie. But : développement sélectif de l'organisme recherché, jusqu'à
obtenir un grand nombre de cellules,
o isolement à partir du milieu d'enrichissement sur une ou plusieurs boîtes de milieu nutritif
sélectif solide avec indicateurs. Pour ceci, on peut utiliser des boîtes avec différents
milieux nutritifs. But : développement de colonies typiques.
o incubation du milieu nutritif ensemencé durant un temps bien déterminé à une
température bien définie – but : développement jusqu'à la formation de colonies visibles,

o évaluation des boîtes :

 si on ne trouve pas de colonies typiques, c'est que l'organisme recherché


n'était pas présent dans l'échantillon, et l'analyse est terminée. Communication
du résultat comme étant 'absent dans X g d'échantillon';
 si on trouve des colonies typiques : repiquer une ou plusieurs colonies
typiques, les isoler et confirmer à l'aide de tests biochimiques ou autres. Si
l'organisme est confirmé : communiquer le résultat comme étant 'présent dans
X g d'échantillon'.

15
.1.2 : boîte de Pétri contenant des colonies noires typiques de Salmonella,
Figure 2.1.2 Salmonella qui à un stade
ultérieur, doivent être isolées et confirmées.

Remarquons que pour la détection, on procède d'abord à un enrichissement et seulement après à un


étalement, qui
ui a pour but l'isolement de l'organisme. Le nombre initial de cellules n'a pas
d'importance. L'enrichissement permet de détecter même un très petit nombre de cellules (par ex. 1
Salmonella dans 25 g d'échantillon).

Pour réaliser ou interpréter correctement


correctement une analyse, qu'il s'agisse d'un dénombrement ou de la
détection d'un organisme ou d'un groupe de micro-organismes,
micro organismes, il faut tenir compte d’un certain
nombre de points :

o quelles caractéristiques l'organisme possède-t-ilil ? Certains organismes se présentent


présente
en petits agrégats (comme le Staphylococcus), ), et il n'est alors pas toujours simple
d'obtenir une bonne homogénéisation de l'échantillon au point de n’obtenir que des
cellules individuelles. Comme un groupe de cellules donne également lieu à une seule
colonie,
olonie, le résultat d'un dénombrement de tels organismes sera toujours une sous-
estimation du nombre réel d'organismes.

o quel est l'état de l'organisme dans l'échantillon ? Surtout dans le cas de produits ayant
subi un traitement thermique, les organismes sont sont 'stressés', ce qui entrave leur
développement, et ce d'autant plus si le milieu nutritif contient des substances inhibitrices
(dans le but d'éliminer les organismes concurrents). D’ou avec de tels échantillons, on
passe par une brève 'étape de récupération'
récupération' dans un milieu non sélectif avant d'entamer
l'analyse proprement dite.
o quel est le degré de sélectivité du milieu nutritif sur lequel l'organisme est élevé ?
Souvent, il peut y avoir confusion avec des organismes apparentés qui forment des
colonies ayant
yant plus ou moins le même aspect. C'est pourquoi des tests complémentaires
sont parfois nécessaires pour confirmer la nature de la colonie suspecte. Pour la
détection de Salmonella,
Salmonella, par exemple, on sélectionne les colonies suspectes, pour
ensemencer des milieux
ilieux différents, sur lesquels les colonies de Salmonella ont un autre
aspect. Si cette étape indique aussi la présence de Salmonella,, on peut encore faire une
série de tests biochimiques en vue d'une confirmation définitive.
o quelle méthode doit être appliquée ? Plusieurs méthodes qui déterminent le même
paramètre ne donnent pas nécessairement les mêmes résultats ! Un milieu nutritif peut

16
être plus sélectif qu'un autre. Des méthodes différentes peuvent aussi être basées sur un
principe différent. On peut, par exemple, détecter Salmonella avec une méthode
classique (développement, colonies typiques sur boîte, réactions biochimiques), mais
aussi par une méthode immunologique (ELISA) ou par PCR. C'est suite à ce problème de
comparaison de méthodes que des méthodes de référence ont été fixées au niveau
international, et sont censées donner le résultat 'exact', ce qui signifie qu'elles donnent le
même résultat dans différents laboratoires. Les méthodes alternatives ne sont pas
nécessairement moins bonnes, mais elles sont généralement plus rapides.

2.1.2.4.4 Le résultat

Les résultats microbiologiques peuvent être exprimés de différentes manières, en fonction de la


méthode utilisée et du mode d'échantillonnage.

Détection

Ce critère est valable pour les organismes pathogènes tels que Salmonella et Listeria; généralement,
on exige le contrôle de l'absence dans une certaine quantité de produit (par ex. absence dans 25 g ou
25 ml). Le résultat est alors exprimé comme étant 'présence ou ‘absence' dans X g (ou ml)' ou
comme '< 1 / X g'.

Dénombrement

Dans les dénombrements, on donne un résultat numérique parce que l'organisme ou le groupe
d'organismes peut être présent mais ne peut pas dépasser une limite fixée (nombre de germes
aérobies pour la durabilité, le nombre de Staphylocoques pour le risque de formation de toxines).

Ce qu'on dénombre, ce sont des unités formant colonie (ufc) – pas des cellules.

Une condition importante pour un dénombrement correct est que les colonies soient suffisamment
séparées les unes des autres pour être reconnues comme des colonies distinctes. S'il y en a de trop
grands nombres, les colonies se touchent ou se chevauchent, et un dénombrement est impossible.
De plus, les colonies se trouvant trop près les unes des autres freinent leur développement
réciproque, ce qui rend les valeurs dénombrées non fiables.

Comme la taille d'une boîte de Pétri est limitée, le nombre maximal de colonies séparées les unes
des autres que l'on peut dénombrer correctement est également limité. En fonction des
caractéristiques des colonies, une limite de 150 à 300 colonies/boîte de Pétri est fixé.

Etant donné que les dénombrements peuvent avoir lieu sur des boîtes provenant de dilutions
différentes, les dilutions plus élevées contiendront moins de colonies, de sorte qu'en cas de boîtes
'indénombrables', on pourra recourir à des boîtes provenant d'une dilution plus élevée.

Outre une limite supérieure de 150 – 300 pour le nombre de colonies, il y a aussi une limite inférieure.
Comme le dénombrement de colonies est analogue au dénombrement de particules, les faibles
valeurs ne sont pas fiables. C'est pourquoi on fixe généralement une limite de 10; les valeurs
inférieures à 10 sont trop peu fiables pour être transmises telles quelles. Si possible, dans pareils cas,

17
on a recourt à une dilution plus faible. C'est seulement lorsque aucune colonie n'est trouvée qu'on
peut donner un résultat comme étant < 1.

Figure 2.1.3 : l'effet des dilutions sur l'étalement et le développement de colonies

Le résultat final d'un dénombrement s'obtient en multipliant le nombre de colonies dénombrées par
le facteur de dilution de la boîte sur laquelle le dénombrement a été fait, par ex. 54 (colonies
3
dénombrées) x 10 (dilution de la boîte qui a fait l'objet du dénombrement). Ce résultat doit encore
être ramené à la quantité d'échantillon dans la dilution initiale (par ex. dans 1 g, dans 0,1 g ou dans
0,01 g).
Pour l'interprétation du résultat, on peut encore faire remarquer ce qui suit :

o les unités sont des 'unités formant colonie' (ufc ou cfu – colony forming units); ceci est
souvent implicite, et on ne le précise pas (donc 1200/g au lieu de 1200 ufc/g)

o étant donné que le dénombrement se fait entre 10 et 150 – 300 colonies, le nombre de
chiffres significatifs est rarement supérieur à 2. un résultat de 29 356/g est donc purement
et simplement absurde !

o les résultats peuvent être exprimés normalement (ex. 54 000), sous forme exponentielle
(5,4 x 104 ou 7,1 x 108) ou logarithmique (4,7 log ; 8,9 log), ce qui est parfois plus
pratique en cas de nombres élevés.
o l'intervalle de confiance du résultat est relativement grand. on peut calculer que dans
le cas idéal, l'intervalle de confiance d'un dénombrement pour 10 colonies est d'environ
120 %, pour 150 colonies il est d'environ 33 % et pour 300 colonies il est d'environ 23 %
relatif.
Ces calculs ne tiennent compte que de la dispersion des résultats provenant du dénombrement lui-
même; dans la pratique, cette dispersion est plus grande à cause de l'homogénéisation, des dilutions
et de la technique d'étalement. En conséquence, on doit compter, pour l'ensemble de l'analyse, sur
un intervalle de confiance d'au moins 50 % relatif. Et 50 % est même encore une valeur optimiste,
car dans la pratique, la plus grande source de dispersion est généralement l'échantillonnage, et pas
tellement l'analyse !

18
Exigences du type n, M, m et c

Certaines réglementations fixent des exigences qui obligent à prendre en considération une
combinaison de critères. Le but est de se faire une meilleure idée de la répartition de la
contamination, et en même temps d'intégrer une notion d'avertissement. Dans ce cas, les critères
sont représentés par les lettres n, M, m et c, n étant le nombre d'échantillons individuels devant être
prélevés (généralement 5, parfois 10), M une valeur maximum absolue qui ne peut être dépassée par
aucun des n échantillons analysés, m une valeur maximum relative qui est toujours inférieure à M, et
c le nombre d'échantillons parmi ces n qui peuvent dépasser la valeur m (mais qui doivent
évidemment toujours être inférieurs à M).

Il y a ainsi pour le nombre de staphylocoques dans le fromage au lait cru une exigence dont les
valeurs sont n = 5, M = 10 000 /g, m = 1000 /g et c = 2. Cela signifie que 5 échantillons doivent être
prélevés, qu'aucun d'entre eux ne peut contenir plus de 10 000 staphylocoques par gramme et qu'un
maximum de 2 échantillons peuvent avoir une valeur comprise entre 1000/g et 10 000/g.

Pour les pathogènes, souvent on ne mentionne que n et c=0, ce qui suppose implicitement que M =
m = 0 (pathogène absent dans tous les n échantillons).

2.1.2.5 Techniques classiques et modernes

Les techniques microbiologiques ci-dessus, ensemencement de milieu de culture avec


développement de colonies typiques sont appliquées depuis des dizaines d'années, elles sont donc
considérées comme des techniques 'classiques'. Un des inconvénients des méthodes classiques est
la durée de l'analyse, généralement de quelques jours, nécessaire au développement et à la
confirmation. Mais les techniques d’analyses ne restent pas statiques et de nouveaux principes sont
appliqués.

On peut noter comme principales évolutions :

O un nouvel affinement des techniques classiques, surtout grâce au développement de


milieux nutritifs plus spécifiques qui permettent une meilleure détection.
O au milieu des années '80, par exemple, la détection de Listeria monocytogenes consistait
en un long enrichissement en milieu sélectif, suivi d'un étalement sur un milieu peu
sélectif. Après incubation, il fallait détecter les colonies bleu acier typiques de Listeria au
microscope avec un éclairage oblique. Ensuite, les colonies suspectes devaient être
purifiées avant qu'une série de tests ne puissent être effectués afin d'identifier l'espèce
monocytogenes. Actuellement, on étale sur un milieu nutritif (ALOA) sur lequel les
colonies de Listeria monocytogenes peuvent être directement distinguées des autres
espèces de Listeria.

O apparition des milieux sélectifs basés sur une technique inhibigen. Une molécule
inhibigen est constituée de deux composés, un inhibiteur spécifique et un substrat. Lié au
substrat l’inhibiteur n’est pas toxique, seuls les microorganismes avec le mécanisme
d’assimilation et les enzymes requis peuvent cliver l’association entre l’inhibiteur et le
substrat. Cette séparation se fait à l’intérieur de la cellule, l’inhibiteur ainsi libéré
interrompt la synthèse de la paroi cellulaire et cause la mort de la cellule concernée.
L’inhibiteur libéré ne peut pas s’attaquer à d’autres cellules, c’est donc une inhibition
ciblée. Ce qui en fait une alternative intéressante aux antibiotiques pour inhiber les

19
bactéries non recherchées. Le taux de recouvrance est amélioré de deux façons : en
réduisant la croissance de la flore compétitive et en minimisant l’exposition aux composés
inhibiteurs potentiels.

O l'application de l'ELISA pour la détection de certains pathogènes (VIDAS). Après


enrichissement, on vérifie ici s'il y a dans l'échantillon des antigènes spécifiques
provenant d'un pathogène donné. Le principal avantage est un raccourcissement de
l'étape de détection (une confirmation par une méthode classique est toutefois encore le
plus souvent nécessaire pour une certitude maximale).
O la PCR est une technique en plein essor. La détection se fait par la recherche dans
l'échantillon d'un fragment d'ADN caractéristique provenant d'un pathogène recherché.
En première étape, un enrichissement est certes encore nécessaire afin d'obtenir
suffisamment d'ADN, après quoi les fragments recherchés sont multipliés par PCR
(Polymerase Chain Reaction), et sont ensuite détectés.

O dans une variante récente, la real-time pcr la présence peut être déjà constatée pendant
la réaction, si bien que la multiplication et la détection sont simultanées.

O des méthodes de dénombrement automatisées apparaissent également sur le marché.


On peut citer ici la méthode TEMPO. Celle-ci allie la technique du nombre le plus
probable (3 dilutions décimales successives et 16 micro-tubes par dilution) à la détection
de fluorescence.

Ces nouvelles méthodes permettent de ramener parfois de plusieurs jours à quelques heures le
temps d'analyse après enrichissement.

2.1.2.6 Paramètres de qualité des analyses microbiologiques

Parmi les paramètres de qualité des analyses microbiologiques il faut distinguer ceux qui vont être
déterminés lors de la validation d’une méthode de ceux qui vont être utilisés pour apprécier les
résultats d’une analyse circulaire.

Ces paramètres seront également différents dans le cas d’analyses quantitatives ou de


dénombrements que dans le cas d’analyses qualitatives ou de détection de la présence de
microorganismes pathogènes.

2.1.2.6.1 Validation d’une méthode

Méthodes quantitatives

Dans ce cas il est nécessaire d’étudier la répétabilité, la reproductibilité et la justesse de la méthode.


C’est la norme internationale ISO 5725 qui va décrire la marche à suivre ainsi que le traitement des
données à effectuer pour mener à bien cette validation.

La fidélité est l’étroitesse de l’accord entre des mesures effectuées sur des prises multiples d’un
échantillon homogène. La fidélité est estimée sur base de deux situations extrêmes d’analyse : la
répétabilité et la reproductibilité ;

20
La répétabilité est une mesure de la fidélité, lorsque les mesures sont faites par un même opérateur,
sur un même instrument, avec une méthode unique et dans un délai court.

La reproductivité est une mesure de la fidélité, lorsque les conditions de mesure changent, plusieurs
opérateurs et/ou instruments et/ou méthodes etc . . .

La justesse est l’étroitesse entre une mesure et la valeur conventionnelle vraie de l’échantillon ; la
valeur conventionnelle vraie de l’échantillon est fournie par consensus à partir des valeurs de
mesures répétées.

Méthodes qualitatives

Les performances de la méthode s’exprimeront en terme d’efficacité, de sensibilité, de spécificité et


de taux de faux positifs et de faux négatifs.

La sensibilité est la fraction de tous les résultats positifs correctement attribués dans l’analyse.
La spécificité est la fraction de tous les résultats négatifs correctement attribués dans l’analyse.
Le taux de faux positifs est la fraction de positifs observés non correctement attribués.
Le taux de faux négatifs est la fraction de négatifs observés non correctement attribués.
L’efficacité est la fraction de résultats correctement attribués.

Donc si on répartit les résultats en quatre catégories :

O le nombre de résultats présumés positifs, confirmés positifs (vrais positifs) (a)

O le nombre de résultats présumés négatifs, s’avérant positifs (faux négatifs) (b)

O le nombre de résultats présumés positifs, s’avérant négatifs (faux positifs) (c)


O le nombre de résultats présumés négatifs, confirmés négatifs (vrais négatifs) (d)

Le calcul des paramètres de performance se fait de la façon suivante :

O sensibilité = a/(a+b)

O taux de faux positifs = c/(a+c)

O spécificité = d/(a+d)
O taux de faux négatifs = b/(b+d)

O efficacité = a+d/(a+b+c+d)

Mais il est également nécessaire de déterminer une limite de détection pour les analyses
qualitatives. Celle-ci est spécifique à chaque laboratoire. On détermine à partir de quel nombre de
cellules le laboratoire est capable de détecter la présence d’un microorganisme recherché dans une
matière donnée.

21
2.1.2.6.2 Analyses comparatives

Les paramètres utilisés pour qualifier la performance d’un laboratoire lors d’une analyse circulaire
dépendent de l’organisateur de cette analyse.
Méthodes quantitatives

Les résultats vont être examinés en fonction de la fidélité et de la justesse.

La fidélité reflète la répétabilité du travail du laboratoire. L’écart type des résultats du laboratoire est
comparé à l’écart type de l’ensemble des résultats de l’analyse circulaire.

La justesse reflète la proximité des résultats du laboratoire à la valeur assignée de la contamination


de l’échantillon. C’est le Z score qui est le plus communément employé

Z score = (x – X)/s

ou x est le résultat du laboratoire


X est la valeur attribuée
S est l’écart type de tous les résultats de l’analyse circulaire.

Méthodes qualitatives

La performance est évaluée par la capacité à détecter uniquement les échantillons contaminés par la
bactérie à rechercher. Les résultats sont généralement classés en résultats justes, résultats
faussement positifs et résultats faussement négatifs.

22
2.1.3 Aperçu des principales analyses microbiologiques

Ce paragraphe a pour but de vous présenter brièvement la raison ou le but des différentes analyses
microbiologiques ainsi qu’une brève description du principe de l’analyse.

On distingue principalement les microorganismes « témoins de défaut d’hygiène », germes totaux


(FMAT), levures et moisissures, entérobactéries, coliformes et Escherichia coli, des germes
pathogènes responsables de toxi-infection alimentaires, Staphylocoques à coagulase positive,
Salmonelles, Listeria monocytogenes, E. coli O157 H7, Campylobacter, Bacillus cereus, Clostridium
perfringens et C. botulinum, Yersinia enterocolica et Vibrio.

2.1.3.1 La Flore Mesophile Aerobice Totale (FMAT)

La flore mésophile aérobie totale représente tous les micro-organismes aptes à donner naissance à
des colonies visibles après une incubation de 3 jours à 30°C sur une gélose de dénombrement de
type Plate Count Agar (PCA). La FMAT est donc un indice de la salubrité et de la qualité d’un produit.
Sur un plan technologique, une flore mésophile nombreuse indique un haut risque d’altération
microbienne. Sur le plan hygiénique, il n’y a pas de corrélation étroite entre l’importance de la flore
totale et la présence de micro-organismes pathogènes. Le dénombrement de la FMAT reste la
meilleure méthode d’appréciation de la qualité microbiologique générale.

2.1.3.1.1 Analyse

Procédure de dénombrement de la FMAT : (ISO 4833 :2003) :

O prélever une quantité d’échantillon, transférer dans du diluant et homogénéiser,

O préparer les dilutions décimales,

O ensemencement en profondeur de 1 ml d’échantillon ou de dilution dans le milieu Plate


Count Agar (PCA)

O incubation à 30°C pendant 72 heures

O comptage de toutes les colonies visibles

O calculer le nombre de cfu à partir du nombre de colonies, en tenant compte des dilutions
réalisées.

23
Figure 2.1.4 : Boîte de milieu PCA

2.1.3.1.2 Schema d’analyse – Dénombrement des micro-organismes


Préparation de l’échantillon

E c h a n t illo n liq u id e
o u s u s p e n s io n m è re
(p r is e d ’e s s a i d e x g o u x m l
d a n s 9 x m l d e d ilu a n t )

D ilu t io n s d é c im a le s d a n s d u
T r y p to n e s e l
Incubation

E n s e m e n c e m e n t e n p ro f o n d e u r d u m ilie u
P C (M )A a v e c 1 m l (1 b o îte p a r d ilu t io n )
In c u b a tio n 7 2 ± 3 h ; 3 0 ± 1 °C
Dénombrement

C o m p ta g e d e la to ta lité d e s c o lo n ie s

24
2.1.3.2 Levures et moisissures

Les moisissures sont responsables de détérioration des aliments, souvent de simples défauts
d’aspect, mais suffisants pour déprécier et rendre invendables les marchandises. Parfois elles
peuvent présenter un danger pour le consommateur, elles produisent dans ce cas des toxines
appelées mycotoxines. Les levures peuvent également produire, par leur développement, des
altérations, par formation de trouble (cellules de levure), d’odeur ou de goût anormaux, provoquant
souvent le gonflement des produits ou de leur emballage.

Il n’est donc pas nécessaire de rechercher les levures et moisissures d’un point de vue hygiénique,
mais sur le plan technologique, elles peuvent provoquer des pertes considérables.

2.1.3.2.1 Analyse

Procédure de dénombrement des levures et moisissures : (ISO 21527-1 et 2 :2008) :

O prélever une quantité d’échantillon, transférer dans du diluant et homogénéiser,

O préparer les dilutions décimales si nécessaire, ensemencement en surface de 0,1 ml


d’échantillon ou de dilution dans le milieu Dichloran Rose Bengale chloramphénicol
(DRBC) pour les échantillons dont l’activité en eau (aw) est supérieure à 0.95 et dans le
milieu Dichloran Glycérol (DG18) pour les échantillons dont aw < 0.95
O incubation à 25°C pendant 5 jours

O dénombrer toutes les colonies visibles après 3, 4 et 5 jours, avec si nécessaire une
distinction entre levures et moisissures (numération après 3 et 4 jours si la plaque risque
d’être couverte de moisissures),

o calculer le nombre de cfu à partir du nombre de colonies, en tenant compte des dilutions
réalisées.

Figure 2.1.5 : Moisissure sur milieu DRBC

25
2.1.3.2.2 Schéma d’analyse– Dénombrement des levures et moisissures

Echantillon liquide
ou suspension mère
Prélèvement et dilution

(prise d’essai de x g ou x ml dans 9x


ml de EPT 0,1%))

Dilutions décimales dans du


peptone sel
Incubation

Ensemencement en surface du milieu


DRBC (Produit à aw supérieure à 0,95)
DG18 (Produit à aw inférieure ou égale à 0,95)
avec 0,1ml
Incubation 5 jours; 25±1°C ***
Dénombrement

Dénombrement des colonies **

* Les boîtes sont contrôlées après 3 et 4 jours d’incubation

** Levures : colonies présentant le plus souvent un contour régulier et une surface plus ou moins convexe
Moisissures : germes plats ou duveteux ou colonies présentant souvent des fructifications colorées
et des formes de sporulation

*** Entourer les boîtes de parafilm


Incuber couvercle vers le haut

26
2.1.3.3 Les entérobactéries

Le nom d’entérobactéries provient du fait que ces bactéries sont en général des hôtes normaux ou
pathologiques du tube digestif de l’homme et des animaux. Les entérobactéries constituent l’une des
plus importantes familles de bactéries, autant d’un point de vue quantitatif que qualitatif. On y
retrouve entre autres les coliformes, plus particulièrement Escherichia coli, mais aussi des germes
pathogènes tels que les Salmonelles, Escherichia coli entérotoxique, Shigella ou Yersinia, ainsi que
beaucoup d’autres bactéries. Elles sont recherchées pour déterminer la qualité sanitaire des aliments.

2.1.3.3.1 Analyse

Le procédure de dénombrement des entérobactéries : (ISO 2158-2° :2004) :

o prélever une quantité d’échantillon, transférer dans du diluant et homogénéiser,


o préparer les dilutions décimales,

o ensemencement en profondeur de 1 ml d’échantillon ou de dilution dans un milieu gélosé


ème
à la bile, au cristal violet et au glucose (VRBG), recouvrement avec une 2 couche de
VRBG (pour créer une semi-anaérobiose),

o incubation à 30°C pendant 24 heures,

o dénombrer les colonies rouge-violet typiques d’un diamètre de 0,5 mm ou plus, parfois
entourées d’une zone de précipité rouge-violet, ainsi que les colonies incolores non
typiques. Si un doute subsiste, effectuez un test d’oxydase sur la colonie (les
Enterobacteriaceae sont oxydase négatif),

o calculer le nombre de cfu à partir du nombre de colonies, en tenant compte des dilutions
réalisées.

Figure 2.1.6 : Boîte de milieu VRBG

27
2.1.3.3.2 Schéma d’analyse: Dénombrement des Enterobacteriaceae

E chantillo n liqu ide


ou s us pens ion m ère *
Préparation de

(prise d ’es sai d e x g o u x m l d ans 9 x


l’échantillon

m l de d iluant)

D ilut ions d éc im ales d ans d u Tr ypto ne se l


Incubation

Ens em encem ent e n pr ofo nde ur du m ilieu VR B G


avec 1 m l
(1 bo îte p ar d ilu tio n)
Inc u bat ion 24± 2h; 30±1°C
Dénombrement

C om ptage des c olonies s us pectes

**

Nut rie nt Ag ar
Inc u bat ion 24± 2h; 37±1°C
Confirmation

S i te s t de
l’oxidas e
n eg ative

Test de l’o x ydas e Test de ferm entation


Inc u bat ion 24± 2h; 37± 1°C

* Po ur les s wa bs : + 1 00 m l de dilua nt
** P ré lèvem en t d e 5 co lon ies ou to u te s les colo nies si < 5, po ur con firm a tio n

28
2.1.3.4 Les coliformes et Escherichia coli

Pour détecter une contamination, il est possible de rechercher directement les espèces pathogènes
ou, si cela présente des avantages de commodité, de rapidité ou de sensibilité, de rechercher une
espèce ou un groupe d’espèces de la même association. Cette espèce ou ce groupe d’espèces
constitue alors un indice ou un témoin de la contamination. Les coliformes et Escherichia coli sont
des microorganismes vivant normalement dans l’intestin de l’homme et des animaux. Ainsi ils sont
recherchés en tant qu’indice de contamination fécale.

La surveillance de ces indicateurs permet de contrôler le respect des normes d’hygiène au long de la
chaîne de production.

2.1.3.4.1 Analyse des coliformes

Procédure de dénombrement des coliformes : (ISO 4832 :1991) :

o prélever une quantité d’échantillon, transférer dans du diluant et homogénéiser,

o préparer les dilutions décimales si nécessaire (en cas de valeurs élevées),

o ensemencement en profondeur de 1 ml d’échantillon ou de dilution dans un milieu gélosé


ème
à la bile, au cristal violet et au lactose (VRBL), recouvrement avec une 2 couche de
VRBL (pour créer une semi-anaérobiose)

o incubation à 30°C pendant 24 heures

o comptage des colonies d’un diamètre égal ou supérieur à 0.5 mm de couleur violacée ou
pourpre

o confirmation, sélectionner cinq colonies de chaque type douteux et ensemencer des


tubes de bouillon lactose, bilié au vert brillant, incuber à 30°C pendant 24 heures, les
colonies pour lesquelles on observe une formation de gaz dans les cloches de durham,
sont considérées comme étant des coliformes

o calculer le nombre de cfu à partir du nombre de colonies, en tenant compte des dilutions
réalisées.

Figure 2.1.7 : Boîte de milieu VRBL

29
2.1.3.4.2 Analyse E. coli

Procédure pour le dénombrement d’E. coli : (ISO 16649-2) :

O prélever une quantité d’échantillon, transférer dans du diluant et homogénéiser,

O préparer les dilutions décimales si nécessaire (en cas de valeurs élevées),

O ensemencement en profondeur de 1 ml d’échantillon ou de dilution dans un milieu gélosé


tryptone-bile-glucuronide (TBX)

O incubation à 44°C pendant 24 heures

O comptage des colonies de couleur bleue

O calculer le nombre de cfu à partir du nombre de colonies, en tenant compte des dilutions
réalisées.

Figure 2.1.8 : Boîte de milieu TBX

30
2.1.3.4.3 Schéma d’analyse : Dénombrement des Escherichia coli

Echantillon liquide
ou suspension mère
(prise d’essai de x g ou x ml dans 9x ml
de diluant)

Dilutions décimales dans du tryptone sel

Ensemencement en profondeur du
milieu TBX avec 1ml
(1 boîte par dilution)
Incubation 21±3h; 44±1ºC

Comptage des colonies bleues

31
2.1.3.5 Staphylocoques à coagulase positive

Si les Salmonelles sont les agents principaux de toxi-infections alimentaires (TIA), les staphylocoques
occupent le deuxième ou troisième rang selon les années. Mais compte tenu des symptômes
relativement bénins qu’elles entraînent, il est fort probable que les intoxications staphylococciques
sont largement sous-estimées. Les intoxications alimentaires dues aux staphylocoques sont
principalement provoqués par les toxines produites par ces organismes.

La contamination par Staphylococcus aureus a deux origines : l’animal (mammites) et l’homme. Ce


germe fait partie de la flore de la peau et des muqueuses. Des souches de S. aureus d’origine variée
peuvent contaminer les aliments crus. Etant thermosensibles, elles sont généralement détruites au
cours de la pasteurisation ou de la cuisson des aliments (les toxines sont relativement résistantes à la
chaleur).

La présence de S. aureus dans les aliments chauffés et manipulés après cuisson est plutôt un indice
de contamination humaine. Le niveau de contamination est habituellement faible, mais si l’aliment est
conservé dans des conditions favorables à la multiplication et à la production de toxines, les
entérotoxines peuvent être produites en quantité suffisante pour déclencher une intoxication.

Un critère important pour la détection de S. aureus est la présence de coagulase, une enzyme qui
déclenche la première étape de la coagulation. L’absence de coagulase implique que la souche n’est
pas S. aureus.

2.1.3.5.1 Analyse

La procédure de dénombrement des staphylocoques : (ISO 6888 –2 :1999) :

O prélever une quantité d’échantillon, transférer dans du diluant et homogénéiser,

O préparer éventuellement une dilution décimale (si on prévoit des valeurs élevées),
O ensemencement en profondeur de 1 ml d’échantillon ou de dilution dans un milieu gélosé
au plasma de lapin et au fibrinogène [Baird Parker + supplément RPF (Rapid Plasma
Fibrinogen)]
O incubation à 37°C pendant 24 à 48 heures

O compter le nombre de colonies typiques : colonies noir-gris entourées d’une zone laiteuse
ou trouble,
O en cas de doute : confirmer les colonies suspectes à l’aide d’un test coagulase,

O calculer le nombre de cfu à partir du nombre compté de colonies, en tenant compte des
dilutions réalisées.

32
Figure 2.1.9 : Boîte de milieu Baird-Parker

33
2.1.3.5.2 Schéma d’analyse – Dénombrement des Staphylocoques à coagulase positive

Echantil lon liq uide


ou suspen sion mère
(pri se d’ essai de x g ou x ml
dan s 9x ml d e d ilua nt)

Dilu tio ns d écimal es da ns du tryp ton e sel

En se menceme nt en pro fon deur du milie u BP + RPF avec 1ml


(une boîte pa r dil ution)
Inc ubation 24 +/-2h; 37+/-1 C
*

t
n
e
m
e
rb Dén ombremen t des colo nies gris-noir a vec un ha lo
m
o
n
é
D

* Si aucune c olonie typique, les boî tes sont incubées 24h s upplément aires

34
2.1.3.6 Les Salmonelles

Les salmonelles sont donc la cause principale des toxi-infections alimentaires. Elles font partie des
Entérobactériacées et sont originaires du tube digestif des animaux à sang chaud. Leur présence
s’explique en général par une contamination d’origine fécale provenant d’individus malades ou
porteurs. Salmonella est capable de se maintenir plus ou moins longtemps en dehors des matières
fécales et peut ainsi contaminer l’eau et les aliments.

2.1.3.6.1 Analyse

Recherche des Salmonelles : (ISO 6579 :2002) :

O prélever une quantité d’échantillon, transférer dans de l’eau peptonée tamponnée et


homogénéiser,

O pré-enrichissement non sélectif en incubant à 37°C pendant 18 heures,

O enrichissement sélectif sur deux milieux en parallèle :

 0,1 ml de culture de pré enrichissement dans un bouillon Rappaport Vassiliadis


Soja (RVS) et incubation 24 heures à 41,5°C

 1 ml de culture de pré enrichissement dans un bouillon Muller Kauffmann


(MKTTn) et incubation 24 heures à 37°C
O isolation à partir de chaque enrichissement sélectif (RVS et MKTTn) sur deux milieux
agar différents (Xylose Lysine Désoxycholate agar, XLD, et Brillance Salmonella), en
étalant à l’aide d’une oese, puis incuber pendant 24 heures à 37°C,
O si l’on observe sur ces milieux agar des colonies avec l’apparence typique de Salmonella
(colonies noires ou colonies rouges avec un centre noir sur XLD, colonies pourpres sur
Brillance Salmonella), effectuer la phase de confirmation en prélevant quelques colonies
typiques, en les replaçant sur Nutrient Agar (NA) et en les incubant pendant 24 heures à
37°C, et effectuer ensuite un certain nombre de tests biochimiques (la galerie API) pour
confirmer que l’organisme observé est effectivement Salmonella.
Recherche des Salmonelles par PCR: (AFNOR iQ-Check Salmonella II (BRD 07/06 – 07/04)) :

o prélever une quantité d’échantillon, transférer dans de l’eau peptonée tamponnée et


homogénéiser,
o pré-enrichissement non sélectif en incubant à 37°C pendant 21 heures,

o extraction de l’ADN de 100 µl de culture de pré enrichissement avec 100µl de réactif de


lyse, incuber 10 min à 95-100°C, centrifuger, prendre 5 µl de surnageant, ajouter 45 µl de
mix PCR et réaliser le screening PCR

o enrichissement sélectif sur deux milieux en parallèle et réalisation de la PCR :

• ml de culture de pré enrichissement dans un bouillon Rappaport Vassiliadis Soja


(RVS) et incubation 24 heures à 41,5°C

• ml de culture de pré enrichissement dans un bouillon Muller Kauffmann (MKTTn)


et incubation 24 heures à 37°C

35
o isolation à partir de chaque enrichissement sélectif (RVS et MKTTn) sur deux milieux
agar différents (Xylose Lysine Deoxycholaat agar, XLD, et Brillance Salmonella), en
étalant à l’aide d’une oese, puis incuber pendant 24 heures à 37°C,

o si l’on observe sur ces milieux agar des colonies avec l’apparence typique de Salmonella
(colonies noires ou colonies rouges avec un centre noir sur XLD, colonies pourpres
brillantes sur Brillance Salmonella), effectuer la phase de confirmation en prélevant
quelques colonies typiques, en les replaçant sur Nutrient Agar (NA) et en les incubant
pendant 24 heures à 37°C, et effectuer ensuite un certain nombre de tests biochimiques
(la galerie API) pour confirmer que l’organisme observé est effectivement Salmonella.

Figure 2.1.10 : Boîte de milieu XLD

36
2.1.3.6.2 Schéma d’analyse– Recherche de Salmonella spp.

Pré-enrichissement

Prise d’essai x g
+
9x ml d’eau peptonée tamponnée *
Incubation 18±2h; 37±1°C
Enrichissement

0,1ml de culture + 10ml de 1ml de culture + 10ml de


bouillon RVS bouillon MKTTn
Incubation 24±3h; Incubation 24±3h; 37±1°C
41.5±1°C

XLD Brillance Salmonella XLD Brillance Salmonella


Isolement

Incubation 24±3h; Incubation 24±3h; Incubation 24±3h; Incubation 24±3h;


37±1°C 37±1°C 37±1°C 37±1°C

**

Nutrient agar
Incubation 24±2h; 37±1°C
Confirmation

Si galerie API
20E et test
d’agglutination
positifs Galerie API 20E
Tests d’agglutination
Incubation 18-24 h; 37±1°C

Détermination du sérotype
et si d’application du phagotype
et de l’antibiorésistance à l’ISP

* Pour les swabs : + 100ml d’eau peptonée tamponnée


** 1 colonie typique d’un des milieux et si celle-ci n’est pas confirmée, confirmation
sur 4 colonies supplémentaires

37
2.1.3.6.3 Schéma d’analyse –Détection des Salmonella spp. (Méthode PCR)
Annexe : Schéma d’analyse – Détection des Salmonella sp p. (méth ode PCR)
Prise d’e ssai
x g ou ml
+
9 x ml d’e au peptonéetamponnée *
Incubati on 21+/-1h; 37+/-1 C

100 µ l + 100 µl de réactif de lyse


Prévoir un éch. blan co (100 µl d’ eau stéri le)
Vortexer
Incubatio n 10 mi n.à 95-100 C
Vortexer
Centrifuger 2’ à 1 0000-12000 rpm
*** ***

45 µl de Mix PCR par puits **


R
C
+ 5 µl du surnageant
P Scelle r les pui ts
Scree ning par PCR

0 ,1ml de culture + 10ml de boui llon 1ml de cu ltu re + 10ml de bouil lon
RVS MKTTn
Incubation 24+/-3h ; 41,5+/-1 C Incubati on 24 +/-3 h; 37+/-1 C

XLD Bri llia nce Sa lmo nella XLD Brill iance Salmonel la
Incubatio n 24 3h; Incubati on 24 3h; Incubatio n 24 3h; Incubati on 24 3h;
37+/-1 C 37+/-1 C 3 7+/-1 C 37+/-1 C

****
Si galeri e API 20 E
et tes ts
d’ agglu tinati on
pos it ifs Nutrien tagar
Incubati on 24+/-2h; 37+/-1 C

Galerie API 20E


Incubation 18+/-3h; 37+/-1 C Tests d’ agglutination

Détermin atio n du sérotype et si d’appl icati on du phagetype et


de l’antibi orési stance à l’ISP

* Pour le s sw abs : + 100 m l d ’eau p ept on ée t am pon né e


* * Prép ar atio n d u M ix PCR : réa ctif C ( solu tion d’am plific atio n) + r éac tif B (so nd es fluo re sce nte s) . À pr épa re r en fo nctio n
du no mb re d ’éch an tillon s à a naly ser et des co ntr ôles à eff ect ue r (1 con tr ôle p ositif et 1 con trô le né gat if par
sér ie)
* ** Si PC R po sitive
* ** * 1 colo nie ty piqu e d’u n d es m ilieux et si c elle- ci n ’est p as con firm ée , con firm ati on su r 4 c olon ies su pplé m ent air es

38
2.1.3.7 Listeria monocytogenes

De très nombreuses denrées peuvent être contaminées par L. monocytogenes : végétaux, lait et
produits laitiers, carcasses de volailles, viandes de porc, viande de bovins, viande d’ovins, produits
carnés, poissons et produits dérivés, coquillages et crustacés . Mais un aliment contaminé n’est pas
toujours dangereux. Des résultats de dénombrement ont montré que la plupart des cas de listériose
humaine sont dus à un aliment contaminé avec plus de 100 L. monocytogenes par gramme ou
millilitre. Les produits les plus sensibles sont ceux qui peuvent favoriser la croissance de Listeria, qui
ont une durée de vie longue et qui peuvent être consommés sans être chauffés. Un des principaux
problèmes rencontrés avec L. monocytogenes est sa capacité de se développer à des températures
avoisinant 0°C.

2.1.3.7.1 Analyse

Recherche de L. monocytogenes ( ISO 11290-2 : 1998 partie 1) :

o prélever une quantité d'échantillon, transférer dans un milieu liquide avec une
concentration réduite en composants sélectifs (Half Fraser Broth) et homogénéiser,

o pré-enrichissement semi-sélectif en incubant à 30°C pendant 24 heures,

o enrichissement secondaire, transfert de 0,1 ml de la culture d’enrichissement primaire


dans un bouillon sélectif avec concentration complète en agents sélectifs (Fraser) et
incubation 48 heures à 37°C

o isolement, étalement à l’aide d’une anse de la culture d’enrichissement primaire et


secondaire sur un milieu gélosé selon OTTAVIANI AGOSTI (ALOA), incubation 24 heures
à 37°C
o si l'on observe sur ALOA des colonies avec l'apparence typique de L. monocytogenes (1-
2 mm de grandeur, de couleur bleu clair et avec un halo clair) alors confirmation,
étalement sur une gélose Tryptone Soja Yeast Agar (TSYEA) des colonies
caractéristiques, incubation 24 heures à 37°C. On effectue ensuite un test d’hemolyse, un
test de Camp et un certain nombre de tests biochimiques (la galerie API) pour confirmer
que l'organisme observé est effectivement bien L. monocytogenes.

Dénombrement de L. monocytogenes ( ISO 11290-2 : 1998 partie 2) :

o prélever une quantité d'échantillon, transférer dans de l'eau peptonée tamponnée et


homogénéiser,

o incuber pendant une heure à 20°C pour donner le temps aux organismes stressés de
récupérer,

o ensemencement en surface de 1 ml de la dilution réparti sur 3 boîtes de milieu d'isolation


sélectif (ALOA), 0,1 ml de la dilution sur 1 boîte et incuber pendant 48 heures à 37°C,
o compter le nombre de colonies sur aloa avec l'apparence typique de L. monocytogenes
(1-2 mm de grandeur, de couleur bleu clair et avec un halo clair). Si l'on observe ce type
de colonies, effectuer alors la phase de confirmation en prélevant quelques colonies
typiques, en les repiquant sur Tryptone Soy Yeast Extract Agar (TSYEA), et en incubant
pendant 24 à 37°C, et ensuite réaliser un test d’hémolyse, un test de Camp et un certain

39
nombre de tests biochimiques (la galerie API) afin de confirmer que l'organisme observé
est effectivement bien L. monocytogenes.
o s'il est confirmé que les colonies prélevées sont effectivement des L. monocytogenes,
calculer alors le nombre de cfu à partir du nombre compté de colonies, en tenant compte
des dilutions réalisées.
Recherche de L. monocytogenes par la méthode VIDAS (Vidas LMO2 – validé AFNOR n°BIO-12/11-
03/04) :
o prélever une quantité d'échantillon, transférer dans un milieu liquide avec une
concentration réduite en composants sélectifs (Half Fraser Broth) et homogénéiser,

o pré-enrichissement semi-sélectif en incubant à 30°C pendant 24 heures,

o enrichissement secondaire, transfert de 0,1 ml de la culture d’enrichissement primaire


dans un bouillon sélectif avec concentration complète en agents sélectifs (Fraser) et
incubation 48 heures à 37°C

o Test immuno-enzymatique permettant la détection d’antigènes de Listeria monocytogenes


grâce au système automatisé Vidas

o Confirmation des résultats positifs par ensemencement d’une gélose ALOA et d’une
gélose RAPID’L. Mono (RLM)

Figure 2.1.11 : Tubes de bouillon Fraser et Fraser demi

Figure 2.1.12 : Boîte de milieu ALOA

40
2.1.3.7.2 Schéma d’analyse – Dénombrement des Listeria monocytogenes

41
2.1.3.7.3 Schéma d’analyse – Détection des Listeria monocytogenes par la méthode Vidas

Annexe: Schéma d’analyse – Détection des Listeria monocytogenes par la méthode Vidas
Pré-enrichement

Prise d’essai x g (of ml)

+ 9x ml bouillon demi-Fraser

Incubation 24-26h; 30±1°C


Enrichement

0.1 ml + 10 ml de bouillon Fraser


Incubation 24-26h; 37±1°C

500 µl dans les barrettes Vidas LM02


Screening

Screening par Vidas Si Vidas


positif

Etalement d’une öse de bouillon Fraser sur ALOA et


RLM
Confirmation

Incubation 24±2h; 37±1°C

Si une des deux


géloses est positive

Sérotypage à l’ISP

Tableau d’interprétation

Résultat VIDAS Résultat ALOA Résultat RLM Interprétation

- Absence

+ + + Présence

+ + - Présence

+ - + Présence

+ - - Absence

42
2.1.3.8 E. coli O150 :H7

Parmi les E. coli, il existe des souches qui produisent une cytotoxine particulière, la vérotoxine ou
vérocytoxine (VTEC). Mais tous les VTEC ne sont pas pathogènes pour l’homme. Le sérotype le plus
fréquent et le plus pathogène est O157 :H7 ou E. coli enterohémorragique. Le code O157:H7 renvoie
à des antigènes spécifiques sur la paroi cellulaire et le flagelle de la bactérie. Comme les autres E.
coli, il s’agit d’une bactérie fécale. Elle se transmet par la nourriture contaminée, la viande
principalement d’origine bovine, le lait cru et d’autres aliments (sandwichs, pomme de terre, jus de
pomme, . . .) et par l’eau (eau de distribution, mais surtout eau de baignade), surtout des denrées
traitées thermiquement ou insuffisamment cuites.

2.1.3.8.1 Analyse

Recherche de E. coli O157:H7 :

o prélever une quantité d'échantillon, transférer dans le milieu d’enrichissement liquide


Tryptone Soy Broth (TSB) et homogénéiser,

o pré-enrichir en incubant à 41,5°C pendant 7 heures,

o enrichissement secondaire, transfert de 1 ml de la culture d’enrichissement primaire dans


un bouillon Mac Conkey (CT-MAC) avec antibiotiques, incubation 18 heures à 37°C
o ensuite on peut soit effectuer un test ELISA à partir du milieu sélectif CT-MAC (détection
immunologique de O157:H7, VIDAS), on effectue en cas de résultat positif une
immunoconcentration pour obtenir une concentration plus élevée en cellules de E. coli
O157:H7, soit on effectue directement depuis CT-MAC une concentration avec des billes
immunomagnétiques dans le même but,

o isolement, étalement à l’aide d’une anse de milieu d’enrichissement concentré sur une
gélose CT-SMAC (CT-MAC avec ajout de sorbitol) et sur un milieu chromogène et incuber
24 heures à 37°C

o si on observe sur CT-SMAC ou sur le milieu chromogène des colonies avec l'apparence
typique (incolore, parfois brunâtre, diamètre > 1 mm sur CT-SMAC, pourpre, diamètre > 1
mm sur milieu chromogène), effectuer alors la phase de confirmation en prélevant
quelques colonies typiques, les repiquer sur Nutrient Agar, incuber pendant 24 heures à
37°C, et ensuite effectuer un certain nombre de tests biochimiques (la galerie API, test
d'agglutination) afin de confirmer que l'organisme observé est effectivement E. coli
O157:H7.

43
Figure 2.1.13 : Boîte de milieu CT-SMAC

44
2.1.3.8.2 Schéma d’analyse - Détection de E. coli O157 par la méthode Vidas

Prise d’essai
x g (ou ml) *
+
9x ml mTSB (acriflavine of
novobiocine)
Incubation 6-7h; 41.5 1 C

t
n
e 1ml de culture
m +
e
ss
i 9ml CT-MAC
h
icr Incubation 18 1h; 37 1 C
n
E

1 ml de culture
15min; 100°C

g Si Vidas positif
in
n 500µl dans une barrette Vidas ECO
e
re
c
Screening par Vidas
S

500µl dans une barrette Vidas ICE


Immuno-concentration par Vidas

CT-SMAC CHROMagar O157


Incubation 21 3h; 37 1 C Incubation 21 3h; 37 1 C

** Nutrient-agar **
24 2h; 37 1 C

Test de confirmation API 20E Si API positi f


Incubation 18-24 h; 37 1 C

Si l’ agglu tinat ion est positive


Test
d’agglutination

Détermination du facteur de virulence par AZ-VUB

* Pour les swabs: + 100m l m-TSB (novobi ocine)


** 1 colonie t ypi que d’ un des milieux et si celle-ci n’est pas conf irmée, conf irmation sur 4 colonies suppl ément aires

45
2.1.3.9 Campylobacter

La présence de Campylobacter dans les aliments indique une contamination fécale car l’habitat de ce
germe se limite au tube digestif des hommes et des animaux . La contamination se fait par contact
des aliments avec des personnes malades ou porteuses. Les produits laitiers, les volailles et, dans
une moindre mesure les viandes, sont les aliments les plus propices aux campylobactérioses. Les
principales causes de toxi-infection alimentaires dues à Campylobacter proviennent de la
consommation de denrées crues ou insuffisamment cuites et par contamination croisée. Cependant il
n’est pas rare que, dans les pays en voie de développement, des épidémies soient dues à l’ingestion
d’eau contaminée.

2.1.3.9.1 Analyse

Recherche de Campylobacter (ISO 10272-1:2006) :

o prélever une quantité d'échantillon, transférer dans un milieu liquide sélectif (Bolton Broth) et
homogénéiser. Eliminer autant que possible l'air du sac avec le milieu d’enrichissement
inoculé (conditions micro-aérophiles).

o première étape du pré-enrichissement en incubant à 37°C pendant 4 à 6 heures,

o deuxième étape du pré-enrichissement en incubant à 41,5°C pendant 44 heures,


o isolement à partir du pré-enrichissement vers deux milieux agar différents : mCCDA (modified
charcoal cefoperazone deoxycholaat agar) et un agar chromogène en étalant à l'aide d'une
oese, suivie par une incubation dans des conditions micro-aérophiles pendant 44 heures à
41,5°C.
o si l'on observe sur les plaques des colonies avec l'apparence typique de Campylobacter (gris,
plat, humide avec tendance à s'étendre sur mCCDA, petit, rouge foncé à rouge-orange,
parfois avec un reflet métallique sur agar chromogène), effectuer alors la phase de
confirmation en prélevant quelques colonies typiques, repiquer sur l'agar au sang Columbia et
incuber dans des conditions micro-aérophiles pendant 24 à 48 heures à 41,5°C.
o effectuer les tests de confirmation sur les colonies gris foncé typiques sur l'agar au sang
Columbia : analyse microscopique, test de mobilité, test de croissance à 25 °C (micro-
aérophile) et à 41,5 °C (aérobie) et un test oxydase. Réaliser un certain nombre de tests
biochimiques (la galerie API) afin de confirmer que l'organisme observé est effectivement bien
Campylobacter.

Dénombrement de Campylobacter (ISO 10272-2 : 2006) :

o prélever une quantité d'échantillon, transférer dans l’eau peptonée tamponnée et


homogénéiser

o ensemencement en surface de 1 ml de la dilution reparti sur 3 boîtes de milieu d'isolation


sélectif (mCCDA), 0,1 ml de la dilution sur 1 boîte et incuber pendant 44 heures à 41°C

o Dénombrement des colonies suspectes.


o Confirmation des colonies suspectes par examen microscopique (morphologie et mobilité
caractéristiques), croissance sur gélose au sang Columbia en atmosphère micro-aérobie
à 25±1°C et en atmosphère aérobie à 44.5±1°C, test de l’oxydase

46
Figure 2.1.14 : Boîte de milieu Columbia

47
2.1.3.9.2 Schéma d’analyse - Détection de Campylobacter spp.

Prise d’essai x g (o u ml)


+
9x ml de bo uillon Bolton *
Incubation 4-6h; 37+/-1 C
Incub atio n 44+/-4h; 41 .5+/-1 C
En atmosphère microa érobie

Gélose mCCDA Gélose Campyfood ID)


Incubation 44+/-4h; 41.5+/- Incubation 24-48h; 41.5+/-1 C
1 C En atmosp hère microaérobie
En atmosphère microa érobie
** **

Gélose a u sang Columbia


Incuba tio n 24-48h; 4 1.5+/-1 C
En atmosphère microa érobie

1ml de Bouillon Brucella n


io
t
a
m
fir s
n tif
o
c is
Microscopie e o
d p
Morpholo gie et mobilité st
se
ti
S

Oxydase Gélose au sang Columbia Gélo se au sang Col umbi a


Incub ati on 44 +/-4h; 4 1.5+/-1 C Incuba tio n 44+/-4h; 25 +/-1 C
En atmosphère aérobie En a tmosphère microaérobi e

Dé termination d e l’ antib iorésistance à l’ISP

* Pour les swabs: + 100ml de bouillon Bolton


**1 colonie typique d’un des milieux et si celle-ci n’est pas conf irmée, confirmation sur 4 colonies supplément aires

48
2.1.3.9.3 Schéma d’analyse - Dénombrement de Campylobacter spp.

P rise d’essai x g (ou ml)


+
9x m l d’eaupeptonée tamponnée

E ns emencement en s urfac e du milieu m CCDA


(1ml réparti sur 3 boît es et 0.1 m l sur une boîte)
Inc ubat ion 44±4h; 41.5±1 C
En atm osphère mic roaérobie

Dénom brement des colonies s uspect es

Gélose au sang Columbia


I nc ubat ion 24-48h; 41.5±1 C
En at mosphère mic roaérobie

1m l de Bouillon Brucella
n
io
t
a
m
rfi
n ifs
Microsc opie co its
Morphologie et mobilité e o
d p
ts
s
e
ti
S

Oxy das e Gélos e au sang Colum bia Gélose au s ang Columbia


Incubation 44±4h; 41.5 ±1 C Inc ubation 44±4h; 25±1 C
E n atmosphère aérobie En at mosphère microaérobie

Dét ermination de l’antibiorés ist ance à l’ISP

* Sélectio nner 5 colo nies susp ectes o u tou tes le s colonie s si < 5

49
2.1.3.10 Bacillus cereus

Bacillus cereus est une bactérie que l’on retrouve surtout dans le sol. Elle va donc contaminer les
aliments lorsque ceux-ci sont souillés par de la terre. Ainsi on la retrouve fréquemment en faible
concentration dans les aliments crus, séchés et transformés. Mais elle n’est dangereuse pour
5
l’homme qu’à des doses supérieures à 10 germes par gramme d’aliment. Les aliments les plus
sensibles sont le riz, les salades ou purée de pomme de terre, les salades de légumes, les épices, les
céréales etc.

2.1.3.10.1 Analyse

Dénombrement de Bacillus cereus (ISO 7932:2004) :

o prélever une quantité d'échantillon, transférer dans du diluant et homogénéiser,


o préparer les dilutions décimales,

o ensemencement en surface avec un étaleur de 0.1 ml d’échantillon ou de dilution d’un


milieu sélectif solide au Mannintol egg Yolk Polymyxin Agar (MYP) et incubation 18 à 24
heures à 30°C

o compter le nombre de colonies typiques sur les plaques contenant l'agar MYP (grandes
colonies roses entourées d’une zone de précipitation). Si l'on observe ce type de
colonies, effectuer alors la phase de confirmation à l'aide d'un test d’hémolyse : prélever
quelques colonies typiques, effectuer une inoculation en stries sur l'agar au sang et
incuber pendant 24 heures à 30°C. Une zone claire autour de la colonie témoigne de
l'hémolyse.
o s'il est confirmé que les colonies prélevées sont effectivement B. cereus, compter alors le
nombre de cfu à partir du nombre compté de colonies, en tenant compte des dilutions
réalisées.

Figure 2.1.15 : Boîte de milieu MYP

50
2.1.3.10.2 Schéma d’analyse - Dénombrement des Bacillus cereus présomptifs

Echantillon liquide
Préparation de l’échantillon

ou suspension mère
(prise d’essai de x g ou x ml
dans 9x ml de diluant)

Dilutions décimales dans du tryptone sel


Incubation

Ensemecement en surface du milieu MYP agar avec 0.1ml


Incubation 18-24h; 30±1°C *
Dénombement

Dénombrement des colonies suspectes

**
Confirmation

Gélose au sang de mouton


Incubation 18-24h; 30±1°C

* Si aucune colonie typique, les boîtes sont incubées 24h supplémentaires


** Prélèvement de 5 colonies ou toutes les colonies si < 5

51
2.1.4 Méthode TEMPO

2.1.4.1 Généralités

La méthode TEMPO est une méthode de dénombrement des microorganismes automatisée.


Elle est basée
o sur la technique du nombre le plus probable (NPP),
mais alors que la technique NPP classique demande l’ensemencement de 3 ou 5 tubes de 3
dilutions successives, la carte TEMPO permet l’analyse de 16 microtubes de 3 dilutions
successives.
o sur la mesure de l’apparition ou de la disparition de la fluorescence.

Cette méthode a fait l’objet d’une validation AFNOR suivant la norme ISO 16140 pour le
dénombrement de la flore mésophile aérobie totale, des staphylocoques coagulase positive, des
Escherichia coli et des entérobactéries dans
da les denrées alimentaires.

Limites d’utilisation de la méthode :


La méthode n’est pas applicable pour les échantillons trop colorés (épices, cacao, …), la couleur
pouvant cacher la fluorescence et donc donner un résultat erroné.
Elle n’est pas indiquée non plus pour les échantillons présentant une activité enzymatique ou
contenant des substances inhibitrices.

2.1.4.2 Principe

Des indicateurs de pH fluorescents sont présents dans les milieux de croissance. Deux principes sont
appliqués suivant l’analyse effectuée.
effec

2.1.4.2.1 Disparition de la fluorescence

Dans le cas des staphylocoques et des entérobactéries, la molécule indicatrice de pH est la 4- 4


méthylumbelliférone (4MU) (Fig gure 2.1.16).
). Cette molécule est fluorescente à pH ≥ 7 et perd sa
fluorescence lorsque le pH est inférieur ou égal à 6.
Lors de la croissance des bactéries recherchées, le métabolisme des glucides des microorganismes
provoque une acidification du milieu et donc une disparition de la fluorescence.

Figure 2.1.16
2.1. : Molécule de 4-méthylumbelliférone

52
2.1.4.2.2 Apparition de la fluorescence

En ce qui concerne le dénombrement des Escherichia coli et de la flore mésophile aérobie totale, la
4-méthylumbelliféryl-β-D-glucuronide,
glucuronide, molécule non fluorescente, est présente dans le milieu. Si elle
sont présentes, la croissance des bactéries recherchées va libérer de la β-glucuronidase.
glucuronidase. Celle-ci
Celle va
provoquer la dissociation de la 4-méthylumbelliféryl-β-D-glucuronide
4 glucuronide en une molécule non
fluorescente (β-D-glucuronide)
glucuronide) et une molécule fluorescente (4MU) (fig.
( 2.1.4.2)

Figure 2.1.17 : Apparition de la fluorescence suite à l’activité enzymatique bactérienne

2.1.4.3 Appareillage

Matériel spécifique nécessaire à l’application de la méthode :

- Flacons de milieux déshydratés spécifiques à chaque microorganisme (Figure.


( 2.1. a)
2.1.18
- Dispensettes d’eau stérile
- Cartes de dilutions spécifiques à chaque microorganisme (Figure.
( 2.1.18 b)
- Automate TEMPO filler + PC (F Figure. 2.1.18 c)
- Automate TEMPO reader + PC (Figure.
( 2.1.18 d)

Le TEMPO filler remplit et scelle les cartes. Un processus de mise sous vide puis une augmentation
de la pression dans l’appareil vont provoquer l’aspiration de la suspension (4ml) et sa répartition dans
les 3 séries de 16 tubes miniaturisés.

Dans la première série, chaque tube reçoit 225µl de l’échantillon,


l’échantillon, dans la deuxième, 22,5µl et dans la
troisième, 2,25µl.

Le TEMPO filler va ensuite sceller hermétiquement la carte pour éliminer tout risque de contamination
extérieure.

53
Figure 2.1.18 a: Flacons de milieux déshydratés Figure 2.1.18 b: Cartes de dilution
(EB : Entérobactéries, EC : Escherichia coli)

Figure 2.1.18 c: Poste de préparation : TEMPO Filler (à droite) avec les dispensettes au centre, les
cartes et les flacons correspondants sur l’étagère.

Le TEMPO reader lit les cartes grâce à une caméra sous lumière UV. Un scanner relève le code
barre présent sur la carte et établit la connexion entre le numéro de l’échantillon, la dilution et le
microorganisme recherché.

54
Figure 2.1.19: Poste de lecture : TEMPO reader ( à droite).

2.1.5 Recherche des Escherichia coli shigatoxines positives (STEC)

2.1.5.1 Généralités

Les Escherichia coli producteurs de shigatoxines (STEC) représentent toutes les souches de E. coli
possédant les gènes stx codant pour une shigatoxine ou vérotoxine (ces E. coli sont aussi
dénommées VTEC).
Les souches STEC les plus dangereuses font partie du groupe des EHEC (E. coli
entérohémorragiques). Ces souches ont les mêmes caractéristiques cliniques et épidémiologiques
que les E. coli O157 :H7 et possèdent les mêmes facteurs de virulence.
La complication la plus grave des infections à EHEC est le syndrome hémolytique et urémique (SHU).

Les souches qui ont été clairement associées aux formes les plus sévères d’affection, comme le
SHU, appartiennent aux sérogroupes O157, O26, O103, O111 et O145. En plus d’un gène stx, ces
souches possèdent le gène eae codant pour l’intimine. Elles font partie du groupe de STEC
provoquant des lésions d’attachement et d’effacement.
2.1.5.1.1
Toutefois, il est nécessaire de considérer toutes les souches STEC comme pathogènes pour
l’Homme dans la mesure où toutes peuvent être à l’origine d’affections sévères selon le risque
associé à la présentation de la denrée alimentaire (prête à être consommée ou bien destinée à être
consommée après un traitement technologique (pasteurisation, cuisson, …) et selon l’état de santé
du consommateur.

2.1.5.2 Analyse

La méthode de recherche des STEC décrite dans la norme ISO 13136 est basée sur la réaction de
polymérisation en chaîne en temps réel (RT-PCR).

55
2.1.5.3 Expression des résultats

o Échantillons négatifs pour les gènes stx : non détection de souche STEC dans la prise
d’essai de x g ou x ml

Si aucune souche STEC n’est isolée à partir des échantillons positifs pour la présence de gènes stx
en criblage PCR:

o Échantillons positifs pour les gènes stx : détection présumée de souches STEC dans la
prise d’essai de x g ou x ml.

o Échantillons positifs pour les gènes stx et le gène eae : détection présumée de souches
STEC provoquant des lésions d’attachement et d’effacement dans la prise d’essai de x g ou x
ml.

Échantillons positifs pour les gènes stx et le gène eae ainsi que pour les gènes associés à
l’un des sérogroupes O26, O103, O111, O145 et O157 : détection présumée de souches
STEC du sérogroupe XX dans la prise d’essai de x g ou x ml.

Si une souche STEC est isolée à partir des échantillons positifs pour la présence de gènes stx en
criblage PCR et confirme la suspicion.

o Souches d’E. coli isolées positives pour les gènes stx : présence de souches STEC dans
la prise d’essai de x g ou x ml.

o Souches d’E. coli isolées positives pour les gènes stx et le gène eae : présence de
souches STEC provoquant des lésions d’attachement et d’effacement dans la prise d’essai
de x g ou x ml.

o Souches d’E. coli isolées positives pour les gènes stx et le gène eae ainsi que pour les
gènes associés à l’un des sérogroupes O26, O103, O111, O145 et O157 : présence de
souches STEC du sérogroupe XX dans la prise d’essai de x g ou x ml.

56
2.1.5.4 Schéma d’analyse – Recherche des E. coli shigatoxines positives par RT-PCR

Prise d’essai x g (ou ml)


+
Préparation de
l’échantillon

9x ml EPT*
(+ acriflavine (10mg/l) pour les produits laitiers)
Viande crue de bœuf : Incubation 10 ± 2h; 41.5 ± 1°C
Autres produits : Incubation 18 ± 2h; 37 ± 1°C

Produits laitiers Autres produits


Viande crue de boeuf

Transférer 1ml de culture dans


un microtube stérile
Centrifuger 5’ à 500g ± 50g à
température ambiante
Préparation de la PCR

Transférer 900µl du surnageant Transférer 50µl de culture dans


dans un tube de lyse un tube de lyse
Centrifuger 5’ à 10000g ± 250g
à température ambiante

Eliminer le surnageant
Suspendre le culot dans 200µl
de tampon de dilution

Lyse :
10’ à 100°C

Analyse RT-PCR
RT-PCR

En cas de résultat positif pour un gène stx :


- effectuer l’analyse RT-PCR pour sérotypage moléculaire.(détection
présumée) – disque EHEC
- envoyer un aliquot du milieu enrichi envoyé au laboratoire de
confirmation

*Pour les swabs + 100ml EPT

57
2.2 PHYTOPATHOLOGIE

Les plantes font partie intégrante de notre écosystème terrestre. Eléments indispensables au
maintien de l’équilibre conditionnant la vie telle que nous la connaissons, les plantes sont aussi un
maillon crucial dans la chaîne alimentaire et leur (non-)disponibilité a des répercussions importantes
sur notre société humaine, notamment sur les plans de l’économie et de la santé publique. S’assurer
de la bonne santé des plantes représente un enjeu capital. Pour ce faire, une surveillance rigoureuse
et bien organisée est de mise, afin de limiter la propagation des dégâts en cas de problème. Cette
surveillance implique la connaissance des organismes phytopathogènes et la disponibilité de
méthodes d’analyse pour poser un diagnostic.

Dans le premier chapitre qui suit, les grandes catégories d’organismes phytopathogènes sont
présentées, tandis que les méthodes d’analyses actuelles sont développées dans le chapitre deux.
Enfin, quelques exemples d’application en laboratoire sont brièvement présentés dans le chapitre
trois.

2.2.1 Les organismes phytopathogènes

Les maladies des plantes résultent de perturbations causées par des facteurs non-vivants ou vivants.

Dans la première catégorie, il s’agit par exemple de modifications non adaptées de la température, du
taux d’humidité, de la luminosité, des sels minéraux, etc. Ces facteurs sont en général facilement
maîtrisables dans le cadre du suivi des cultures.

Dans la deuxième catégorie, il s’agit d’organismes dits « phytopathogènes ». Il en existe différents


types, généralement associés aux ensembles taxonomiques suivants : bactéries et mollicutes,
champignons, nématodes, insectes et autres arthropodes, virus et viroïdes.

o Les bactéries et mollicutes : ces organismes appartiennent au groupe des procaryotes, ç-à-
d. Dépourvus de noyau cellulaire. Les bactéries possèdent une paroi rigide tandis que les
mollicutes (littéralement « peau molle ») en sont dépourvus. Parmi les mollicutes, on
distingue les phytoplasmes (= mycoplasmes pathogènes de plantes) et les spiroplasmes (=
mollicutes spiralés). L’absence de paroi chez ces dernières leur confère une sensibilité
diminuée aux antibiotiques, mais une plus grande fragilité, notamment par rapport à la
pression osmotique.

Les bactéries ont une taille tournant autour de 1-2 µm tandis que les mollicutes les plus petits
mesurent 0,1 µm. Le génome des mollicutes est également de taille inférieure.
Dans la classification taxonomique de ces organismes interviennent les notions de pathovar
et de race. La pathovar (pv.) Est, au sein d’une espèce, un groupe montrant une spécificité
parasitaire vis-à-vis d’un type de plante donnée, par exemple Pseudomonas syringae pv.
Tabaci. La race ou biotype est, au sein d’un pathovar, un groupe qui n’attaque que des
cultivars donnés d’une espèce végétale. On parlera aussi de biovars quand la classification
repose sur des différences d’activité métabolique.
Les microorganismes ont une capacité importante de survie dans divers milieux (terre, eau,
plantes-réservoir,…), sont facilement propagés (y compris par l’air et les insectes) et
colonisent extrêmement vite les tissus végétaux d’intérêt.

58
Les maladies causées par les bactéries sont variées, comme par exemple des galles (genre
Agrobacterium) (figure 2.2.1a), des pourritures (ex. Ralstonia solanacearum responsable de
la pourriture brune de la pomme de terre), des flétrissements (ex. Clavibacter michiganensis
sur tomate) ou encore des nécroses (ex. Pseudomonas syringae pv. Phaseolicola sur
haricot).
Les phytoplasmes se localisent presqu’exclusivement dans les cellules du phloème (figure
2.2.1b) et affectent l’appareil reproducteur et végétatif des plantes, causant nanisme,
jaunisse, « balais de sorcières » (croissance anarchique), déformation des fruits, etc. les
spiroplasmes parasites sont moins bien connus, seules deux maladies sont décrites, dont le
nanisme du maïs. Les mollicutes sont transmis par les insectes et difficiles (si pas impossible)
à cultiver en conditions artificielles.

Figure 2.2.1a : Photo de gauche : bactéries Agrobacterium tumefaciens vues au microscope


électronique à balayage. Photo de droite : tumeurs induites par A. tumefaciens sur plante.

Figure 2.2.1b : Photo de gauche : phytoplasmes (flèches) de la maladie du jaunissement de l’Aster à


balais de sorcière (Aster yellows Witches’broom ou AY-WB) observés au microscope électronique à
transmission dans une coupe de cellules (se1 et se2) du phloème (canaux conducteurs de la sève)
d’une feuille d’Aster. Barre d’échelle = 1µm. Photo de droite : Aster en bonne santé (gauche) et Aster
infecté par le phytoplasme AY-WB.

59
o Les champignons : il s’agit d’un groupe hétérogène d’eucaryotes (à noyau cellulaire)
dont le point commun est la nutrition hétérotrophe (« hétéro » autre et « trophe » nourriture)
par absorption. Près de la moitié des maladies des plantes sont causées par des
champignons phytopathogènes, parmi lesquels on dénombre plus de 10.000 espèces
connues. Leur taille va de quelques micromètres à plusieurs millimètres, voire centimètres.

La majorité des champignons a la possibilité de se reproduire tant de manière sexuée


qu’asexuée. Les spores sexuées représentent en général les sources d’inoculum primaire,
assurant le maintien de l’existence de la maladie. Les spores asexuées sont produites en
grand nombre pour la dispersion de la maladie.

Trois grand groupes peuvent être considérés :


• les champignons à plasmode (cellule amiboïde polynuclée dépourvue de paroi) :
parasites obligatoires des plantes supérieures, attaquant surtout les organes souterrains
et les tiges, et jouant un rôle en tant que vecteurs de virus. Exemple : Polymyxa betae,
vecteur du virus de la rhizomanie de la betterave (Figure 2.2.2 – photo de gauche).
• les champignons à thalle filamenteux coenocytique (c-à-d. mycelium non cloisonné) :
provoquent diverses maladies telles que des fontes de semis (pourritures des graines et
jeunes plantules), des pourritures racinaires sur plantes ligneuses ou herbacées, des
mildious (ex. Plasmopara viticola sur la vigne) (Figure 4.2.2 – photo du milieu), des
rouilles blanches. Ils attaquent aussi les parties aériennes des plantes.
• les champignons à thalle filamenteux septé ou « champignons vrais »: causent une
multitude de maladies telles que des déformations d’organes (ex. Taphrina deformans
causant la cloque du pêcher), des oïdiums (dépôt blanchâtre à la surface de l’hôte), des
chancres (ulcères entraînant la réduction de croissance voire la mort), des attaques sur
fruits (ex. Claviceps purpurea ou ergot de seigle, tavelures du poirier,…), des maladies
vasculaires avec flétrissements, des rouilles (pustules sur feuilles et tiges) ou encore des
charbons (ex. Tilletia causant la carie du blé) (Figure 4.2.2 – photo de droite).

Figure 2.2.2 : Photo de gauche : Rhizomanie de la betterave causée par un virus transmis par le
champignon Polymyxa betae. Photo du milieu : attaque d’une vigne par le mildiou Plasmopara
viticola. Photo de droite : maladie de la carie du blé causée par Tilletia indica.

60
o Les nématodes : appellés aussi « vers ronds », ces eucaryotes forment un groupe assez
homogène quant à leur morphologie - à savoir d’apparence vermiforme comprise entre 0,2 et
12 millimètres (pour les phytopathogènes) (figure 3 – photo de gauche) avec une épaisse
cuticule - mais hétérogène quant au mode de vie. Ils peuvent vivre dans le sol, l’eau, ou
encore parasiter des animaux ou des végétaux. Ils possèdent un tractus génital, et la
reproduction se fait via ponte d’œufs. Il existe différents stades juvéniles et un stade adulte,
entre lesquels se produisent des mues. Ils possèdent aussi un tractus digestif et certains sont
capables de « mordre » le tissu végétal à l’aide de dents ou d’un stylet afin d’y injecter des
enzymes digestives. D’autres entrent carrément dans les cellules de l’hôte. Par ailleurs, ils
possèdent une musculature permettant la mobilité. Ils ne possèdent pas de systèmes
circulatoire et respiratoire. Leur reconnaissance sur base visuelle nécessite un bon
entraînement.

Ils causent divers problèmes aux cultures, comme des problèmes de croissance (nanisme),
des diminutions de rendement, voire la mort. Ils sont aussi vecteurs d’autres maladies.
Parmi les nématodes les plus problématiques, on distingue notamment les nématodes à
kyste (ex. Globodera rostochiensis et Globodera pallida) et les nématodes à galles (ex.
Meloidogyne chitwoodi et Meloidogyne fallax).

Les kystes résultent de la transformation de la femelle après fécondation : la femelle meurt et


son corps constitue un sac rempli d’œufs (jusqu'à 1000!). Les kystes peuvent être visibles à
l’œil nu, sous forme de petites boules jaunes ou brunes localisées sur les racines (ex. Plants
de pomme de terre) ou dans le sol (figure 2.2.3 – photo du centre). Les kystes sont
extrêmement résistants, même à des températures basses, et ont une viabilité pouvant
atteindre 15-20 ans.

Les galles les galles apparaissent sur les racines et tiges souterraines (rhizomes ex.
Tubercules de pomme de terre), sous forme de bosses et protubérances (figure 2.2.3 – photo
de droite).

Figure 2.2.3: Photo de gauche: Nématodes du pin; la barre d'échelle représente 100 µm. Photo du
milieu: kystes de Globodera rostochiensis sur racines. Photo de droite: galle sur carotte provoquée
par Meloidogyne fallax.

61
o Les insectes et autres arthropodes : une grande diversité d'arthropodes est nuisible
aux végétaux, soit de manière directe, en tant que phytophages (ç-à-d. Qui mangent les
tissus végétaux) soit indirecte, en transmettant des maladies (par ex. Des virus et
bactéries phytopathogènes). Il peut aussi s'agir des deux à la fois.
Les phytophages peuvent s'attaquer à différents tissus: feuilles (phyllophages), tiges
(cauliphages), racines (radiciphages), boutons floraux et fleurs (floriphages), fruits
(frugiphages), bois (xylophages), etc. Leur appareil buccal est adapté à la fonction, par
exemple de type piqueur-suceur ou capable de mordre et broyer.

Tant les formes adultes que juvéniles sont susceptibles d'attaquer les plantes. Les larves
de papillons, appellées vulgairement chenilles, sont notamment des terribles ravageurs
de cultures.

Plusieurs ordres d'insectes sont phytopathogènes, citons par exemple les lépidoptères
(papillons et chenilles, ex. la teigne du bananier (figure 4.2.4 – photo du centre)), les
coléoptères (ex. le doryphore, le capricorne asiatique (figure 4.2.4 – photo de gauche)),
les orthoptères (ex. le criquet), les hémiptères homoptères (ex. le puceron, la cicadelle),
les hémiptères hétéroptères (ex. la punaise), les thysanoptères (ex. le thrips, appellé
aussi "bête d'orage"), les diptères (ex. la mouche du chou), les hyménoptères (ex. le
cynips du chataîgnier), etc.

Dans le groupe des arthropodes, à côté des insectes, on retrouve par exemple des
acariens nuisibles comme les tetranyques (ex. araignée rouge) (figure 4.2.4 – photo de
droite).

Le diagnostic passe au moins par une observation, de préférence au microscope, par du


personnel expérimenté.

Figure 2.2.4: Photo de gauche: Anoplophora ou Capricorne, insecte phytophage coléoptère. Photo du
centre: larve de Opogona sacchari ou teigne du bananier, insecte phytophage lépidoptère. Photo de
droite: Tetranychus urticae ou araignée rouge, acarien phytophage.

o Les virus et viroïdes : les virus sont des entités composées d'acides nucléiques (ADN
ou ARN) contenus dans une enveloppe de protéines appelée capside. Dans de rares cas,
la capside inclu en outre des lipides ou une enzyme arn polymérase. La taille des virus
phytopathogènes varie en moyenne de quelques dizaines à quelques centaines de
nanomètres, mais peut atteindre 2 µm pour les formes allongées. Dans ce dernier cas, on
parlera de formes filamenteuses; mais il existe aussi des formes isométriques (par ex. de
type hexagonale), des formes globuleuses, des formes de bâtonnets, etc. (figure 2.2.5a).

62
Les viroïdes sont structurellement plus simples que les virus, puisqu'ils sont constitués
exclusivement d'une molécule d'ARN circulaire de maximum 400 nucléotides. Leur
détection ne peut se faire que par des méthodes moléculaires (ex. PCR) et non par
observation au microscope comme c'est le cas pour les virus.

Virus et viroïdes sont des parasites intracellulaires obligatoires de cellules vivantes, dont
ils utilisent la machinerie métabolique (facteurs de réplication, transcription, traduction)
pour se multiplier.

Les virus et viroïdes se déplacent dans la plante soit en passant de cellule en cellule via
les plasmodesmes (canaux intercellulaires de communication entre cytoplasmes), soit sur
des plus longues distances via le phloème (canaux de circulation de la sève élaborée).
Pour faciliter le passage intercellulaire, les virus utilisent des protéines de mouvement,
qui polymérisent éventuellement en tubules. Le passage de plante à plante se fait soit par
transmission verticale (d'un plant mère à la descendance par multiplication végétative),
soit par transmission horizontale, ç-à-d. par contact au site d'une blessure, par greffe, par
l'intermédiaires de vecteurs comme des champignons, nématodes, acariens, insectes,
etc.

Les virus phytopathogènes sont classés dans cinq groupes, définis sur base du type
d'acide nucléique et des stratégies de réplication:
GROUPE 1 : VIRUS À ARN MONOCATÉNAIRE (= SIMPLE BRIN) MESSAGER (POSITIF +)
GROUPE 2 : VIRUS À ARN BICATÉNAIRE (= DOUBLE BRIN)
GROUPE 3 : VIRUS À ARN MONOCATÉNAIRE ANTIMESSAGER (NÉGATIF -)
GROUPE 4 : VIRUS À ADN MONOCATÉNAIRE
GROUPE 5 : VIRUS À ADN BICATÉNAIRE AVEC ARN INTERMÉDIAIRE.

La majorité des virus phytopathogènes se trouvent dans le groupe 1. A l'intérieur des cinq
groupes, des sous-classements (familles, genres, espèces, etc.) Prennent encore en
compte la morphologie, les propriétés du génome (nombre de produits codés,
homologies de séquences,…), les propriétés biologiques (type d'hôte, mode de
transmission,…) et les propriétés sérologiques (type de protéines).

Les viroïdes phytopathogènes sont classés dans deux groupes: les pospoviroidae
(contenant la majorité des viroïdes) et les avsunviroidae. L'infection virale touche soit des
organes précis de la plante (ex. système vasculaire) soit la plante entière. Les
symptômes – quand ils sont visibles - sont variés: comme des changements de couleur,
des malformations, des nécroses, etc.

Citons quelques exemples de virus et viroïdes:

• ALFALFA MOSAÏC VIRUS (AMV) (Figure 4.2.5a – photo de gauche), groupe des ARN
monocaténaires (+), famille des Bromoviridae, genre Alfamovirus, responsable de
maladies chez diverses plantes comme par exemple la mosaïque de la lucerne,
la nécrose de la pomme de terre et de la tomate (Figure 4.2.5b – photo de
gauche).
• CITRUS PSOROSIS VIRUS (CPSV), groupe des ARN monocaténaires (-), famille des
Ophioviridae, genre Ophiovirus, cause des dommages aux arbres du genre
Citrus, comme par exemple des crevasses de l'écorce du tronc des orangers
(Figure 4.2.5b – photo du centre) et des taches foliaires.

63
• TOMATO YELLOW LEAF CURL VIRUS (TYLCV), groupe des ADN monocaténaires, famille des
Geminiviridae, genre Begomovirus, responsable de la maladie des feuilles jaunes
en cuillère de la tomate, impliquant des déformations, des limitations de
croissance et des pertes de rendement en fruits.
• POTATO SPINDLE TUBER VIROID (PSTVD), groupe des viroïdes, attaque les tomates et
pommes de terre, donnant des plants rabougris, à croissance plus lente, des
tubercules déformés et plus petits (Figure 4.2.5b – photo de droite), une nécrose
ou une taille anormalement petite des feuilles, voire un dépérissement.

Figure 2.2.5a : Images de différents virus phytopathogènes, négativement colorés et observés au


microscope électronique à transmission, illustrant quelques morphologies possibles. Image de
gauche : Alfalfa mosaïc virus. Image du milieu : Tobacco mosaïc virus. Image de droite : Tomato
bushy stunt virus. Toutes les images résultent d’un agrandissement 300.000x.

Figure 2.2.5b: Photo de gauche: maladie du virus Alfalfa mosaïc sur plant de tomates. Photo du
centre: attaque de l'écorce d'un oranger par le virus Citrus psorosis. Photo de droite: tubercules de
pomme de terre de plants infectés par le Potato spindle tuber viroïd (partie gauche de la photo) dont
la taille est anormalement réduite comparé aux tubercules de plants sains (partie droite de la photo).

o Autres organismes phytopathogènes: mises à part les cinq catégories citées ci-
dessus, il existe encore d'autres organismes ennemis des plantes, marginaux ou peu
décrits.
Parmi ceux-ci, on retrouve des protozoaires (animaux unicellulaires) de type
trypanosomatides (même catégorie que le pathogène de la maladie du sommeil!), comme
par exemple les protozoaires laticifères causant des atrophies du manioc.
On trouve par ailleurs des plantes parasites d'autres plantes: il s'agit de plantes à fleurs
qui ont perdu leur autotrophie au cours de l'évolution, et qui détournent l'eau, les glucides
et sels minéraux de la plante-hôte à l'aide de structures aspirantes appelées suçoirs. Un
exemple connu est celui du gui (porte-bonheur sous lequel on s'embrasse
traditionnellement au nouvel-an!) Parasite de conifères.

64
2.2.2 Les méthodes d’analyse en phytopathologie

La première approche d’un végétal malade, lors de sa découverte, est avant tout visuelle.
L’apparence anormale ou le dépérissement de la plante ou de parties précises de celle-ci constitue
souvent le premier signal d’alerte de l’existence d’une pathologie. Des symptômes caractéristiques de
maladies bien connues, voire la présence sur le végétal de parasites clairement visibles, contribuent
plus ou moins fortement à l’orientation du diagnostic. Ceci concerne principalement les insectes, qui
laissent apparaître des indices plus ou moins flagrants, comme par exemple : attaque typique des
tiges, présence de larves sur graines, grosses masses blanches de cochenilles, déformation
caractéristique « en rosette » de l’extrêmité des pousses associée à la présence de miellat, mines
(galeries) dessinant des formes particulières sur les feuilles, anneau de tissu abîmé autour de l’apex
des fruits, pelotes fécales sur des galles, position spéciale du corps de l’insecte, etc.

Toutefois, un diagnostic certain et définitif, uniquement sur base visuelle des symptômes, n’est pas
toujours facile et fiable. La majorité des maladies chez les plantes entraînent des symptômes
généraux non caractéristiques (flétrissement, jaunissement, apparitions de taches, de duvet, de
reliefs, détérioration des tissus, limitation de la croissance, etc.) pouvant entraîner la confusion. Par
ailleurs, certaines pathologies ne laissent pas apparaître des symptômes facilement détectables, et
dans certains cas, les symptômes peuvent même être absents, par exemple pendant une phase de
latence (exemple : phase latente du feu bactérien sur poiriers en hiver). Ceci étant, des tests
approfondis en laboratoire s’imposent dans la plupart des cas.

En phytopathologie, les méthodes d’analyse actuelles sont diversifiées, et en développement continu.


A côté des méthodes simples et classiques, auquel on recourt encore aujourd’hui, des méthodes plus
sophistiquées sont adaptées ou développées à l’attention des phytopathologistes. Dans le premier
point qui suit, les principales méthodes classiques sont présentées, et dans le deuxième point,
quelques méthodes plus modernes ou en projet.

2.2.2.1 Méthodes classiques

2.2.2.1.1 Biotests sur plantes et phytopathogénicité

Parmi les méthodes de diagnostic en phytopathologie, un grand classique est le biotest sur plantes.
Des plantes indicatrices sont inoculées à partir d’un échantillon supposé contaminé par un pathogène
donné, et après une période d’incubation, les plantes sont analysées afin de déceler des symptômes
de maladie (Figure 6). L’observation peut se faire à l’œil nu, considérant l’état général de la plante, ou
bien par analyse microscopique des tissus végétaux, après traitement colorant, afin de mettre en
évidence des zones abîmées plus discrètes. Les plantes test peuvent aussi être utilisées pour
multiplier le supposé pathogène, et ensuite mettre en évidence sa présence avec plus d’aisance, en
l’isolant à partir des plantes après incubation. Des autres méthodes sont alors utilisées, comme
l’isolement sur milieu de culture et la PCR, notamment.

65
Figure 2.2.6 : Test de phytopathogénicité sur plants de vigne de cépage Cabernet Sauvignon. Dans le
bassin de gauche, des plants inoculés avec la moisissure Phaemonella chlamydospora, et dans le
bassin de droite, des plants contrôle, inoculés avec de l’eau stérile.

2.2.2.1.2 Tests nutritionnels

Le profil d’utilisation des nutriments, et plus précisément les sources de carbones, peut constituer un
indicateur de l’identité des microorganismes, en général pour les bactéries et champignons.
Actuellement, il existe des kits commerciaux pour obtenir plus ou moins rapidement (de quelques
heures à quelques jours) le « profil métabolique » d’un microorganisme étudié. Nous reprenons ici les
exemples des systèmes BIOLOG et des galeries API.

2.2.2.1.3 Morphologie sur milieu de culture

Quand cela est envisageable, c’est-à-dire pour les bactéries et les champignons, une des premières
manipulations qui s’impose naturellement est l’isolement et la multiplication du phytopathogène
d’intérêt en laboratoire. Il devient alors accessible en quantité illimitée, et peut être soumis à une
batterie de tests. L’isolement constitue déjà souvent en lui-même un test, car la vitesse de croissance
de l’organisme isolé et la morphologie qu’il laisse apparaître orientent plus ou moins fortement le
diagnostic. En effet, une variété de formes, couleurs, odeurs, textures, tailles, etc. existent au niveau
des bactéries et moisissures pathogènes des plantes.

Plusieurs renseignements peuvent être cumulés grâce à l’usage de différents milieux de culture ; il
existe des milieux non sélectifs, semi-sélectifs, totalement sélectifs…en fonction par exemple des
nutriments disponibles, ou encore de la présence d’un inhibiteur tel qu’un antibiotique auquel résiste
normalement l’organisme d’intérêt, etc. La production stimulée de molécules faciles à détecter,
comme par exemple des pigments, des fluorochromes ou des polysaccharides, est d’une aide
précieuse.

Cette méthode est en général facile à mettre en œuvre et abordable au niveau des prix. Par contre,
elle ne suffit pas toujours pour prononcer le diagnostic définitif.

66
2.2.2.1.4 Analyse visuelle à la loupe ou au microscope

Un autre analyse qui va de soi est l’observation directe de l’organisme, à l’œil nu, à la loupe ou au
microscope. L’observation à l’œil nu ou à la loupe concerne les insectes, nématodes et moisissures.
Les structures morphologiques sont passées au peigne fin, avec un souci du détail prononcé, car la
différence entre 2 espèces (ou autre niveau taxonomique) tient parfois à une caractéristique discrète
de la morphologie. Pour les insectes et les nématodes, des dessins et clefs de détermination sont
notamment disponibles dans la littérature. Un dissection sous microscope est envisageable, ou
encore un pré-traitement (fixation, coloration,…) pour faciliter l’analyse.

2.2.2.1.5 Analyse des acides nucléiques

Technologie mise au point dans les années 1980, la PCR pour « Polymerase Chain Reaction »
consiste à répliquer en un grand nombre de copies une séquence d’ADN ciblée, à l’aide d’une
enzyme ADN polymérase. Cette mise en évidence peut servir de preuve de la présence d’un
organisme pour lequel cette séquence d’ADN est spécifique, dans le contexte diagnostic.

La PCR est extrêmement populaire, voire la technique la plus utilisée actuellement en biologie
moléculaire. Elle est applicable à tous les vivants, dès lors qu’on dispose d’ADN ou d’ARN. C’est une
méthode sensible, car même une infime quantité d’ADN deviendra détectable après la réaction
d’amplification. C’est aussi une technique relativement rapide : en quelques heures, le résultat peut
être disponible. Au niveau du coût, cela reste raisonnable, dès lors qu’on a acheté le thermocycleur
(quelques milliers d’euros) et le matériel d’électrophorèse (quelques centaines à quelques milliers
d’euros). Les réactifs (enzymes, nucléotides) sont faciles à trouver dans le commerce. Les amorces
sont soit vendues pré-définies (par exemple sous forme de kit, pour l’amplification de tel gène chez tel
organsime), soit à définir au choix par le client, et synthétisées par une firme.

La PCR présente aussi quelques désavantages : beaucoup de protocoles nécessitent encore une
étape préliminaire d’extraction d’ADN à partir de l’organisme étudié, augmentant la durée
d’expérience, et faisant appel à des méthodes d’extraction pas toujours simples d’utilisation (par
exemple des techniques de purification de l’ADN faisant appel à des solvants délicats à manipuler
tels que le phénol, etc.). Une autre difficulté est qu’il faut en général connaître au moins partiellement
la séquence de la zone génomique que l’on souhaite amplifier, afin de définir les amorces de PCR,
alors que la séquence des génomes de tous les vivants n’est pas encore disponible. Un autre
problème potentiel, en raison de la sensibilité de la technique, est le risque de contamination ; en
effet, il suffit de l’introduction malencontreuse d’une toute petite quantité d’ADN dans le tube test pour
obtenir un faux positif. A l’inverse, la réaction PCR peut dans certains cas être inhibée par des
molécules non souhaitables dans le tube, comme par exemple des composés phénolés présents
dans les extraits de plantes sur lesquelles on cherche à mettre en évidence la présence d’un
organisme phytopathogène ; on obtient alors des résultats faussement négatifs. De mutiples
contrôles doivent donc être intégrés à une expérience de PCR.

Il est difficile de recenser tous les travaux dans la littérature ayant fait appel à la PCR, pour le
diagnostic des maladies des plantes. A titre indicatif, si l’on entre les mots clés « PCR » + « plant » +
« pathogen » dans un moteur de recheche tel que Pubmed (www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez), on
obtient 1272 références de publications.

67
La PCR est une méthode dont il est désormais difficile de se passer pour les diagnostics. Elle reste
encore à développer pour certains organismes phytopathogènes (y compris les nématodes et les
insectes), et connaît par ailleurs des améliorations extraordinaires (voir plus loin ‘Variantes de la
PCR’).

2.2.2.1.6 Analyse des protéines

Le contenu en protéines d’un individu est aussi une bonne source de renseignements pour
l’orientation du diagnostic. En principe, cette technique doit pouvoir s’appliquer à tous les
phytopathogènes.

Les protéines sont extraites et soumises à une analyse, généralement l’une des 2 suivantes:

o profil général des protéines totales après séparation par électrophorèse


o détection d’une activité enzymatique particulière

2.2.2.1.7 Méthodes chimiques et analyse des acides gras

A côté des méthodes moléculaires ciblant l’ADN et l’ARN, et les méthodes ciblant les protéines, il
existe des analyses chimiques, chromatographiques et spectroscopiques, ciblant des métabolites et
composés tels que des sucres, des lipides et acides gras et des molécules volatiles (pour ce dernier,
voir plus loin à propos du nez électronique).

2.2.2.1.8 Sérologie

Les techniques sérologiques sont assez fréquemment utilisées, en parallèle des techniques
moléculaires. Elles sont toutes basées sur l’utilisation d’anticorps dirigés contre des antigènes
spécifiques du phytopathogène recherché. Différentes méthodes existent, nous en décrivons trois ci-
après: séro-agglutination, ELISA et immunomarquage.

2.2.2.2 Méthodes modernes

2.2.2.2.1 Séquençage

Le génome déterminant l’identité de chaque organisme, la connaissance de celui-ci, sous forme de


séquences de nucléotides, pour chaque pathogène, est un atout majeur dans le domaine du
diagnostic des maladies, y compris les maladies des plantes. Dans ce contexte, le séquençage des
génomes amène 2 types d’informations, suite à un travail de comparaison des séquences
disponibles: d’une part, les éléments communs entre les différents génomes séquencés permettent
des rapprochement entre individus, c’est-à-dire le positionnement dans un arbre phylogénétique, et
d’autre part, la découverte de nouvelles séquences/mutations génomiques, uniques à un groupe
d’organismes donné, ouvrent la voie au développement d’outils moléculaires pour le diagnostic de
routine, comme par exemple la PCR.

68
2.2.2.2.2 Barcoding

L’idée ambitieuse du « barcoding » est d’attribuer à chaque vivant connu sur Terre un code-barre
unique, sous forme d’une ou plusieurs courtes séquences d’acides nucléiques, caractéristique(s) du
génome de cet individu, de la même manière que sont associés des code-barres numériques aux
produits du commerce ! En phytopathologie notamment, ces code-barres sont d’une grande utilité,
car ils facilite(ro)nt l’approche diagnostic, au niveau de l’utilisation des technologies moléculaires.

2.2.2.2.3 La technologie du nez électronique

Le nez électronique est un appareil qui contient différents senseurs capables de reconnaître diverses
molécules organiques volatiles à partir d’une mixture aromatique. Le signal de chaque senseur est
réceptionné et analysé de manière informatique via un réseau neural artificiel, transformé en
empreinte digitale, et la combinaison des différentes empreintes correspondant à la mixture donne un
profil ou « signature aromatique » qui est identifié par comparaison avec une banque de signatures
pré-encodées.

Ce type d’appareil n’est pas nouveau, mais son utilisation s’est jusqu’ici en général limitée aux
contrôles qualité dans le secteur alimentaire (vérification de la fraîcheur des aliments, recherche de
contaminations de la viande,…) ou médical (recherche de pathogènes dans des tissus humains
malades,…). L’idée d’utiliser cette machine comme outil diagnostic pour les maladies des plantes est
assez récente (Figure 2.2.7), illustrée par quelques publications ces dernières années.

Figure 2.2.7 : Exemple de montage d’un nez électronique sur le terrain dans le cadre d’une analyse
en phytopathologie.

69
2.2.2.2.4 Microarrays (Puces à ADN) en tant que nouvel outil de diagnostic

La technique des microarrays est basée sur un principe d’hybridation entre des séquences d’acides
nucléiques complémentaires. Ces séquences sont, d’une part, des brins d’ADN greffés de manière
régulière sur une lame de verre, tous différents et correspondant à des régions génomiques variées
d’un organisme d’intérêt, représentant si possible tous ensemble le génome complet de l’organisme,
et d’autre part, des brins d’ADN libres, auxquels on a volontairement greffé des molécule d’un
fluorochrome.

2.2.2.2.5 Analyse du point isoélectrique : capillary isoelectric focusing

La technique de capillary isoelectric focusing (CIEF) consiste à séparer des éléments sur base de
leur point isoélectrique, en les faisant migrer dans un capillaire de silice (de l’ordre de 100
micromètres de diamètre), dans lequel un gradient de pH est installé par l’application d’un courant
électrique sur une série d’ampholytes ayant des valeurs de point isoélectrique différentes (résultant
en un pH acide à l’anode et basique à la cathode). Le principe est que la substance s’arrête de migrer
dès que sa charge globale est nulle, ce qui se produit à un pH donné. L’élément étudié peut être par
exemple une protéine mais aussi une bactérie intacte !

2.2.2.2.6 Variante des tests en sérologie : Lateral Flow Device

Les tests sérologiques ont prouvé leur efficacité en matière de diagnostic, et restent parmi les favoris.
Dès lors, ils n’échappent pas à la tendance actuelle, orientée vers la mise au point de tests toujours
de plus en plus simples et rapides, avec le maintien dans la mesure du possible d’un bon niveau de
sensibilité et de spécificité. Nous décrivons ici un test ultra-simple tentant de répondre à ces critères :
le Lateral Flow Device ou « LFD ».

Littéralement, il s’agit d’un dispositif à flux latéral, se présentant sous 2 formes possibles : soit la
tigette, soit le dispositif type « test de grossesse ».

2.2.2.2.7 Variantes de la PCR

A côté de la PCR classique (voir supra), inspirées du principe de cette technologie, des variantes
existent désormais, développées en vue d’améliorer des critères capitaux comme la sensibilité, la
spécificité, la rapidité, la facilité, etc. Ci-après, nous décrivons quelques-unes de ces méthodes.

2.2.2.2.8 Analyses acoustiques

Une nouvelle méthode originale récemment proposée est la reconnaissance d’insectes xylophages
directement sur les lieux suspectés contaminés, via l’écoute des bruits produits par ces pathogènes,
dont la signature est caractéristique pour chaque type d’organisme donné. Ces bruits peuvent résulter
des mouvements de l’insecte, ou encore des morsures de celui-ci dans le bois.

70
2.2.2.2.9 Imagerie satellite

Le principe de cette méthode est de surveiller par imagerie satellite à haute définition l’état des
plantations et forêts du globe. En effet, certaines maladies entraînent des symtpômes potentiellement
détectables à partir d’un point d’observation suffisamment éloigné pour avoir une vue d’ensemble :
par exemple, le nématode des pins entraîne un brunissement général assez rapide (environ 3 mois)
des forêts infectées. Par ailleurs, le spectre infrarouge (réflectance) émis par la végétation se modifie
en cas de maladie. Le développement de cette méthode est en projet au Royaume-Uni (Rutherford
Appleton Laboratory).

2.2.3 Exemples d’application dans le contexte AFSCA

Au niveau de l'AFSCA, les phytopathogènes contrôlés sont ceux de quarantaine, qui sont désignés
"paramètres phytosanitaires". Il s'agit d'organismes dont il faut à tout prix éviter l'introduction sur le
territoire, ou au pire limiter la dissémination et tenter d'éradiquer les foyers, car ils représentent une
grande menace pour les cultures et plantations.

Chaque année, la liste est revue (par la DG politique de contrôle) et commentée par le Laboratoire
National de référence. Pour l'année 2012, 41 paramètres précis ont été fixés pour des recherches
ciblées, ainsi que des listes génériques de bactéries, virus, champignons, nématodes et insectes pour
des recherches plus générales face à tout végétal malade, notamment lorsqu'ils sont importés.

Citons quelques exemples de paramètres appartenant à la liste des cibles:

o Champignons: Claviceps purpurea (ergot de seigle) sur céréales, Guignardia citricarpa


sur citrus, Phytophtora kernoviae sur plantes de type Rhododendron,…

o Bactéries: Ralstonia solanacearum sur pomme de terre, plantes et eaux de surface,


Erwinia amylovora sur rosacées, Xanthomonas fragariae sur fraisiers,…

o Phytoplasmes: Apple proliferation mycoplasm sur plantes notamment de type pommier et


poirier, Pear decline mycoplasm sur plantes telles que le poirier,…

o Virus: Plum pox virus (Sharka) sur arbres fruitiers à noyau type prunus, Pepino mosaïc
virus sur tomates et autres plantes, Tomato spotted wilt virus sur tomates et autres
plantes,…

o Viroïdes: tous viroïdes du groupe des Pospiviroïdes


o Nématodes: Globodera spp. sur terre, Meloidogyne chitwoodi sur pommes de terre et
autres plantes, Ditylenchus dipsaci (parasite de plants d'oignons) sur terre,…

o Insectes: Anoplophora chinensis (Capricorne asiatique) sur plantes et bois, Diabrotica


virgifera virgifera (Coléoptère chrysomèle des racines du maïs) dans les pièges à
phéromones, Opogona sacchari (lépidoptère teigne du bananier),…

Toutes les analyses sont réparties dans 5 laboratoires:

2 LABO'S EXTERNES FORMANT LE LNR maladies des plantes:


o l'ILVO situé à Merelbeke: toutes catégories de phytopathogènes

o le CRA-W situé à Gembloux: virus, viroïdes, champignons et phytoplasmes

71
1 LABO EXTERNE SUPPLEMENTAIRE:
o le BLGG situé aux Pays-Bas (à partir de 2009): pour les nématodes et une moisissure de
plants d'oignons

2 LABO'S INTERNES:
o le LFSAM: pour les nématodes dorés Globodera spp.

o le LFSAGx: pour la bactérie du feu bactérien Erwinia amylovora et les pourritures brune
(Ralstonia solanacearum) et annulaire (Clavibacter michiganensis sepedonicus) de la
pomme de terre.

Les méthodes utilisées dans les différents laboratoires varient selon le type d'organisme: on retrouve
par exemple beaucoup d'analyses microscopiques pour les insectes et les nématodes, beaucoup de
PCR ou RT-PCR pour la virologie et la mycologie, de la culture sur milieu pour la mycologie et la
bactériologie, etc. Ainsi, les techniques dites "classiques" sont encore beaucoup utilisées
actuellement, même pour des organismes de quarantaine.

72
2.3 PCR et OGM

2.3.1 Fondements de la biologie

2.3.1.1 La cellule

Nous constatons que pratiquement tous les êtres vivants sont constitués d’une ou de plusieurs
cellules (les virus peuvent dans ce contexte être considérés comme des parasites extrêmes). Ces
cellules possèdent toutes une structure fondamentalement identique et utilisent des molécules assez
analogues pour remplir des fonctions dans la cellule.

D’une manière plus précise, nous pouvons partager les cellules en deux grands groupes sur base de
la structure interne :
• La cellule procaryote : le type de cellule le plus simple qui a été découvert chez les
microorganismes des groupes Eubactéries et Archéobactéries. La cellule procaryote ne
possède pas de structure interne (il y a des exceptions telles que les cyanobactéries) et peut
être plus simplement représentée comme une membrane cellulaire, avec à l’intérieur, du
cytoplasme, un agglomérat de molécules qui assurent les processus de la vie (« une poche
de molécules »). Il y a parfois présence de structures externes (flagelles,…).

• La cellule eucaryote : une cellule avec une structure beaucoup plus complexe qui a été
découverte chez les unicellulaires (Protistes), les levures et moisissures (Fungi), les plantes
(Plantae) et les animaux (Animalia). La cellule eucaryote possède une structure interne
complexe : la cellule se compose d’une membrane avec à l’intérieur un cytosquelette avec du
cytoplasme; ici se retrouvent des organites qui remplissent des fonctions définies. Les
organites les plus importants sont : le noyau cellulaire, les mitochondries, les chloroplastes
(chez les plantes), l’appareil de Golgi, les lysosomes, les vacuoles,... Des processus
déterminés de la vie prennent place dans des compartiments déterminés : production
d’énergie dans les mitochondries, excrétion dans l’appareil de Golgi, dégradation dans les
lysosomes, information génétique dans le noyau cellulaire, photosynthèse dans les
chloroplastes, contrôle osmotique dans les vacuoles...

Figure 2.3.1 Une cellule de bactérie

73
Figure 2.3.2 Les deux types de cellules eucaryotes

Pour leur structure et leur fonctionnement, les cellules utilisent un nombre limité de molécules de
base. Les plus importantes de ces molécules sont les acides aminés, les sucres, les acides gras et
les nucleotides.

2.3.1.2 Acides aminés et protéines

Les protéines sont des molécules complexes constituées d’une chaîne d’acides aminés. Etant donné
que les acides aminés se différencient par leurs propriétés chimiques, les propriétés des protéines
avec une chaîne constituée de suites d’acides aminés différents se différencieront par leurs
propriétés. Ainsi, la seule différence de suite d’acides aminés fait qu’il existe un nombre quasi indéfini
de protéines ayant des propriétés différentes.

Les acides aminés sont des molécules dont la


structure de base peut être représentée comme
dans la figure. Dans la figure, R est un chaîne
latérale qui diffère d’acide aminé à acide aminé,
ce groupe détermine des propriétés telles que la
polarité (groupements hydrophiles ou hydrophobes),
propriétés acide/base, caractéristiques aromatiques,
taille dans l’espace etc. Dans la nature, on trouve
une vingtaine d’acides aminés « universels » qui
sont utilisés par chaque type de cellule.

Le squelette de l’acide aminé a la structure H2N –


CH(R) – COOH. Cette structure contient un groupement amine et un groupement carboxyle.

Entre 2 acides aminés, le groupement amine de l’un peut réagir avec le groupement carboxyle de
l’autre et former ainsi un liaison peptidique :

74
Figure 2.3.3 : Formation d’une liaison peptidique

Pareille réaction peut se répéter jusqu’à ce que nous obtenions de cette manière une longue chaîne
d’acides aminés: un polypeptide.

Les protéines diffèrent l’une de l’autre par la succession d’acides aminés : on appelle cette suite la
structure primaire.

Des parties de la chaîne peuvent prendre une structure dans l’espace : la plupart du temps une hélice
ou une structure en feuillet plissé. C’est la structure secondaire de la protéine.

Cette structure secondaire peut également se replier d’une manière analogue en une structure
tertiaire. C’est la structure la plus importante chez les enzymes parce que c’est dans la structure
tertiaire que se forme le centre actif, siège des réactions chimiques.

Dans certains cas, le plus souvent en présence de structure complexe de protéines, différentes
protéines peuvent se rassembler et former une structure quaternaire. Un exemple connu est
l’hémoglobine qui est constituée de 4 unités : 2x une protéine alpha-hémoglobine et 2x une protéine
beta- hémoglobine.

75
Figure 2.3.4 : Aperçu des différents niveaux de structure chez les protéines

2.3.1.3 Nucléotides et acides nucléiques

Les nucléotides sont les matériaux de construction de l’ARN, de l’ADN et de quelques molécules
stockant / fournissant de l’énergie (ATP).

Les nucléotides sont constitués de 3 composants :

 une base se présentant sous 5 formes universelles différentes : Adénine (A), Cytosine (C),
Guanine (G), Thymine (T) et Uracile (U),

 un sucre, se présentant dans la nature sous 2 formes différentes : Ribose en Désoxyribose,

76
 1 à 3 groupements phosphate (mono, di et tri).

Un nucléotide est issu de la combinaison d’une base avec un sucre, à laquelle un ou plusieurs
groupements phosphate sont liés.

Les nucléotides sont les éléments de construction des acides nucléiques qui sont des molécules
linéaires constituées d’une chaîne dont les maillons sont des nucléotides. Tout comme 2 acides
aminés sont reliés par une liaison peptidique, le groupement phosphate d’un nucléotide peut former
une liaison avec un groupement sucre d’un autre nucléotide et former une liaison sucre-phosphate.

Un acide nucléique est une chaîne de nucléotides qui se compose donc d’un squelette sucre-
phosphate avec des bases comme chaînes latérales. Et comme chez les protéines, c’est ici aussi la
succession des bases qui est caractéristique pour un acide nucléique. Cette succession de bases
contient les informations pour le pilotage de la cellule (contrôle, production des protéines,…) ; les
acides nucléiques sont donc les porteurs d’information dans la cellule.

77
Figure 2.3.5 : Représentation schématique d’une chaîne d’acides nucléiques.

En fonction du type de sucre et des nucléotides présents, nous pouvons distinguer deux types
d’acides nucléiques:

o ARN – acide ribonucléique. Ici se retrouvent seulement les bases A, C, G et U (donc pas
T) et le sucre ribose. Une molécule arn se présente comme un simple brin; dans les
longues chaînes des interactions entre des parties déterminées peuvent apparaître et
L’ARN peut prendre une forme dans l’espace. Dans la cellule, 3 types d’ARN sont
présents:

ARNm (ARN messager), une longue chaîne qui est utilisée pour la synthèse des
protéines (voir plus loin),
ARNt (ARN de tranfert) qui est utilisé pour le transfert des acides aminés pendant la
synthèse des protéines, et
ARNr (ARN ribosomial), ARN qui fait partie des ribosomes, des complexes de
protéines où se réalise la synthèse des protéines.

o ADN – acide désoxyribonucléique. Ici sont présentes seulement les bases A, C, G et T


(donc pas U) et le sucre est le désoxyribose. L’ADN se présente la plupart du temps
comme une molécule à double brin qui est constituée de 2 chaînes complémentaires
l’une à l’autre :
• Les bases peuvent former des liaisons hydrogène comme chaînes latérales avec
d’autres bases. Seulement 2 paires stables peuvent être formées : A avec T (2
liaisons hydrogène) et C avec G (3 liaisons hydrogène).
• Cela signifie que 2 chaînes ADN complémentaires (chaînes dont une base A dans
une chaîne correspond à une base T dans l’autre chaîne et une base C à une
base G) peuvent former une double chaîne stable par appariement des bases.
• La structure spatiale d’une double chaîne est une double hélice : 2 simples brins
s’enroulent l’un sur l’autre.

• Une double hélice A 2 sillons: un grand et un petit.


• Une des conséquences de la formation de la double hélice fait que L’ADN est
plus stable que L’ARN; cela fait de L’ADN le porteur idéal de l’information dans la
cellule.

78
Figure 2.3.6 : Structure schématique d’une double hélice ADN (gauche) et la structure dans l’espace
correspondante (droite)

Figure 2.3.7 : Représentation simplifiée avec des lettres d’une chaîne d’ADN. Remarquez la
complémentarité des bases.

Un aspect important des chaînes d’acides nucléiques est la polarité, un terme qui permet de
comprendre les différences chimiques entre les extrémités des chaînes. Un morceau d’acide
nucléique comporte 2 extrémités : une tête en position 5’ et un début en 3’ (voir Figure 4.3.6). Dans la
double hélice de l’ADN, la polarité des 2 brins est opposée : un brin va de 5’ vers 3’ tandis que le brin
complémentaire va de 3’ vers 5’. Cette polarité est très importante pour la lecture d’un brin !

79
2.3.1.4 ADN et gènes

La fonction de l’acide nucléique dans la cellule est double :


o l’ADN est l’archive qui contient l’information pour le pilotage de la cellule (archive
permanente),
o l’ARN est le porteur d’information pour la fabrication des protéines ( temporaire – après
chaque utilisation, est à nouveau détruit et recyclé).

Le principe général est le suivant : l’information de l’ADN est copiée vers l’ARN ( produit dans le
noyau des eucaryotes), après quoi l’ARN est lu par les ribosomes pour la synthèse des protéines :

ADN => ARN => protéine.

L’étape ADN => ARN est la transcription, l’étape ARN => protéine est la traduction.

Figure 2.3.8 : Schéma de la transformation de l’information ADN en protéine

L’ADN contient l’information pour la fabrication des protéines; chaque unité (succession de bases)
dans l’ ADN qui contient toute l’information pour une protéine est un ‘gène’ . La totalité de tous les
gènes dans la cellule est le ‘génome’.

Un gène contient :
Toutes les informations pour déterminer la succession d’acides aminés d’une protéine,
L’information pour le contrôle de la synthèse des protéines.

Chez les eucaryotes, l’ADN contient, à côté des parties ‘codantes’ effectivement utilisées pour
l’information, des parties non-codantes qui sont souvent des fossiles moléculaires issus de l’histoire
de l’évolution de l’espèce (pseudogène, ‘junk’ADN,...).

80
La structure générale d’un gène est constitué (voir la figure) :

De séquences de contrôle :
O au début : le promoteur, une séquence qui détermine où le gène commence ; il est le
point de départ pour la transcription de l’ADN vers l’ ARN,
O à la fin : le terminateur, une séquence qui indique où le gène se termine ; il doit donc
stopper la transcription vers l’ARN.

Entre le promoteur et le terminateur : la séquence qui doit être transposée en ARN et qui détermine la
succession d’acides aminés pour la fabrication d’une protéine.

La plupart du temps, on constate aussi la présence d’éléments-contrôle supplémentaires qui pilotent


la transcription; par exemple, des gènes qui codent pour une protéine qui peut bloquer un promoteur,
etc. Ces éléments secondaires peuvent se retrouver sur l’ADN parfois loin du gène à contrôler. La
fonction de cela est surtout de veiller que les gènes soient seulement lus quand c’est nécessaire ;
d’autre part, construire en continu une protéine qui est déjà présente en suffisance dans la cellule, ou
qui n’est pas vraiment nécessaire à ce moment là, constitue un gaspillage d’énergie et de matériaux.

Chez les eucaryotes, le gène est souvent plus long que l’ARN nécessaire pour la synthèse de la
protéine; après la transcription, l’ARN formé est découpé pour enlever les morceaux superflus
(‘splicing’) avant que la synthèse des protéines ne soit réalisée.

2.3.1.5 ADN, ARN et synthèse des protéines

La synthèse des protéines est une traduction d’une suite de bases dans l’ADN via l’ARN vers la
succession d’acides aminés d’une protéine.

Sont concernés par ce processus aussi bien l’ADN, les différentes sortes d’ARN que les protéines; le
processus de la synthèse des protéines se déroule dans les ribosomes ( ‘petite machine à protéines’):
O l’ADN est l’archive contenant l’information nécessaire et ne prend pas part elle-même
activement à la fabrication des protéines,

O l’ARN est directement concerné par la synthèse des protéines :


 ARNm : ARN messager amène l’information de l’ADN vers les ribosomes,
 ARNt : ARN transporteur porte les acides aminés vers les ribosomes. Il existe
différents ARNt qui diffèrent l’un de l’autre par la succession de 3 bases (‘le triplet’) ; à
chaque ARNt différent est lié un autre acide aminé,
 ARNr : ARN ribosomial est un composant essentiel des ribosomes.

81
Le processus de la synthèse des protéines se déroule comme suit (voir figure) :

 La première étape est la transcription : la fabrication de ARNm avec ADN comme matrice.
Cette étape commence avec
l’enzyme ARN-polymérase qui se lie
avec l ’ADN sur le promoteur du
gène. Il ouvre l’hélice jusqu’à ce que
les 2 brins d’ADN s’écartent l’un de
l’autre. Le polymérase fait une copie
complémentaire du gène en
fabriquant un brin d’ARNm.
Complémentaire signifie qu’ à
chaque A dans l’ADN correspond un
U dans l’ARNm, à chaque T un A, à
chaque C un G et à chaque G un C.
La transcription s’arrête lorsque l’
ARN-polymérase atteint le
terminateur, puis l’ARNm est libéré.

 La seconde étape est la traduction:


la fabrication d’une protéine avec
l’ARNm comme matrice. Cela se
produit sur/dans les ribosomes. L’ARNm est ‘aggripé par un ribosome, puis l’ARNm est lu
par groupes de trois bases. Pour chaque groupe de trois bases l’ARNt correspondant est
utilisé dont la molécule d’acide aminé est lié à la molécule d’acide aminé de l’ARNt précédent
par une liaison peptidique. De cette manière une nouvelle protéine est formée qui peut
ensuite se replier en une structure secondaire et tertiaire.

2.3.1.6 La réplication de l’ADN

Quand une cellule se divise, chaque cellule fille doit recevoir une copie identique de l’ADN de la
cellule-mère. Il est donc nécessaire que la cellule dispose d’un mécanisme pour faire une copie
exacte de l’ADN présent. Ce processus est appelé la réplication de l’ADN.

Le processus de réplication suit les étapes suivantes :


• les 2 brins étant enroulés en hélice dans l’ADN, ils doivent d’abord être « désenroulés » par
l’enzyme hélicase pour être accessibles à l’enzyme qui exécutera la copie. Une fourche de
réplication (qui se présente comme un Y) est formée où a lieu la réplication proprement dite.

82
Figure 2.3.9 : Le déroulement de l’hélice d’ADN par l’hélicase

• lorsque les deux brins ont été séparés, nous avons donc deux simples brins. Sur chacun
d’eux, un brin complémentaire peut être synthétisé par l’enzyme ADN-polymérase. Deux
problèmes se présentent :

1. L’ADN-polymérase ne peut prolonger qu’un brin complémentaire existant et le


processus ne peut pas commencer ‘de novo’. Ce problème est résolu par une autre
enzyme, la ‘primase’. Celle-ci synthétise, sur un brin d’ADN simple, une courte amorce
d’ARN : le ‘primer’ ou amorce. L’ADN-polymérase peut utiliser ce primer comme
séquence de départ et, à partir de là, prolonger la chaîne complémentaire.

Figure 2.3.10 : Synthèse de l’amorce ARN et son allongement par l’ADN-polymérase

83
2. Les brins d’ADN possèdent une polarité (voir ci-dessus) ; suite au désenroulement des
brins, nous obtenons donc deux simples brins avec une polarité inverse. La DNA-
polymérase ne peut effectuer l’élongation des brins que dans le sens 5’-> 3’ ce qui veut
dire que seul 1 des 2 brins pourrait être synthétisé. La solution est la synthèse du brin
complémentaire à l’autre chaîne par petits segments dans le sens inverse, ceux-ci seront
ensuite reliés entre eux. Ces segments sont appelés ‘fragments d’Okazaki’.

Figure 2.3.11 : Synthèse des fragments d’Okazaki

2.3.1.7 La cellule procaryote

Sur le plan génétique, le génome des procaryotes présente les caractéristiques suivantes :

o Il est circulaire : l’adn se présente sous forme d’un anneau. Il comprend les gènes
essentiels au fonctionnement de la cellule procaryote.

o Les gènes sont organisés en opérons :

 un opéron est une unité génétique dans laquelle les différents gènes remplissant une
même fonction (par exemple, une synthèse biochimique) se trouvent regroupés,
 le contrôle de l’expression de l’opéron entier est régi par une seule structure de
contrôle, ainsi, cette structure de contrôle maîtrise la fonction entière.
 l’exemple d’opéron le plus connu est le lac-operon des E. coli qui régule le
métabolisme du lactose. Cet opéron consiste en une séquence [Promoteur –
Opérateur – gènes de structure pour le métabolisme du lactose - Terminateur].
L’Opérateur est ‘l’interrupteur’ qui détermine l’expression de l’opéron et est à son tour
dirigé par la présence ou absence de lactose dans la cellule.

84
Figure 2.3.12 : Structure du lac-opéron

A côté des gènes essentiels se trouvant sur le génome circulaire, une cellule procaryote peut aussi
contenir des gènes isolés qui codent pour des caractéristiques non essentielles de la cellule et donc
qui, en principe, peuvent être absents. Ces gènes se trouvent également sur des segments d’ADN
circulaire et sont appelés plasmides. Leur nombre est variable dans la cellule ; ils se multiplient de
façon autonome, indépendamment du cycle de réplication du génome.

Quelques exemples de plasmides :


o plasmides avec les gènes de résistance aux antibiotiques (R-plasmides),

o plasmides avec les déterminants du sexe (F-plasmides) – ils jouent un rôle lors l’échange
de matériel génétique,
o les déterminants de la virulence chez les pathogènes (Salmonella,…)

Les plasmides expliquent pourquoi dans certains cas les souches bactériennes peuvent perdre leur
virulence (perte du plasmide) ou pourquoi d’autres organismes peuvent devenir très vite résistants
aux antibiotiques (échange entre organismes des plasmides responsables de la résistance).

Dans la nature, certaines espèces de procaryotes se rencontrent dans des conditions extrêmes. Elles
sont connues comme extrêmophiles et ont comme caractéristiques qu’elles peuvent croître et se
multiplier malgré des valeurs extrêmes de pH, concentration en sel, température, ions métalliques,
etc. Les thermophiles et les hyperthermophiles vivent à des températures allant jusqu’à 120°C. Elles
possèdent des protéines et des enzymes thermostables qui ne sont pas dénaturés à ces hautes
températures. L’ADN-polymérase est également thermostable.

Voici quelques procaryotes importants dont nous reparlerons par la suite :

o Thermus aquaticus (‘Taq’). Cet extrêmophile vit dans les sources d’eau chaude, ce qui
induit que les enzymes, y compris ceux qui sont impliqués dans la réplication de l’ADN,
sont toujours actifs à haute température (aux environs de 100°c). Ceci est
particulièrement important dans l’exécution de la technique PCR qui utilise une ADN-
polymérase thermostable (la ‘Taq-polymérase’),

o Agrobacterium tumefaciens. Il s’agit d’un pathogène des plantes qui provoque la


formation de galles sur les feuilles d’un grand groupe de plantes. Agrobacterium dispose
d’un mécanisme pour transférer un plasmide (le Ti-plasmide) dans la plante. Après quoi,

85
ce plasmide est intégré dans l’adn des cellules végétales. Un certain nombre de gènes
dans ce plasmide deviennent alors actifs et poussent la plante à produire des galles. En
outre, le plasmide contient aussi des gènes par lesquels la plante peut synthétiser des
acides aminés spéciaux (opines) utilisés comme source d’azote par Agrobacterium.
L’opine la plus importante chez A. tumefaciens est la nopaline ; l’enzyme servant à sa
synthèse est la nopaline synthase (NOS). Le gène codant pour nos est flanqué d’une
séquence promoteur (pNos) et d’une séquence terminateur (tNos). Par sa propriété
d’intégrer le Ti-plasmide dans l’ADN de la cellule végétale, ce plasmide est souvent utilisé
pour l’insertion de gènes étrangers dans les végétaux (modification génétiques, ingénierie
génétique).

Figure 2.3.13 : Le Ti-plasmide de A. tumefaciens. ori est le site de démarrage de la réplication, le T-


ADN est le fragment par lequel la plante est infectée (le reste du plasmide n’est pas transféré dans la
plante. Ce fragment contient des gènes tumoraux par lesquels la plante produit des galles, et des
gènes de synthèse de la nopaline. En outre, le plasmide contient également des gènes pour réaliser
l’infection de la plante avec le T-ADN et des gènes grâce auxquels A. tumefaciens commande le
métabolisme de la nopaline (une opine) par la plante.

2.3.1.8 Virus et phages

Les virus peuvent être considérés comme les parasites ultimes : ils sont entièrement dépendant du
mécanisme de réplication de l’hôte pour leur multiplication. Il y a des virus végétaux, des virus
animaux et des virus bactériens ou bactériophages (ou simplement phages).

En temps que parasites ultimes, leur structure est tellement simplifiée qu’elle ne comporte guère plus
que du matériel génétique, une enveloppe protéique, éventuellement une structure d’injection (surtout
chez les phages) pour introduire le matériel génétique dans l’hôte, et parfois une enveloppe
supplémentaire de glycoprotéines.

86
Figure 2.3.14 : Structure du virus de l’influenza (gauche) et d’un phage (droite)

Selon la nature du matériel génétique (celui-ci peut être de l’ADN ou de l’ARN et se présenter sous
forme monocaténaire ou bicaténaire) et la façon dont il est transcrit en ARNm (qui doit servir à la
synthèse des protéines pour la formation des nouveaux constituants viraux), les virus peuvent être
classés en plusieurs groupes différentes.

Un virus intéressant pour la suite, est le virus de la mosaïque du chou-fleur (CaMV, Cauliflower
Mosaic Virus) qui affecte les crucifères. Ce virus possède une enveloppe protéique dans laquelle se
trouve un ADN circulaire double brin. Cet ADN contient un promoteur (le promoteur 35S ou p35S) qui
est souvent utilisé dans les modifications génétiques.

2.3.1.9 La cellule eucaryote

L’organisation de l’ADN dans la cellule eucaryote présente des différences importantes avec celle
observée dans la cellule procaryote :

o l’ADN est concentré dans la noyau,

o l’ADN est scindé en chromosomes, complexes


d’ADN et de protéines de base (histone),

Figure 2.3.15 Structure d’un chromosome

o les différents gènes impliqués dans une même voie biochimique sont dispersés dans
l’ADN et peuvent même se trouver sur des chromosomes différents et il existe plusieurs
structures de contrôle,

87
o l’ADN contient beaucoup de régions non codantes (‘junk-DNA’), souvent au sein d’un
gène codant pour une protéine déterminée. Ces segments non codants contenus dans
les gènes sont appelés introns ; les segments codants étant appelés exons. Lors de la
transcription de L’ADN en ARN, les introns doivent être éliminés afin d’obtenir un brin de
ARNm entièrement codant. La synthèse des protéines chez les eucaryotes peut donc
être représentée comme ADN => pré-ARNm=> ARNm => protéines.

2.3.1.10 Relations

Nous pouvons classer les organismes terrestres en plusieurs grands groupes qui sont relatées parce
qu’ils ont un ancêtre commun. Ces relations évolutionnaires expliquent un certain nombre de
constatations :
o toute vie utilise les mêmes acides aminés,

o toute vie est basée sur l’ARN et l’ADN,

o toute vie utilise les mêmes principes pour la réplication, la transcription et la traduction.

Dans ce contexte, il n’est donc pas surprenant que l’échange d’éléments génétiques entre
organismes appartenant à des domaines très différents soit possibles.

2.3.2 PCR : Polymerase Chain Reaction

2.3.2.1 Le problème analytique

Supposons que nous voulions détecter la présence d’un gène donné, ou de manière plus générale
une séquence d’ADN donné dans une cellule. Nous nous heurtons alors à trois problème :

O la séquence cible ne repésente qu’une très petite partie de l’ensemble de l’ADN présent,
O le nombre de copies de cette séquence est généralement très faible, parfois il n’y a
qu’une copie présente dans la cellule, ce qui rend la détection impossible et

O on recherche une aiguille dans une bote de foin : comment pouvons nous différencier la
séquence ciblée du reste de l’ADN ?

Nous avons donc à faire à un problème de basse concentration et à un manque de spécificité.

La solution à ce problème est


o de chercher, d’une manière ou d’une autre, à multiplier la séquence cible de telle sorte
que sa concentration devienne suffisamment importante pour rendre une détection
possible

o et chercher que cette multiplication n’augmente que la séquence cible et pas le reste de
l’ADN. Nous avons donc besoin d’un moyen de multiplication sélectif.

88
2.3.2.2 La solution analytique : la PCR

La solution au problème posé consiste à utiliser pour la multiplication de la séquence cible le


processus naturel de multiplication de l’ADN, mais cela en fonction de nos objectifs. Cette technique,
connue sous le nom de PCR (Polymerase Chain Reaction ou Réaction en Chaine par
Polymérase) a été proposée par Kary Mullis qui a reçu le Prix Nobel en 1993.

Le point de départ pour la PCR est la réplication de l’ADN comme cela se passe dans la nature. Mais
pour réaliser ce processus in vitro, certaines modifications ont été apportées à ce schéma :

o la séparation des 2 brins n’est pas réalisée par l’hélicase mais par dénaturation: l’ADN
est réchauffé ou à haute température on passe de doubles brins d’ADN à des simples
brins d’ADN.
o les amorces ne sont pas synthétisées par la primase mais sont ajoutées ‘prêt à
l’emploi’ dans le tube à essai. Ceci est très important, car cela signifie que l’on peut de
cette manière avoir un contrôle sur la séquence de l’amorce – comme nous le verrons,
ceci est essentiel pour la PCR. En refroidissant les amorces présentes en solution vont
s’attacher sur les simples brins d’ADN aux emplacement complémentaires.

o le complexe amorce-ADN ainsi formé est le point de départ pour la fixation de l’ADN-
polymérase après quoi la polymérase procède à l’élongation à partir de l’amorce dans le
sens 5’=>3’ de telle sorte qu’un nouveau double brin d’ADN est formé.

Ce processus est présenté de manière schématique dans la figure suivante :

89
Le point le plus important de ce processus est que la réplication puet être répétée ! Lors de chaque
cycle pour lequel le processus complet est réalisé, l’ADN est multiplié depuis lámorce. Si on réalise
correctement de nombreux cycles - chaque cycle correspond alors à un doublement - alors la
concentration peut finalement être suffisamment haute pour être détectée.

Pour la PCR, il y de nombreux aspects qui doivent être pris en compte pour que les principes de la
PCR puissent être appliqués de manière judicieuse :

o l’ADN polymérase doit résister à la température de dénaturation de l’ADN (95°C). Une


polymérase thermostable peut être utilisée qui provient d’organisme thermophile.
Généralement on utilise la polymérase de Thermus aquaticus (Taq-polymérase).

o dans la solution les nucléotides individuels (A, T, C, G) doivent être présents, sans cela la
polymérase ne peut évidement pas remplir sa fonction. Les conditions doivent être
++ +
appropriées à l’activité de la polymérase, comme la force ionique, la présence de Mg , K
etc ,
o les amorces appropriées doivent être présents dans la solution. Les amorces sont cruciaux
car ils déterminent le point de départ depuis lequel le brin d’ADN complémentaire sera
allongé ; ils doivent aussi être complémentaire à la séquence de ce point de départ. Cela
signifie que lorsque l’on souhaite détecter une séquence donnée, les amorces doivent se
fixer dans le voisinage de la séquence cible. En pratique deux amorces sont utilisés : le

90
premier est complémentaire à une séquence proche du début du fragment choisi (‘forward
primer’, amorce sens) et un second complémentaire avec une séquence située à la fin
(‘reverse primer’, amorce anti-sens).

Schématiquement le principe est le suivant :

o On commence avec une solution contenant le simple brin d’ADN (après dénaturation), les
ions appropriés et les nucléotides, un primer et l’ADN-polymérase. Une séquence de départ
(start) est la région de l’ADN sur laquelle l’amorce complémentaire se fixe:

o durant le premier cycle, lors du refroidissement, l’amorce se lie à la séquence


complémentaire d’ADN et forme un petit double brin. La Taq-polymérase utilise ce petit
double brin comme point de départ pour l’élongation de la chaîne – cette élongation se
produit en principe jusqu’à la fin de la chaine. Il y a donc un double brin d’ADN qui
commence à l’amorce.
o lors de l’augmentation de la température les deux brins se séparent et le processus peut alors
se répéter.

91
o remarquez que dans cette exemple à chaque cycle une seule nouvelle chaine est formée.
Cela signifie que le nombre de chaînes nouvellement formées augmente peu à peu (1 par
cycle),

o chaque nouvelle chaine formée commence au primer et se termine là ou la polymérase


s’arrête. Ce qui signifie que la nouvelle chaine est généralement plus longue que la séquence
cible.

Cette méthode est donc peut efficace. Pour rendre le processus plus efficace, on ajoute une seconde
amorce, l’amorce anti-sens (reverse primer) :
o cette seconde amorce se lie à un brin complémentaire d’ADN à une place proche de la
fin de la séquence cible ,

o parce ce que cet amorce se liée à un brin complémentaire, l’élongation par la


polymérase se fait dans le sens 5’=> 3’ sur ce brin, c’est pourquoi l’élongation se fait
d’arrière en avant vu du premier brin. C’est la raison pour laquelle cette seconde amorce
est appelée ‘reverse primer (amorce anti-sens) tandis que l’amorce qui se lie au
premier brin est appelé ‘forward primer’ (amorce sens).

Avec l’utilisation de ces paires de primer le processus de la PCR devient plus efficace :

92
Avec l’utilisation d’une seconde amorce le premier cycle se déroule maintenant comme suit :

o dénaturation par réchauffement de la double hélice d’ADN en deux simples brins d’ADN,

o lors du refroidissement : liaison de l’amorce sens sur le premier brin du coté du début du
fragment cible et l’amorce anti-sens se lie sur le brin complémentaire du coté de la fin du
fragment cible.

o la Taq-polymérase allonge les deux chaines depuis chaque amorce dans le sens 5’ => 3’

o il y a à ce moment deux doubles brins partiels séparés formés à partir des deux brins
originaux (logeur complète) et deux nouveaux brins différents et plus courts qui commencent
chacun à un primer différent et qui ont des longueurs différentes.

Le seconde cycle se passe le manière suivante :

o lors du cycle de chauffage suivant, les doubles brins sont séparés, on obtient 4 brins uniques:
les 2 originaux complets et les 2 nouveaux plus courts,

o lors de la diminution de la température les amorces se lient à des sites complémentaires tant
sur les brins originaux que sur les nouveaux brins. notez que les amorces se lient "quelque
part au milieu" des chaines (voir figure),

o la Taq polymérase allonge les chaines depuis chaque amorce dans les 5 '=> 3',

o il ya maintenant un total de 8 brins:

 brins originaux de la longueur complète,


 brins 'plus courts’ nouvellement créés : 2 avec un de la longueur (théorique) qui va de
l'amorce ‘sens’ jusqu à la fin de la séquence d’origine et 2 brins avec une longueur
(théorique) qui va du début de la séquence d’origine jusqu’à l’amorce ‘anti-sens’
(complémentaire),
 brins courts dont la longueur est la distance entre les amorces ‘sens’ et ‘anti sens’
(indiquée par des flèches dans la figure).

93
Les brins courts d'ADN comprennent la séquence d’ADN recherchée ; idéalement, la longueur
de ces brins est exactement la même que celle de la séquence cible, mais dans la pratique elle peut
être un peu plus courte ou un peu plus longue (les amorces spécifiques pour le début et la fin de la
séquence cible peuvent par exemple ne pas être assez sélectif, ou le fragment peut être trop long
pour être correctement dupliqué).

Les fragment avec une longueur compris entre l’amorce ‘sens’ et l’amorce ‘anti sens’ est appelé
l’amplicon.

Lors de chaque cycle PCR ultérieur le nombre de brins augmente comme suit :

o il y a toujours deux nouveaux brins "plus courts",

o chaque brin ‘plus court’ est le modèle pour un nouveau brin court,
o chaque brin court est le modèle pour un nouveau brin court d’exactement la même longueur.
Cela signifie que lors de chaque cycle le nombre de brins courts est doublé.

94
Si on calcule le nombre de chaque sorte de brins pour chaque cycle, on obtient le tableau suivant :

Tableau 2.3.1 : ‘Long’ est le nombre de brins avec la longueur totale (= brin d’ADN original, il en reste
2 tout au long de l’analyse). ‘Plus court’ est le nombre de brins d’ADN avec une longueur allant
del’amorce jusqu’à la fin du brin original, ‘Court 1r duplex’ donne la multiplication exponentielle du
premier brin court (longueur allant de l’amorce ‘sens’ à l’amorce ‘anti sens’) et ‘Court Total’ le nombre
de brins courts présents lors du cycle (noter que lors de chaque cycle un nouveau duplex est formé)

Il ressort clairement de ce tableau que le nombre de brins courts augmente de façon exponentielle, si
bien qu'après une 15aine de cycles il y a déjà une augmentation par un facteur de 65 000. Cette
augmentation élevée de la concentration, qui en pratique peut être quantifiée sur base des courtes
chaines (=fragment cible), rend la détection possible. Cela peut être fait avec un détecteur UV (l’ADN
absorbe fortement à 260 nm), mais en pratique, on utilise des méthodes de fluorescence (voir ci-
dessous).

95
Lorsque la réaction est suivie par un instrument spécialement conçu pour cela (un thermocycleur
avec un détecteur en temps real (Real-Time), on obtient le graphique suivant :

On peut diviser chaque courbe de ce graphique en différente partie:

o d'abord une phase stationnaire (A): l'augmentation du nombre d’amplicons est trop petite
pour être détectée,
o ensuite une phase exponentielle (B): le nombre d'amplicons devient détectable et augmente
de façon exponentielle. La réaction se passe bien et l'augmentation est presque uniquement
liée à l'augmentation des courtes chaines.
o enfin, une phase de ralentissement (C) se terminant par un plateau (D): la réaction est
inhibée et l’augmentation n’est plus exponentielle. La raison de cette inhibition est
généralement que l’on arrive à court de certains réactifs (amorces et nucléotides).

L'augmentation exponentielle du nombre d'amplicons, peut être transformé en valeurs logarithmiques,


de cette manière la phase exponentielle est une ligne droite dans le graphique:

96
Pour un déroulement idéale de l’analyse, on obtient en logarithme base 10 une pente de 3,3 si on
travaille en logarithme base 2, la pente est d’exactement de 1,0.

2.3.2.3 Conditions pour la PCR

Pour la réalisation de la PCR, les éléments suivants doivent être pris en compte en ce qui concerne
les réactifs :
o la concentration de l'ADN matrice (= l’ADN de l'échantillon où le fragment cible doit être
détecté) ne doit pas être trop élevé, car cela peut interférer avec la détection et va
généralement de paire avec une concentration élevée en inhibiteurs,
o la polymérase utilisée

• elle doit résister à la température de dissociation de L'ADN (95°C),

• la Taq polymérase est généralement utilisée et supporte des cycles répétés de 95 ° C

• la Taq polymérase a une activité exonucléase 5 '=> 3' et peut donc décomposer la
séquence qu’elle rencontre en nucléotide.

• la Taq polymérase n'effectue pas de correction d'épreuves ( «relecture») de la copie


de synthèse et rend ainsi les erreurs relativement fréquentes dans la synthèse d'une
nouvelle chaîne (environ 1 erreur par 10 000 nucléotidiques). Cela signifie que, après
30 cycles, environ 50% des amplicons ont subis une ou plusieurs mutations!

o les amorces
• deux amorces sont nécessaires, une amorce « sens » et un « anti sens »,

• les amorces doivent avoir la séquence correcte : les amorces doivent être
développées en fonction du fragment cible et synthétisés sur commande. Conditions
pour avoir de bonnes amorces sont qu’ils doivent être uniques pour la séquence cible
du fragment (sélectivité), qu’ils n’ont pas des domaines complémentaires (risque de
formation des dimères entre eux) et qu’ils ne sont pas trop courtes. Généralement, on
choisi des amorces d’une longueur de 20 à 30 bases.

97
o Les nucléotides libres

• dA, dT, dC et dG doivent être présents en tant que blocs de construction pour les
nouvelles chaines,

• parfois dT est remplacé par du dU. On a alors un type de chaîne qui n’existe pas
dans la nature (ADN avec U au lieu de T). Pour la réalisation de la réaction cela n’a
pas d’importance, la Taq polymérase ne fait aucune distinction entre dT et dU et les
incorpore tous les deux dans la chaine en cours d’élongation. De plus, l'utilisation d'U
a un avantage ; en évitant la contamination par des produits de réaction d'une
analyse antérieure.

• la concentration idéale de nucléotides est d'environ 1mM.


o conditions de réaction
++ +
• dans le mélange réactionnel Mg et K doivent être présents,
++ ++
• Mg est ajouté sous forme de MgCl2 (ca. 2 mM) pour la Taq polymérase (Mg est
un cofacteur de la polymérase)
+
• la concentration idéale est de 50 mM pour le K , notamment pour la régulation de la
force ionique.
o absence d’inhibiteurs

• les inhibiteurs sont des composants qui peuvent ralentir la réaction. Les plus courants
sont des polysaccharides (matériel végétal!), l'éthanol et l'isopropanol (> 1%), le NaCl
(> 25 mM), d'EDTA (> 0,5 mm), SDS, phénol, ...

• La plupart de ces inhibiteurs sont malheureusement souvent utilisés dans l'une des
étapes de l'extraction de l'ADN ...

2.3.2.4 Détection

Il existe deux grands types de PCR: la PCR classique et la RT-PCR (Real time PCR, parfois aussi
appellé QRT-PCR pour PCR Quantitative en temps réel, ceci pour faire une distinction avec la
Reverse transcriptase PCR dont l’abréviation est aussi RT-PCR).

Via la PCR classique le résultat de l’analyse est connu après que l’analyse soit complètement
terminée: on analyse le mix de réaction a posteriori quant à la présence des produits de réaction.
C’est la plus ancienne forme de PCR qui est surtout utilisée actuellement quand on souhaite travailler
directement avec les produits issus de la réaction. La détection s’opère principalement par
électrophorèse au moyen de laquelle les produits sont séparés et identifiés de manière semi-
quantitative. L’électrophorèse permet aussi d’identifier la longueur des amplicons présents, ce qui
peut constituer une confirmation du fait que les produits engendrés par la réaction sont bien ceux que
l’on cherche.

Les désavantages de la PCR classique sont d’une part que le résultat de l’analyse n’est connu que
par la suite, et d’autre part qu’il faut un local indépendant à cause d’un risque élevé de contamination.

Via la RT-PCR on a déjà un suivi de la réaction pendant son déroulement, de telle manière qu’on a
déjà une idée du résultat avant que l’analyse ne soit terminée. A cet effet, un certain nombre

98
d’adaptations a été apporté (par rapport à la PCR classique) qui rend la détection possible en direct. Il
existe deux systèmes de base pour la détection pendant la RT-PCR :

o détection non-spécifique par la formation d’un complexe-ADN fluorescent,

o détection spécifique via un produit de dégradation qui est formé pendant l’élongation de
l’ADN. Il existe plusieurs variantes basées sur ce principe ; le plus connu est le système
Taqman.

2.3.2.4.1 Détection non spécifique avec un complexe-ADN fluorescent

Cette méthode de détection implique l’ajout d’un colorant intercalant au mélange de réaction : un liant
qui se lie à l’ADN double-brin (« dsDNA ») en s’intercalant entre les bases dans le sillon mineur de la
double-hélice d’ADN. Le colorant intercalant le plus utilisé est le SybrGreen I, un composé de
cyanine.

Figure 2.3.16 : Intercalation du SybrGreen dans l’ADN double brin et apparition de la fluorescence.

Le complexe SybrGreen-ADN double-brin formé absorbe la lumière d’une longueur d’onde de 488 nm
(bleue) et émet en retour de la fluorescence à 560 nm (verte, d’où le nom) ; ainsi, sur base de
l’intensité de la fluorescence, on peut déduire la quantité d’ADN double-brin. La liaison avec l’ADN
n’est absolument pas spécifique en ce sens que le SybrGreen se lie à tous les ADN double-brin, et
donc la fluorescence émise est relative à un nombre d’emplacements (sur l’ADN) où du SybrGreen
est lié (c’est-à-dire à une quantité donnée d’ADN double-brin), mais ne renseigne en aucun cas sur la
nature même de cet ADN.

La liaison du SybrGreen avec l’ADN double-brin est réversible : quand la température augmente et
que le double brin se scinde en ADN simple-brin (ssDNA), le colorant est relibéré en solution et la
fluorescence disparaît. Lors du refroidissement, quand les ADN simple-brin se rassemblent pour
former du ADN double-brin, le complexe SybrGreen-ADN se forme à nouveau et la fluorescence
apparaît également à nouveau. Cela signifie aussi que la mesure doit être faite à des températures
assez basses car l’ADN doit se trouver sous forme double-brin.

99
Ce comportement réversible est la base de l’établissement d’une courbe de fusion.
fusion Pour ce faire, on
démarre avec une température basse, à laquelle l’ADN est présent sous forme d’ADN
d double-brin et
les molécules de SybrGreen y sont liées, et donc la fluorescence émise est forte. On augmente
ensuite lentement la température ; à partir d’une température donnée l’ADN
’ADN double-brin
double commence à
se dénaturer et la force
e liant chaque élément l’un à l’autre diminue. A ce moment-là,
moment la fluorescence
diminue. Lorsque l’on atteint une température donnée, dans une zone délimitée à quelques degrés
près sur la courbe, l’ADN
’ADN double-brin
double est presque complètement dénaturé en ADN simple-brin
si et la
fluorescence disparaît alors aussi presque complètement.

La température à laquelle la moitié de l’ADN est sous forme ADN simple-brin est la température de
fusion Tm. La température de fusion peut ainsi être utilisée en guise de confirmation
confirmat de la nature des
amplicons. On n utilise en pratique le plus souvent la première dérivée (mathématique) de la courbe de
fusion, à l’aide de laquelle la sigmoïde est convertie en un pic dont le sommet correspond à la
température de fusion (voir figure).

Figure 2.3.1
.3.17: Trois courbes de fusion et leurs dérivés.

100
2.3.2.4.2 Détection spécifique avec fluorescence

Cette détection spécifique fait appel à de courtes séquences d’ADN – les « sondes » - qui sont
complémentaires à une partie du fragment qui se trouve entre les amorces et qui doit être détecté.
Ceci implique que les sondes peuvent se lier de manière très spécifique (on dit « s’hybrider ») à un
fragment d’ADN particulier.

Comme la sonde fait partie d’un système où la détection est basée sur une hybridation, la présence
du fragment d’ADN est mise en évidence de manière très spécifique.

Il existe plusieurs variantes du principe de détection à l’aide de sondes, dont la plus utilisée est celle
décrite ci-après.

2.3.2.4.3 Sondes à hydrolyse : TaqMan

Le système TaqMan fait appel à l’activité exonucléasique 5’-3’ de la polymérase Taq pendant
l’élongation des chaînes. Quand, pendant l’élongation, la polymérase Taq rencontre une séquence
complémentaire déjà existante, celle-ci est hydrolysée et donc disparaît, et ensuite la polymérase
synthétise une nouvelle séquence complémentaire sur le brin mis à nu.

Une sonde Taqman est constituée de trois parties (voir figure):

O la séquence de bases complémentaires, le plus souvent d’une longueur de 20 à 30 bases.

O un fluorophore, une molécule fixée à l’extrêmité 5’ de la séquence de la sonde, qui fluoresce


si irradiée par une lumière de longeur d’onde adaptée. Des fluorophores beaucoup utilisés
sont FAM (6-carboxyfluorescéine), VIC (breveté, structure non communiquée), TET
(tetrachlorofluorescéine), HEX (hexachlorofluorescéine) et JOE (6-carboxy-4’,5’-dichloro-2’,7’-
diméthoxyfluorescéine).
O un quencheur, une molécule fixée à l’extrêmité 3’ de la séquence de la sonde, qui éteint la
fluorescence du fluorophore lorsqu’à proximité de celui-ci. Le quencher le plus utilisé est
TAMRA (6-carboxytétraméthylrhodamine).

Sur une sonde intacte le fluorophore et le quencheur se retrouvent voisins l’un de l’autre, donc le
quencher éteint la fluorescence du fluorophore et en pratique aucune fluorescence n’est émise. Un
fluorophore libre sans quencher à proximité n’est pas éteint et fluoresce lorsque irradié par la lumière.

Parce que l’extrêmité 3’ de la sonde est bloquée par le quencher, la sonde ne peut pas être utilisée
comme amorce et il n’y a donc pas de risque que la polymérase fasse une élongation des chaînes à
partir de la sonde.

101
Figure 2.3.18: Structure d’une sonde TaqMan; R est le fluorophore (« Rapporteur »), Q est le
quencheur.

Pendant l’analyse avec une sonde TaqMan il se passe les évènements suivants:

o au début de l’analyse la solution contient l’ADN double-brin, la polymérase Taq, les


nucléotides, les amorces et la sonde,

o lorsqu’on chauffe l’ADN double-brin se dénature en ADN simple-brin,


o lorsqu’on refroidit les sondes vont se lier en premier à la séquence cible. Les amorces ne se
lient pas en premier à l’ADN car la température de fusion de la sonde est environ de 10°C
supérieure à celle des amorces.
o lorsqu’on refroidit encore les amorces se lient alors à l’ADN. A partir de cet instant, la
polymérase Taq peut utiliser le complexe ADN-amorces comme point de départ pour la
synthèse des chaînes complémentaires
o pendant l’élongation des chaînes, la polymérase rencontre les sondes. En vertu de l’activité
exonucléasique de la polymérase, la sonde est hydrolysée, ce qui libère le quencher et le
fluorophore, lesquels se retrouvent indépendants l’un de l’autre en solution. La conséquence
est que la fluorescence n’est plus éteinte (il n’y a plus de proximité quencher-fluorophore) et
le fluorophore libre peut fluorescer sous irradiation de lumière. La fluorescence de la solution
augmente. C’est à cette étape que la fluorescence est lue.
o à l’étape suivante, la température est de nouveau augmentée pour dénaturer l’ADN double-
brin et le cycle est répété.

Figure 2.3.19: Déroulement de la PCR avec sondes TaqMan.

102
Nous remarquons donc qu’à chaque cycle la fluorescence augmente; à partir d’un cycle donné, celle-
ci sera mesurable et la courbe typique en forme de S d’une réaction RT-PCR va se former.

La détection se base donc sur la rupture de la sonde avec suivi de l’augmentation du signal
fluorescent. Il est à noter que ceci est une réaction irréversible : la fluorescence ne peut alors
qu’augmenter, et ceci à l’inverse de l’utilisation d’un agent colorant intercalant de type SybrGreen.
Une conséquence de cela est que il n’y a pas de courbe de fusion à établir en guise de confirmation ;
sinon la réaction est très spécifique : on ne détecte plus une augmentation dépendant d’une quantité
totale d’ADN mais une augmentation dépendant du fragment cherché.

2.3.2.4.4 Sondes FRET

FRET signifie Fluorescence Resonance Energy Transfer, donc la transmission d’énergie de


résonance via fluorescence.

Contrairement aux sondes TaqMan on utilise ici 2 sondes: une première sonde avec à son extrêmité
3’ un fluorophore-donneur (le plus souvent fluorescéine) et une deuxième sonde avec à son extrêmité
5’ un fluorophore accepteur (Red-640 ou Red-705).

Quand le fluorophore donneur est soumis à un rayon lumineux (la longueur d’onde idéale est 493
nm), il fluoresce à une longueur d’onde d’émission donnée. Comme le fluorophore donneur est
vraiment en contact direct avec le fluorophore accepteur (distance 1 à 10 nm), l’énergie du donneur
est transmise à l’accepteur et suite à cela de la lumière à une longeur d’onde supérieure est émise
(640 ou 710 nm). Nous avons donc ici un phénomène tel que il y a seulement émission de
fluorescence par l’accepteur quand donneur et accepteur sont dans le voisinnage immédiat l’un de
l’autre.

Pour adapter ce système à la détection d’une séquence d’ADN déterminée, on conçoit les deux
sondes de sorte à ce qu’elles soient liées l’une à côté de l’autre sur le fragment d’ADN recherché, et
où le fluorophore donneur (l’extrêmité 3’ de la première sonde) se trouve à côté du fluorophore
accepteur (l’extrêmité 5’ de la deuxième sonde). C’est seulement dans cette configuration qu’il peut y
avoir émission de fluorescence à une longeur d’onde élevée par l’accepteur suite à l’exposition à un
rayonnement lumineux.

103
Pendant l’analyse avec les sondes FRET se produisent les faits suivants:

o au début de l’analyse la solution contient l’ADN double-brin, la polymérase Taq, les


nucléotides, les amorces et les deux sondes,
o puis on chauffe (à 95°C) et l’ADN double-brin devient ADN simple-brin,

o puis on refroidit (jusqu’à 50-55°C) et les amorces et les deux sondes se lient,

o les deux sondes se retrouvent l’une à côté de l’autre de sorte que FRET devient possible.
Lors de l’irradiation lumineuse les accepteurs vont fluorescer ; c’est à cette étape que la
fluorescence est mesurée.

o ensuite la température est augmentée pour atteindre la température optimale pour la


polymérase Taq (72°C) et alors la polymérase allonge les amorces entraînant la formation
des chaînes complémentaires ; pendant l’élongation, la polymérase rencontre les sondes et
les casse, impliquant que le donneur et l’accepteur sont éloignés l’un de l’autre par libération
dans la solution. La conséquence est que plus aucune fluorescence du donneur est
transférée à l’accepteur. La fluorescence de la solution diminue à ce moment.

o à l’étape suivante, la température est de nouveau augmentée à 95°C pour dénaturer l’ADN
double-brin et le cycle est répété.

104
Remarquons qu’ici 3 étapes de température doivent être utilisées : pour pouvoir mesurer la
fluorescence de l’accepteur il faut opérer avant que la polymérase exécute l’élongation et ceci est
possible via un abaissement de la température sous la température optimale de la polymérase de
telle sorte que celle-ci est à peine active après la liaison des amorces et des sondes.

A chaque étape les sondes liées sont brisées par la polymérase de telle manière que la concentration
des sondes dans la solution de départ doit être assez élevée pour qu’au dernier cycle il y en ait
encore suffisamment de copies pour pouvoir se lier à l’amplicon.

Il est possible d’établir une courbe de fusion avec les sondes FRET: à faible température il y a
exclusivement du dsDNA. A l’augmentation de la température le ssDNA s’accumule et les sondes
FRET peuvent se lier à celui-ci et la fluorescence peut alors être mesurée. Contrairement à la courbe
de fusion obtenue avec le SybrGreen, il y a ici une augmentation et pas de diminution de la
fluorescence lorsqu’on augemente la température.

2.3.2.4.5 Balises moléculaires

Les balises moléculaires sont parentes des sondes TaqMan, mais présentent quelques différences
importantes.

Une balise moléculaire est une sonde qui consiste en 4 parties:

o une séquence de 15 à 30 bases qui est complémentaire à une partie du fragment d’intérêt (le
« loop »)

o à chaque extrêmité de cette séquence on trouve une séquence plus courte de 5 à 7 bases
qui sont complémentaires l’une avec l’autre de sorte qu’elles puissent s’hybrider ensemble

o à l’extrêmité 5’ on trouve un fluorophore

o à l’extrêmité 3’ on trouve un quencheur

En situation normale (faible température et pas d’ADN complémentaire présent) une balise
moléculaire est repliée en structure « d’épingle à cheveux » : les deux pièces complémentaires
s’hybrident ensemble et alors le fluorophore et le quencher sont en contact l’un avec l’autre et il n’y a
pas d’émission de fluorescence.

Quand une balise moléculaire entre en contact avec une séquence qui est complémentaire à celle de
la séquence « loop », alors la balise va s’y lier avec préférence et un fragment double-brin se forme
(la stabilité d’un « loop » lié est plus grande que la structure en épingle à cheveux). Ceci implique que
les extrêmités de l’épingle à cheveux sont déshybridées donc le fluorophore est éloigné du
quencheur ; dans cette configuration, le fluorophore peut fluorescer.

105
En pratique la longueur du “loop” est le plus souvent choisie de sorte à ce que les fragments double-
brins soient à peine plus stables que l’épingle à cheveux. Ainsi on a la possibilité d’une grande
spécificité : la présence d’un quelconque base non complémentaire dans l’ADN peut gêner la liaison
de la balise moléculaire.

Lorsqu’on utilise des balises moléculaires on mesure la fluorescence pendant l’étape où la balise se
lie à l’ADN, car c’est la seule phase pendant laquelle le fluorophore et le quencher sont séparés.

Après la mesure la température est augmentée et la polymérase exécute l’élongation des chaînes à
partir des amorces. Quand une balise moléculaire est rencontrée, celle-ci est libérée (pas brisée !) et
ainsi se retrouve en solution à nouveau, et donc la structure en épingle à cheveux se reforme. Les
balises moléculaires peuvent donc être réutilisées à chaque cycle de PCR.

2.3.2.4.6 Amorces scorpion

Les amorces scorpion résultent de la combinaison d’amorces et d’une balise moléculaire. Tout
comme les balises moléculaires, les scorpions consistent en une structure en épingle à cheveux avec
un fluorophore et un quencheur. L’extrêmité 3’, à laquelle le quencheur est lié, est ici prolongée par
une molécule qui est connue comme le « bloqueur de PCR » (« PCR-blocker ») et qui est non
nucléotidique, bien qu’ici il s’agisse d’une séquence d’amorce confirmée. Le bloqueur de PCR, entre
l’épingle à cheveux et l’amorce, est là pour empêcher que la polymérase n’ouvre l’épingle à cheveux
pendant la liaison sur l’amorce, ce qui impliquerait la formation de produits non-spécifiques.

Une analyse PCR avec les scorpions se déroule selon les étapes suivantes :

o les scorpions se trouvent en solution sous la forme d’épingle à cheveux,


o lors de la dénaturation sont dénaturés tant l’ADN-cible que l’épingle à cheveux,

o lors du refroidissement l’amorce du scorpion se lie sur l’ADN simple-brin et l’épingle à


cheveux est de nouveau formée,

106
o la polymérase allonge les chaînes à partir de l’amorce avec formation d’ADN double-brin,

o à l’étape suivante de dénaturation la torsade (scorpions + chaînes allongées) est de nouveau


libérée et l’épingle à cheveux est ouverte,

o lors du refroidissement la séquence de la boucle de l’épingle à cheveux se lie à la séquence


complémentaire de la nouvelle torsade formée (donc une hybridation interne), ce qui entraîne
l’éloignement du quencher et du fluorophore l’un par rapport l’autre et donc émission de
fluorescence. Cette configuration est plus favorable sur le plan énergétique que la liaison des
chaînes allongées avec une torsade d’ADN complémentaire. A cette étape, la fluorescence
est mesurée. Comme cette étape est aussi celle à laquelle les amorces se lient, un scorpion
complémentaire peut se lier à l’extrêmité de la torsade allongée ayant une telle configuration
et être allongé jusqu’au bloquer de PCR. De cette manière, il se produit aussi via les
scorpions un dédoublement du nombre de torsades par cycle de PCR.

Etant donné que l’élongation du scorpion fait disparaître sa fonction d’amorce, du scorpion est
consommé à chaque cycle de la PCR de manière irréversible. A chaque cycle, la fluorescence
augmente.En général, on limite la distance entre l’amorce et la séquence-cible de la sonde à moins
de 200 bases.

2.3.2.4.7 Autres variantes

Outre les applications exposées ci-dessus, il existe un certain nombre d’autres variantes. La
particularité est que tous travaillent suivant le principe du quenching <-> fluorescence liée à la
séquence recherchée.

107
2.3.2.5 PCR combinée

Il est possible d’utiliser des associations d’amorces et de fluorophores soit pour réaliser différentes
réactions simultanément, soit pour utiliser l’amplicon d’une réaction comme séquence de départ d’une
autre réaction.

Dans la singleplex-PCR, il existe une disposition unique : il n’y a qu’une seule paire ‘amorce/sonde’
présente. Il s’agit de la variante la plus simple et la plus répandue.

Dans la duplex-PCR, deux opérations sont exécutées simultanément. Ceci est possible grâce à
l’ajout de deux couples d’amorces et de deux sondes différentes. Ainsi, deux réactions peuvent avoir
lieu simultanément et indépendamment l’une de l’autre. Pour que les deux réactions puissent être
distinguées l’une de l’autre dans la RT-PCR, les sondes sont couplées à des fluorophores émettant
un rayonnement à des longueurs d’ondes différentes (par exemple, FAM et HEX). En utilisant des
filtres appropriés, les ‘couleurs de fluorescence’ de chacun peuvent être distinguées, ce qui permet la
réalisation de deux réactions différentes dans le même puits.

Muliplex-PCR : il s’agit d’une variante plus élaborée de la duplex-PCR, dans laquelle plus de
deux jeux d’amorces et de sondes sont utilisés. La distinction des couleurs de fluorescence
émises ainsi que l’optimalisation des conditions de réaction sont plus compliquées.

Nested PCR : Deux jeux d’amorces sont ici utilisés. Le premier donne lieu à la formation d’un long
amplicon qui comprend la séquence cible. Le second entoure la séquence cible ; comme ce dernier
est aussi présent dans le long amplicon formé par le premier jeu, l’amplicon de ce premier set est
utilisé comme matrice pour la seconde réaction. Une seule sonde est utilisée seulement à proximité
de la seconde amorce, alors, le signal détecté sera spécifique au second segment. Ceci est souvent
utilisé dans des conditions difficiles pour amplifier le DNA parce que l’amplification avec le premier
amplicon comme matrice se fera beaucoup plus facilement.

Figure 2.3.20 Principe de la Nested PCR

108
2.3.2.6 Exécution de la PCR

Toutes les variantes de la PCR se font à partir d’une solution dans laquelle l’ADN double brin (ou
l’ARN dans le cas de certaines applications spéciales) est présent avec une pureté suffisante.

2.3.2.6.1 Equipement

L’appareil de base pour l’exécution de la PCR est le thermocycleur. Il consiste essentiellement en


une plaque chauffante dans laquelle une plaque de microtitration (96 ou 384 puits) est placée. Cette
plaque chauffante, généralement en aluminium, peut être très rapidement chauffée ou refroidie. Pour
rendre possible ce chauffage et ce refroidissement rapide, cette plaque est installée sur un élément
Peltier, ainsi la température peut être réglée au moyen de l’effet Peltier.

Figure 2.3.21 Un thermocycleur pour la RT-PCR. La partie inférieure est le thermocycleur pour la
PCR classique, la partie supérieure contient le détecteur pour la RT-PCR.

109
A côté de la plaque chauffante grâce à laquelle la température de la plaque de microtitration est
régulée, la température du couvercle qui recouvre la plaque doit aussi être augmentée pour éviter la
condensation sur le haut des puits.

Un thermocycleur pour la PCR classique est composé d’un bloc chauffant, un couvercle thermostatisé
et l’électronique pour contrôler la température du bloc chauffant et programmer le cycle de
température.

Dans un thermocycleur pour RT-PCR, il y a en plus un bloc détecteur qui permet de mesurer la
fluorescence dans un puits à une étape donnée de chaque cycle de température. Un tel système de
détection est composé
o d’une source d’excitation pour produire la fluorescence. Ce peut être une lampe au xénon
mais aussi une LED qui émet un rayonnement dans une gamme étroite de longueurs d’onde.
Ce rayonnement passe encore à travers un filtre afin de restreindre la gamme de longueurs
d’onde pour l’excitation.
o de filtres pour délimiter la gamme de longueurs d’onde dans laquelle la mesure de
fluorescence pourra être effectuée,

o d’une caméra ou photodiodes pour mesurer l’intensité de la fluorescence.

Figure 2.3.22 Un détecteur pour RT-PCR (Bio-Rad). Les LED’s émettent de la lumière dans une
gamme de longueur d’onde donnée, les photodiodes mesurent l’intensité de la fluorescence. Il faut
noter que les LED’s comme les photodiodes ont leurs propres filtres.

110
2.3.2.6.2 Déroulement de la PCR classique

Le déroulement de la PCR classique comprend les étapes suivantes :

o Etape 1 : diluer l’ADN jusqu’à une concentration standard. Une concentration trop élevée en
ADN peut inhiber la réaction.

o Etape 2 : préparer un mix contenant tous les composants de base pour la réaction :
nucléotides, Taq-polymérase, ions,…Un tel mix est commercialisé en prêt-à-l’emploi.
o Etape 3 : répartir le mix dans des tubes suivant la quantité de paire d’amorces qui sera
utilisée. Ceci est important quand différentes séquences sont recherchées lors d’une
analyse : chaque séquence recherchée a sa propre paire d’amorces.
o Etape 4 : ajouter à chaque mix la paire d’amorces pour la séquence cible,

o Etape 5 : pipetter les mélanges ‘mix + amorces’ et les répartir sur une plaque de microtitration
(96 ou 384 puits) suivant un schéma prédéfini,
o Etape 6 : ajouter dans les puits l’ADN de l’échantillon et les contrôles (contrôles positifs,
contrôles négatifs, blanco, etc.),

o Etape 7 : couvrir la plaque avec un film plastique ou des capuchons afin d’éviter l’évaporation
durant l’analyse,

o Etape 8 : Mettre la plaque dans le thermocycleur, fermer le couvercle, programmer le cycle de


températures et démarrer l’analyse,
o Etape 9 : Retirer la plaque du thermocycleur et effectuer les analyses nécessaires pour
déterminer le résultat de la réaction (par exemple, électrophorèse sur gel sur le produit de la
PCR avec coloration afin de déterminer la présence d’une bande caractéristique
correspondant à la longueur attendue de l’amplicon).

Un programme de température consiste principalement en la répétition d’un cycle de températures


(généralement 40 à 50 répétitions). Ce cycle comporte différents paliers de température, ayant
chacun une durée déterminée.

111
Figure 2.3.23 Schéma d’un cycle de température d’une PCR

2.3.2.6.3 Déroulement de la Real-Time PCR

Le déroulement de l’analyse Real-Time PCR diffère du déroulement de la PCR classique dans deux
principaux domaines
o l’ajout au mix de réactifs qui permettent la détection de l’amplicon recherché (SybrGreen ou
sondes),

o la présence d’un module détecteur au-dessus du thermocycleur.

Le déroulement de l’analyse RT-PCR se distingue par l’utilisation du SybrGreen comme système de


détection.

La RT-PCR avec SybrGreen ou sonde comme système de détection comporte les étapes
suivantes :
o Etape 1 : Diluer l’ADN jusqu’à une concentration standard,
o Etape 2 : préparer un mix contenant les composants de base pour la réaction : nucléotides,
Taq-polymérase, ions, SybrGreen si nécessaire,…

o Etape 3 : répartir le mix dans des tubes suivant la quantité de paire d’amorces qui sera
utilisée,

o Etape 4 : ajouter à chaque mix la paire d’amorces et sonde si nécessaire pour la séquence
cible,
o Etape 5 : pipetter les mélanges ‘mix + amorces’ et les répartir sur une plaque de microtitration
(96 ou384 puits) suivant un schéma prédéfini,

112
o Etape 6 : ajouter dans les puits l’ADN de l’échantillon et les contrôles (contrôles positifs,
contrôles négatifs, blanco, etc.),
o Etape 7 : couvrir la plaques avec un film plastique ou des capuchons afin d’éviter
l’évaporation durant l’analyse,

o Etape 8 : Mettre la plaque dans le thermocycleur, fermer le couvercle, programmer le cycle de


températures et démarrer l’analyse,

o Pendant l’analyse, au cours de chaque cycle, la fluorescence de chaque puits est mesurée ;
son évolution est représentée graphiquement durant l’analyse même.
o Etape 9 : quand SybrGreen est utilisé comme système de détection : après le dernier cycle
de températures les courbes de dénaturation peuvent être enregistrées. Ainsi la température
de dénaturation Tm du produit est déterminée ; cette température de dénaturation peut être
utilisée pour rechercher la nature de l’amplicon.

o Etape 10 : retirer la plaque du thermocycleur. Souvent l’analyse est alors complètement


terminée et la plaque peut être détruite.

Après chaque cycle, l’intensité de la fluorescence est présentée sur un graphique. De cette façon, le
déroulement de la réaction peut être suivi dans chaque puits pendant l’analyse.

2.3.2.7 Interprétation de la RT-PCR

Les résultats de la PCR classique sont seulement connus après que les analyses post-PCR soient
réalisées. Avec la RT-PCR, les résultats sont déjà connus après le dernier cycle de température.

Avec la RT-PCR, le déroulement de la réaction (la fluorescence mesurée) est présentée de manière
graphique; lors d’une réaction normale, on obtient une courbe sigmoïde typique (voir plus haut).

SERIES OF 10-FOLD DILUTIONS

113
La phase qui est utilisée pour l’interprétation et l’évaluation de la courbe est la phase exponentielle.
Comme cette zone devient une droite après la transformation logarithmique, en pratique on utilise le
logarithme de toutes les valeurs de fluorescence. C’est avec la droite résultante qu’on fait la suite du
travail.

2.3.3 PCR et OGM

2.3.3.1 Historique

OGM signifie Organisme Génétiquement Modifié (nl. GGO = Genetisch Gemodificeerd Organisme,
angl. GMO = Genetically Modified Organism). Ce terme exprime clairement de quoi il s’agit: des
organismes qui ont été modifiés par des aménagements de leur matériel génétique.

La manière classique de modifier les propriétés des organismes est la sélection: c’est le fait de
sélectionner des descendants sur base de propriétés “favorables” et de les cultiver dans l’espoir que
ces propriétés soient héréditaires, afin qu’elles se répandent dans la descendance. La manière
classique est vraiment très lente et limitée: lente car on doit attendre que la descendance elle-même
soit féconde pour pouvoir continuer à travailler, et limitée car on peut seulement travailler avec des
caractéristiques qui soit sont déjà présents soit sont spontanées et donc non contrôlables. Ne serait-
ce pas tellement plus facile si on pouvait choisir les modifications et les introduire dans l’organisme
souhaité?

Vu que les principes fondamentaux sont pareils chez tous les organismes (ADN, réplication,
expression,…) il s’est avéré facilement envisageable de tester et observer le résultat du transfert des
gènes d’un organisme dans le génome d’un autre organisme. Et quand on a compris qu’un tel
transfert se passe aussi dans la nature (entre bactéries elles-mêmes et entre bactérie et cellule
eucaryote), on a immédiatemment pu adapter un mécanisme pour pouvoir transmettre d’autres
modifications à des fins propres.

Ces modifications sont appliquées aujour d’hui surtout sur des bactéries et des plantes. Ces
dernières années, on a aussi commencé à faire des adaptations à but commercial sur les animaux.
Tout semble indiquer qu’avec le temps il y aura de plus en plus d’organismes génétiquement modifiés
sur le marché.

2.3.3.2 Principe

Le principe d’un OGM est la modification du matériel génétique pour changer une ou plusieurs
caractéristiques d’une cellule ou d’un organisme.

Comme point de départ, on a besoin de la séquence d’un gène qui code pour la modification
souhaitée, par exemple la tolérance à un herbicide. On peut isoler ce gène dans un plasmide (le plus
souvent le plasmide Ti de A. tumefaciens), lequel est alors introduit dans une bactérie pour être
multiplié. Selon la suite de la procédure choisie, on peut soit infecter la plante via la bactérie, soit
isoler le plasmide à partir de la bactérie (après multiplication) pour ensuite l’administrer à une cellule
végétale par une méthode alternative (micro-injection, pistolet à gène avec lequel on “tire” dans la
cellule des petites billes métalliques sur lesquelles est fixé le plasmide,…). Remarquons qu’on utilise
un plasmide défectueux qui ne provoque pas de galles.

114
A ce principe simple quelques modifications doivent en fait être apportées, pour pouvoir travailler
avec dans la pratique:

o à part du gène des éléments de contrôle (promoteur, terminateur) doivent être présents.
Sans ces éléments de contrôle, le gène ne peut être exprimé. C’est pourquoi on couple,
dans le plasmide, une séquence de promoteur en amont du gène, ainsi qu’une séquence de
terminateur en aval.
o un promoteur très utilisé est le p35S du virus de la maladie de la mosaïque du chou (nom du
virus = CaMV); un terminateur courant est le tNos du gène de la nopaline (une des opines)
de A. tumefaciens.

o la plupart des cellules manipulées ne donnent aucun résultat. Pour pouvoir sélectionner les
cellules traitées avec succès, on introduit (préalablement) dans le plasmide un gène codant
pour la résistance à un antibitotique ou pour la production d’un produit qui permette de
recherchér facilement les cellules transformées. On cultive par exemple les cellulles traitées
sur un milieu nutritif qui contient l’antibiotique concerné, et seules les cellules exprimant le
gène de résistance à l’antibiotique peuvent se développer.

Après cette première sélection, une autre sélection doit être effectuée sur l’expression de la
modification même.

L’intégration non dirigée de la modification dans le génome signifie aussi que dans les différentes
cellules exprimant le gène, le gène peut se trouver à différents endroits dans le génome. Une lignée

115
cellulaire donnée avec une place d’intégration (du plasmide) bien déterminée s’appelle un “event”
(“événement”).

Une des premières applications dans l’agriculture a été l’introduction du “RoundUp Ready Soja”. En
1996, Monsanto a mis sur le marché ce soja génétiquement modifié, dans lequel un gène codait pour
un enzyme (EPSPS) moins sensible à l’herbicide total RoundUp, résultant en un cultivar tolérant de
cet herbicide total. Plus tard, d’autres modifications (génétiques) ont été mises sur le marché par un
certain nombre de firmes (Monsanto, Pioneer, Syngenta, Bayer Crop Sciences,…), et pas seulement
pour le soja mais aussi pour le maïs, le colza, la tomate, la pomme de terre, la papaye, la betterave,
le coton,…

Sur un plan commercial, l’attention est surtout donnée aux modifications


o des plantes d’importance économique (soja, maïs, colza, pomme de terre…),

o pour la résistance contre les herbicides totaux (Roundup – glyphosate, Basta –


glufosinate,…)

o pour la résistance contre les insectes (comme le chrysomèle du maïs) ou les virus (Papaya
ringspot virus),
o pour des propriétés spécifiques (fermeté plus durable de la tomate, plus d’amylopectine dans
l’amidon de pomme de terre, plus haute teneur en vitamine A dans le riz,…).

Quand on a modifié un nombre de cultivars d’une espèce donnée pour différentes caractéristiques,
par exemple une variété de maïs qui est tolérante pour un herbicide et une variété de maïs qui est
résistante au chrysomèle du maïs, alors on peut les croiser pour obtenir un cultivar qui contient les
deux modifications et donc les deux caractéristiques. On parle alors d’un cultivar avec des “stacked
events” (“événements empilés”): la combinaison de deux ou plusieurs modifications dans la même
plante.

2.3.3.3 Modifications appliquées

Actuellement, les modifications commerciales les plus importantes concernent les tolérances aux
herbicides et les résistances aux insectes.

Remarque : les abréviations des gènes sont écrites en italiques (pat), les produits des gènes
(protéines, enzymes) sont indiqués en lettres majuscules (PAT).

2.3.3.3.1 Tolérance aux herbicides

Dans la cellule, les herbicides totaux agissent par inactivation d’une ou de plusieurs enzymes, ce qui
pertube un métabolisme déterminé. Pour installer une tolérance à un herbicide chez une plante qui
naturellement n’est pas tolérante, il existe deux approches possibles : introduire un gène codant pour
une enzyme qui va rendre inoffensive la matière active, ou introduire un gène codant pour une
enzyme modifiée sur laquelle la matière active n’a plus d’effet .

116
2.3.3.3.2 Résistance aux insectes

La bactérie Bacillus thuringiensis (Bt) produit une protéine qui est toxique pour les larves d’un grand
nombre d’insectes (le δ-endotoxine, toxine CRY). L’introduction du gène Cry assure la présence de
cette protéine CRY dans la plante ; de ce fait , les larves qui se nourrissent de cette plante
consomment la toxine et meurent.

Le gène Cry possède une variabilité étendue : il existe une multitude de variantes différentes qui
codifient chacune pour une toxine mortelle et spécifique à d’autres groupes d’insectes.

2.3.3.4 Applications : quelques OGM’s commercialisés

2.3.3.4.1 Soja (Glycine max)

Identification Gène Promoteur Terminateur

MON 40-3-2, RoundUp


cp4-epsps p35S tNos
Ready Soja
MON89788 cp4-epsps / ctp2 p-FMV/Tsf1 T-E9

A2704-12 pat p35S t35S

Le soja est l’une des premières cultures pour lesquelles un OGM a été commercialisé (RoundUp
Ready Soja de Monsanto). Comme annoncé ci-dessus, cela concerne une modification du
gène epsps qui offre une meilleure tolérance à l’herbicide total glyfosate. Comme promoteur et
terminateur, on a utilisé p35S et tNos.

Le MON89788 (Monsanto) est un soja tolérant au glyfosate de la deuxième génération; ici on a utilisé
un autre promoteur et terminateur pour un meilleur contrôle de l’expression.
Le soja libertyLink (Soja A2704-12, Bayer Crop Science) contient une modification pour la tolérance à
l’herbicide total glufosinate qui est mis sur le merché sous les noms Liberty, Basta, Rely et Finale.

Parce qu’une résistance au glyfosate s’est établie chez certaines mauvaises herbes, diminuant ainsi
l’efficience de l’herbicide, une rotation de cultures avec différents soja-OGM’s couplée à l’utilisation
de différents herbicides totaux, peut ralentir l’apparition de résistance.

117
2.3.3.4.2 Maïs (Zea mays)

Le maïs est la plante dont il y existe le plus d’OGM’s sur le marché. Les maïs-OGM’s peuvent être
répartis dans les groupes suivants :

o Uniquement les modifications de la tolérance aux herbicides

Identification Gène Promoteur Terminateur

T25 pat p35S t35S


Chaque gène epsps
a son propre
NK603 epsps / epsps tNos (2x)
promoteur, dont
p35S
GA21 mepsps (modified epsps) p-ract1 (actine du riz) tNos

o Uniquement les modifications de la résistance aux insectes

Identification Gène Promoteur Terminateur

MON810 Cry1Ab p35S tNos

MIR604 Cry3A / pmi pMTL / pUbi tNos (2x)

MON863 Cry3Bb1 / nptII p35S (2x) tNos


pmi chez MIR604 et nptII chez MON863 sont des gènes de sélection.
Les différentes protéines CRY sont actives contre Diabrotica spp., Ostrinia nubilialis et Sesamia spp.
(ravageurs des tiges de maïs).

o Modification de la tolérance aux herbicides et de la tolérance aux insectes

Identification Gène Promoteur Terminateur

Bt11 Cry1Ab / pat p35S (2x) tNos (2x)


Chaque gène a son
Bt176 Cry1Ab (2x) / bar propre promoteur dont t35S (3x)
p35S chez bar
Chaque gène a son
Chaque gène a son
Cry34Ab1 / Cry35Ab1 / propre terminateur
DAS59122 (Herculex) propre promoteur dont
pat dont t35S de CaMV
p35S chez pat
chez pat
Chaque gène a son
Chaque gène a son
propre terminateur
1507 Cry1F / pat propre promoteur dont
dont t35S de CaMV
p35S chez pat
chez pat

118
2.3.3.4.3 Colza (Brassica napus)

Identification Gène Promoteur Terminateur

GT73 (canola) cp4-epsps / goxv247 p-CMoVb (2x) t-E9

Topas 19/2 pat / nptII p35S / pNos t35S / tActS

T45 pat p35S

2.3.3.4.4 Riz (Oryza sativa)

Identification Gène Promoteur Terminateur

LLRICE62 bar p35S t35S

À part de ces modifications il y a aussi des OGM de tomate (Solanum lycopersicum), pomme de terre
(Solanum tuberosum), coton (Gossypium hirsutum), papaye (Carica papaya) etc.

2.3.3.5 Cadre légal

Le cadre légal pour la mise sur le marché des OGM’s dans l’Union européenne est consigné dans
deux arrêtés de 2003 et une Recommendation de la Commission de 2004.

L’essence même des deux Arrêtés peut être résumée comme suit:

o L’obligation pour le producteur d’informer le client lorsque des OGM’s ou des dérivés sont
fournis et l’obligation de prévoir la traçabilité à chaque maillon de la chaîne alimentaire,
o Les produits dérivés des OGM’s doivent être étiquetés, même lorsqu’ils ne contiennent plus
de traces d’ADN ou de protéines qui proviennent des modifications génétiques,

o L’étiquetage des produits destinés aux aliments pour animaux est obligatoire et s’inspire des
normes en vigueur pour l’étiquetage des produits alimentaires,

o Le seuil de tolérance pour la traçabilité et l’étiquetage est de 0,9%.

Dans l’UE on distingue deux groupes d’OGM : ceux avec autorisation pour la fabrication des produits
destinés aux aliments pour animaux ou des produits alimentaires, et ceux sans autorisation.

La règle générale est que chez les OGM’s autorisés, la présence et la teneur doivent être signalées
sur l’étiquette lorsque cette teneur dépasse 0,9%; des teneurs moins élevées sont considérées
comme provenant d’une production antérieure lors du processus de fabrication et ne doivent pas être
déclarées sur l’étiquette.

La présence des OGM’s non autorisés n’est pas tolérée; pour ces OGM’s, la tolérance zéro est en
vigueur et lors de la présence d’un OGM non autorisé , le produit ne peut pas être mis sur le marché.

119
La liste des OGM’s autorisés est tenu à jour par DG SANCO et peut être consultée sur
http://ec.europa.eu/food/dyna/gm_register/index_en.cfm.

En 2011, d'autres règlements ont été publiés :

Le Règlement (UE) n° 619/2011 de la Commission du 24 juin 2011 vue de la détection de matériel


génétiquement modifié faisant l’objet d’une procédure d’autorisation ou dont l’autorisation a expiré.
Il s’ agit:
o d’ OGM autorisés dans un pays tiers pour lesquels une autorisation est demandée à la
Commission Européenne

o d’ OGM pour lesquels l'autorisation a expiré et n'a pas encore été renouvelé

La décision d’ exécution de la Commission du 22 décembre 2011 sur des mesures d’urgence


concernant la présence non autorisée de riz génétiquement modifié dans les produits à base de riz
provenant de Chine et abrogeant la décision 2008/289/CE, concernant le contrôle sur la présence ou
l'absence d’ OGM non-ogm autorisés en provenance du riz (produits) importé de la Chine.

2.3.3.6 Analyse des OGM

L’analyse des OGM a deux objectifs:

o la détection de la présence d’OGM dans un produit, et

o lors de la suspicion de présence ; identifier l’OGM présent et en déterminer la teneur dans


le produit. Ce point étant particulièrement important pour contrôler la limite de 0.9% définie
dans la législation.

Lors de l’analyse, les points suivants doivent être abordés avec attention :
o la séquence du ou des gènes introduits qui déterminent la nature du produit formé,

o le promoteur et le terminateur pour l’expression du gène,

o l’endroit d’intégration de l’unité fonctionnelle génétique dans l’ADN génomique de la plante ce


qui détermine ‘l’event’.

L’analyse consiste en les étapes suivants :


o le screening où le taxon présent (soja, maïs, colza,…) et la présence de deux types de
marqueurs est examinée de manière qualitative: le promoteur p35S et le terminateur tNos qui
sont généralement utilisés. Un résultat positif pour un de deux élément indique une
modification génétique. On peut aussi détecter un ou plusieurs gènes courant pour limiter les
recherches suivantes.

o l’identification : lorsque la présence d’un OGM est supposée sur base d’un résultat de
screening, l’’event’ présent doit être identifié. Lors de l’identification, les différentes event
possibles sont testé de manière qualitative. Cela se fait de manière très spécifique en PCR
par le domaine de transition ou la construction est intégrée dans le génome. La présence
d’une séquence qui fait le passage entre ADN génomique de la plante et l’ADN de la
modification (promoteur ou terminateur) doit inclure l’event sans ambiguité

120
o quantification : une fois l’event identifié, sa teneur doit être déterminée. Pour cela on utilise
des standards avec une teneur connue qui sont analysés en même temps que l’échantillon et
sur base desquels on estime la teneur dans l’échantillon.

121
3 MATRICES – PARAMETRES

3.1 Introduction

L’AFSCA contrôle de nombreux composants présents dans la chaine alimentaire. Les résidus et
contaminants dans les produits d’origine animale dont le contrôle est imposé par la Directive
96/23/CE du Conseil du 29 avril 1996 en font partie.

Cette Directive contient les mesures de contrôle vis-à-vis de certaines substances et leurs résidus
dans les animaux vivants et les produits dérivés, comme la viande, le lait et le miel. Cette Directive
détermine comment un programme national de contrôle doit être établi : quels résidus doivent être
annuellement dépistés, dans quelle matrice et avec quelle fréquence. Chaque année, les Etats
Membres doivent établir et soumettre leur plan national de contrôle à l’UE.
La législation européenne est traduite dans le « Plan National pour les Résidus et Contaminants
dans les animaux vivants et les produits d’origine animale »

Annexe I de la Directive divise les résidus en 2 groupes : Groupe A contient les substances interdites
et Groupe B les médicaments vétérinaires et les contaminants

Tableau 3.1.1: Annexe I de la Directive UE 96/23/CE

Groupe A: Substances ayant un effet anabolisant et Substances non autorisées


Stilbènes, dérivés de stilbènes et leurs sels et esters
Agents antithyroïdiens
Stéroïdes
Resorcylic acid lactones,-y compris zeranol
Beta-agonistes
Substances incluses dans l’annexe IV du règlement (CEE) 2377/90 du Conseil du 26 juin 1990

(1)
Groupe B: Médicaments Vétérinaires et Contaminants
Substances antibactériennes, y compris sulfamides, quinolones
Autres médicaments vétérinaires
Anthelmintiques
Anticoccidiens, y compris nitroïmidazoles
Carbamates et pyréthroïdes
Tranquillisants
Anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS)
Autres substances exerçant une activité pharmacologique
Autres substances et contaminants environnementaux
Composés organochlorés, y compris les PCB’s
Composés organophosphorés
Eléments chimiques
Mycotoxines
Colorants
Autres

1
Y compris les substances non-enregistrées qui pourraient être utilisées à des fins vétérinaires.
Dans ce chapitre plusieurs des groupes mentionnés ci-dessus seront traités ainsi que les techniques
d’analyses les plus importantes.

122
Ultérieurement quelques autres composants importants seront traités comme l’acrylamide, les
vitamines et la recherche des farines animales.

3.2 Composant : structure, effet et toxicité, techniques d’analyse

3.2.1 Stilbenes et dérivés

3.2.1.1 Structure

Ce groupe de substances sont des œstrogènes synthétiques. Ils possèdent une activité similaire à
l’hormone naturelle l’œstradiol, mais n’ont pas, contrairement aux hormones sexuelles, une structure
stéride. Diéthylstilbestrol (DES) est le représentant le plus connu du groupe des stilbènes et ne
diffère pas beaucoup, d’un point de vue chimique, des œstrogènes naturels. Ceci se manifeste
clairement lors d’un contrôle approfondi de la structure de diéthylstilbestrol.

OH

HO

Figure 3.2.1: La concordance entre le diéthylstilbestrol (à gauche) et le 17ß-œstradiol (à droite).

L’effet ostrogénique est surtout attribué au fait que les deux groupes hydroxyliques se trouvent sur la
même distance spatiale que l’œstradiol. Il existe un certain nombre de composants apparentés au
diéthylstilbestrol, également avec un effet œstrogène (voir Figure 3.2.2).

OH OH OH

HO HO HO
Diëthylstilbestrol Hexestrol Diénestrol

Figure 3.2.2: analogues du DES: hexestrol en diénestrol

123
3.2.1.2 Effet et toxicité pour l’être humain et/ou l’animal

Le diéthylstilbestrol était utilisé comme additif alimentaire ou comme implant sous-cutané dans
l’oreille des bovins pour stimuler la croissance. Il s’avairait toutefois cancérigène.

Les filles DES (dont les mères avaient eu du DES sous prescription, à titre préventif contre une
fausse couche) couraient un plus grand risque de problèmes de fertilité et étaient susceptibles de
développer des types de cancer très spécifiques au niveau du vagin ou au museau de tanche.

De ce fait, l’utilisation du DES est interdite partout.

3.2.1.3 Techniques d’analyse

Le DES est lentement métabolisé dans le foie et excrété dans l’urine et les fèces. Des méthodes ont
aussi été développées pour le tissu musculaire, souvent matrice unique d’introduction.
n n
Les techniques utilisées sont le GC-MS (et/ou GC-MS et GC-MS/MS) et le LC-MS (et/ou LC-MS et
LC-MS/MS).

3.2.2 Agents antithyroïdiens

3.2.2.1 Introduction

Avec l’industrialisation de l’élevage du bétail on essaie d’augmenter la productivité : produire plus de


viande/poids à un prix coûtant égal ou plus faible. Les agents antithyroïdiens ou les inhibiteurs
thyroïdiens sont un des moyens utilisés d’une façon illégale.

3.2.2.2 Effet et toxicité pour l’être humain et/ou l’animal

Les effets des agents antithyroïdiens chez les bovins sont à attribuer au fait qu’ils ont un effet
suppressif sur le fonctionnement normal de la glande thyroïde. Ainsi, il y a production réduite des
hormones thyroïdiennes, la thyroxine (T4) et le trijodothyronine (T3). Par conséquence, il y a une
augmentation du remplissage de l’estomac-tube digestif et une plus grande rétention d’eau dans les
tissus. Cela aboutit à une augmentation spectaculaire du poids en peu de temps.

La viande, en provenance des animaux traités avec des agents antithyroïdiens, est dans la plupart
des cas, très humide et très dégoulinante, fréquemment plus pâle que la normale et d’une qualité
inferieure. De ce fait, l’utilisation des agents antithyroïdiens peut être considérée comme une forme
manifeste de fraude : on vend au consommateur, de l’eau au prix de la viande. Et d’ailleurs, il y a de
fortes indications que la présence des agents antithyroïdiens et leurs métabolites peuvent avoir un
1
effet nuisible sur la santé publique. Certaines substances sont cancerogènes ou tératogènes .

1
tératogène: propriété d'une substance afin de provoquer des anomalies du foetus pendant la grossesse si la
mère est en contact avec la substance, ou inhaler qu'elle occupe.

124
L’utilisation des agents antithyroïdiens est dès lors aussi prohibée dans l’UE et beaucoup d’autres
pays. Par l’instauration d’une prohibition, un contrôle efficace pour le dépistage de l’administration de
telles substances doit être mis en place.

3.2.2.3 Structure et les groupes les plus importants

Les agents antithyroïdiens, important pour l’engraissage des bovins, peuvent être divisés en résumé
dans deux groupes :

o Un premier groupe est formé par les agents antithyroïdiens naturels, une collection de
produits naturels à effet antithyroïdien;

o Un deuxième groupe contient les agents antithyroïdiens xénobiotiques.

Les agents antithyroïdiens naturels se retrouvent surtout dans le matériel d’origine végétale plante
sous forme de précurseur, précité des glucosinolates. Sur le schéma suivant, le catabolisme général
des glucosinolates est présenté. Sous l’influence d’un enzyme, la thioglucosidase ou myrosinase,
sont isolés de la molécule mère.

S-glucose
R–C
N-OSO 2O -

thioglucosidase

S- + glucose
R–C
N-
+ sulfate

pH= 5-9 pH = 3-4


R–N=C=S R C N + S
isothiocyanate nitrile
"R" "R"
R–S–C ≡ N
SCN - oxazolidine-2-thion CN -

Figure 3.2.3: Schéma général de l’hydrolyse enzymatique des glucosinolates


(“R” dépendant de la structure du groupe R)

Le reste de la molécule se réforme vers un isothiocyanate ou un nitrile, en fonction du pH. En fonction


de la structure du R-groupe, l’isothiocyanate est transformé en thiocyanate et ensuite éventuellement
encore en ion de thiocyanate ou en oxazolidine-2-thione.

125
La formule développée de l’oxazolidone-2-thione le plus important, le dérivé 5-vinyle, est repris dans
Figure 3.2.4. Ici on retrouve la séquence N-C-S, ce qui est typique pour une substance à effet
antithyroïdien. Le 5-vinyle-1,3-oxazolidine-2-thione a reçut à sa découverte le nom vulgaire de
« goitrine », ceci par son pouvoir de générer un goitre chez l’être humain et l’animal. Le glucosinolate
d’où la goitrine est formée s’appelle la « progoitrine ». Le colza peut contenir jusqu’à 1% de
glucosinolates.

Figure 3.2.4: formule développée de 5-vinyl-1,3-oxazolidine-2-thione

On retrouve la séquence N-C-S aussi dans la plupart des agents antithyroïdiens xénobiotiques.
Ceux-ci contiennent les dérivés de thiouracil et mercaptoimidazole:

o Analogues du thiouracil (entre autres, le méthylthiouracil et le propylthiouracil);

o Analogues du mercaptoimidazole (le tapazole et le mercaptobenzimidazole).

Lors d’utilisation illicite, c’était surtout le méthylthiouracil (MTU) qui était utilisé. MTU a connu une
utilisation très importante durant les années 70.

CH 3
C H3 N SH
SH
N SH NH
N
N N
OH

Méthylthiouracil Tapazole Mercaptobenzimidazole

Figure 3.2.5: formules développées de différents agents antithyroïdiens : méthylthiouracil, tapazole,


mercaptobenzimidazole

A côté de ces deux groupes-ci d’agents antithyroïdiens, il y a encore quelques ions inorganiques,
+ - -
comme le Li , ClO4 et SCN qui ont une activité antithyroïdienne.

126
3.2.2.4 Analytique

Le dépistage des agents antithyroïdiens se fait principalement de deux façons :

o indirect (screening) : en apercevant les symptômes d’une hypothyréose;

o direct (confirmation) : en décelant les résidus des agents antithyroïdiens.

Les symptômes de l’hypothyréose peuvent être aperçus par les moyens suivants :

o macroscopiquement : par exemple, carcasse aqueuse et surtout présence d’une glande


thyroïde agrandie

o analyse gravimétrique : en pesant la glande thyroïde des bovins (> 60 g : suspect)

o microscopique : changements dans l’image histologique de la glande thyroïde;


o clinique-biologique : abaissement de la concentration des hormones thyroïdiennes.

Les deux premières méthodes se situent plus dans le domaine de la médecine vétérinaire, la
troisième méthode et la démonstration des résidus des agents antithyroïdiens se situent dans le
domaine chimique.

Normalement, une glande thyroïde de bovin pèse environ 20 grammes. Parfois, des goitres, typique
pour un animal traité avec des agents antithyroïdiens, ont été observés pesant 200 g et dans un cas
exceptionnel, pesant 1200 g. Néanmoins, la possibilité existe que des animaux traités, avec par
exemple le MTU, ne manifestent pas un accroissement de la glande thyroïde.

Figure 3.2.6: glande thyroïde Figure 3.2.7: un goitre chez l’être humain

Souvent, des discordances claires sont observées entre la recherche chimique et les méthodes
basées sur les symptômes de l’hypothyréose. L’argument le plus important qui peut être cité contre
l’emploi des symptômes de l’hypothyréose comme moyen de détection des agents antithyroïdiens,
est le fait que les symptômes peuvent être provoqués par différents facteurs incontrôlables tels que
certaines maladies, l’efficience d’iodide et la présence des agents antithyroïdiens naturels.
Ces méthodes (=méthodes de screening) ne servent qu’à sélectionner les échantillons pour une
analyse chimique décisive (méthode de confirmation).

127
3.2.2.5 Techniques d’analyse pour les agents antithyroïdiens xénobiotiques

Autrefois la technique de la chromatographie sur couche mince était appliquée pour le dépistage des
agents antithyroïdiens. Pour une détection sensible on devait dérivatiser, ainsi toutes les substances
obtenaient une coloration identique.

Aujourd’hui, dans les Etats Membres de L’UE, la détermination par spectrométrie de masse est
n
impérative selon la Décision 2002/657/UE. Initialement, la GC-MS (ou GC-MS ) était utilisée, mais à
n
présent les agents antithyroïdiens sont presque uniquement détectés par LC-MS ou LC-MS .

3.2.2.6 Matrices

Par des expériences animales il s’avère que les concentrations de MTU dans la glande thyroïde sont
environ 20 à 100 fois plus élevées que la normale dans la viande. Dans le rein aussi les
concentrations sont plus élevées que dans des échantillons de viande. Il est évident que la glande
thyroïde est la matrice idéale pour le dépistage. Toutefois, si la glande thyroïde n’est pas disponible,
on effectue de préférence le dépistage sur le diaphragme. Ce muscle peut facilement être excisé et
identifié, il n’a pas de valeur économique et, en proportion aux autres muscles, contient une
concentration élevée d’agents antithyroïdiens. Chez des animaux vivants, l’urine est la matrice la plus
apte.

3.2.3 Stéroïdes: substances à effet androgène, oestrogène ou gestagène

3.2.3.1 Introduction

L'utilisation des préparations hormonales a été introduite, dans les années cinquante pour l’élevage
du bétail. Il s'agit ici des substances à effet androgène, œstrogène ou gestagène, souvent désignées
sous la dénomination anabolisants. L'utilisation des anabolisants aboutit à une augmentation de
poids plus rapide de l'animal et une conversion améliorée de la nourriture par une rétention d'azote
accrue au cours du traitement.

La notion que certaines de ces substances peut produire un danger pour la santé publique, a pour
cela incité les législateurs au sein de l'UE à interdire totalement l'utilisation de ces substances dans
l’élevage de bétail et d’analyser les résidus dans les animaux de boucherie.

Vu le bénéfice retiré de l'usage des anabolisants dans l’élévage de bétail, il est encore saisi de temps
en temps des préparations hormonales dont l'utilisation nest pas toujours simple à détecter.
L'utilisation des méthodes spécifiques et universelles pour le contrôle de l'utilisation illégale
d'anabolisants suppose une recherche de résidu ciblée dans le matériel animal. Une connaissance
des substances, leurs métabolites, les teneurs d’excrétion et de résidus en fonction des modes de
traitement et la matrice est indispensable.

128
3.2.3.2 Structure et classification

3.2.3.2.1 Classification

Le terme “anabolicum" comprend un très large éventail de componsants qui peuvent être assimilés,
selon leur activité biologique dans la production animale, aux hormones sexuelles. Les anabolisants
peuvent être classés sur base de différents critères (tableau 3.2.1).

La plupart des anabolisants ont une structure de stéroïde. Les stéroïdes peuvent être classés à l'aide
du nombre d'atomes de carbone et le site de production principal. Les oestrogènes, androgènes et
gestagènes possèdent respectivement 18, 19 et 21 atomes de carbone. Selon leur activité hormonale
aussi, les hormones anabolisantes peuvent être réparties en oestrogènes, androgènes et
gestagènes.

Tableau 3.2.1: Classification d’un nombre d’anabolisants

oestrogènes androgènes gestagènes

stéroïdes naturels oestrone testostérone progestérone


(activité par voie orale faible) 17ß-oestradiol hydroxyprogestérone
oestriol

ethinylestradiol nortestosterone medroxyprogesterone


mestranol methyltestosterone melengestrol
trenbolone megestrol
boldenone chloormadinone
stéroïdiens
anabolisants methylboldenone
synthétiques chloortestosterone
(en général actif stanozolol
par voie orale) fluoxymesterone
diethylstilbesterol
non- dienestrol
stéroïdiens hexestrol
zeranol

En outre, en plus d'une classification des stéroïdes anabolisants utilisés par la structure chimique
(stéroïdiens ou non stéroïdiens) d'un éventuel classement par la source (endogène ou exogène).

Comme tels les stéroïdes anabolisants peuvent être divisés en:

o stéroïdes endogènes: les hormones sexuelles qui sont produites naturellement dans le corps
sont présents. Ces stéroïdes sont principalement inactivés par le foie et ne sont donc pas très
actifs par voie orale.

o hormones stéroïdes synthétiques: stéroïdes exogènes ou composés chimiques dont certains


xénobiotiques agissent en mimant les effets des stéroïdes endogènes (aussi appelée
stéroïdes anabolisants exogènes ou xénobiotiques).

129
Les stéroïdes anabolisants xénobiotiques sont les plus actifs par voie orale. Les esters des hormones
naturelles, l'œstradiol, la testostérone et la progestérone, peuvent être considérés comme une classe
intermédiaire. Le terme endogène ou exogène devrait toujours être considéré en fonction des
espèces et du sexe de l'animal. Ainsi, le 19-nortestostérone est endogène dans le porc mâle, le
cheval et le bovin gestant.

3.2.3.3 Oestrogènes

Ceux-ci peuvent être subdivisés en oestrogènes endogènes, semi-synthétiques et synthétiques.

Oestrogènes endogènes

o estrone;

o estradiol;
o estriol.

O OH OH

OH

HO HO HO

Estrone Estradiol Estriol


Figure 3.2.8: Formules de l’ estrone, estradiol et estriol

Parmi ces composés, seulement la forme 17-bêta est active.

En plus du groupe de dérivés d'hormones naturelles, il existe deux groupes principaux d’oestrogènes
non-stéroïdiens: les stilbènes (voir ci-dessus) et zéranol et autres dérivés (voir ci-dessous).

3.2.3.4 Androgènes

La structure de base des androgènes est le squelette androstane avec 19 atomes de carbone et un
groupe 17-hydroxyl, un groupe 3-cétone et une double liaison entre C4 et C5.

Les androgènes peuvent également être divisés en endogènes, semi-synthétiques et synthétiques.

3.2.3.4.1 Androgènes endogènes

Au sens strict les androgènes endogènes comprennent la testostérone et ses métabolites (comme
androstérone et androsténolone). La figure 3.2.9 montre le testostérone et un de ses métabolites,
l’androstérone.

130
OH O

0 H0
H
Testostérone Androstérone
e
Figure 3.2.9: Testostérone et un de ses métabolites

3.2.3.4.2 Androgènes semi-synthétiques

Dans ces dérivés, le groupe 17-OH est estérifié avec un acide organique. Ainsi on crée des
préparations "retard", avec action prolongée par la libération lente de la substance à partir du site
d'injection. Une fois dans la circulation sanguine, l'ester est hydrolysé et ainsi la testostérone libre (le
stéroide endogène) se forme.

Le plus courant est l'ester propionate. L'extension de la durée est presque proportionnelle à la
longueur de la chaîne de carbone dans l'acide.

Dans les sites d'injection, on a déjà trouvé plusieurs esters de testostérone.

3.2.3.4.3 Androgènes xénobiotiques

Il existe plusieurs androgènes xénobiotiques dérivés de la testostérone. Plusieurs groupes sont


discutés ci-dessous:

Un groupe important comprend la 19-nortestostérone ou la nandrolone et ses esters.

La nortestostérone est l'un des plus importants stéroïdes anabolisants. Elle a également tenu une
place particulière dans les androgènes, compte tenu de sa présence naturelle dans le verrat (cochon
mâle) et l'étalon. Des concentrations faibles sont même communes chez les bovins femelles à la fin
de la gestation.

Un autre groupe d’androgènes sont les derivés d’alkyle, comme la 17α méthyl-testostérone. Parce
que le groupe alkyle se trouve sur la position C17, le groupe 17-OH est protégé contre les enzymes
hépatiques de sorte que l'administration perorale est possible.

Le groupe suivant a une double liaison supplémentaire sur la position 1, 2: boldénone et


méthylboldenone (ou methandienon).

La trenbolone peut être dérivée de la testostérone par deux liaisons doubles supplémentaires: sur la
position 9,10 et 12,13 (‘tren’ est également dérivé de triène: trois doubles liaisons).

Un autre anabolisant important qui est classé chez les androgènes est le stanozolol. La structure du
stanozolol est très différente des androgènes précédents par la présence d'un anneau pyrazol.

131
3.2.3.5 Gestagènes

La structure de base des gestagènes est le squelette pregnane. Comme avec les oestrogènes et les
androgènes, on peut également faire la distinction entre les gestagènes endogènes, les gestagènes
semi-synthétiques et les gestagènes synthétiques.

3.2.3.5.1 Gestagènes endogènes

La progestérone est aussi appelée l’hormone du "corpus luteum" . La forme de l'excrétion de la


progestérone dans l'urine est le pregnanediol.

Un autre gestagène naturel est 17α-hydroxyprogestérone.

CH3 CH3

C=0 C=0
OH
17

0 0
Progestérone Hydroxyprogestérone
Figure 3.2.10: Formules structurelles de progestérone et de 17α-hydroxyprogestérone

3.2.3.5.2 Gestagènes semi-synthétiques

Les esters de l’hydroxyprogestérone peuvent être classés dans cette catégorie. En particulier les
esters acétate et caproate du 17-hydroxyprogestérone sont importants (acetoxyprogestérone et
caproxyprogestérone). Par hydrolyse, ils donnent la 17-hydroxyprogestérone. Les esters en tant que
tels, peut être trouvés dans la graisse rénale.

3.2.3.5.3 Gestagènes synthétiques

La figure suivante présente quelques uns des principaux gestagènes synthétiques:


médroxyprogestérone (acétate), chlormadinone (acétate), mégestrol (acétate) et mélengestrol
(acétate).

Elles peuvent être dérivées de la (hydroxy) progestérone par substitution d'un groupe méthyle sur la
6-position et une double liaison supplémentaire sur la position 6,7. Le mélengestrol (acétate) a un
groupe CH2 supplémentaire sur le C16 et pour le chlormadinone, le groupe méthyle C6 est remplacé
par un chlore.
En particulier, les esters d'acétate sont connus pour s'accumuler dans la graisse rénale.

132
3.2.3.6 Réponse de croissance

La première enquête sur l'utilisation de stéroïdes anabolisants en tant que promoteur de croissance
chez les animaux remonte à 1939, notamment en matière d’estradiolbenzoate chez les volailles
(Zandek et Marx, 1939). Après la synthèse du DES (Dodds et al, 1938), ce produit , relativement peu
coûteux, actif par voie orale a d'abord été testé chez les volailles. Les expériences avec des
androgènes ont commencé environ 10 ans plus tard (Andrews et al, 1949). L'impact économique des
stéroïdes anabolisants est considérable: dans l'utilisation américaine de stéroïdes anabolisants chez
les bovins il y a des marges de profit indiqué d'environ 17 $ par animal. Sur le marché de détail, la
marge bénéficiaire devrait encore augmenter ( États-Unis, la pratique juridique, Hancock, 1990).

Les substances anabolisantes accélèrent la croissance globale des tissus et augmentent aussi la
conversion des aliments dans les protéines musculaires (augmentation de la conversion des
aliments). Outre ce gain de poids accru, il se produit généralement une amélioration de la qualité des
carcasses. La réponse est très différente en fonction de la préparation, l'espèce et le sexe de l'animal.
En outre, l'utilisation de stéroïdes anabolisants affecte aussi la qualité de la viande elle-même.

3.2.4 Zéranol et dérivés

3.2.4.1 Structure

Le zéranol est un produit à effet estrogénique mais avec une structure totalement différente de
l’estradiol et des stéroïdes. Le zéranol a des propriétés de stimulation de croissance. Il faut dire que
la forme "active" est la forme 7-α, tandis que pour les substances à structure stéroïde la forme β est la
forme "active".

2
Le zéranol peut être formé in vivo par la mycotoxine zéaralénone. La zéaralénone peut être trouvée
entre autres dans le maïs infecté. Il a des propriétés estrogéniques et peut être produit en grandes
quantités par des cultures de certaines moisissures (par exemple Fusarium roseum ; 3-15 g de
produit par kg de culture de moisissure). Le zéranol a une activité estrogénique plus grande que le
zéaralénone. L'utilisation de zéranol est interdite dans l'UE.

En déterminant le zéranol et/ou le taléranol (le métabolite principal de zéranol) dans p.ex. l'urine des
animaux, il est important de vérifier si on ne peut pas l’attribuer à la présence des mycotoxines. Le
tableau ci-dessous montre clairement que, dans le cas de mycotoxine, le zéaralénone, le β-
zearalenol et/ou le α-zearalenol seront également présents, ce qui n'est pas le cas lors de l'utilisation
de zéranol comme anabolisant.

2
dans l’organisme vivant

133
OH O CH3

HO O
zearalenone

OH O CH3 OH O CH3

O O
H OH
HO OH HO H
β-zearalenol α-zearalenol
FUSARIUM
FUNGUS
OH O CH3 OH O CH3

O O
OH
H
HO OH HO H
α-zearalanol
β-zearalanol (zeranol)
(taleranol)

OH O C H3

ZERANOL IMPLANT
O

HO O
zearalanone

Figure 3.2.11: Zéranol et les dérivés provenant d’un traitement et les substances apparentées
produites par la moisissure Fusarium

3.2.4.2 Techniques d’analyses

n n
GC-MS/MS ou GC-MS et LC-MS/MS ou LC-MS .

3.2.5 ß-agonistes

3.2.5.1 Introduction

Les exigences des consommateurs pour la viande sont de plus en plus strictes. Ils demandent une
viande tendre et maigre à un prix raisonnable. La qualité des animaux d'abattage est parfois vue
comme un volume musculaire qui doit être le plus grand possible au moment de l’abattage.

Pour ces raisons, on se sert parfois de substances non autorisées /non reconnues ou de l’emploi
abusif des médicaments. Les ß-agonistes, par exemple le clenbutérol le plus connu d’entre eux, sont

134
donc arrivés dans l’engraissement en tant que promoteur de croissance: à l’origine utilisé comme un
bronchodilatateur (utilisé en médicine humaine pour des problèmes respiratoires et l’asthme) et
ensuite, comme redistributeur, basé sur leurs effets secondaires d’une meilleure utilisation des
nutriments. Il y a moins de graisse et le tissu graisseux est même activement dégradé, tandis qu’il y a
plus de tissu musculaire. Ce qui induit une conversion alimentaire améliorée.

3.2.5.2 Effets et la toxicité pour les humains et/ou animaux

Le clenbutérol et d'autres ß-agonistes appartiennent au groupe des ß2-sélectifs agonistes ou bêta-


mimétiques. L'effet est exercé par la stimulation de récepteurs spécifiques. Ces récepteurs sont
normalement stimulés par l’adrénaline et la noradrénaline (qui sont synthétisés et répandus par les
glandes surrénales après stimulation par le système nerveux sympathique) (Figure 3.2.12). Après la
liaison des ß-agonistes sur ces récepteurs, situés sur la membrane cellulaire, de nombreuses
réactions ont lieu. Après stimulation des récepteurs, l'AMP cyclique est produit dans la cellule, celui-ci
fonctionne comme messager secondaire et apporte, par influence du métabolisme dans la cellule,
certains effets.

H H OH H

HO C — C — N—CH 3 HO CH — C – NH 2
H
OH H H H
HO HO
Adrénaline Noradrénaline

Figure 3.2.12: formules développées de l’adrénaline et de la noradrénaline

Les récepteurs peuvent être divisés en α- et β-récepteurs, ce dernier groupe peut encore être
subdivisé en β1- et β2-récepteurs. Tout comme pour la présence de récepteurs dans le système
nerveux central, on peut faire la classification suivante des récepteurs dans les divers tissus (Tableau
3.2.2):

Tableau 3.2.2. Localisation et effet de α- , β1- et β2-récepteurs

Récepteur Effet après stimulation du récepteur

Α constriction des vaisseaux sanguins, en particulier dans les zones cutanées et


intestinales

β1 augmentation du rythme cardiaque, augmentation du débit systolique et la vitesse de


conduction cardiaque, raccourcissement de la période réfractaire cardiaque,
augmentation de la glycogénolyse et la lipolyse
β2 relaxation des muscles bronches, relaxation du muscle utérus

Les ß-agonistes sont des substances apparentées (corps) à l’adrénaline et la noradrénaline, où, par
des modifications chimiques, la fonction ß2 est renforcée par rapport aux fonctions α et ß1. La

135
fonction ß1 reste présente chez la plupart des composés. En particulier à des doses plus élevées ou
à une application plus fréquente, des effets secondaires peuvent se produire. Ceci concerne en
général des effets sur le cœur (voir Tableau 3.2.2). En outre, l’effet est prolongé par un métabolisme
modifié, moins rapide.

Contrairement aux stéroïdes anabolisants, il y a des effets toxiques aigus des résidus de bêta-
agonistes qui sont décrits. En France et en Espagne un certain nombre de personnes sont tombées
malades après avoir mangé du foie d'animaux traités avec le clenbutérol. En Espagne, il s’agissait en
1990 de 125 personnes dans 43 familles localisées dans 4 provinces. Aussi les "dealers" du
clenbutérol devenaient la victime mortelle de leurs propre préparations (Irlande).
Le clenbutérol est parfois également appelé "Angel Dust" (poudre d'ange). En Chine, plus de 300
personnes ont été hospitalisées après avoir consommé de la viande de porc provenant d'animaux
traités avec le clenbutérol (septembre 2006). Les symptômes sont des tremblements prononcés des
mains et des pieds, des palpitations cardiaques, nausées, maux de têtes et vertiges.

3.2.5.3 Structure et groupes principaux

Les ß-agonistes ont une structure de base commune: la phényléthylamine. Ils appartiennent au
groupe des aryléthanolamines.

CH – CH – NH CH – CH – NH – R
2 2 2 | 2
OH
-Phényléthylamine Aryléthanolamine

Figure 3.2.13: structure de base du phényléthylamine et de l’aryléthanolamine

3.2.5.4 Méthodes d’analyse

Pour l'analyse des ß-agonistes de nombreuses méthodes sont décrites. Elles sont principalement
basées sur des méthodes immunologiques et chimiques (HPTLC, HPLC, GC-MS et LC-MS). Il y a
aussi des méthodes générales qui n’examinent pas le résidu, mais l'effet des ß-agonistes. Étant
donné la grande variété des ß-agonistes, l'utilisation des méthodes de dépistage sont
recommandées. Elles sont basées sur des méthodes immunochimiques (avec un anticorps non-
spécifique) ou p.e. des paramètres physiologiques.

3.2.5.4.1 Méthode de dépistage

Au RIKILT-DLO on a découvert que les concentrations de créatinine et de lactate dans l’urine des
veaux est indicative de l'utilisation des ß-agonistes.

Ces concentrations peuvent être mesurées par des analyses enzymatiques. Des dizaines d'analyses
d'échantillons par heure sont possibles en utilisant un ‘auto-analyser’. Il est également possible de
développer une méthode applicable "sur place" à la ferme, basée sur ce type d’analyse.

136
3.2.5.4.2 Méthodes immunochimiques

Pour les ß-agonistes des méthodes immunochimiques (ELISAs) peuvent être utilisées. Les anticorps
aux ß-agonistes sont surtout spécifiques aux groupes et moins aux produits. De ce fait de multiples ß-
agonistes peuvent être recerchés simultanément. Plusieurs ‘kits’ commerciaux sont disponibles.

3.2.5.4.3 Méthodes chimiques

Purification

Pour les techniques d'extraction et de purification plusieurs techniques sont décrites.

En raison de la présence de groupes à la fois acides et basiques dans des phénols relativement
polaires et les résorcinols il faut , en cas d'extraction liquide-liquide, utiliser des solvants polaires, ce
qui conduit à la co-extraction de nombreux composés interférents de la matrice. Pour les multi-
méthodes le choix du pH est important (uniquement en milieu acide tous les ß-agonistes sont chargés
positivement. L’extraction paire d’ions a également été décrite et la SPE a fréquemment été utilisée
(C4, C8 et C18 mélangé avec l’échangeur des cations). La chromatographie d'immuno-affinité a
également été utilisée, tandis que, plus récemment, l'utilisation des MIPs est apparue très intéressant
pour une bonne purification.

Méthodes HPLC

Pour la détermination du clenbutérol dans l'urine, les tissus, le fourrage et les préparations, un certain
nombre de méthodes HPLC ont été décrites. Dans la plupart des cas il s’agit de chromatographie par
paire d’ions en phase inversée avec détection électrochimique ou détection diode-array.

Une dérivatisation sélective postcolonne a aussi été appliquée sous la forme d’une réaction Bratton
Marshall (diazotation et formation d'un colorant diazo).Seuls les composés du groupe des anillines
peuvent être recherchés avec cette réaction. Maintenant les méthodes HPLC ne peuvent être
utilisées que comme techniques de dépistage ou comme techniques pour la purification des extraits
de matériel biologique. Pour l’examen de confirmation il faut utiliser des analyses GC-MS ou LC-MS.

Méthodes de spectrométrie de masse

Dans les États membres de l'UE, la spectrométrie de masse est exigée par la décision 2002/657/CE
pour la confirmation de la présence de ces substances, comme pour d'autres substances interdites
(composés de l’annexe A).

Pour la recherche en GC-MS, les bêta-agonistes doivent, à cause de leurs forte polarité, être
derivatisés, en composés plus volatils. En fonction du réactif utilisé, les groupes hydroxy et amino
sont convertis en dérivés moins polaires. La silylation de l'hydroxyle à une O-TMS ou un O-éther de
butyle tertiaire dimethylsilyl (O-TBDMS) est largement utilisée. En outre, une acylation des deux
groupes hydroxyle et amine est possible (TFA, PFPA ou HFB).
Une combinaison de silylation et acylation a également été utilisée (des dérivés O-TMS/N-TFA sont
formés).

137
La formation de dérivés cycliques de l'acide borique est un fait intéressant (Leloux et al., 1989). La
fragmentation de la chaîne latérale est en partie empêchée et des fragments de masse plus élevée
sont obtenus. En plus de l’amélioration de la volatilité, la dérivatisation joue un rôle important dans la
fragmentation. L'intégration de différents groupes modifie la molécule de sorte que lors de la
fragmentation au spectromètre de masse (en particulier dans le cas d’ ionisation plus dure par impact
d'électrons) certains fragments sont mieux stabilisés et obtiennent une plus grande intensité dans le
spectre de masse. Cela offre la possibilité d'influencer la fragmentation de telle sorte qu’avec des
spectromètres de masse avec uniquement IE, des ions fils plus spécifiques (avec des valeurs de
masse plus élevées) soient détectés à une limite de détection assez basse.

Cl
O C4 H 9
B
H2 N
N
C(CH3 )3
Cl
Figure 3.2.14: des dérivés cycliques de l'acide borique de clenbutérol

Dans les dérivés O-éther de TMS ,par exemple le clenbutérol (obtenu par spectrométrie par impact
d’électrons) est obtenu. Le spectre de masse du clenbutérol montre une masse dominante (m/e 86)
en brisant la chaîne latérale. L'autre fragment (m/e 262) et les autres fragments à masse plus élevée,
n’apparaissent qu’en faible intensité. En figure 3.2.15, le spectre de masse du TMS dérivé du
clenbutérol, dans un système de iontrap, est affiché en mode EI.

100% 86

CLENBUTEROL 335
SMP MSTFA/TMSI EI
-
BKG

300

227

116 262 320 405


182 210 421

100 150 200 250 300 350 400 450 500


Figure 3.2.15: Spectre de masse de clenbutérol-O-TMS (en EI)

n
Aujourd'hui surtout la LC-MS est utilisée (LC- MS et aussi LC-MS/MS), de sorte qu’il n’y a plus de
problèmes de dérivatisation. Dans les méthodes de spectrométrie de masse, les analogues deutérés
des bêta-agonistes sont utilisés comme étalon interne, ce qui est très favorable à la quantification.

138
3.2.5.5 Matrices

De nombreuses matrices pour l'analyse des bêta-agonistes sont décrites. On peut analyser aussi
bien l’urine que les matières fécales d’animaux vivants. Lors d’échantillonage à la ferme, on doit
également avoir la possibilité d’analyser l'eau, des aliments et des mélanges à base d’herbes. Pour
les animaux abattus, les reins et le foie sont plus intéressants que la viande, car les niveaux de
résidus sont plus élevés et restent plus longtemps. Pour démontrer l’usage des beta-agonistes
longtemps après l'arrêt du traitement, des poils (de préférence foncés) et la rétine sont spécialement
indiqués.

3.2.6 Les composés Annexe IV

Les composés énumérés dans l'annexe IV du Règlement (CEE) nr. 2377/90 du Conseil sont des
substances pharmacologiquement actives pour lesquelles les niveaux maximaux admissibles ne
peuvent pas être établis. Le danger de l'utilisation de ces substances est connu, mais il est impossible
de déterminer le risque d’un traitement (par exemple, cancérigène) et une LMR ne peut pas être
enregistrée. Ces substances ne sont pas autorisées dans l'UE. Par l'abrogation du règlement (CEE)
N° 2454/93. 2377/90, ces substances sont inclus dans la tableau 2 "Substances interdites" du
Règlement (UE) n° 37/2010 du 22 de la commission du décembre 2009 « relatif aux substances
pharmacologiquement actives et à leur classification en ce qui concerne les limites maximales de
résidus dans les aliments d’origine animale ».

3.2.6.1 Chloramphénicol

3.2.6.1.1 3.2.6.1.1 Structure

Figure 3.2.16: Formule structurelle de chloramphénicol

3.2.6.1.2 Fonctions

Chloramphénicol inhibe la synthèse protéique au niveau des ribosomes. Il s'agit d'un antibiotique
bactériostatique, actif contre les organismes Gram+ et Gram-. Il est insoluble dans l'eau et très
soluble dans les graisses.
A l'origine le chloramphénicol a été dérivé de la bactérie Streptomyces venzuelae. Il a été le premier
antibiotique qui a été préparé à grande échelle.

139
Le chloramphénicol est métabolisé en glucuronate de chloramphénicol dans le foie. La plupart du
chloramphénicol administré est excrété par les reins sous forme du métabolite inactif, glucuronate de
chloramphénicol.

3.2.6.1.3 Utilisation et toxicité

Chez les êtres humains le chloramphénicol peut endommager irréversiblement la moelle osseuse, et
peut causer l’aplasie hématopoïétique (anémie aplastique). Pour cette raison l’usage du
chloramphénicol est devenu interdit dans l’Union Européenne. Dans les pays à faibles salaires c’est
encore utilisé parce que le chloramphénicol est bon marché.

3.2.6.1.4 Technique d’analyse

n n
ELISA pour le screening et GC-MS(/MS) ou GC-MS et LC-MS/MS ou LC-MS pour les confirmations.

3.2.6.2 Dapsone

3.2.6.2.1 Structure

La dapsone est un antibiotique dont le mécanisme d'action est très comparable à l’action des
sulfonamides (voir ci-dessous).

Figure 3.2.17: Formule structurelle de dapsone

3.2.6.2.2 Technique d’analyse

n
LC-MS(/MS) et LC-MS .

3.2.6.3 Nitroimidazoles

3.2.6.3.1 Structure

Les nitroimidazoles sont surtout utilisés pour traiter les infections à parasites protozoaires. Ces
substances ont donc souvent été utilisées pour la prévention et le traitement de la « maladie de la
tête noire » (histomonose) chez les dindes et autres volailles, pour la prévention de la trichomonase
chez d'autres oiseaux et pour le traitement de la trichomonase chez les bovins. Ces composés
synthétiques sont également importants dans le traitement des infections bactériennes anaérobies.

140
Leur structure de base est un anneau imidazole avec un groupe nitro (NO2). Les nitroimidazoles les
plus courants ont été le dimétridazole, le ronidazole, le métronidazole et l’ipronidazole.

dimetridazole ronidazole

Figure 3.2.18: Formule structurelle du dimetridazole et duronidazole

3.2.6.3.2 Technique d’analyse

n n
ELISA, LC-MS/MS ou LC-MS et GC-MS/MS et GC-MS .

Outre le dimétridazole, le métronidazole et les métabolites hydroxylés HMMNI et MNZOH sont aussi à
déterminer.

3.2.6.3.3 La toxicité humaine et / ou animale

Surtout leurs métabolites qui possèdent une structure nitroso sont potentiellement cancérogènes et
mutagènes. L'utilisation de nitroimidazoles est interdite dans les animaux destinés à la
consommation.

3.2.6.4 Nitrofuranes

3.2.6.4.1 Structure

L'effet des nitrofuranes est basé sur l'inhibition de certaines enzymes microbiennes impliquées dans
le métabolisme des glucides. Les nitrofuranes sont rapidement métabolisés in vivo et leurs
métabolites se lient facilement avec les protéines tissulaires.

Exemples de nitrofuranes et leurs métabolites:


o furazolidon avec le métabolite le 3-amino-2-oxazolidinon (AOZ)
o furaltadone avec le métabolite le 3-amino-5-2-morpholinomethyl-oxazolidinon (AMOZ)
o nitrofurazone avec le métabolite semicarbazide (SEM)
o nitrofurantoïne avec le métabolite le 1-aminohydantoin (AHD)

O 2N O CH N

N O

O
Figure 3.2.19: Formule structuelle du furazolidon

141
3.2.6.4.2 Effets et toxicité

Les nitrofuranes ont été largement utilisés pour traiter les infections gastro-intestinales telles que des
infections à E. coli chez les volailles et les infections à Salmonella chez les porcs et les veaux. Dans
l'UE, on en a interdit l'utilisation pour les animaux destinés à la consommation en juin 1995. Cela fait
suite aux préoccupations croissantes concernant la cancérogénicité et la mutagénicité éventuelle des
nitrofuranes.

3.2.6.4.3 Technique d’analyse

n
ELISA et LC-MS/MS ou LC-MS .

3.2.6.5 Critères

La décision 2002/657/CE de l'UE fixe les modalités et les méthodes d'analyse qu’il faut utiliser pour
les échantillons de tests officiels, prélevés comme défini dans la directive 96/23/CE. La qualité et la
comparabilité des analyses de différents laboratoires devraient être assurées. Il est donc nécessaire
que les méthodes appliquées soient validées sur la base de procédures communes et de critères de
performance. Ces critères de performance ainsi que les critères pour l'interprétation des résultats
d'analyse sont définis dans la décision 2002/657/CE.

142
3.3 Antibiotiques

3.3.1 Introduction

Dans l'élevage moderne on utilise une grande variété d'antibiotiques. Le but de l'administration légale
d’antibiotiques aux animaux est de lutter contre la maladie ou pour empêcher la propagation de
maladies là où l’agriculture est intensive. A coté de l'utilisation légale des produits vétérinaires,
certains produits sont également utilisés illégalement comme promoteur de croissance.

L'utilisation inappropriée ou le non-respect des délais d'attente peuvent conduire à la présence de


résidus dans les aliments d'origine animale. Ces résidus peuvent être nuisibles pour l’homme et
provoquer des réactions allergiques. Afin d'éviter de retrouver des concentrations nocives dans la
chaîne alimentaire, l'Union Européenne a fixé des limites maximales de résidus (LMR). Certains
antibiotiques (par exemple, le chloramphénicol) sont même toxiques et leur utilisation a également
été interdite par l'Union Européenne (voir ci-dessus).

Antibiotiques et médicaments chimiothérapeutiques:

Le concept classique des antibiotiques concerne des substances antibiotiques dérivées de la matière
vivante et servant à combattre des agents pathogènes (principalement des bactéries dans
l'organisme), contrairement aux produits chimiothérapeutiques qui sont préparés par l’homme de
manière synthétique. Un exemple de cette dernière catégorie est le groupe des sulfamides (découvert
en 1935). Aujourd'hui, cette distinction n'est plus strictement appliquée et on parle des antibiotiques
pour toutes les substances qui peuvent être administrées aux humains pour combattre les infections
bactériennes.
Il existe deux groupes importants d'antibiotiques: les bactéricides, qui tuent les bactéries et les
bactériostatiques ou les inhibiteurs de bactéries, qui empêchent la croissance des germes. Les ß-
lactams, les fluoroquinolones et la majorité des aminosides sont bactéricides, la pénicilline, par
exemple, affaiblit la paroi cellulaire. La bactérie explose en raison de sa propre pression osmotique.
Les tétracyclines, le chloramphénicol, les macrolides et les sulfamides sont bactériostatiques: ils ne
tuent pas les bactéries mais empêchent leur croissance.

3.3.2 Sulfamides et Triméthoprime

3.3.2.1 Structure

Les sulfamides ont des structures analogues à l'acide p-aminobenzoïque (PABA) (Figure 3.3.1) dont
la structure de base est le benzènesulfonamide (Figure 3.3.2). Le terme sulfamides est souvent
abrégé en sulfa’s.

Figure 3.3.1: Formule structuelle de l'acide p-aminobenzoïque (PABA)

143
Figure 3.3.2: structure de base de sulfamide

3.3.2.2 Propriétés

Triméthoprime

Le triméthoprime, un diaminopyrimidin est bactériostatique et inhibe la synthèse de l'acide folique. La


cible enzymatique est différente de celle des sulfamides. Le triméthoprime est actif contre les
bactéries Gram + et Gram-, mais pas contre les anaérobies.

Sulfamides associés au triméthoprime

Actuellement, les sulfamides sont souvent associés au triméthoprime en raison d'effets synergiques.
Ces combinaisons, souvent dans un rapport de 5/1, deviennent bactéricides.

3.3.2.3 Utilisation

Les sulfamides sont surtout utilisés dans le traitement par voie orale des coccidioses (volaille,
ruminants) ou des infections urinaires et digestives chez les carnivores. Les sulfonamides les plus
couramment utilisés en médecine vétérinaire sont la sulphamethazine (sulfadimidine),
sulfadiméthoxine, sulfapyridine, sulfamerazine et sulfadiazine.

En médecine vétérinaire les sulfamides ne sont pas seulement utilisés à des fins thérapeutiques.
Depuis 1950, ils ont également été utilisés pour prévenir les infections causées par des bactéries ou
des protozoaires. En plus , on peut utiliser les sulfamides comme additifs de croissance.

3.3.2.4 Technique d’analyse

Five plate test (STAR), le Premi test, ELISA, CHARM II, HPLC-DAD, HPLC-fluo, LC-MS/MS et LC-
MSn (LMR: Σ 100 g / kg).

3.3.3 ß-lactamines

3.3.3.1 Structure

Les bêta-lactamines, possèdent un noyau bêta-lactame qui leur confère une activité antibactérienne.
Ce noyau est composé de trois atomes de carbone et d’un atome d'azote.

144
Les ß-lactamines sont répartis dans différentes catégories comme les pénicillines, céphalosporines,
monobactams et carbapénèmes. Les ß-lactamines
ß lactamines les plus couramment utilisés sont dans les
groupes des pénicillines et des céphalosporines. Les deux classes ont des chaînes latérales l
implantées respectivement sur l’acide 6-aminopénicilane
6 aminopénicilane ou sur le noyau de l’acide 7- 7
aminocephalosporane. La structure de base
b des pénicillines est décrite à la Figure 3.3.3.
3.3.3 La structure
de base des céphalosporines est décrite à la Figure 3.3.4.

Figure 3.3.3: structure de base des pénicillines

Figure 3.3.4: structure de base des céphalosporines

3.3.3.2 Propriétés

3.3.3.2.1 Penicillines

Les pénicillines sont les antibiotiques les plus anciens et le groupe le plus connu. La benzylpénicilline
a été la première de la famille des pénicillines. Toutes les autres pénicillines en sont des dérivés.

En médecine vétérinaire, on utilise deux types de pénicillines: les benzylpenicillines dont le spectre
est principalement limité aux germes GRAM + (antibiotiques
(antibiotiques à spectre étroit, p.e. Benzylpénicilline et
benzylpénicilline procaïne), et les aminopénicillines qui travaillent aussi contre les germes Gram-
Gram (
antibiotiques à large spectre, p.e. amoxicilline et l'ampicilline).

Les pénicillines principales sont la pénicilline G (benzylpénicilline), la pénicilline V (phenoxymethyl-


(phenoxymethyl
penicilline), l'amoxicilline, nafcilline, oxacilline, flucloxalline, methicilline, cloxacilline et dicloxacilline.

145
3.3.3.2.2 Céphalosporines

Les céphalosporines possèdent un cycle dihydrothiazine attaché au noyau bêta-lactame, qui


augmente leur résistance aux bêta-lactamases. Leur mécanisme d'action est semblable à celui des
pénicillines. Traditionnellement, les céphalosporines sont classées par "générations", de la première à
la quatrième, ce qui correspondent à une chronologie de mise sur le marché et, dans une certaine
mesure, à leur spectre d'activité. Les céphalosporines de première génération sont essentiellement
actives sur les GRAM+ mais aussi sur les staphylocoques et les streptocoques. Des exemples de
céphalosporines de première génération sont : la céphacétrile, céphalexine, céphalonium et la
céphazoline.

Les céphalosporines du deuxième génération (p.e. céphalor), ont un spectre d'activité proche de celui
de la première génération. Elles ont une activité plus marquée vis-à-vis les germes GRAM-.

Les céphalosporines de troisième génération (p.e. ceftiofur et céfapérazone) ont une activité moins
marquée vis-à-vis des staphylocoques que celles de la première et la deuxième génération. Mais
elles sont plus actives sur les germes GRAM- que les céphalosporines de la première et de deuxième
génération.

Les céphalosporines de la quatrième génération (p.e. cefquinome) ont un spectre vraiment élargi,
avec une activité sur les GRAM+ comparable à celles de la première génération, alors que leur
activité contre les GRAM- est plus marquée que celles de la troisième génération.

Les céphalosporines les plus importantes sont le ceftiofur, cefquinome, céphapirine, céphazolin,
céfacétrile, céphaperazone et céfalexine.
Ils sont principalement excrétés sous forme de médicament parentéral dans l'urine.

3.3.3.3 Utilisation

Les pénicillines ont une très faible toxicité, même à des posologies largement supérieures aux doses
recommandées. Des réactions croisées d'hypersensibilité comme des chocs et des œdèmes,
peuvent toutefois être observées.

On peut associer la pénicilline à l’acide clavulanique. Ce composé possède aussi un noyau β-


lactame, mais au contraire des antibiotiques il n’est pas inactivé par la β-lactamase, une enzyme
développée par certains bactéries résistantes, mais forme un complexa stable avec les pénicillines,
ce qui empêche l’enzyme de dégrader la pénicilline.

Les pénicillines et les céphalosporines sont principalement utilisées contre le mastitis (mammites)
chez les bovins, les ovins et les caprins. Les produits utilisés sont notamment l'oxacilline,
dicloxacilline, céfacétrile, céfalonium, céfazoline, céfalexine et la céphapirine.

3.3.3.4 Technique d’analyse

Essais biologiques, les essais de récepteurs, de l'immuno-essais, HPLC-UV, HPLC-DAD, HPLC-


n
détection par fluorescence, LC-MS , LC-MS/MS.

146
3.3.4 Fluoroquinolones

3.3.4.1 Structure

Les quinolones et les fluoroquinolones sont un groupe relativement nouveau de composés


synthétiques antibactérien. Elles sont dérivées de l’acide naldixine. Les quinolones de première
génération appartiennent au groupe de l’acide naldixine et de l’acide oxolinique. La majorité des
quinolones cliniquement utilisés sont parmi les quinolones de la deuxième génération: les
fluoroquinolones (par exemples: ciprofloxacine, iprofloxacine, saraflocxacin, fluméquine et
enrofloxacine). Celles-ci
ci sont fluorés
fluoré sur le cycle central.

Figure 3.3.5 : Formule structurelle d’acide naldixine et d’acide ciprofloxacine

3.3.4.2 Utilisation

La flumequine est utilisée dans le traitement des infections digestives et urinaire chez les animaux de
rente. Des dérivés les plus récemment développés sont l'enrofloxacine, la marbofloxacine, la
danofloxacine, la difloxacine, l'ibafloxacine et l'orbifloxacine.
l'orbiflox

Après administration orale de ces substances aux animaux de rente, il est possible que des facteurs
de résistance de la flore intestinale de ces animaux soient transférés à la flore intestinale de l'homme.
Ainsi, l'utilisation d'enrofloxacine chez les volailles pourrait conduire à l'élaboration de Campylobacter
résistantes aux fluoroquinolones, un agent pathogène pour l'homme.

3.3.4.3 Technique d’analyse

n
Bioassays, ELISA, HPLC-FLD,
FLD, LC-MS
LC , LC-MS/MS.

3.3.5 Macrolides

3.3.5.1 Structure

Les macrolides sont un grand groupe d'antibiotiques, qui se caractérisent par la présence d'un
macrocycle lactonique, dans laquelle un ou plusieurs amino-
amino et sucres deoxyglucoses (généralement
cladinose et desosamine) sont implantés.

147
Figure 3.3.6: structure chimique de l’erythromycine (le macrocycle lactonique est le cycle dans la
partie supérieure)

3.3.5.2 Techniques d’analyse

Bio-assays, Receptor-assays, immuno-assays, LC-MSn, LC-MS/MS

3.3.6 Florfénicol et Substances apparentées

3.3.6.1 Structure

Le thiamfenicol est l’analogue sulfonyle-méthyle du chloramphénicol, tandis que le florfenicol est un


analogue synthétique fluorisé du thiamfenicol. Ci-dessous la structure du thiamfenicol.

Figure 3.3.7: structure chimique du thiamphénicol

148
3.3.6.2 Caractéristiques

Chloramphénicol est produit par l’Actinomyces Venezuela, qui se trouve dans le sol. Chloramphénicol
a été synthétisée pour la première fois en 1949.
Le chloramphénicol, le florfénicol et le thiamfenicol inhibent la synthèse des protéines au niveau des
ribosomes. Ce sont des antibiotiques bactériostatiques et sont actifs contre la plupart des organismes
à gram négatif et à gram positif. Ils sont très liposolubles.
L’élimination de chloramphénicol se faite par l'intermédiaire de métabolisation dans le foie. Le
florfénicol est éliminé via les reins.
Parfois on retrouve le chloramphénicol dans l'ensilage de l'alimentation et de la paille.

3.3.7 Tétracyclines

3.3.7.1 Structure

Les tétracyclines sont constituées d'un squelette de naftacène, dans lequel un certain nombre de
groupes polaires sont implantés. La chlortétracycline, l’oxytétracycline et la tétracycline sont des
composés naturels qui peuvent être isolés de certains Streptomyces spp. La doxycycline est un
dérivé semi-synthétique.

3.3.7.2 Caractéristiques

Les antibiotiques de la famille des tétracycline sont un groupe d'antibiotiques bactériostatiques basé
sur la tétracycline. Les tétracyclines les plus importantes utilisées en médecine vétérinaire sont la
tétracycline, la chlortétracycline, l’oxytétracycline et la doxycycline.

Figure 3.3.8 : structure chimique de la Tétracycline

3.3.7.3 Techniques d’analyse

Bio-assay, Receptor-assay, ELISA, HPLC-UV, HPLC-DAD, HPLC-FLD, LC-MSn, LC-MS/MS (dans le


MRL les tétracyclines et leur 4-epimères sont inclus. Doxycycline n’ a pas de 4-épimère).

3.3.8 Lincosamides

3.3.8.1 Structure

Ce groupe comprend la lincomycine et la clindamycin. La lincomycine est produite par la bactérie


Streptomyces lincolnensis.

149
3.3.8.2 Caractéristiques

Les lincosamides sont actives contre les organismes à gram positif, les anaërobies et les
mycoplasmes. Leur structure et leur mécanisme d'action sont similaires à celle des macrolides.
L’ élimination se faite par l'intermédiaire de métabolisation dans le foie. Chez les porcs, 20% est
éliminé sous forme de médicament parentérale. Chez les poulets, 80% is retrouvé sous forme de
médicament parentérale dans les matières fécales.
fécales

3.3.8.3 Usage

La lincomycine est souvent utilisée en conjonction


conj avec la spectinomycine et ajoutée à l’eau potable
chez les porcs et les poulets.

Au niveau des effets toxiques,


toxique les lincosamides peuvent causer une diarrhée grave avec
éventuellement une issue fatale chez l’homme et les herbivores. Chez les carnivores, les
lincosamides sont bien tolérées. Elles
Elle sont, toutefois, à éviter chez le lapin, le cobaye et le hamster.

3.3.9 Aminoglycosides

3.3.9.1 Structure

Les aminoglycosides ou les aminosides sont des composés cationiques polycycliques


polycycliques qui contiennent
un aminocyclitol sur lequel des sucres-amino
sucres amino sont liés par des liaisons glycosidiques (Figure 3.3.11).
Ils sont très polair et peu liposolubles.
liposolubles

Figure 3.3.9:
3.3. structure chimique de la néomycine

3.3.9.2 Caractéristiques

Les aminoglycosides sont des antibiotiques à large spectre, qui sont produits par Streptomyces et
Micromonospora.. Parmi les aminoglycosides
amino les plus importants à usage vétérinaire: néomycine,
gentamicine, kanamycine et apramycine. Ils sont actifs contre les organismes
organismes aerobies à gram négatif
et aussi contre quelques organismes à gram positif.

150
Les aminoglycosides ont une activité bactéricide par leur capacité à inhiber la synthèse protéique
bactérienne.

Les aminoglycosides sont rapidement absorbés après injection mais ne sont presque pas absorbés
après administration orale et rectale. Ils restent actifs dans le système digestif. Ils sont excrétés dans
les fèces. Fortes concentrations sont trouvées dans l'urine et les reins.

Les aminoglycosides sont particulièrement liés par des liaisons ioniques aux proteines tissulaires et a
des macromolécules, mais la liaison avec les proteines du plasma est minime. Ils sont généralement
retrouvés en faibles concentrations et et sous forme non liée dans les tissus. Ils s'accumulent en
particulier dans les reins et dans d'autres organes tels que le foie.

3.3.9.3 Techniques d’analyse

Bio-assays, Receptor-assays, immuno-assays, LC-MSn, LC-MS/MS.

3.3.10 Polypeptides

3.3.10.1 Structure

La bacitracine est un mélange de decapeptides cycliques liés , produite par Bacillus subtilis var
Tracy.

3.3.10.2 Caractéristiques

La bacitracine empêche la formation de la couche peptidoglycane de la paroi cellulaire bactérienne.

La bacitracine est active contre les organismes aerobies et anaerobies à gram positif mais ne
fonctionne pas contre les bactéries à gram négatif.

Les plus importants représentants des polypeptides sont l’avoparcine, la bacitracine, l’efromycine, la
bambermycine (flavomycin, flavophospolipol) et la virginimyacine.
3.3.10.3 Usage

3.3.11 Glycopeptides

3.3.11.1 Structure

Les glycopeptides se composent d'un peptide glycosylé cyclique ou polycyclique. Le glycopeptide


plus important est la vancomycine.

151
3.3.11.2 Caractéristiques

Les glycopeptides empêchent la formation de la couche peptidoglycane de la paroi cellulaire


bactérienne. Ce sont des antibiotiques à spectre étroit qui sont actifs contre des micro-organismes à
gram positif.

3.3.11.3 Usage

En raison de leur toxicité, leur utilisation est très limitée.

La vancomycine est souvent le dernier recours dans la lutte contre la Staphylococcus aureus
(MRSA), une importante cause d’infections bactérienne en hôpitaux.

3.3.12 Nitrofurans et Nitro-imidazoles

Voir plus haut.

3.3.13 Origine des résidus antibiotiques dans la chaîne alimentaire

Les raisons les plus évidentes de la présence d’importante concentration en résidus d'antibiotiques
dans la chaîne alimentaire sont les abus et le non respect des temps d'attente.

Le temps d'attente est le délai entre l'administration de l'antibiotique à l'animal et la récolte de ses
produits (lait, œufs, viandes, miel, etc..). Lorsque le temps d'attente est trop court, des résidus
d'antibiotiques sont succeptibles de se retrouver dans les produits d’origine animale, et donc dans la
chaîne alimentaire. Ces résidus peuvent dépasser les limites autorisées ou tout simplement ne pas
être autorisé (comme par exemple le chloramphénicol). La raison d’un temps d'attente trop court peut
être entre autre la conséquence d’un suivi inexacte des registres de traitement ou de l’impossibilité
d'identifier les animaux traités.

Un mauvais usage des antibiotiques peut avoir differentes origines; un dépassement de la dose
prescrite pour des produits enregistrés ou l’administration a une espèce animale pour lesquelles
l'antibiotique n'a pas été enregistré conduit à des manquements. Toutefois, il peut s’agir également de
l'utilisation illicite des produits non enregistrés. Certains antibiotiques sont également utilisés
abusivement comme promoteur de croissance.

Les antibiotiques sont administrés aux animaux par injection (intraveneuse, intramusculaire ou sous-
cutanée), par le fourrage ou par l'eau, directement appliquer sur la peau ou par perfusion
intramammaire et intrauteriène. Tous ces modes d’administration peuvent mener à des résidus dans
les produits d'origine animale.

Les injections sous-cutanées et intramusculaires augmentent la probabilité de résidus au niveau des


sites d’injection, mais elles peuvent également donner lieu à de concentrations élevées de résidus
dans le plasma. Les administrations intramammaires, par exemple pour le traitement de la mastite
avec des ß-lactams, peuvent entrainer la présence des résidus dans le lait.

152
Souvent des résidus d’antibiotiques sont aussi trouvés dans des soi-disant animaux "non traités".
Cela peut avoir différents causes :

o "le recyclage des matières fécales" se produit lorsque les résidus d'antibiotiques excrétés
dans les excréments d'animaux traités contaminent le fourrage des animaux non traitées ou
le sol. Cela peut mener à la présence de résidus d'antibiotiques chez les animaux "non
traités". De même lorsque les veaux sont nourris avec du lait provenant de vaches traitées,
cela peut mener à des résidus d’antibiotiques dans les viandes.
o en outre, des antibiotiques indésirables peuvent être administrés aux animaux par la
contamination des aliments. Lorsque, par exemple, après la préparation des aliments
médicamenteux la ligne de production n'est pas suffisant nettoyée, cela peut entrainer la
contamination des lots d’aliments.

3.3.14 Les effets nocifs des résidus d'antibiotiques

3.3.14.1 Résistance

Les résidus d'antibiotiques représentent une menace potentielle pour la santé publique.
L'augmentation la résistance bactérienne est le risque principal en ce qui concerne les antibiotiques.
La résistance est la défense que les bactéries (également des fongus et des virus) développent
contre les moyens utilisés pour les combattre.

Un micro-organisme peut être naturellemen insensible (= résistant) à certains antibiotiques. Un autre


type de résistance est la résistance acquise. Des mutations du matériel génétique se manifestent et
des bactéries peuvent survivre à l'antibiotique. Ce qui va permettre précisément à ces bactéries de se
reproduire. Si cela se produit fréquemment les bactéries résistantes vont dominer les bactéries non
résistantes. Les souches résistantes aux antibiotiques appelées «foodborne» pathogènes comme
Salmonella spp., E. coli et Campylobacter spp. ont été isolées des animaux de ferme. Ces bactéries
résistantes peuvent causer des infections humaines qui sont difficiles à traiter.

3.3.15 L'évaluation des risques et la fixation de LMR

3.3.15.1 L’évaluation des risques

Afin de garantir la sécurité des résidus antimicrobiens présent dans les denrées alimentaires, on a
fixé des LMR. LMR est la limite maximale de résidus.
C'est la norme qui détermine la quantité maximale de résidus d'un médicament vétérinaire, autorisé
par les autorités publiques dans les denrées alimentaires. Une LMR est exprimée en mg/kg ou µg/kg.
Une LMR est utilisée pour garantir la sécurité des denrées alimentaires pour l'homme.

Au sein de l'Europe, les LMR sont harmonisées pour éviter des obstructions des relations
commerciales internationales. Les LMR pour les substances actives dans les médicaments
vétérinaires sont déterminées de manière commune pour tous les pays européens par le CVMP
(Comitee for Veterenary Medical Products) de l’ EMEA (European Agency for the evaluation of
Medical Products) à Londres. Cette Agence est l'organisme qui coordonne la fixation de LMR.

153
L'évaluation des risques est utilisée pour les résidus de médicaments vétérinaires dans l'Union
européenne est semblable à celle utilisée par le groupement de WHO / FAO. L’analyse de risque est
réalisée par le JECFA (Expert Commitee on Food Additives) pour les résidus de médicaments
vétérinaires et est exécutée en conformité avec le Codex Alimentarius.

3.3.15.2 Fixation de l’LMR

Les LMR sont fixées sur base de l’ADI (Acceptable Daily Intake = consommation quotidienne
acceptable) ou de la dose journalière admissible. C'est une estimation de la quantité de résidus,
basée sur le poids corporel, qui peut être prise sur une base quotidienne tout au long de la vie, sans
risque important pour la santé du consommateur (basé sur un poids standard de 60 kg). La base de
calcul de l’ ADI est le NOEL (No-Observed Effect Level). Ceci est estimé sur base d’études
toxicologiques in vitro et in vivo et sur différentes espèces animales. La dose est dérivée des
quantités qui peuvent être administrées pour les espèces les plus sensibles sans qu’ aucun effet
négatif soit détecté (exprimée en milligrammes par kilogramme de poids corporel par jour).

Le NOEL est généralement divisé par 100 afin de parvenir à l’ ADI. On suppose que les personnes
pourraient être dix fois plus sensibles que les animaux, et que la sensibilité pourrait varier dix fois
d’homme à homme. Pour déduire des LMR de l’ ADI, on suppose qu’une personne moyenne
consomme sur une base quotidienne, 500 grammes de viande, 1,5 litres de lait et 100 g d'oeufs ou de
produits d'œufs.

Les LMR ont été fixées par le Règlement 37/2010 CE (tableau 1: Substances autorisées, tableau 2:
Substances interdites).

3.3.16 Détection des substances à effet bactériostatique dans les produits d'origine animale

3.3.16.1 Classement des méthodes d'analyse

Les méthodes d'analyse peuvent être classées dans différentes classes sur la base du principe
utilisé.

3.3.16.1.1 Méthodes microbiologiques

Les méthodes microbiologiques pour la détermination des résidus antimicrobiens sont des tests de
screening rapides. Aux États-Unis on utilise en particulier le Kidney Inhibition Swab (KIS-test), Swab
Test On Premises (STOP) et le Calf Antibiotic and Sulfa Test (CAST).
En Europe, nombreux tests utilisés sont sous forme de tube : La Premi ® test (r-Biopharm), Explorer
(Zeu-Immunotec), de Delvotest, de COPANtest.
Parmi les tests fréquemment utilisés sous forme de plaque : les tests des 4-plaques au niveau
européen (ou une variante de celle-ci), le Screening Test for Antibiotic Residus (STAR) et le Nouws
Antibiotic test (NAT).

154
3.3.16.1.2 Receptor test

Le principe d'un test de récepteur est la liaison des molécules d’antibiotiques avec un récepteur à
spectre large. SNAP (IDEXX), Bèta-star et TetraStar (Neogen), charme-ROSA, Tetrasensor et kits de
Twinsensor (UNISENSOR), Biosensor, CHARM II essais et le Penzym sont des exemples.

3.3.16.1.3 Méthodes Immunochimiques

Ceux-ci peuvent être divisés en deux groupes: immunoassay et chromatographie d’ immunoaffinité.


La méthode ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent) est un exemple d'immunoassay.

3.3.16.1.4 Méthodes physicochimique

Ces méthodes sont basées sur la séparation par chromatographie de résidus suivi de la
quantification spectroscopique comme l’UV, la fluorescence et la spectrométrie de masse. L'utilisation
de LC-MS/MS ou LC-MSn est de plus en plus répandue.

Les méthodes physico-chimiques sont généralement très spécifiques et quantitatives mais prennent
beaucoup de temps si l'identité du résidu n'est pas connue. Par conséquent, ces méthodes sont
fréquemment utilisées comme méthode de confirmation et pas comme méthode de dépistage.

155
3.4 Acrylamide

3.4.1 Structure et/ou les groupes principaux

L’acrylamide produit commercialement est utilisé comme matière première pour la production de
polyacrylamides. Les polyacrylamides sont très absorbants et forment un gel doux. Les
polyacrylamides ont de nombreuses applications : ils peuvent être utilisés dans les usines de
traitement des eaux usées, d'eaux usées industrielles et pour la purification de l'eau potable ; dans
les produits cosmétiques, produits de toilette, dans la fabrication de lentilles de contact souples et
dans la chirurgie plastique faciale.

Figure 3.4.1: Structure chimique de l’acrylamide

La présence d’acrylamide dans les aliments a été découverte récemment En avril 2002, un groupe de
scientifiques à partir des données de l'Université de Stockholm a montré que l'acrylamide se forme
lors de la préparation des denrées alimentaires et que l'essentiel se trouve dans différents aliments.
Les recherches de laboratoires dans les autres pays d'Europe et d'Amérique confirment ces résultats.

L'acrylamide se produit naturellement lors de la préparation des aliments à des températures élevées,
telles que la cuisson au four, rôtir ou poêler. L'acrylamide fait probablement déjà partie de notre
alimentation depuis que l'homme a commencé à réchauffer sa nourriture. L'acrylamide se forme à des
températures supérieures à 120 ° c par réaction entre l'acide aminé asparagine et les sucres comme
le fructose et le glucose.
Les teneurs les plus élevées se trouvent dans les chips, frites et pain d'épice. Le café, le pain, les
céréales, les biscuits et biscottes contribuent également à l'absorption de l'acrylamide. Les niveaux
les plus élevés sont trouvent dans les aliments riches en glucides chauffés de manière prolongée.

Depuis la mise en évidence de l’acrylamide dans les aliments, les industriels ont mené des
recherches afin de réduire les niveaux d’acrylamide. Cela a abouti à la publication d’ « boîte à outils »
fourni par la CIAA (Association européenne pour l'industrie alimentaire)

Ainsi, l’utilisation de pommme de terre à faible teneur en sucre réducteur dans la préparation des
frites permet de réduire le niveau d’acrylamide.

Il existe d’autres façons de réduire la présence d'acrylamide comme :


- ajuster le temps et la température de chauffage lors du processus ;
- minimiser ou éviter complètement si possible la présence de sucres réducteurs ;
− amélioration du processus de contrôle et éviter les valeurs extrêmes de température.

L'utilisation de l’enzyme asparaginase semble être une voie prometteuse pour réduire le niveau
d’acrylamide.

156
3.4.2 Techniques d’analyse

L’analyse peut être réalisée par LC-MS/MS ou GC-MSn. Les échantillons sont extraits avec de l'eau
après homogénéisation. L'Acrylamide marqués au deutérium est disponible comme étalon interne.
Après centrifugation, une petite quantité d'extrait est purifié sur cartouche SPE. L’extrait purifié est
injecté sur un système de CL-SM/SM.

3.4.3 Toxicité pour l'être humain et/ou l’animal

L'acrylamide est à la fois génotoxique et cancérigène chez les animaux de laboratoire et selon les
experts, probablement aussi chez les humains.

Le Comité scientifique sur l'alimentation (UE) applique la position générale pour les substances
cancérogènes génotoxiques, et en particulier qu'une exposition doit être aussi faible que
raisonnablement possible (ALARA = as low as reasonable achievable) parce que pour ces
substances, il n’a pas été mis en évidence de seuil où l’interaction avec l’ADN commence.

157
3.5 DIOXINES

3.5.1 Introduction

Les dioxines, les composés de type dioxine et les biphényles polychlorés de type dioxine (dioxine-like
ou dl-PCB) ont provoqués des incidents alimentaires. Ces incidents sont parfois découverts suite à la
constatation d’effets sur les animaux. En 1976, lors de l’explosion d’une usine chimique à Seveso,
près de Milan, un nuage toxique s’est échappé dispersant 170 grammes de dioxine. Il n'y a pas eu
de victimes directes, mais différentes études de cohorte ont montrées un risque accru de cancer.
Depuis lors, la dioxine est quelque chose de bien connu, et Seveso est même le nom d’un chapitre
important de la législation environnementale européenne.

Il était déjà découvert tôt que par l'incinération des déchets à grande échelle les dioxines ont été
formés et émis. Ces dioxines contaminent alors le lait, œufs, et les graisses des animaux dans les
exploitations proches des lieux d’incinération. De cette manière, la conscientisation par rapport à ces
matières est devenue plus importante et par exemple les installation d’incinération de déchets ont été
adaptées pour diminuer les contamination. Néanmoins, l’incinération des déchets est une des plus
grandes sources de dioxine et est en partie à l’origine de la contamination des œufs de poule élevée
en parcourt libre à l’extérieure.

Au Brésil , en 1998, l’utilisation de calcium dans l’industrie de la pulpe de citron a amené le plus haut
niveau de dioxine dans le lait des vaches nourrie avec cet aliment. Il a fallu attendre plusieurs années
pour que les pellets de pulpe de citron puissent à nouveau être exportées vers l’Europe.

En 1999, a eu lieu le plus grand incident en Europe lorsque 200 litres d’huile contenant des PCB’s, dl-
PCB’s et des dibenzofuranes polychlorés ont été utilisées pour la production d’aliments pour volailles
et porcs. Il en a résulté une contamination étendue des aliments produits en Belgique. Le problème a
été aggravé par le fait que l’incident a été découvert tardivement mais aussi par la manière dont la
contamination s’est étendue et par les difficulté à remonter à la source de cette contamination.

Cette même année, un scientifique autrichien découvrait que certaines argiles kaolinitiques utilisée
pour les mélanges contenaient de hautes teneurs en dioxine et que cela induisait un niveau importnat
en dioxine chez les porcs. En 2004, le même type d’argile a provoqué un incident aux Pays-Bas
lorsqu’il a été utilisé par des sélectionneurs de pommes de terre et que les déchets étaient utilisés
pour nourrir des vaches laitières.

En 2003, l’utilisation de déchets de bois employés pour sécher des sous-produits de boulangerie ont
provoqué un nouvel incident en Allemagne et aux Pays Bas où ils étaient utilisé comme aliment pour
animaux. Un incident comparable concerne la contamination de choline chloride, un ingrédient utilisé
en alimentation animale, par l’utilisation de copeaux de bois traités avec du pentachlorophénol.

En 2006, l'utilisation de l'acide chlorhydrique contaminé dans la fabrication de la gélatine était à l’


origine d'un incident à grande échelle où la graisse contaminée a été portée dans la chaîne
alimentaire comme animal feed. L'acide chlorhydrique aurait été produite avec des filtres défectueux,
ce qui en fait était contaminé par des dioxines.

Les principaux problèmes sont la contamination généralisée des œufs de poules en libre parcours et
des anguilles capturées dans les rivières polluées. En réponse à ces incidents l’Union Européenne

158
(UE) a développé une politique forte pour les dioxines et les dl-PCB’s, y compris les tolérance et les
limites d’action pour l’alimentation animale et les denrées alimentaires.

déversement,
contamination
paître & picoter
Sol incinération

Plante
Eau:
Poisson
(C)

Animal
huille &
farine de
poisson

90 - 95%

Alimentation

Aliments des
animaux

(C)= Contamination de matière végétale ... par exemple par


adhésion avec des particules de sol ou,
autre contamination externe (par exemple à l`exterieur ( la cire) d`une pomme).

Figure 3.5.1 : La distribution des dioxines et analogues

3.5.2 Structure et/ou groupe principaux

La structure de base des dioxines est composée de 2 anneaux benzéniques (dibenzo) couplés entre
eux par deux par 2 atomes d’oxygène (diox). Sur cette structure de base, un nombre d’atome de
chlore (Cl) est implanté de manière variable. Tant le nombre d’atome de chlore que leur position peut
varier. De cette manière, il y a 75 variantes possibles de la molécule de dibenzodioxine, dont environ
17 sont considérées comme toxique. La plus toxique des dioxine est le 2,3,7,8 tetrachlorodibenzo-p-
dioxine (2,3,7,8-TCDD) ou « dioxine de Seveso » et le groupe des 17 dioxines toxiques a été décrit
comme le groupe 2,3,7,8-dibenzodioxine.

Figure 3.5.2 : structure chimique du 2,3,7,8- TCDD

159
Les concentrations en dioxines sont exprimées en TEQ (equivalent toxique) pour lequel un score de
toxicité est calculé qui est la somme des indices de toxicité des congénères concernés, avec la
« dioxine Seveso » comme référence :

TEQ = ∑ ci . TEFi

avec
ci : la concentration d’un congénère i
TEFi : un facteur d’équivalence toxique (spécifique) pour le congénère concerné i (TEFi < 1)

Outre les dioxines même, il y a également les composés de type dioxine tels que les dibenzofuranes
polychlorés, pour lesquels le lien entre les cycles de benzène se fait par un atome d’oxygène à la
place de deux.

Figure 3.5.3 : structure chimique du 2,3,7,8- TCDF

3.5.3 Téchniques d’analyse

La méthode CALUX®-bioassay (Chemically Activated LUciferase eXpression) est actuellement la


méthode de screening la plus courante pour les dioxines, pour les composés de type dioxine et les dl-
PCB’s. Cette méthode est capable de déceler des échantillons avec une teneur en dioxine plus
élevée que la normale et il a comme avantage sa rapidité de réalisation (3 jours ouvrables) et sa
grande capacité d’analyse.

Avec CALUX, les dioxines peuvent être détectées dans les échantillons mais il n’est pas possible de
faire une quantification exacte. CALUX donne une réponse générale parce que la technique n’est pas
en mesure d’identifier individuellement les composés dans l’échantillon.

En outre la réponse des différents composés n’est pas toujours directement proportionnelle à la
valeur de TEF et il se peut donc qu’un composé avec une faible valeur de TFE donne une très grande
réponse avec la méthode CALUX (cela vaut en particulier pour les échantillons avec une
teneur élevée en mono-ortho-PCB’s comme par exemple les anguilles sauvages). C’est pourquoi,
lorsque la méthode CALUX détecte des échantillons suspects ceux-ci doivent toujours être confirmés
de manière quantitative en Spectrométrie de Masse Haute Résolution (GC-HRMS), méthode capable
d'identifier et de quantifier de façon unique les différents composés.

En condition normale, lorsque les dioxines et les composés de type dioxine viennent au contact de
cellules, elles se lient avec un récepteur cellulaire très spécifique à savoir le récepteur aryl
hydrocarbone (ArylhydrocarbonReceptor of AhR). Il en découle une activation de l’expression
génique AhR-dépendante qui peut provoquer des effets toxiques. La première étape dans ce
processus est la liaison de la dioxine et des autres composés de type dioxine à la AhR, après quoi,
une translocation du complexe AhR intervient au niveau du noyau cellulaire. Dans le noyau cellulaire,
le complexe AhR se lie a une séquence d’ADN bien déterminée qui a été appelée le Dioxin
Responsive Element (DRE). Cela induit une perturbation dans le fonctionnement normal du gène

160
provoquant des erreurs de transcription et de traduction, erreurs qui peuvent provoquer des effets
toxiques.

La méthode CALUX-bioassay joue sur ce mécanisme naturel et utilise des cellule génétiquement
modifiées (souris, rats) qui contiennent un gène reporteur qui code pour la luciferase. (Un gène
rapporteur est un gène dont l’expression qualitative/quantitative peut être détecté, par exemple par la
production d’une substance spécifique, dans ce cas, la luciferase). Avec CALUX, le gène luciférase
est “activé” puisque le complexe AhR va se lier sur le DRE. La quantité de luciférase qui est ainsi
produite est une mesure de la concentration en composés de type dioxine. Par l’ajout de luciferine
aux cellules, la quantité de luciferase produite peut être mesurée par la quantité de lumière émise
(‘luciferine’+luciferase = produit de la réaction + lumière)

Figure 3.5.4 : mécanisme de la méthode CALUX

3.5.4 Toxicité pour l’homme et / ou l’animal

Les dioxines et les composés de types dioxines s’accumulent dans les graisses et sont
essentiellement transmises à l’homme via les graisses (et huiles) animales. L’élimination se fait
principalement via la vésicule biliaire. Les femmes peuvent déjà contaminer leur bébé à un stade
précoce par l’allaitement au sein.

Les dioxines se lient à un récepteur dans la cellule par lequel des gènes déterminés sont activés ce
qui donne lieu à la formation de polypeptides spécifiques qui sont responsables de l’effet toxique,
effet qui n’est aigu qu’à de très hautes concentrations (mécanisme de toxicité, voir plus haut). Le type
d’exposition (aigu vs chronique) et le niveau d’exposition déterminent dans une large mesure l’effet
toxique des expositions aux dioxines. Les dioxines peuvent interférer avec les hormones et les
récepteurs cellulaires. C’est pourquoi elles peuvent avoir un effet sur la croissance, la reproduction, le

161
développement et également sur le système immunitaire et sur les fonctions neurologiques. A hautes
concentrations, les dioxines peuvent causer la chloracnée (une affection de la peau), le cancer, des
troubles du foie, de l’estomac et de l’intestin.

162
3.6 Métaux lourds et arsenic

3.6.1 Groupes principaux

Principaux : Pb, Cd, Hg, As

déversement,

Sol contamination
incinération

assimilation

Nutrition
L`eau:
Poisson

Animal fourrage et herbe


Plante
principalement dans le rein et le foie

Figure 3.6.1 : Voies de contamination possible pour les métaux lourds. Le schéma ne prétend pas à
l’exhaustivité mais indique seulement les ‘sources de contamination’ les plus générales (Hg peut par
exemple également être absorbé via les voies respiratoires)

3.6.2 Techniques d’analyse

AAS, ICP-OES, ICP-MS, AMA

3.6.3 Toxicité pour l’homme et/ou l’animal

3.6.3.1 Plomb

Le plomb entre dans la chaîne alimentaire via des particules contenant du plomb qui se déposent sur
les végétaux. Les végétaux n’absorbent quasiment pas de plomb à partir du sol. Si le bétail est nourri
avec des végétaux contaminés au plomb, on peut donc aussi retrouver du plomb dans la viande, le

163
lait et les produits laitiers. Les tripes contiennent relativement plus de plomb que la chair musculaire,
car le plomb s’accumule surtout dans le foie. La teneur en plomb du poisson et des fruits de mer est
peu élevée à très peu élevée.

Les denrées alimentaires végétales et surtout les légumes feuillus et les fruits constituent la principale
source de plomb dans notre alimentation. La concentration en plomb des boissons alcoolisées, et en
particulier du vin, peut être très élevée. La cause en est, en partie, l’utilisation de capsules contenant
du plomb pour la fermeture des bouteilles. La conservation des liqueurs et des apéritifs dans de
belles carafes en cristal peut aussi augmenter la quantité de plomb dans la boisson. Le cristal
contient en effet de grandes quantités d’oxyde de plomb susceptible de migrer dans la boisson.

Seule une petite partie du plomb ingéré est assimilée de manière effective par l’organisme. La
majeure partie du plomb ingéré s’accumule dans le squelette. Le reste aboutit dans le sang. Même si
l’effet nocif de concentrations trop élevées en plomb peut être observé dans presque tous les tissus,
certains organes et tissus sont particulièrement sensibles au plomb, comme le sang et les organes
hématopoïétiques (la moelle osseuse), le système nerveux (le cerveau et le système nerveux
périphérique), les muscles et les reins.

3.6.3.2 Cadmium

Le cadmium est présent dans presque tous les aliments et provient de manière plus ou moins égale
des produits végétaux et des produits animaux. La viande, les céréales, les fruits, le lait et les
produits laitiers contiennent relativement peu de cadmium. Les légumes, et surtout les légumes
feuillus absorbent par contre assez facilement le cadmium du sol. Les céréales, et en particulier le riz,
contribuent de manière plus importante à l’absorption de cadmium via l’alimentation. Toutefois, lors de
la transformation des céréales, la concentration en cadmium diminue fortement. Les fruits de mer et
le poisson contiennent relativement beaucoup de cadmium. On peut également rajouter que les
fumeurs ingèrent une quantité considérable de cadmium.

Seule une petite partie (5 à 6 %) du cadmium présent dans l’alimentation est résorbée. Le cadmium
ingéré s’accumule facilement dans le corps, principalement dans le cortex du rein et en moindre
mesure dans le foie.

3.6.3.3 L’arsenic

L’arsenic constitue un élément naturel de la croûte terrestre. L’arsenic est toxique dans toutes ses
liaisons, toutefois les liaisons d’arsenic inorganiques sont beaucoup plus toxiques que les liaisons
d’arsenic organiques. Les sources d’arsenic sont l’eau de source (il y a dans certains pays beaucoup
d’arsenic dans le sol), le poisson, les fruits de mer. La concentration en arsenic dans l’alimentation est
d’un ordre de grandeur tel qu’elle ne présente aucun danger pour la santé publique.

Via d’autres sources autres que les aliments, une personne peut cependant subir une intoxication à
l’arsenic (suicide, exploitation minière, pesticides). L’arsenic inorganique perturbe les processus
3+ 5+
biochimiques (As se lie à l’acide lipoïque en pyruvate déshydrogénase et As perturbe la
phosphorylation oxydative).

164
3.6.3.4 Le mercure

Dans la nature, le mercure se présente sous forme élémentaire et dans diverses liaisons
inorganiques et organiques et complexes.

Les formes inorganiques du mercure sont moins toxiques que les formes organiques, mais les formes
inorganiques peuvent être transformées en formes organiques par les bactéries. Le méthyle de
mercure est la forme organique la plus toxique.

0 1+ 2+
Le mercure a trois valences : Hg , Hg et Hg . Parmi les espèces toxiques, on compte les formes
0 +
inorganiques : le mercure métallique (Hg ), le mercure monovalent (mercureux, Hg ), le mercure
2+
bivalent (mercurique, Hg ), et les formes organiques : entre autres le mercure d'éthyle et le méthyle
de mercure.

3.6.3.4.1 Absorption

La façon dont le mercure est stocké dans le corps dépend de la forme et de la manière dont le
mercure rentre en contact avec le corps. Les tableaux 3.6.1 et 3.6.2 donnent un aperçu des voies
d'exposition principales et de la cinétique de toxicité des liaisons du mercure dans le corps humain.

Le mercure métallique est généralement mal absorbé par ingestion, mais les vapeurs inhalées dans
les poumons sont à 80 % absorbées et très toxiques.

10 à 30 % du mercure inorganique est absorbé via le tube digestif. L'importance de l'ingestion et de la


2+
toxicité du mercure inorganique dépend fortement de sa solubilité dans l’eau. Les liaisons Hg sont
+
plus facilement assimilables que les liaisons Hg (European Food Safety Authority (EFSA), 2008).

Tableau 3.6.1 Sources des liaisons toxiques du mercure pour l’homme (ATSDR, 1999)

liaisons Sources d’exposition pour l’homme


Mercure
« plombage des dents », exposition lors de tâches spécifiques (labo,
élémentaire
0 électronique), combustibles fossiles, usines d’incinération.
(Hg )
Mercure
Oxydation du mercure élémentaire, déméthylation du méthyle de
mercurique
2+ mercure, empoisonement accidentel ou voulu avec HgCl2
(Hg )
Les poissons, les animaux marins, les crustacés, les animaux et la
Méthyle mercure
+ volaille nourris avec de la farine de poisson
(CH3Hg )

L'absorption du méthyle de mercure et de ses sels via le système digestif est plus rapide que
l’absorption du mercure inorganique et s'élève à plus de 80 %. La présence de ligands organiques
dans la nourriture comme les phytates, les protéines, les aminoacides ou les oligo-éléments comme
le sélénium peuvent influencer l'absorption, mais d'autres facteurs comme le temps que la nourriture
passe dans l'intestin et la physiologie ont un plus grand effet sur la disponibilité biologique du
mercure.

165
Tableau 3.6.2 Absorption des formes toxiques de mercure dans le corps humain (ATSDR, 1999)

Mercure élémentaire Mercure mercurique Méthyle mercure


0 2+ +
(Hg ) (Hg ) (CH3Hg )
0
Absorption Hg - 80 % absorbé Aérosol d’ HgCl2 Vapeur de mercure
par quasi immédiatement – 100 %
inhalation d’absorption
Absorption Absorption quasi Proportionnelle à la Méthyle de mercure
par nulle, les vapeurs de solubilité dans l’eau dans le poisson –
0
ingestion Hg sont des sels de mercure 95 % d’absorption
transformées dans mercurique;
l’intestin en HgS et assimilation chez les
évacuées nouveaux-nés plus
importantes que chez
les adultes.
Absorption La vitesse moyenne 2 à 3 % de la dose 3 à 5 % de la dose
cutanée d’absorption cutanée appliquée est appliquée est
= 0,024 ng/cm ² pour absorbée absorbée après 5
chaque 1 mg/m ³ immédiatement heures.
dans l'air

3.6.3.4.2 Distribution et dépôt dans les tissus

Les vapeurs de mercure métallique sont quasi immédiatement diffusées à travers le corps. Le
mercure métallique traverse la barrière hémato-encéphalique et le placenta de telle manière que 5 %
de la quantité présente dans le sang de la mère se retrouve dans le lait maternel. Les faibles
2+
quantités de mercure métallique absorbées dans l'intestin sont oxydées en Hg et ne présentent
presque plus de risque de diffusion dans le corps (EFSA, 2008). Le mercure métallique peut causer
des dommages graves au cerveau, au système nerveux, au foie et aux reins.

Le mercure inorganique peut difficilement traverser la barrière hémato-encéphalique et le placenta.


Dans le cerveau, on retrouve très peu de mercure inorganique. Son absorption se fait en majorité par
les reins et en moindre mesure dans le foie et les os.

Chez les femmes enceintes, seulement de petites quantités de mercure inorganique arrivent chez le
futur bébé. Dans le fœtus et chez le nouveau-né, la barrière hémato-encéphalique n'est pas formée
entièrement, raison pour laquelle, la concentration en mercure mercurique dans son cerveau est plus
élevée que dans celui des adultes. Chez les nouveau-nés, le mercure mercurique n'est pas concentré
dans les reins, mais il est disséminé dans les autres tissus.
Le mercure de méthyle peut traverser la barrière hémato-encéphalique, le placenta, les glandes
mammaires et les follicules pileux.16 % de la teneur totale en mercure dans le lait maternel se
retrouve sous forme de mercure de méthyle. Dans les cheveux, 90 % du mercure se retrouve sous
forme de mercure de méthyle (ATSDR, 1999).

Le mercure de méthyle absorbé diffuse vers les tissus, mais la plus grosse partie est stockée dans
les reins. Dans le sang, le mercure de méthyle est stocké en majorité dans les globules rouges où il
est lié à l'hémoglobine. Une plus petite partie est liée aux protéines du plasma. Le mercure dans le
sang est synonyme d’une exposition récente au mercure de méthyle et au mercure inorganique. Le
mercure de méthyle se retrouve dans le sang du fœtus de par le sang de la mère.

166
Tableau 3.6.3 Distribution des formes toxiques du mercure dans le corps humains (ATSDR, 1999)

Mercure élémentaire Mercure mercurique Méthyle de mercure


0 2+ +
(Hg ) (Hg ) (CH3Hg )
Répartition Liposoluble, d’où Accumulation dans Liposoluble, d’où
dans le diffusion rapide dans les reins, la diffusion importante à
corps le corps proportion non travers le corps, dont
éliminée via les 1-10 % dans le sang
urines dépend de la et 90 % dans les
dose globules rouges.

Lors d’expositions fréquentes, le mercure peut s’accumuler dans le corps. Les organes touchés
dépendent du type de liaison (Tableau 3.6.4).

Tableau 3.6.4 Organes cibles en fonctions des liaisons mercuriques (ATSDR, 1999)

Liaisons Organes cible


Mercure élémentaire
0 Cerveau et reins
(Hg )
Mercure mercurique
2+ Reins
(Hg )
Méthyle de mercure
+ cerveau, aussi bien chez l’adulte que le fœtus
(CH3Hg )

3.6.3.4.3 Métabolisme

Le mercure et les liaisons mercuriques sont métabolisés via un cycle d’oxydoréduction. Le mercure
métallique peut, dans le sang et dans les tissus, être oxidé par la catalase et le peroxyde d’hydrogène
2+
et peut être transformé sous la forme ionisée Hg la plus dangereuse (Tableau 3.6.5). Aussi
longtemps que l’oxydation n’est pas complète, le mercure dissout peut traverser la barrière cérébrale
et placentaire. Si l'oxydation a lieu dans le cerveau ou le placenta, le retour dans les vaisseaux
sanguins est quasi impossible et le mercure s’accumule alors dans le cerveau ou le fœtus.

Dans les reins, le mercure inorganique se lie aux liaisons thiols et aux protéines structurelles. Ainsi le
méthyle mercure- cystéine est structurellement analogue à méthionine. Soumises à une exposition
prolongée au mercure, la capacité de ces protéines peut être dépassée et ainsi le mercure peut
causer des dommages aux reins.

Tableau 3.6.5 Mécanisme de toxicité des formes toxiques du mercure (ATSDR, 1999)

Liaisons Mécanisme de toxicité


Mercure élémentaire 2+
0 Oxydation en Hg
(Hg )
2+
Mercure mercurique Hg liée aux liaisons thiols (ex. cystéine) et aux protéines
2+
(Hg ) structurelles
2+
Méthyle de mercure Déméthylation en Hg et toxicité intrinsèque du méthyle de
+
(CH3Hg ) mercure.

167
2+
Le mercure Hg peut être méthylé dans les tissus du corps où il est transformé en méthyle mercure
par les bactéries de l'intestin.

2+
Le mercure organique qui est absorbé, est transformé en Hg par la scission de la liaison C-Hg et
ensuite métabolisés par le cycle d’oxydoréduction. Ceci arrive dans l'intestin à l’aide des bactéries
intestinales, mais également dans les globules rouges et les tissus. La déméthylation est une étape
très lente. Les liaisons aryles du mercure (par ex. phénylmercure) se forment plus rapidement que les
liaisons à chaines courtes (par ex. le méthyle mercure).

Les bactéries intestinales semblent avoir une résistance au mercure organique via une enzyme (une
2+ 2+
lyase) qui catalyse la déméthylation de méthyle de mercure en Hg . Le Hg peut aussi être réduit
jusqu’au mercure élémentaire.

Le sélénium peut influencer l'accumulation du méthyle de mercure dans le corps, mais le mécanisme
n'a pas encore été prouvé.
Mécanismes possibles sont: la formation des complexes sélénium-methylmercure, la libération de
methylmercure des composés de soufre dans le sang induite par le sélénium et des mécanismes
spécifiques dans un tissu qui influent l’absorption du méthylmercure.

3.6.3.4.4 Excrétion

La voie d'excrétion la plus importante du mercure inorganique se fait via l'urine et les fèces. 80 % du
2+
mercure inorganique absorbé oralement est excrété via les fèces. Le temps de demi-vie du Hg
absorbé est d’environ 40 jours (Clarkson et al., 1988).

Le mercure inorganique peut aussi être réduit en mercure élémentaire qui sera exhalé ou migrera
dans le lait maternel.

L'excrétion du mercure de méthyle se fait principalement dans les fèces via l'excrétion de bile. Dans
le foie, le mercure de méthyle est transformé en complexe mercure de méthyle-glutathion et excrété
dans l’intestin via la bile. La part la plus importante du mercure de méthyle est ensuite excrétée via
les fèces, une petite partie est déméthylée en mercure inorganique dont 10 % est réabsorbé.

2+
D'autre part, la lente déméthylation du mercure de méthyle en Hg se fait grâce aux macrophages
des tissus et des bactéries intestinales. La déméthylation a aussi lieu dans le foie du fœtus.

Le mercure de méthyle est écarté d'une manière naturelle du corps à une vitesse de 1 % par jour.
Après 1,5 à 2 mois, la moitié du mercure de méthyle présent a disparu du corps. L'allaitement aboutit
à une élimination plus rapide du mercure du sang. Le tableau 3.6.6 résume les voies d'excrétion les
plus importantes des liaisons mercuriques.

168
Tableau 3.6.6 Excrétion des formes toxiques du mercure (ATSDR, 1999)

Liaisons Excrétion hors du corps humain


0 2+
Mercure élémentaire Hg via la respiration, la sueur, la salive; comme Hg via les
0
(Hg ) fèces et les urines
Mercure mercurique Dans les fèces et les urines, aussi via sueur, salive, bile,
2+
(Hg ) respiration, lait maternel.
0 2+
Méthyle de mercure Comme Hg via la respiration, la sueur, la salive; comme Hg
+
(CH3Hg ) via les fèces et les urines

3.6.3.4.5 Effet toxique du mercure sur le corps humain

Le mercure est très toxique pour la plupart des formes de vie, mais la toxicité dépend de la forme
chimique. Le mercure élémentaire est relativement inerte et non aisément absorbé via le canal
gastro-intestinal, mais ses vapeurs sont toxiques. Les sels de mercure sont très toxiques, mais à
cause des micro-organismes, les produits de méthylation (mercure de méthyle et le mercure de
diméthyle) son encore plus toxiques.

3.6.3.4.6 Effet toxique du mercure élémentaire

Chez l’homme, le système nerveux apparaît le plus sensible à l'exposition au mercure élémentaire.
Les symptômes de neurotoxicité par le mercure élémentaire sont des tremblements, nervosité,
irritabilité, timidité exagérée, insomnie, amnésie et problèmes cognitifs. A hautes doses, les reins
sont endommagés et des problèmes pulmonaires peuvent apparaîtrent. Des réactions auto-immunes
sont également associées au mercure élémentaire.

3.6.3.4.7 Effets toxiques du mercure inorganique

Le rein semble être l'organe cible après ingestion des sels de mercure inorganiques. Il est aussi
prouvé que l'exposition au mercure inorganique provoque une réponse auto-immune. Le mercure-
mercurique est classé par « l'International Agency for Research on Cancer » (IARC) dans le groupe 3
(= substance non cancérigène pour l’homme).

3.6.3.4.8 Effet toxique du mercure de méthyle

À peu près toutes les études toxicologiques disponibles au sujet du mercure organique se limitent au
mercure de méthyle.

L'organe cible du mercure de méthyle est le cerveau, aussi bien chez les adultes que dans chez le
fœtus.

L'effet le plus important suite à une longue durée d’exposition et à une concentration en mercure de
méthyle élevée est la neurotoxicité. Les effets sur le développement du système nerveux ont été
perçus chez les enfants qui ont été exposés dans leur phase prénatale au mercure de méthyle. Les
études sur animaux confirment ces constatations.

169
Neurotoxicité

Les effets neurotoxiques ont pu être déterminés dans deux incidents où des personnes ont été
exposées à des doses de mercure de méthyle très élevées : au Japon (Minamata Bay et Niigata,
1956-1965) et en Irak (1956 et 1959-1960). De ces incidents, sont ressortis que les premiers
symptômes de toxicité apparaissent seulement quelques mois après l'exposition et les effets les plus
graves sont apparus dans le cerveau et le système nerveux du fœtus.

Les personnes qui, au Japon, ont été empoisonnées par du mercure de méthyle issu de poissons ont
montré entre autre des perceptions des sentiments erronées causées par des stimuli internes, l'ataxie
(dysfonctionnement dans la synchronisation des muscles), des tremblements, la défaillance de l'ouïe
et des difficultés à marcher. En Irak, où les gens ont été empoisonnés par du pain confectionné à
partir de grains traités avec un fongicide au mercure de méthyle, on a constaté le plus couramment
des troubles de perceptions des sentiments ; pour les personnes les plus contaminées, de l'ataxie,
une vision floue, des bégayements, aveuglement, surdité et mort. Aussi bien au Japon qu'en Irak, les
effets sont apparus chez les enfants qui ont été exposés gravement dans l'utérus.

Des études épidémiologiques ont été obtenues sur des effets neurotoxiques lors de longues durées
d’exposition chronique à une faible dose de mercure de méthyle.
Les études ont eu lieu dans les pays où beaucoup de poissons et d’animaux marins sont
consommés, à savoir la Nouvelle-Zélande, les iles Faeröer et les Seychelles. Le mécanisme exact
par lequel le mercure de méthyle cause les effets neurotoxiques n’est pas encore connu. Le mercure
de méthyle provoque des changements possibles dans le développement normal du cerveau des
enfants et, lors des concentrations hautes, il peut causer des changements neurologiques chez les
adultes.

L'exposition prénatale interfère avec la croissance et la migration des neurones et peut causer des
dommages irréversibles au système nerveux central. Lors de l'exposition à des doses extrêmement
élevées dans l'uterus, des handicaps graves ont été constatés comme le retard mental, l'épilepsie,
l’aveuglement et la surdité.

Carcinogécité

Certaines études ont montré une association entre le mercure de méthyle et le cancer, mais les
preuves pour la carcinogécité du mercure de méthyle sont contradictoires. Aucune association n'a été
trouvée entre le mercure et le cancer dans les études épidémiologiques, mais deux études ont
démontré une association entre le mercure et la leucémie aigüe. Dans les essais sur animaux, des
dommages aux reins ont été causés par une dose de mercure élevée, mais sans effet tumoral. Le
mercure apparaît in vitro capable de nuire aux chromosomes et à l’ADN, entre autres, sur levures et
bactéries, cellules de poissons et de mammifères et aussi dans des lymphocytes de cerveaux
humains. In vivo, les résultats des tests ne sont pas toutefois convaincants.

Le mercure de méthyle est classé pour cette raison, pour l'homme, en groupe 2B selon
« l'International Agency for Research on Cancer » comme possible cancérigène (IARC, 1993). La
toxicité dépend de la dose.

170
Effets toxiques sur le système cardio-vasculaire

Il y a des preuves des effets négatifs du mercure de méthyle sur le système cardio-vasculaire adulte
et en développement (problèmes de tension, variations du rythme cardiaque, maladies cardiaques).
Certaines recherches ont montré des effets négatifs à des expositions à des teneurs en mercure de
méthyle plus basses que le niveau avec lequel la neurotoxicité a été déterminé.

En 1995, les chercheurs finlandais ont trouvé une corrélation entre la consommation de poisson
contaminés au mercure de méthyle et le risque d’infarctus aigu du myocarde ; ceci est possible du
fait que le mercure peut promouvoir la peroxydation des graisses.

Effets toxiques sur les reins

Le mercure organique et inorganique sont connus pour leurs effets toxiques sur les reins. Les gens
exposés au mercure organique souffrent de polyurie (urines abondantes) et albuminurie (présence
de protéines dans l'urine). L’autopsie des gens empoisonné au alkyles de mercure à dévoilé des
néphrites (inflammation des reins).

Effets toxiques sur le système immunitaire

Le système immunitaire apparaît être sensible au mercure. Les scientifiques ont étudié les effets du
mercure de méthyle sur le système immunitaire de souris et ont observé des changements au niveau
du thymus et dans l’activité naturelle des cellules tueuses (killer-cels) en présence de mercure de
méthyle. Sur les gens, les tests n’ont pas été effectués, mais il y a des cas bien connus d'exposition
au mercure élémentaire provoquant des modifications au niveau des lymphocytes CD4+

Effets toxiques sur la régulation de la tension

Une tension diastolique et systolique accrue a été déterminée chez les enfants de 7 ans dont le fœtus
avait été exposé au mercure de méthyle.

3.6.3.4.9 Risque d’empoisonnement – Exposition humaine par la nourriture

Bien que l'inhalation de mercure gazeux de l'air, de consommation d’eau potable contaminée au
mercure, de la présence de mercure dans certaines médications puissent contribuer à l'exposition
humaine au mercure, l'ingestion via la nourriture est la source la plus importante d’exposition non
accidentelle au mercure.

Le poisson et les produits d’aquaculture sont la source la plus importante d’ingestion de mercure par
l'homme. La concentration moyenne de mercure dans le poisson en Europe est estimée de 62
jusqu'à 97 µg/kg selon une étude de 2005. Le mercure de méthyle est présent à concurrence de 70 à
100 % de la teneur de mercure totale dans le poisson.

3.6.3.4.10 Recommandations concernant le mercure dans l’alimentation

À peu près tous les poissons contiennent des traces de mercure de méthyle, mais les plus grands
poissons qui ont vécu longtemps, ont les concentrations les plus élevées en mercure de méthyle

171
parce qu'ils ont eu plus de temps pour accumuler ce mercure dans leur corps. Il est recommandé
pour cette raison d’être modéré avec la nourriture des poissons prédateurs comme l'espadon, le
requin, le maquereau- roi, le tile et le thon (concentrations typiques de 500 à 1000 µg/kg). Ceci est
surtout valable pour les femmes enceintes ou voulant l’être, pour les enfants et pour les femmes qui
allaitent. Les enfants et les nouveau-nés sont les plus sensibles aux effets du mercure.

Il n’est pas déconseillé de manger du poisson mais il faut des poissons en faible teneur en mercure.
Les poissons et les produits d’aquaculture avec des teneurs basses en mercure de méthyle sont
entre autres la crevette, le thon mis en conserve, le saumon, le colin, le poisson chat, le hareng et les
sardines (concentration < 100 µg/kg).

Consommer deux portions de thon par semaine n'est pas un problème surtout si les sujets sont
jeunes. La concentration en mercure maximale trouvée dans le saumon d’élevage est environ cinq
fois plus basse que la norme pour le mercure dans le poisson (0,5 mg/kg pour les salmonidés). Il est
donc possible de consommer deux fois par semaine du poisson et même recommandé par les
diététiciens, sans risque accru pour la santé.

172
3.7 Coccidiostatica

3.7.1 Généralités

La coccidiose est une maladie infectieuse et contagieuse des animaux, elle est causée par des
formes de vie eucaryotes unicellulaires parasitaires (protozoaires). Ces protozoaires sont appelés
coccidies et plus spécifiquement Eimeria. Actuellement, il y a plus de 600 espèces connues de
coccidies, mais certaines espèces seulement infectent les volailles. Les coccidies le plus pathogènes
sont E. tenella, E. necatrix, E. Maxima, E. acervulina, E.mitis, E.praecox et E. Brunetti. Outre les
volailles, les dindes et les lapins, des coccidies peuvent aussi infecter d’autres animaux comme les
porcs et des ovins, ces animaux étant cependant moins sensibles.

Le cycle de vie d’un Eimeria dans un animal commence par l’ingestion d’oocystes sporulées qui
contiennent chacun 4 sporocystes avec 2 sporozoaires. A la température corporelle les sporozoaires
quittent leur sporocyste, deviennent actifs et pénètrent rapidement les cellules épithéliales de la paroi
intestinale de l’hôte. Le cycle de vie d’un Eimeria à l’intérieur des cellules épithéliales continue par 3
ou 4 générations de multiplication asexuelle (schizogonie ou merogonie), suivie par une multiplication
sexuelle appelée gametogonie. Finalement il y a l’émergence des oocystes, qui sont excrétés dans le
fumier. Dans des conditions favorables ces oocystes se développent en 24 heures en oocystes
sporulés, qui à leur tour peuvent être avalés par des animaux, et le cycle recommence.

La coccidiose dans sa forme aiguë est mortelle et dans sa forme subaiguë cause la perte de poids
suite à la diminution de la conversion alimentaire et réduit la production d’œufs de volaille.

Figure 3.7.1 : Le cycle de vie d’un Eimeria

173
3.7.2 Structure et/ou groupes principaux

Les composés chimiques utilisés comme coccidiostatiques n’ont pas de dénominateur commun
général et peuvent exercer leur effet sur les coccidies à divers stades du cycle de vie du parasite. Ils
sont généralement appelés des coccidiostatiques, bien qu’on puisse faire une distinction entre un
effet anticoccidial (inactivation des coccidies) et un effet coccidiostatique (inhibition du développement
de coccidies). Les coccidiostatiques sont généralement administrés via des aliments médicamenteux,
bien qu’il puissent l’être également par des ajouts dans l’eau des abreuvoirs. Certaines molécules
possèdent également, outre leur action coccidiostatique, une activité antibiotique ou antibactérienne.
L’utilisation du composé thérapeutique comme antibiotique ou coccidiostatique dépend de la
concentration administrée.

En général les coccidiostatiques peuvent être divisés en deux groupes, les coccidiostatiques non-
ionophores ou chimiques et les coccidiostatiques ionophores.

Les coccidiostatiques ionophores sont des substances qui contiennent un groupe polyéther et qui
sont produites par fermentation par un certain nombre d’espèces Streptomyces et Actinomadura. Ce
sont des molécules solubles dans la graisse et qui peuvent transporter des ions à travers la bicouche
lipidique de la membrane cellulaire et ainsi perturber le système vital de gradient d’ions des micro-
organismes.

Il existe deux mécanismes par lesquels les ionophores peuvent régler le transport des ions à travers
des structures hydrophobes: une formation de complexes entre ions et ionophore ou la formation d’un
canal ionique.

Via la formation du complexe il y a un ratio spécifique ion-ionophore (généralement 1-1). L’ionophore


s’enroule autour de l’ion de telle façon que l’ion est attrapé dans l’intérieur polaire de l’ionophore,
alors que l’extérieur reste principalement hydrophobe et est soluble dans les milieux non polaires.
L’ion est retenu dans l’ionophore par les atomes d’oxygène via des interactions ion-dipôle. En fait,
l’ionophore agit comme solvant pour l’ion.

Des ionophores qui agissent par la formation d’un canal ionique forment un canal polaire dans la
membrane cellulaire apolaire permettant aux petits ions de se mouvoir à travers la membrane
cellulaire.

L’activité biologique des ionophores est due à leur capacité de perturbation du flux ionique cellulaire.
Normalement, la concentration de K+ à l’intérieur de la cellule est plus élevée que la concentration de
Na+, tandis que dans le milieu extracellulaire c’est le contraire. Ce déséquilibre est nécessaire pour le
fonctionnement normal de la cellule et est maintenu par une protéine spécifique de transport qui
pompe les ions sodium de la cellule en échange d’ions potassium (le sodium-potassium adénosine
trifosfatase). Les ionophores perturbent ce « déséquilibre » ionique, car ils permettent aux ions de
bouger à travers la cellule, avec, comme conséquence, des lésions cellulaires et apoptoses
éventuelles.

Les coccidiostatiques ionophores comprennent : semduramycin (sodium), lasalocid (sodium),


monensin (sodium), salinomycine (sodium), narasine et maduramicine (ammonium). Les
coccidiostatiques non-ionophores n’ont pas de propriétés chimiques communes et sont :
halofuginone, nicarbazine, robenidine (chlorhydrate), diclazuril et décoquinate.

174
Actuellement, il y a 11 coccidiostatiques autorisés comme additif alimentaire chez les poulets, les
dindes et les lapins. Chaque produit est légalement autorisé en vertu d’un nom de marque pour une
utilisation dans une espèce cible spécifique et à une concentration spécifique. Chaque licence inclut
également une période d’attente obligatoire, c’est à dire le temps minimum qui doit s’écouler entre la
dernière administration du coccidiostatique à l’animal et son abattage. Cette période d’attente ou
temps de retrait vise à éviter la prévalence des résidus des coccidiostatiques dans les aliments
d’origine animale et par conséquent un risque éventuel pour les consommateurs.
Le règlement (CE) nr.1831/2003 prévoit la possibilité de changer la licence d’autorisation d’un additif
sur demande du preneur de licence et après avis de l’Autorité Européenne de Sécurité des Aliments
(EFSA).

3.7.2.1 Halofuginone

Le bromhydrate d’halofuginone est un composé non ionophorique dérivé d’un alcaloïde naturelle de
la plante Dichroa febrifuga Lour. L’isomère « trans-halofuginone » est le principe actif, tandis que
l’isomère « cis » est présent comme impureté.

3.7.2.2 Robenidine

Le chlorhydrate de robenidine est un coccidiostatique synthétique et non ionophorique qui est


autorisé à une concentration de 30 à 36 mg/kg pour les aliments pour animaux chez les volailles et à
une concentration de 50 à 66 mg/kg pour l’alimentation des lapins (marque Cycostat ®).

3.7.2.3 Nicarbazine

La nicarbazine est un complexe de synthèse non ionophorique composé d’une quantité équimolaire
de 4,4’-dinitrocarbanilide (DNC) et de 2-hydroxy-4,6-diméthylpyrimidine (HDP), autorisé comme
additif coccidiostatique dans l’alimentation animale chez les poulets d’engraissement, éventuellement
sous forme de produit combiné au narasin (marque Maxiban®).

3.7.2.4 Diclazuril

Le diclazuril est un composé synthétique non-ionophorique dont l’utilisation en tant qu’agent


coccidiostatique est autorisée à une concentration maximale de 1 mg/kg d’aliment complet pour
animaux chez les poulets et les dindes d’engraissement (16 et 12 semaines au maximum,
respectivement), mais aussi chez les lapins et pintades (marque Clinacox®).

3.7.2.5 Décoquinate

Le décoquinate est un composé synthétique non-ionophorique déjà décrit en 1968. Son utilisation est
relativement limitée, car il y avait des soupçons de résistance des coccidies au produit si la même
entreprise l’utilisait durant une période assez longue. Le décoquinate est autorisé en tant qu’additif
alimentaire chez les poulets d’engraissement à une dose minimale-maximale de 20 à 40 mg/kg
d’aliment complet (marque Deccox ®)

175
3.7.2.6 Semduramycine

La semduramycine-sodium est un agent polyéther ionophore qui est produit par fermentation par
Actinomadura roseorufa et purifié chimiquement. Elle est autorisée comme coccidiostatique pour les
poulets d’engraissement à une dose maximale de 25 mg/kg d’aliment complet (marque Aviax®).

3.7.2.7 Lasalocide

Lasalocide-sodium est un ionophore polyétherique naturel qui est produit par fermentation de
Streptomyces lasaliensis subsp lasaliensis. Il est isolé du milieu de fermentation par une acidification
et ensuite purifié. Le principe actif principal du produit purifié est lasalocide A, qui représente 90% du
produit final. Le solde de 10% dans le produit final est composé des homologues B, C, D et E,
molécules pour lesquelles un groupe méthyle est remplacé par un groupe éthyle en différentes
positions de la molécule.

L’usage de lasalocide-sodium comme coccidiostatique est autorisé pour les poulets d’engraissement
et les poules pondeuses (jusqu’à 16 semaines), et pour les dindes à 12 semaines (marque Avatec®).
Le niveau maximal de l’ingrédient actif dans l’alimentation est de 125 mg/kg.

3.7.2.8 Monensin

Le monensin est un ionophore polyétherique naturel qui est produit par la fermentation de
Streptomyces cinnamonensis. Il est composé de plusieurs analogues A, B, C et D dont le monensin A
est l’élément le plus important (98%). Dans la pratique le monensin est utilisé sous la forme de sel de
sodium.

Le monensin-sodium est autorisé comme additif coccidiostatique pour les aliments de poulets
d’engraissement aux concentrations de 100 à 125 mg/kg d’aliment complet. Il est aussi autorisé pour
des poules pondeuses (âge maximum de 16 semaines) dans une gamme de concentration de 100 à
120 mg/kg. Pour les dindons jusqu’à l’âge de 16 semaines le monensin est autorisé dans une gamme
de 60 à 100 mg/kg (marques Coxidin ® et Elancoban ®).

3.7.2.9 Salinomycine

Le salinomycine est un ionophore polyéther naturel qui est isolé de Streptomyces albus, et qui a un
effet antimicrobien ainsi qu’un effet anticoccidial. Il est principalement utilisé sous forme de sel de
sodium.

Salinomycine sodium est autorisé comme coccidiostatique pour les poulets d’engraissement dans
une concentration minimale – maximale de 50-70 mg/kg d’aliment (marque Salinomax ®).
Sous la marque Sacox ® le salinomycine sodium est autorisé à une concentration de 50 mg/kg pour
les poules pondeuses et les poulets d’engraissement et pour les lapins d’engraissement à une
concentration de 20-25 mg/kg.

176
3.7.2.10 Narasin

La narasine est un polyéther ionophore produite par Streptomyces aureofaciens qui a un effet
anticoccidial ainsi qu’un effet antimicrobien. Le composant principal de la narasine est le narasin A
(96%), mais il contient aussi les variantes structurelles B, D et I.

La Narasine est autorisée comme coccidiostatique pour utilisation chez les poulets d’engraissement
dans une concentration minimale-maximale de 60-70 mg/kg (marque Monteban®). Comme déjà
mentionné ci-dessus la narasine est également permise pour utilisation en combinaison avec
nicarbazine.

3.7.2.11 Maduramicine

Ce produit ionophore est obtenu comme le sel d’ammonium d’un acide mono carboxylique
polyétherique produit par Actinomadura yumaensis.

La maduramicine a un effet anticoccidial ainsi qu’un effet antimicrobien. La maduramicine ammonium


qui est utilisée comme additif alimentaire est composée pour 90% du sel d’ammonium d’un polyéther
mono carboxylique avec une groupe -OCH3 à la position C5 de l’anneau A (maduramicine-alfa) et
pour 10% d’un composé structurellement similaire avec un groupe -- OH à cette position
(maduramicine-beta). La maduramicine-alpha a une affinité surtout pour les cations monovalents.
La maduramicine-ammonium est autorisée comme coccidiostatique pour les poulets et les dindes
d’engraissement (jusqu’à l’âge maximale de 16 semaines), à une concentration maximale de 5 mg/kg
(marque Cygro®).

3.7.2.12 Amprolium

L’amprolium n’est pas un antibiotique, mais un analogue de la thiamine (= vitamine B1). Il est en
compétition avec le transport actif de la vitamine thiamine par les coccidies qui ont besoin de cette
vitamine pour leur croissance dans les intestins des volailles. L’amprolium a souvent été utilisé en
combinaison avec éthopabate ou avec éthopabate en combinaison avec sulfaquinoxaline. La dose
habituelle est de 125 mg/kg amprolium + 8 mg/kg éthopabate.

3.7.3 Les différents techniques d’analyse

La technique d’analyse utilisée pour les différents coccidiostatiques dépend de l’objectif de l’analyse.
Globalement, deux types d’analyse peuvent être distinguées, à savoir le contrôle des dosages des
coccidiostatiques utilisés dans l’alimentation animale et la détection des résidus de coccidiostatiques
dans les denrées alimentaires et les aliments pour animaux.

Comme décrit ci-dessus, il existe actuellement 11 coccidiostatiques autorisés comme additif


alimentaire pour une utilisation chez les poulets, les dindes, la pintade et les lapins au moyen de
différentes licences. Chaque licence décrit l’utilisation d’un coccidiostatique pour des animaux
spécifiques et à une concentration bien déterminée, c’est à dire avec des valeurs autorisées
minimales en maximales. L’ordre de grandeur des concentrations est en mg/kg et donc le contrôle de

177
la dose cible pour les animaux sont faisables avec des méthodes d’analyse traditionnelles comme
l’HPLC et la microbiologie. En générale un seul coccidiostatique est déterminé quantitativement par
analyse. Pour l’analyse HPLC les conditions sont optimisées afin qu’elles soient idéales pour chaque
coccidiostatique. Pour les coccidiostatiques chimiques on peut utiliser une détection UV, tandis que
pour les ionophores une dérivatisation est nécessaire pour les rendre détectables par fluorescence.

Pour les coccidiostatiques qui ont aussi un effet antimicrobien l’analyse peut être effectuée par une
méthode microbiologique. Il s’agit d’une méthode où une quantité du coccidiostatique est ajouté à un
milieu de culture liquide inoculé avec des bactéries. Ainsi la croissance des bactéries présentes sera
inhibée. Le degré d’inhibition de la croissance est une mesure de la concentration du coccidiostatique
et est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre. On parle dans ce contexte de turbidimétrie car il y a
réellement une turbidité du milieu qui est mesurée. Une augmentation de la turbidité de milieu de
culture est en relation avec une augmentation de la croissance bactérienne et donc avec une
concentration plus basse du coccidiostatique. La quantification de la concentration d’un
coccidiostatique dans un aliment est réalisée par comparaison entre la turbidité d’un milieu de culture
ensemencé dans lequel on a ajouté différentes concentrations du standard (courbe de calibration) et
la turbidité d’un milieu de culture ensemencé dans lequel on a ajouté l’extrait de l’aliment qui doit être
analysé. Puisqu’on ne mesure qu’une inhibition de la croissance, une identification du
coccidiostatique n’est pas possible. On peut seulement quantifier en supposant que l’inhibition
mesurée est causée par le coccidiostatique qu’on veut analyser.

A côté de l’utilisation réglementée des coccidiostatiques pour certains animaux cibles, il y a aussi des
animaux pour lesquelles l’utilisation des coccidiostatiques est interdite. Pour contrôler l’absence de
coccidiostatiques dans les aliments pour ces animaux il nous faut une analyse à des niveaux de
résidus (µg/kg). Basé sur des études de toxicité chez des animaux non cibles on a fixé des limites
maximales pour les différents coccidiostatiques dans des aliments pour ces animaux. Pour contrôler
les résidus de coccidiostatiques indésirables dans les aliments on utilise la LC-MS et l’UPLC comme
technique d’analyse.

En plus du contrôle dans des aliments il y a aussi des limites maximales en coccidiostatiques dans la
viande, les œufs, le foie et les reins (p.e. les “Maximum Residue Limits” ou MRLs) parce que les
résidus de coccidiostatiques dans des aliments peuvent être transférés dans des denrées
alimentaires. Les contrôles des MRLs dans les denrées alimentaires sont réalisés par LC-MS

Les MRLs pour les différents coccidiostatiques sont entre autre décrits dans la Directive 2009/08/CE
(aliments) et le Règlement (CE) no 124/2009.

3.7.4 Toxicité pour l’homme et/ou l’animal

3.7.4.1 Aperçu de la situation

Les exploitants du secteur de l'alimentation animale pouvant produire une grande variété d'aliments
au sein d'un même établissement, différents types de produits doivent parfois être fabriqués
successivement sur une seule chaîne de production. Il peut ainsi arriver que des traces inévitables
d'un produit subsistent dans la chaîne de production et qu'elles soient encore présentes au début de
la production d'un autre produit destiné à l'alimentation animale.

178
Cette propagation d'un lot de production à l'autre se nomme «transfert» ou «contamination croisée»
et peut par exemple se produire lorsque des coccidiostatiques sont utilisés en tant qu'additifs
autorisés dans l'alimentation animale. Elle peut conduire à la contamination d'aliments pour animaux
produits en aval, en provoquant la présence de traces techniquement inévitables de ces substances
dans des «aliments pour animaux non cibles», c'est-à dire des aliments pour lesquels l'utilisation de
coccidiostatiques n'est pas autorisée, tels que les aliments destinés à des espèces ou catégories
animales non visées par l'autorisation de l'additif. Cette contamination croisée inévitable peut se
produire à toutes les étapes de la production et du traitement des aliments pour animaux, mais
également pendant l'entreposage et le transport.

Sous réserve d'application des bonnes pratiques de fabrication, les valeurs maximales du transfert
inévitable de coccidiostatiques vers les aliments pour animaux non cibles doivent être établies selon
le principe «ALARA» (As Low As Reasonably Achievable, c'est-à-dire au niveau le plus bas pouvant
raisonnablement être atteint).

3.7.4.2 Halofuginone

Sur la base d’études limitées sur la tolérance réalisées par l’industrie chez différentes espèces
animales non cibles, il a été conclu qu’une ingestion accidentelle d’aliments pour animaux destinés
aux poulets ou aux dindes, contenant de l’halofuginone à la dose maximale autorisée de 3 mg/kg
d’aliments pour animaux, pourrait présenter un risque pour la santé de plusieurs espèces animales
non cibles, notamment pour les lapins, les oies, les perdrix et les cailles, qui pourraient réagir par un
refus de s’alimenter et un ralentissement de la prise de poids. Cette dose pourrait également être une
cause de mortalité chez les perdrix.

3.7.4.3 Robenidine

Les producteurs des coccidiostatiques ont fait des études de tolérance chez des poules pondeuses,
des porcs et des ruminants. Ces études ont montré que la consommation accidentelle des aliments
pour animaux contenant des doses maximales autorisées de 36 et 66 mg/kg d’aliment n’a aucun
risque de santé pour ces espèces.

3.7.4.4 Nicarbazine

Sur la base d’une série limitée d’études de tolérance réalisées chez différentes espèces animales non
cibles, on a conclu qu’il est improbable qu’une ingestion accidentelle d’aliments pour animaux
contenant de la nicarbazine à la dose maximale autorisée chez les poulets (50 mg/kg d’aliments pour
animaux) entraîne des effets indésirables chez des espèces animales non cibles.

3.7.4.5 Diclazuril

Un certain nombre d’études de tolérance effectuées par l’industrie sur des espèces animales non
cibles ont prouvé l’absence de toxicité du diclazuril chez les canards, les cailles, les pintades, les
porcs et les ruminants exposés au taux maximal autorisé dans l’alimentation animale pour les
espèces animales cibles (1 mg/kg d’aliment pour les animaux).

179
3.7.4.6 Décoquinate

Différents études de tolérance ont été effectuées chez des animaux non cibles, mais n’ont pas montré
d’effets toxiques chez les porcs, les ruminants, les chevaux et les lapins qui ont été exposés au
maximum de la teneur admise pour les animaux cible (40 mg/kg). Les chiens apparaissent être les
animaux non cibles les plus sensibles avec une tolérance d’ingestion maximale de 15 mg/kg de
poids corporel par jour.

3.7.4.7 Semduramycine

La semduramycine produit une toxicité typique des composés ionophores chez le chien, notamment
des lésions du muscle squelettique; de plus, la semduramicine induit des modifications rétiniennes
chez le chien qui n’ont pas encore été étudiées chez d’autres espèces.

3.7.4.8 Lasalocid

Des signes d'intoxication chez l'animal, comprenant des signes neurologiques (dépression, ataxie,
parésie, paralysie, tremblements musculaires) et des effets cardiaques (effets inotropes et
tachycardie), ont été rapportés chez différentes espèces non cibles après une exposition accidentelle,
et des symptômes neurotoxiques sans lésions histopathologiques ont été décrits au cours d’études
expérimentales menées chez le chien.
Ces signes de toxicité correspondent au mode d'action des coccidiostatiques ionophores polyéthers,
et concordent avec les symptômes observés dans les espèces cibles à des posologies dépassant la
dose autorisée. Les espèces particulièrement sensibles sont les chiens, les veaux, les lapins et les
chevaux. Par conséquence on a conclu que l’ingestion accidentelle de la dose maximale autorisée de
lasalocide dans les aliments destinés aux volailles (125 mg/kg d'aliments) pouvait entraîner des
intoxications chez les espèces non cibles.

3.7.4.9 Monensin

Les caractéristiques ionophores de la molécule sont responsables pour l’intoxication par le monensin.
Chez les animaux non cibles, differents effets comme des problèmes cardiaques (y compris
l’hypertension), des dégâts aux fibres musculaires striées et aux nerfs ont déjà été observés. D’autres
signes d’intoxication sont l’anorexie, la diarrhée, la dépression, la relaxation musculaire et le retard de
croissance. Les chevaux sont les animaux les plus sensibles pour lesquels une seule dose de 2
mg/kg de monensin est fatale. Les chiens, les canards et les petits ruminants sont aussi très
sensibles aux ionophores polyetheriques.

3.7.4.10 Salinomycine

Des signes d'intoxication chez l'animal, comprenant des effets cardiovasculaires (augmentation de la
pression artérielle et dégénérescence myocardique), anorexie, faiblesse, ataxie, paralysie, ont été
rapportés chez différentes espèces non cibles. Ces signes correspondent au mode d’action des

180
ionophores et surviennent également chez les espèces animales cibles à des concentrations
dépassant la dose maximale autorisée. Les espèces particulièrement sensibles à la salinomycine
sont les dindes, les veaux pré ruminants et les bœufs, les chevaux, les chats et les chiens, alors que
les porcs sont moins sensibles.

3.7.4.11 Narasine

Différent signes de toxicité ont été constaté chez différents animaux cibles tels que l’anorexie,
l‘œdème pulmonaire, la nécrose des cellules du foie et des dégâts aux fibres musculaires. Ces
symptômes sont causés par l’action ionophorique de la narasine. Les animaux non cibles les plus
sensibles sont les chiens, les chevaux et probablement aussi les dindes et les lapins.

3.7.4.12 Maduramicine

Des différences de sensibilité à la maduramicine entre les espèces et une faible marge de sécurité
entre le niveau maximal autorisé et la dose toxique minimale chez les espèces animales non cibles
ont été mises en évidence. Des signes d’intoxication ont été signalés chez les lapins, les bovins et les
ovins au niveau maximal autorisé pour les poulets d’engraissement et les dindes (5 mg/kg). Les
syndromes toxiques incluent des cardiomyopathies associées à une insuffisance cardiaque
congestive et des lésions du muscle squelettique modérées à sévères, ce qui correspond au mode
d’action des agents polyéthers ionophores. Chez les dindes, une réduction du gain de poids corporel
a été constatée au-dessus de 10 mg/kg d’aliments et des effets létaux ont été observés chez les
porcs à 37,5 mg/kg d’aliments.

181
3.8 Mycotoxines

3.8.1 Nature et origine

Les mycotoxines sont des métabolites secondaires produits par des moisissures. Par opposition aux
métabolites primaires, les métabolites secondaires ne sont pas nécessaire à la croissance de
l’organisme. Leur rôle biologique est très différent, ils peuvent agir comme insecticide, antibiotique,
antifongique, antiprotozoaire… De ce fait, l’organisme émetteur acquiert un avantage compétitif face
aux autres moisissure et bactéries.

3.8.2 Les risques associés aux mycotoxines

La préoccupation relative aux risques chimiques et biologiques dans la chaîne alimentaire n’est pas
neuve. Une grande diversité de substances potentiellement toxiques peuvent se retrouver dans les
produits alimentaires à différents moments de la production. Il est évident qu’une chaîne alimentaire
sûre est fondamental pour toute société moderne et il serait faux de déclarer que la présence de
mycotoxines dans notre alimentation ne revêt aucune importance. Les mycotoxines les plus connues
et les plus courantes, en particulier celles qui représentent une menace potentielle pour la santé, sont
régulièrement mises en évidence dans les denrées alimentaires. L’ingestion de mycotoxines peut
provenir de la consommation de denrées alimentaires végétales mais aussi animales.

Pour ces raisons, on trouvera dans les chapitres suivants un résumé des recherches de résidus dans
les animaux d’élevage. Les résidus retrouvés sont-ils dangereux pour l’homme suite à leur
consommation ? En général, les questions liées au bien être animal sont de moindre importance. M.P.
(1994) le formule comme suit : le plus souvent, on porte peu d’attention aux maladies provoquées par
les mycotoxines aux animaux d’élevage. Les symptômes sont en effet assez vagues et il est difficile
de poser un diagnostic. Les pertes d’animaux sont rares, mais il peut y avoir des troubles de la
production et une diminution de la rentabilité. Il faut cependant tenir compte que les animaux
d’élevage sont nourris à partir de grain et il n’est pas imaginable que les mycotoxines se retrouvent
dans la chaine alimentaire humaine depuis les grains via les animaux.

182
Plante

(1) Champ

Formation des mycotoxines Contamination (humaine)


(Moisissures)

(2)
Entrepôt
Alimentation

Infection par (1)et/ou (2) Lait


Viande

Animal

-Aflatoxines (les plus connues)


formées par Aspergillus flavus

-autres:Ochratoxine, DON(deoxynivalenol), Fumonisine e.a.

Figure 3.8.1 : Voies d'exposition aux mycotoxines

3.8.3 Mycotoxicose

Il n’est pas évident de considérer une mycotoxine comme cause possible de mycotoxicose. Un lien
clair entre une mycotoxine et une maladie n’a été que rarement mis en évidence et ce pour les
raisons suivantes :

o Les mycotoxines sont souvent présentes en très faible quantité et peuvent ne pas être
détectées si les analyses ne sont pas sensibles assez, ou si la mycotoxine n’a pas encore été
identifiée.

o Lors d’une détection de mycotoxine, la source de contamination a souvent déjà disparu et


n’est donc plus disponible pour l’analyse.

o À part quelques cas particuliers pour lesquels ils sont bien décrits, les symptômes cliniques
sont vagues et chroniques. Dans le cas de nouvelles molécules, les effets biologiques et
médicaux pour les hommes et les animaux sont le plus souvent inconnus.

o Les vétérinaires sont souvent peu familiers avec les symptômes car l’apparition des
mycotoxines est sporadique, étendue géographiquement et liée aux saisons.

o Le principe toxicologique qui lie la dose d’un toxique à la réponse de l’organisme est
difficilement applicable vu la nature chronique des mycotoxicoses

o Souvent, plusieurs mycotoxines sont présentes simultanément. L’effet synergétique induit par
la présence de plusieurs mycotoxines est encore inconnu.

183
Les critères suivants ont été proposés pour l’identification d’une mycotoxicose :

o La maladie doit être causée par un produit alimentaire

o Aucun organisme pathogène ne doit être isolé de l’aliment

o La maladie ne peut pas être contagieuse ou transmissible

o Après arrêt de la consommation de la nourriture contaminée, on doit voir une nette


amélioration de l’état du sujet

o La mycotoxine doit être identifiée dans la nourriture de l’animal et doit être détectée en
quantité suffisante pour induire un effet toxique

o Les mycotoxines isolées doivent être reconnues comme induisant les symptômes observés

o Si la nourriture contaminée est donnée à des animaux sains, ils doivent alors montrer les
même symptômes

o L’analyse post mortem peut seulement indiquer une irritation de la gorge ou une inflammation
des tissus.

3.8.4 Conditions de production des mycotoxines

Il y a beaucoup de facteurs qui influencent la production des mycotoxines, comme l’activité en eau, la
température, le temps, les concentrations en oxygène et dioxyde de carbone, la composition du
substrat, la présence abondante de moisissures, la présence de souches toxiques, la quantité de
spores, les interactions microbiologiques et la présence d’insectes. Bien que la pourriture, la
croissance des moisissures et la formation des mycotoxines résultent d’une interaction complexe
entre ces différents facteurs, la compréhension de chaque facteur est essentielle pour comprendre le
processus dans son entièreté et pouvoir ainsi faciliter le pronostic et prévenir l’apparition des
mycotoxines.

3.8.4.1 L’activité en eau

Dans les climats tempérés, les moisissures qui colonisent les grains peuvent être classées en trois
catégories suivant la quantité d’eau dont elles ont besoin : les champignons de cultures, les
champignons de conservation et les moisissures qui apparaissent lors de pourritures avancées.
Lacey & Magan (1991) ont montré que le domaine aw de production des mycotoxines est
généralement plus limité que le domaine dans lequel les moisissures peuvent se développer. (cfr.
Figure 3.8.2)

184
Figure 3.8.2 : Relation entre croissance des moisissures et production des toxines

3.8.4.2 Température

La température est aussi un facteur important qui influence la production de mycotoxines. Comme
pour l’activité en eau, les moisissures ont des températures minimale, optimale et maximale de
croissance. La température a une grande influence sur les besoins en eau, en effet, le teneur
minimale est différente suivant la température et suivant également le type de substrat. L’activité en
eau nécessaire est la plus basse à l’optimum de température et la plus haute aux températures
minimale et maximale de croissance. Norholt et al. (1979) on montré ce modèle dans le cas de la
production de l’ochratoxine par P. cyclopium, P. viridicatum et A. ochraceus.

3.8.4.3 Substrat

Les différences de croissances des moisissures et de production de toxines dépend des


caractéristiques physico-chimiques du substrat. Les paramètres physiques sont la quantité d’eau
disponible, la résistance mécanique suite à l’entassement qui détermine la quantité résiduel d’air et
donc la quantité d’air disponible ainsi que la conductivité thermique qui influence la migration des
températures dans la matrice. Les propriétés chimiques sont les teneurs en matières grasses et
protéiques, en oligo-éléments, en acides aminés et acide gras.

3.8.4.4 Teneur en oxygène et en dioxyde de carbone

La plupart des moisissures qui causent la pourriture des grains ont besoin d’oxygène. Une
concentration basse en O2 (<1%) et/ou une augmentation de la concentration en CO2 résultent dans
la plupart des cas dans la formation de moisissure et dans la production de toxine.

3.8.4.5 Interactions microbiennes

La présence d’autres micro-organismes, moisissures ou bactéries, peut modifier la croissance des


moisissures et la production de toxines.

185
3.8.4.6 Dégâts mécaniques et insectes

La relation entre les moisissures de conservation et les insectes est imprévisible. Certains insectes
dispersent les moisissures, d’autres peuvent en diminuer la croissance. Les mites peuvent ainsi avec
leurs corps répandre des spores de moisissures des grains infectés vers des grains sains.

3.8.4.7 Temps

Madhyasta et al. (1990) ont étudié la croissance et la formation de toxines par A. alutaceus et P.
verrucosum après 7, 15 et 30 jours d’incubation. Ils ont observé peu de production de toxines avant le
jour 5. Une croissance perceptible et une production
production de toxine ont été démontrées
démontrée après le septième
jour. Les auteurs ont conclu à une évolution logarithmique. Dans tous les substrats (blé, maïs, colza,
cacahuète) à part les graines de soja, la production de toxine continue à augmenter jusqu’au jour 30
après lequel plus aucune mesure n’a été réalisée.

Étant donné que les mycotoxines sont répartis de façon très irrégulière au sein d’un lot, le législateur
européen a déterminé dans le règlement 401/2006 le mode de prélèvement des échantillons de
denréess alimentaires pour la recherche des mycotoxines.
mycotoxines Deses propositions ont été mis en place pour
l'échantillonnage d’ aliments pour animaux.

3.8.5 Ochratoxine A (OA)

3.8.5.1 Structure de l’ochratoxine A

Figure 3.8.3
3.8. : structure chimique de l’ochratoxine A

Les Ochratoxines
oxines sont un groupe de plusieurs molécules chimiquement apparentées qui sont isolées
de certaines espèces d’Aspergillus et de Penicellium. On retrouve entre autre les ochratoxines A, B et
C, les esters méthyliques et éthyliques de ces structures ainsi que
que les ochratoxines α et β. La plus
courante et la plus toxique parmi ces molécules est l’ochratoxine A

L’ochratoxine A (MW = 403.8) est un composé cristallin incolore, soluble dans les solvants organiques
polaires et dans les solutions aqueuses de bicarbonates diluées,, légèrement soluble dans l’eau et
ayant un point de fusion de 90°C quand il est cristallisé dans le benzène et de 169 °C pour les
cristaux obtenus dans le xylène.

186
Une réaction chimique importante de l’ochratoxine A est l’estérification du groupe carboxyle. Le
méthyl ester formé avec du BF3-méthanol est utilisé en chromatographie liquide pour la confirmation
de l’identification de la molécule.

3.8.5.2 Risques associés à l’ochratoxine A

L’apparition de l’OA dans les tissus animaux après ingestion de la molécule dépend d’un certain
nombre de facteurs comme le temps d’alimentation, la dose, la façon dont l’OA est ingérée, le degré
de liaison du sérum, le temps de demi-vie et la durée d’une alimentation sans ochratoxine avant
l’abattage.

Une comparaison entre elles des teneurs en Ochratoxine A trouvées dans la littérature est souvent
problématique car les méthodes d’analyse ne sont pas toujours spécifiées et leurs critères de
performances sont inconnus. C’est pourquoi il est souhaitable que les études soient réalisées dans
un système de qualité analytique avec des méthodes validées.

3.8.5.3 Effets sur les hommes

Bio marqueurs pour l’exposition

OA a un temps de demi-vie d’environ 35 jours dans le corps humain. La concentration dans le sang
représente un marqueur adéquat de l’exposition récente (cfr. Tableau). Cette approche pour la
détermination de la quantité d’OA ingérée chaque jour peut être comparée avec celle calculée sur
base de la concentration en OA des aliments.

3.8.5.4 Technique d’analyse

3.8.5.4.1 Extraction

L’extraction est le plus souvent réalisée avec un mélange d’eau et de solvants organiques, dépendant
du type de matrice. Une méthode IUPAC/AOAC pour la détermination de l’OA dans l’orge utilise un
mélange de CHCl3 et H3PO4 ; pour le café vert, seul CHCl3 est utilisé. Pour la détermination dans le
blé, on utilise différents milieux d’extraction en ce compris le mélange toluène/HCl/MgCl2,
CHCl3/ethanol/acide acétique et dichlorométhane/H3PO4. Les solvants chlorés sont de moins en
moins utilisés à cause de leur effet néfaste sur l’environnement.

Burdaspal a proposé le methylbromyde tert-butylether comme solvant d’extraction pour l’OA dans les
aliments pour bébé. D’autres mélanges non chlorés qui sont utilisés pour le blé sont : méthanol/eau,
acétonitrile/eau. Seulement deux méthodes pour la détermination de l’OA dans l’orge et le café
torréfié sont validées. L’extraction de l’orge est réalisée avec un mélange acétonitrile/eau, et l’extrait
est dilué avec du PBS pour purification par IAC. Lors d’un test d’aptitude sur la détermination d’OA
dans le café torréfié, un mélange de méthanol avec une solution aqueuse à 3% de bicarbonate de
sodium (50:50) a été employé principalement pour l’extraction. Zimmerli et Dick ont décrit une
méthode de détermination de l’OA dans le vin rouge en utilisant une extraction au chloroforme.

187
3.8.5.4.2 Purification

La technique IAC (immuno affinity column) est le ‘state of the art’ pour la purification de l’OA. L’extrait
parcourt la colonne et l’ochratoxine est liée par des anticorps. L’analyte est ensuite élué par une
solution adéquate (par exemple l’acétonitrile). La réaction immunologique est spécifique à l’OA.
L’analyte est élué de la colonne après une étape de rinçage.

3.8.5.4.3 Séparation et détection

Après la purification sur IAC, la détection se fait le plus souvent par HPLC-FLD. La détermination est
possible à des niveaux du µg/kg. Généralement on utilise l’HPLC en phase inverse avec des
colonnes greffées en C18 et une solution tampon acide (acide acétique). Des rendements de 70 à
100% sont rapportés.

Les critères de prestations pour la détermination de l’OA sont décrits dans le règlement 401/2006

3.8.6 Deoxynivalenol (DON)

3.8.6.1 Introduction

3.8.6.1.1 Apparition et importance de la deoxynivalenol (DON) dans les aliments pour animaux

On trouve le plus souvent les toxines de Fusarium dans le blé, le maïs et l’orge. L’avoine, le seigle et
le triticale peuvent aussi contenir ces toxines, mais en général ils sont résistants ou échappent à des
contaminations significatives.

3.8.6.1.2 Production de DON par les moisissures

Deoxynivalenol est une mycotoxine appartenant à la famille des trichothécènes qui apparaissent à
grande échelle dans les céréales. DON est la molécule trichothécènes la plus souvent retrouvée au
Canada et aux Etats-Unis. On retrouve en plus faible quantité la nivalenol, les toxines T-2 et HT-2
tandis que le diacetoxyscirpenol (DAS) est très peu présent.

188
La zearalenon (ZEA) et les trichothécènes sont les mycotoxines les plus importantes d’un point de
vue économique pour le Canada et le nord des Etats-Unis. Dans d’autres pays, ce sont l’ochratoxine
3
et l’aflatoxine qui ont un impact économique plus grand que les toxines de Fusarium .

3.8.6.2 Structure du DON

CH3 O
O
OH
O
O H CH2
CH3
OH

Figure 3.8.4 : Deoxynivalenol


4-Deoxynivalenol (DON; vomitoxin, dehydronivalenol, RD-toxine) est l’appellation pour le 12,13-
epoxy-3,4,15-trihydroxytrichotec-9-et-8-one (MW: 296,32) (cfr. Figure 3.8.5). Don se présente sous
forme de cristal blanc avec un point de fusion de 151-153 °C. C’est un produit optiquement actif,
soluble dans l’éthanol, le méthanol, l’acétate d’éthyle, l’eau et le chloroforme. C’est un composant
stable, aussi bien durant le stockage et le broyage que durant la préparation et la cuisson de la
nourriture. La molécule n’est pas dégradée à haute température.

3.8.6.3 Méthode d’analyse

3.8.6.3.1 Extraction

L’extraction du DON est réalisée par agitation dans une solution aqueuse d’acétonitrile, de l’eau ou de
l’eau avec du polyéthyleneglycol. Le temps d’extraction doit être suffisant (2h) comme présenté dans
la méthode pour les fourrages.

3.8.6.3.2 Purification

La purification est réalisée avec des colonnes d’immunoaffinité ou des colonnes SPE.

3.8.6.3.3 Séparation et détection

L’analyse peut être réalisée aussi bien en RP-HPLC-UV qu’en GC après dérivatisation. En HPLC-UV,
il faut travailler dans les UV bas (218 nm)

Le règlement 401/2006 présente les critères de prestations pour l’analyse du DON.

3
malheureusement, l’auteur de cette étude ne donne pas de ces observations pour l’Europe.

189
3.8.7 Fumonisines

3.8.7.1 Structure des fumonisines

On retrouve les fumonisines la plupart du temps dans le maïs souillé et dans les produits à base de
maïs. On les retrouve un peu moins souvent dans d’autres denrées alimentaires comme le sorgho, le
riz, la bière et les haricots. Les fumonisines les plus courantes sont les fumonisines B1 et B2. Les
méthodes d’analyse sont donc développées essentiellement pour ces deux molécules.
En général, les méthodes dirigées vers les fumonisines B1 et B2 semblent valables pour la
fumonisine B3. Il n’existe pas de méthode d’analyse spécifique pour la fumonisine B4 et il y a très peu
d’information sur son apparition naturelle.

Les fumonisines sont un groupe de matières apparentées structurellement. La fumonisine B1 est le


diester de l’acide 1,2,3-tricarboxy-propane et du 2S-amino-12S,16R-diméthyl-3S, 5R,10R,14S,15R
pentahydroxyeicosane où les groupes hydroxyde du C14 et du C15 sont estérifiés. La fumonisine B2
est l’analogue déoxygéné en C10 de la B1. La stéréochimie complète des fumonisines B3 et B4 est
inconnue, mais la terminaison amino de la fumonisine B3 a la même configuration que celle de la
fumonisine B1.

190
3.8.7.2 Les moisissures produisant les fumonisines.

Les fumonisines sont produites par des moisissures du genre Fusarium. La seule espèce qui produit
des quantités significatives de fumonisines est le Fusarium verticillioides (Sacc.) Nirenberg (F.
moniliforme (Sheldon)=) et l’espèce apparentée F. proliferatum (Matsushima) Nirenberg qui domine
en fin de période de croissance. Au moins dix autres espèces de Fusarium produisent aussi cette
toxine.

F. verticillioides et F. proliferatum appartiennent aux moisissures les plus communes sur le maïs et
sont retrouvés aussi bien sur les épis endommagés que sur les épis intacts. Ces espèces causent la
pourriture fusarienne du maïs, une maladie importante dans les régions chaudes. Il existe également
une relation étroite entre les dégâts des insectes et la pourriture fusarienne avec d’autres espèces de
Fusarium comme F. graminearum. Le stress thermique peut aussi jouer un rôle, spécialement pour
les cultivars cultivés en dehors de leurs régions d’origines. F. verticillioides et F. proliferatum croissent
dans une gamme étendue de température, mais c’est uniquement à des valeurs de l’activité en eau
assez élevées (> 0.9) qu’il peuvent produire dans le maïs, avant la récolte ou la phase du séchage,
des fumonisines. Sauf dans des circonstances extrêmes, les concentrations de fumonisines
n’augmentent pas durant le stockage.

3.8.7.3 Les hommes

Chez l’homme, plusieurs apparitions ont été déterminées avec des cancers de l’œsophage, des
cancers du foie et un cas confirmé de mycotoxicose aiguë en Inde.

3.8.7.4 Techniques analytiques

3.8.7.4.1 Screening

La chromatographie sur couche mince et les techniques immunochimiques comme l’ELISA sont les
méthodes de screening les plus courantes. Il existe différents kits ELISA disponibles dans le
commerce.

3.8.7.4.2 Méthodes quantitatives

Les méthodes disponibles pour la quantification comprennent souvent une extraction, une purification
avant une quantification de l’analyte.

3.8.7.4.3 Extraction et purification

La purification n’est souvent pas nécessaire pour les immunoessais, elle est au contraire
indispensable pour les méthodes chromatographiques. Les solutions utilisées pour l’extraction sont
entre autre : méthanol/eau (3:1) et acétonitrile/eau (1:1).

Pour la purification, on utilise le plus souvent des colonnes d’immunoaffinité.

191
3.8.7.4.4 Séparation et détection

Vu leur caractère polaire, la technique la plus courante pour l’analyse des fumonisines est la
chromatographie liquide en phase inverse avec une détection par fluorescence. Le plus souvent, on
réalise une dérivatisation précolonne avec le o-phtaldialdéhyde / mercaptoéthanol (OPA) malgré sa
faible stabilité quand la détection par fluorescence suit. Des méthodes GC ont également été
développées.

Le réglement 401/2006 présente les critères de prestations pour l’analyse des fumonisines.

3.8.8 Trichothécènes

3.8.8.1 Structure

Les trichothécenes sont essentiellement produits sur les champs (Moisissures – Fusarium) dans les
productions céréalières. Les plus importants sont les T-2, HT-2 (Type A) et les DON (type B).

Les toxines T-2 et HT-2 sont des Trichothécènes de type A qui s’apparentent aux
époxysesquiterpénoïdes. La recherche a démontré que les toxines T-2 et HT-2 sont présentes dans
les productions tels que le froment, le maïs, l’avoine, l’orge, le riz, les haricots et les fèves de soja.
Les toxines T-2 et HT-2 sont issues du Fusarium sporotrichioides, F. paoe, F. equiseti et F.
acuminatum. Le principal producteur est le Fusarium sporotrichioides, une moisissure saprophyte qui

192
se développe entre -2 et 35°C et prolifère par activité (au-dessus de 0.88). Par conséquent, les
toxines T-2 et HT-2 ne se retrouvent normalement pas dans les grains lors de la récolte, mais par
suite de dégâts causés par l’eau lorsque le grain reste longtemps sur le champ durant ou après la
récolte, en particulier, par temps froid où les céréales conservées sont humides.

La toxine T-2 est le nom trivial du 4-15-diacétoxy-3-dihydroxy-8-[3-méthylbutyryl-oxy]-12,13-


époxytrichotec-9-ène, qui est illustrée à la figure 1. Conformément à la formule brute C24H34O9, la
masse moléculaire relative est de 466,5 g/mol.

La toxine HT-2 est le nom trivial du 15-acétoxy-3-4-dihydroxy-8-[3-méthylbutyryl-oxy]-12,13-


époxytrichotec-9-ène, qui est illustrée à la figure 1. Conformément à la formule brute C22H32O8, la
masse moléculaire relative est de 424,5 g/mol.
Les structures des toxines T-2 et HT-2 se différencient seulement par un groupe fonctionnel sur le
carbone C-4-positif, car la toxine T-2 se métabolise facilement en toxine HT-2. C’est pourquoi, ces
deux mycotoxines sont évaluées ensembles.

La toxine T-2 se présente sous la forme cristalline d’aiguilles blanches, avec un point de fusion de
26
151-152°C et un pouvoir rotatoire de [] D = +15 (c= 2,58 dans l’éthanol).

3.8.8.2 L’homme

Un contact accidentel de la toxine T-2 avec la peau occasionne de sérieuses irritations et de l’apathie.

3.8.8.3 Méthode d’analyse

3.8.8.3.1 Screening

Pour le screening, des kits d’immuno-essais sont disponibles pour la T-2 et la HT-2 dans le froment.
L’extraction est généralement réalisée dans l’acétimètre/eau, le méthanol ou le chloroforme/éthanol. Il
peut y avoir détection à partir de 200 µg/kg.

3.8.8.3.2 Méthode quantitative

Il y a différentes méthodes existantes pour l’analyse des toxines T-2 et HT-2. La technique d’HPLC
avec détection UV n’est pas applicable étant donné que le groupe cétone sur le carbone C8 positif est
absent. Cependant, il semble que dans la pratique cela serait bien possible d’effectuer l’analyse par
HPLC-UV.

Pour l’extraction dans les graines des aliments et fourrage, il est habituellement fait usage
d’acétonitrile/eau ou méthanol/eau. L’extraction est alors réalisée avec un ultra-turrax ou un agitateur
horizontal. Pour la purification, de courtes colonnes IAC sont disponibles depuis peu.
L’analyse peut se faire aussi bien par HPLC-FLD que par GC. Pour l’HPLC-FLD, il peu être fait usage
du 1-anthroynitril et du 4-diméthylaminopyridine. Pour la GC, on utilise le plus souvent la
triméthylsilylation ou la fluoroacylation pour augmenter la rapidité et la sensibilité.
Dans le décret CE/401/2006 sont repris les indices de prestation pour l’analyse des toxines T-2 et
HT-2.

193
3.8.9 Zéaralénone

3.8.9.1 Introduction

La zéaralénone est produit durant la conservation du maïs (moisissures fusarium) et a un


fonctionnement oestrogène. C’est une mycotoxine non stéroïdienne produite par plusieurs
moisissures Fusarium spp. Il est connu qu'elle est impliquée dans plusieurs mycotoxicoses du bétail,
en particulier chez les porcs.

La zéaralénone est stable à chaud et est trouvée partout dans le monde dans des céréales comme le
maïs, l'orge, l'avoine, le blé, le riz et le sorgho ainsi que dans le pain.

3.8.9.2 Ingestion chez l’homme

Dans le Moyen-Orient la source la plus importante était le maïs (31%) et le froment (52%) ; le riz dans
l’Extrême-Orient (62%) ; Le maïs (55 %) et le riz (31%) en Afrique ; le maïs (27%), le riz (30%) et le
froment (30%) en Amérique Latine ; et le froment (67%) en Europe.

La concentration en zéaralénone dans les fruits, les légumes et les noix n’est pas significative.

L’ingestion moyenne quotidienne en zéaralénone est estimée à 1,5 µg/jour en Europe et 3,5µg/jour
dans le Moyen-Orient.

Sur base des résultats des différentes études une PMTDI de 0,5 µg/kg/jour a été établie.

194
3.8.9.3 Méthode d’analyse

3.8.9.3.1 Extraction

Les solvants utilisés pour l’extraction sont normalement des mélanges de solvants liquides
organiques dont l’acétate d’éthyle, le méthanol, l’acétonitrile et le chlorophorme.

3.8.9.3.2 Purification

Généralement on utilise une colonne IAC.

3.8.9.3.3 Séparation et détection

La plupart du temps on utilise la technique RP-HPLC-FLD.

Dans le règlement 401/2006 les critères de prestation sont établis pour la zéaralénone.

195
3.8.10 Aflatoxines

3.8.10.1 Structure

3.8.10.2 Méthodes d’analyse

3.8.10.2.1 Extraction

L’extraction des aflatoxines se fait, en général, par des solvants classiques tels que l’acétone, le
chloroforme, le méthanol et leurs mélanges. La pratique montre que de petites quantités d’eau
augmentent, de manière significative, le rendement d’extraction.

3.8.10.2.2 Purification

La purification se réalise par solid-phase extraction (SPE) avec des cartouches C18 et des colonnes
florisil ou d’immuno-affinité (IAC).

3.8.10.2.3 Séparation et détection

Les méthodes de chromatographie liquide les plus utilisées sont les RP-HPLC avec dérivatisation
post colonne. La dérivatisation peut être réalisée avec Br2 ou I2 (pour les aflatoxines B et G). La
longueur d’onde d’excitation est à 435 nm, celle d’émission à 365 nm. La colonne de séparation
consiste en la classique C-18. Il y a continuellement de nouvelles techniques disponibles en LC/MS.
Récemment il y a aussi d’ équipements UHPLC sur le marché avec lesquels des aflatoxines peuvent

196
être mesurées sans derivatisation. Afin de pouvoir mesurer ainsi sensiblement les aflatoxines B1 et
G1 qui sont faiblement fluorescents, une cellule de flow extra large est utilisée.

Le décret 401/2006 fixe les critères de performance pour l’analyse des aflatoxines.

3.8.10.3 Propriétés

Des quatre aflatoxines (B1, B2, G1 et G2), c’est l’aflatoxine B1 qui est la plus importante et la plus
toxique, aussi bien pour l’homme que pour l’animal, et elle est un puissant carcinogène. Elle est
classée, par l’IARC, dans le groupe 1 et est clairement génotoxique. Le métabolite de l’aflatoxine B1
se retrouve dans le lait comme aflatoxine M1.

Dans les régions géographiques à forte prévalence de porteurs de l’antigène du sérum de l’hépatite
B, il y a une forte chance de développement du cancer du foie.

Les aflatoxines sont principalement produites par les moisissures Aspergillus : A. parasiticus et A.
flavus. A. parasiticus se retrouve principalement dans le sol tandis qu’ A. flavus se retrouve
principalement dans les plantes (feuilles, fleurs). Les aflatoxines sont produites aussi bien avant
qu’après la moisson selon des conditions de température, de pluies et de disponibilité de nutriments
bien définies.

Avant on pensait que la pollution primaire des plantes agricoles en Europe était peu probable, mais,
récemment, on a retrouvé des aflatoxines dans du maïs produit en Italie.

Il est apparu que la principale source d’aflatoxines dans les aliments des animaux provient des
déchets de coco, arachides et tournesol ainsi que du gluten de maïs. Les aflatoxines sont donc
principalement présentes dans les moyens nutritifs importés.

197
3.8.10.4 L’aflatoxine M1

3.8.10.4.1 Structure

L’aflatoxine M1 et métabolisée in vivo, chez le bétail, à partir de l’aflatoxine B1 absorbée dans


l’alimentation. Elle est excrétée par le lait ; chez la vache laitière 0.5 à 4 % de l’aflatoxine B1 ingérée
se retouve dans le lait sous forme d’aflatoxine M1.

Vu sa présence dans le lait, elle fait courir un grand risque aux enfants et nourissons, grands
consommateurs de produits laitiers.

L’aflatoxine M1 est particulièrement résistante aux traitements de transformation du lait, à savoir, le


chaud, le froid, la lyophilisation. Vu l’affinité de l’aflatoxine M1 pour les caséines, on la retrouve
presque en totalité dans les fromages, le lait écrémé, les yogourts, fromage blanc mais très peu dans
le beurre

3.8.10.4.2 Toxicité

Les aflatoxines figurent parmi les cancérigènes les plus puissants. Les aflatoxines M1 ont les mêmes
propriétés toxicologiques que les aflatoxines B1 mais avec un pouvoir carcinogène moindre. Une
intoxication aigüe est souvent mortelle avec des symptômes de dépression, anorexie, diarhée,
anémie, ictère ; les liaisons hépatiques évoluent en carcinome.

3.8.10.4.3 Technique d’analyse

o Screening ELISA

o Confirmation par clean-up sur colonnes d’immunoaffinité et dosage en HPLC-FLUO.

3.8.11 Ergot de seigle

3.8.11.1 Introduction

Ergot de seigle est un nom collectif pour les alcaloïdes (ergotamine, ergostine…) qui sont surtout
produits dans le seigle (Claviceps purpurea). Ces composés occasionnent des fractures, de la
diarrhée et ont un effet hallucinogène.

Voir aussi les techniques d’analyse : ‘Microscopie’. Depuis peu, il y a aussi des techniques HPLC
disponibles.

Le terme ergot de seigle fait référence à des ergots foncés formés par différentes sortes de
moisissures du genre Claviceps. Claviceps purpurea est le plus fréquent et on le trouve surtout sur le
seigle, le triticale et le froment mais aussi sur d’autres céréales et herbes. La quantité d’alcaloïdes
formée est très variable. La législation actuelle est basée sur le poids des ergots. Il faut cependant
faire remarquer que la toxicité est déterminée tant par la teneur que par la composition des
alcaloïdes.

198
Le terme alcaloïdes de l’ergot de seigle fait référence à un groupe varié de maximum 40 toxines
consistant en clavines, acides lysergiques et ergopeptines. Ces toxines sont produites par des
moisissures de la famille des Clavicipitacées à laquelle appartiennent, entre autre, Claviceps
purpurea, C. paspaspali et C. fusiformis qui sont prédominants sur le seigle, le froment et l’orge mais
qui peuvent se présenter aussi sur le riz, le maïs, le sorgho et l’avoine.

Claviceps purpurea contamine les plantes pendant la floraison. Il y a, en principe, de nombreuses


poacées qui peuvent lui servir d’hôte. Les contaminations se produisent plus dans le seigle et le
triticale qui ont des fleurs ouvertes. Cependant, différentes herbes qui constituent un réservoir naturel
pour les moisissures peuvent être contaminées.
Les ergots sont résistants et restent intacts pendant l’hiver et pendant la montée du froment. Dans
des conditions favorables, ils développent des périthèces qui peuvent produire des ascospores qui à
leur tour peuvent contaminer les plantes en fleur. Après la contamination, il est produit un mycélium
blanc-jaune qui produit un miellat qui contient des conidies infectieuses. Le miellat attire les insectes
qui dispersent les conidies, ce qui provoque une infection secondaire. La grandeur des ergots va de
quelques mm à plus de 4 cm selon la plante hôte et le poids varie de quelques grammes à 25 g par
100 ergots. La couleur des ergots va du blanc (C. tripsaci) au brun (C. glabra) au jaune (C. hirtella) et
au brun-violet (C. purpurea). En outre, la teneur totale en alcaloïdes dans les ergots varie
considérablement entre 0,01 et 0,21 %. Ces différences sont dépendantes de la souche, de la région
géographique et de la plante hôte. En Allemagne, on a constaté, ces 10 dernières années une
augmentation des infections par C. purpurea. Il en résulte que 40 à 50 % des échantillons examinés
sont infectés. En plus, il peut aussi y avoir des ergots des herbes qui infectent entre les moissons.

Les intoxications occasionnées par C. purpurea sont connues depuis des siècles. Dans la littérature
moyenâgeuse, ces intoxications portent les noms de « feu de St Antoine » et « feu sacré » avec des
symptômes de gangrène, de douleur intense et des symptômes neurotoxiques. La dernière grande
épidémie de gangrène s’est produite en Ethiopie en 1977-1978 chez 140 personnes qui montraient
des signes d’intoxication et avec une grande mortalité (34 %).

Sur base de ces effets biologiques, les alcaloïdes de l’ergot de seigle sont utilisés depuis le début du
ème
19 siècle à des fins médicales. Ainsi l’ergotamine agit comme antagoniste des alpha-adéno-
récepteurs et provoque un accroissement de la circulation sanguine ; de même pour la bromocriptine
comme antagoniste des dopamino-récepteurs. L’ergométrine est utilisée lors des accouchements
alors que son mécanisme d’action n’est pas connu.

3.8.11.2 Méthodes d’ analyse

L'extraction est fait à l'usage d'acétonitrile / d'ammonium carbonate 200 mg/l. Une solution alcaline
est utilisée pour rendre les alcaloïdes dans la configuration appropriée. L'extraction est réalisée avec
un ultra-turrax ou un agiteur horizontale. Pour la purification, des colonnes SPE - développées
spécifiquement pour cette analyse - sont utilisées. La longueur d'onde d'excitation s'élève à 330 nm,
la longueur d'onde d'émission à 415 nm.

L'analyse est réalisée avec l'HPLC-FLD. On n’a plus besoin de derivatisation pour séparer les 6
principaux alcaloïdes et leurs isomères stéréo.

199
3.8.12 La patuline

3.8.12.1 Structure

La patuline est un métabolite issu d’espèces fongiques de type Penicillium, Aspergillus et


Byssochlamys. Penicillium expansum en est l’espèce la plus fréquente.

Seul Penicillium peut contaminer les Pomacae (pommes, poires et coings). Ce champignon est un
parasite des blessures : chocs du fruit avec altération de l’épiderme, piqûres d’insectes ; il est souvent
identifié sur des fruits présentant des symptômes de pourriture externe.

Ce champignon tolérant aux températures, aux conditions hygrométriques, indifférent à la lumière est
présent partout, dans les vergers, les stations fruitières et les ateliers de transformation.

Formule moléculaire Pomme atteinte par Penicillium expansum

La présence de patuline n'est pas décelable au goût ou à l’odorat. Seule l'analyse peut la mettre en
évidence. Les jus contaminés n'ont ni goût particulier, ni modification d'aspect.

C'est un toxique à faible dose sur les animaux à sang chaud et l'homme. Les alcools forts n'en
contiennent plus. La transformation d'alcools à faible degré d'alcool en vinaigres détruit également la
patuline, mais celle-ci
ci n'est pas détruite par la pasteurisation.
pasteurisation. Elle est cependant présente dans les
produits cidricoles non fermentés ou faiblement fermentés.

Cette molécule de faible poids moléculaire est difficilement dégradable et thermostable en milieu
aqueux. La patuline, comme d'autres mycotoxines est capable
capable de subsister des années dans les
denrées, même après l'élimination des moisissures par un fongicide ou par traitement mécanique.

3.8.12.2 Toxicité

A partir d'une certaine dose (faible), les symptômes se manifestent par des lésions congestives au
niveau des poumons,
oumons, des reins et de la rate ; mais accessoirement, la patuline provoque une
dégénérescence des neurones du cortex cerébral, d'où peuvent résulter divers symptômes nerveux
(dont paralysie...).

Classification IARC : Groupe 3 (non classifiable comme carcinogène


carcinogène pour les humains).
humains)

200
3.8.12.3 Technique d’analyse

o extraction à l’acetate d’éthyle


o clean-up SPE
o injection et quantification en HPLC-UV
o confirmation possible en GC-MS

201
3.9 Les allergènes

3.9.1 Les allergènes alimentaires

3.9.1.1 Généralités

Une allergie est en fait une réaction exagérée de notre corps à des substances (appelées antigènes)
étrangères à l'organisme, que notre système immunitaire considère à tort - on ne sait trop pourquoi -
comme ennemies, alors qu'intrinsèquement, elles ne sont pas dangereuses, contrairement à certains
microbes ou virus. Pour des raisons peu claires, le système immunitaire des personnes allergiques à
une substance précise considère la substance allergisante comme un ennemi. Dans ce cas, les
antigènes sont appelés allergènes. N'importe quel allergène susceptible d'entrer dans notre corps
peut provoquer une allergie.

Pour résumer la situation, il existe deux grandes espèces d'allergies: les allergies alimentaires et les
allergies respiratoires. Dans les deux cas, le mécanisme au cours duquel l'allergie apparaît est le
même. Le premier contact avec la substance allergène ne provoque aucune réaction dans
l'organisme: c'est ce que l'on nomme la phase de sensibilisation, mais le deuxième contact de la
personne allergique avec l'allergène suscite la réaction allergique.

Les allergies respiratoires apparaissent suite au contact du système immunitaire de l'appareil


respiratoire avec un allergène, tel que acariens, pollens, moisissures, poils d'animaux, etc. Une
allergie respiratoire provoque principalement des difficultés respiratoires: rhinites, sinusites,
laryngites, asthme, etc.

Les allergies alimentaires apparaissent suite à l'ingestion d'allergènes qui entrent en contact avec le
système immunitaire de l'appareil digestif. Les symptômes des allergies alimentaires sont plus variés:
éruptions cutanées, oedèmes (gonflement), urticaire, asthme, choc anaphylactique (degré le plus
grave des réactions allergiques), troubles digestifs, rhinites. Les allergies alimentaires peuvent se
produire chez 2 à 3% de la population belge et probablement 8 % des enfants, le taux étant quelque
peu plus élevé chez les enfants.

Actuellement, on compte plus de 160 allergènes alimentaires. Les allergènes les plus connus se
trouvent dans les arachides, les oeufs, le poisson et les crustacés, les céréales contenant du gluten
(froment, orge, avoine et seigle), le soja, le lait et les produits laitiers, les noix et leurs dérivés, les
graines de sésame, les denrées alimentaires contenant des sulfites (conservateurs utilisés dans
certains aliments). Les réactions allergiques les plus graves sont provoquées par la consommation
d'arachides (choc anaphylactique pouvant être mortel si traité trop tard).

Les allergies alimentaires sont dès lors en première instance en relation directe avec des éléments
habituels et normaux de notre alimentation auxquels une personne est allergique (source :
www.afsca.be). Une allergie alimentaire survient en réaction à une protéine qui peut être présente par
exemple dans les arachides, le lait de vache, le poisson, etc. Il est donc impossible d’être allergique à
un sucre ou à un corps gras, même si l’on peut très bien avoir une intolérance au lactose, sucre
naturellement présent dans le lait. Pour provoquer une allergie, une très petite quantité de l’aliment
est suffisante pour provoquer des symptômes.

L’unique solution, pour un traitement curatif des allergies alimentaires, consiste à bannir la
consommation des aliments allergènes.

202
Les symptômes d’allergie peuvent être légers, par exemple des picotements sur les lèvres, ou très
graves et potentiellement mortels, comme une difficulté à respirer, une perte de conscience ou de
l’arythmie cardiaque dans le cas d’un choc anaphylactique.

3.9.1.2 Mécanisme de la réaction allergique

Lors d’une allergie, le système immunitaire réagit envers une ou quelques substances spécifiques et
non contre tous les ingrédients de l’aliment. L’organisme considère ces substances comme
dangereuses et met en place un mécanisme pour les éliminer.
Le système immunitaire, grâce à des anticorps (immunoglobulines, Ig) commande la libération de
substances pro-inflammatoires comme l’histamine et provoquent des effets sur le corps comme des
rougeurs, des démangeaisons, une rhinite, de l’eczéma, de l’asthme.

Les symptômes d’allergie apparaissent au moment du deuxième contact avec l’aliment. Au premier
contact avec l’aliment allergisant, le système immunitaire, se « sensibilise ». Au second contact, il
sera prêt à réagir. L’allergie se développe donc en deux étapes.

3.9.1.3 Les allergies croisées

Ce sont des allergies à des substances présentant des similitudes chimiques. Par exemple, une
personne allergique au lait de vache risque fort d’être aussi allergique au lait de chèvre, en raison de
la similarité de leurs caséines.

Des tests cutanés permettent d’identifié les allergies croisées. Ci dessous, un tableau présentant
quelques allergies croisées.

3.9.1.4 Symptômes

Les signes d’allergies apparaissent habituellement dans les minutes suivant l’absorption de l’aliment
(et jusqu’à deux heures). Leur nature et leur intensité varient d’une personne à l’autre. Ils peuvent
inclure l’un ou l’autre des symptômes suivants, seuls ou en association.

o symptômes cutanés : des démangeaisons, des éruptions cutanées, des rougeurs, un


gonflement des lèvres, du visage et des membres (urticaire, eczéma, angio-œdème).

Figure 3.9.1. Urticaire Figure 3.9.2 Angio-oedème

203
o symptômes respiratoires : une respiration sifflante, une sensation de gonflement de la gorge,
une difficulté à respirer, une sensation d’étouffement (asthme) ; le nez qui pique, qui coule,
tension dans les sinus, rougeurs aux yeux, rhinite).

o symptômes digestifs : des crampes abdominales, de la diarrhée, des coliques, des nausées
et des vomissements.

o symptômes cardiovasculaires : une pâleur, un pouls faible, des étourdissements, une perte
de conscience.

3.9.1.5 La réaction et le choc anaphylactiques

La réaction anaphylactique est une réaction subite et généralisée touchant tout l’organisme. Traitée
non rapidement, elle entrainera un choc anaphylactique se traduisant par une chute de la tension
artérielle, un perte de conscience, voir le décès en quelques minutes. Dès les premiers signes de
réaction grave et de détresse repiratoire, il est vital d’administrer de l’épinéphrine (adrénaline)

Les allergies aux arachides, aux noix, aux poissons et aux fruits de mer sont les plus souvent
impliquées dans les réactions anaphylactiques dues aux allergènes alimentaires..

o Pour qu’il soit question de réaction anaphylactique, les symptômes doivent être très
prononcés. Habituellement, plus d’un système est atteint (cutané, respiratoire, digestif,
cardiovasculaire).

o Pour qu’il soit question d’un choc anaphylactique, il doit y avoir chute de la pression
sanguine. Celle-ci peut entraîner une perte de conscience, de l’arythmie cardiaque et même
la mort.

3.9.1.6 Personnes à risque

Pour un enfant dont l’un des parents souffre d’une forme d’allergie, le risque qu’il ait une allergie
alimentaire augmente de 20 % à 40 %. Il grimpe de 60 % à 80 % lorsque les deux parents sont
allergiques.

3.9.1.7 Personnes à risque de réaction anaphylactique

o Les personnes qui ont déjà fait une réaction anaphylactique.

o Les personnes qui, en plus d’avoir une ou des allergies alimentaires, sont aussi atteintes
d’asthme.

3.9.1.8 Techniques utilisées

o Spectrométrie de masse

o PCR (polymearse chain reaction)

204
o Elisa (sandwich et/ou compétitive

Avantages Inconvénients
Spectrométrie de masse Peu de faux positifs ; Spécificité Sensibilité ; couteux
PCR Spécificité ; Sensibilité DNA et non l’allergène
ELISA Rapide, facile, sensibilité Faux positifs et faux négatifs
possibles

3.9.2 L’histamine

Les intoxications histaminiques font parties des toxi-infections alimentaires les plus répandues liée à
la consommation des produits de la pêche.

3.9.2.1 Formation de l’histamine

A la mort du poisson, certaines bactéries produisent une enzyme responsable de la tranformation


d’un acide aminé (l’histidine présente en grandes quantités) en une amine biogène : l’histamine.

Figure 3.9.3 : formation de l’histamine

L’histidine peut se présenter sous forme libre mais aussi sous forme liée dans les pigments comme
l’hémoglobine et la myoglobine.

Les bactérires responsables de la transormation de l’histidine en histamine se développent entre 7-


10°C dans les ouïes et viscères des poissons.

3.9.2.2 Espèces de poissons concernées

Les 3 principales familles de poissons riches en histidine sont :

o les scombridés : thon, maquereau…

o les clupéidés : sardine, hareng,…

o les engraulidés : anchois,…

205
3.9.2.3 Symptômes

L’intoxication histaminique est souvent confondue avec une réaction allergique : on parle de pseudo-
allergie alimentaire ; les symptômes sont les mêmes que ceux d’une allergie mais les mécanismes
impliqués ne sont pas immunitaires. Les symptômes durent quelques heures mais peuvent se
prolonger plusieurs jours dans les cas graves.

La réaction à l’histamine est différente d’un individu à l’autre suivant sa sensibilité. La réaction peut se
produire après quelques minutes ou quelque heures suivant l’ingestion du poisson contaminé et selon
une gradation :

o symptômes initiaux : rougeurs au visage et à la nuque, œdème au visage, démangeaisons,


picotements de la peau, sensations de brûlure dans la gorge et la bouche.

o symptômes de seconde phase : maux de tête, étourdissements, palpitations cardiaques.

o symptômes secondaires : de types gastro-intestinal comme nausées, vomisements,


diarrhées.

3.9.2.4 Comment éviter sa formation ?

o Saigner et rincer le poisson (le sang contient de l’histidine libre)

o Eviscérer (les bactéries sont présentes dans les viscères), réfrigérer ou congeler rapidement.

o Ne pas rompre la chaîne du froid.

o Respecter de bonnes conditions d’hygiène.

Remarques :

o L’histamine est résistante à la cuisson, à la mise en conserve, à la congélation.

o Le salage et le fumage n’inhibent pas toujours le développement des bactéries responsables


de la transformation de l’histidine en histamine.

o Une fois l’enzyme libérée (histidine décarboxylase), la réfrigération ne diminue pas son
activité d’où ne pas rompre la chaîne du froid.

3.9.2.5 Méthodes de dosage

o Méthodes de références : HPLC-fluo avec dérivatisation pré-colonne

o Méthodes alternatives : CCM, CPG, HPLC par ions pairés avec détection DAD

o Méthodes immunoenzymatiques : par kits Elisa avec dérivatisation préalable.

206
3.10 Matériaux au contact des denrées alimentaires

3.10.1 Introduction

L’industrie alimentaire est la première consommatrice d’emballages et représente 66% du chiffre


d’affaire de ce secteur. Elle est également la plus confrontée aux exigences réglementaires et ce, à
tous les stades de production. A côté de l’emballage, il existe une variété d’objets ou contenants
susceptibles d’entrer en contact avec les denrées alimentaires. Le risque de transferts réciproques
entre ces objets ou matériaux et les denrées alimentaires ne doit pas être négligé.

L’aptitude au contact alimentaire d’un objet signifie que le matériau dont il est constitué répond aux
exigences réglementaires garantissant qu’il n’y a pas de risque susceptible de présenter un danger
pour la santé humaine lors de la consommation d’aliments ou boissons au contact de cet objet. Cette
aptitude est régie par le Règlement CE 1935/2004 et concerne les matériaux et objets tels :

o les emballages et conditionnements,

o les récipients et ustensiles de cuisine, les machines et les matériaux utilisés dans la
production, le stockage ou le transport de denrées alimentaires,

o les tétines et les sucettes.

Le règlement vise les aliments et boissons qu’ils soient à l’état de produits finis ou de produits
intermédiaires, destinés à l’alimentation humaine.

A côté du règlement cadre, il existe divers règlements ou directives spécifiques décrivant les critères
d’inertie pour certains matériaux (Matières plastiques, céramiques, pellicule de cellulose régénérée)
et les modalités de contrôle de la conformité. La réglementation spécifique défini les critères d’inertie
en fonction de la nature des matériaux. Ce principe d’inertie est exprimé en terme de limite de
migration globale et limite de migration spécifique (SML). La migration globale correspond à la
somme des migrations des composés qui constituent le matériau ou l’objet. La limite de migration
spécifique est quant à elle définie pour le composé individuel.

La réglementation européenne fonctionne avec des listes positives, à savoir, des listes de substances
autorisées dans la fabrication des matériaux délivrée par la DG-Sanco. La législation américaine
fonctionne avec des listes négatives, toutes les substances non reprises dans les listes sont
autorisées.

Certaines directives sont transposées en droit national belge par matériau ou type de matériau.

Pour assurer un niveau élevé de protection de la santé et de la vie des personnes, la législation
alimentaire se fonde sur l’analyse des risques. L’union européenne demande à chaque état membre
d’établir un plan national de contrôle contenant les informations générales sur la structure et
l’organisation des systèmes de contrôles officiels.

207
3.10.2 Migrations spécifiques

3.10.2.1 Généralités

La migration spécifique est le passage de substance entre deux milieux en contact notamment ou
cours de l’interaction contenant-contenu. La migration est surtout étudiée dans le cas d'un contact
liquide-solide. Ex. : emballage des liquides alimentaires (contact paroi du récipient - liquide contenu).
Par extension le terme " migration " désigne la masse de ce qui migre et peut s’exprimer en mg/kg de
contenu ou en mg/dm² de surface en contact.

Les migrations spécifiques peuvent être évaluées soit dans les denrées alimentaires, soit au départ
des matériaux.

3.10.2.2 Migration dans les denrées alimentaires

Dans les denrées alimentaires, les analyses de migration sont complexes car l’effet de matrice est
non négligeable et la préparation des échantillons nécessite divers clean-up et/ou étapes de
concentration.

3.10.2.2.1 Migration dans les simulants

Les paramètres de l’essai de migration sont :

o le couple Temps/Température

o le simulant

La durée de l’essai de migration varie de 30 minutes à 10 jours et la température de 5°C à 175°C.

Simulants
Définition : un milieu d’essai qui imite une denrée alimentaire et qui, par son comportement,
reproduit la migration à partir des matériaux destinés à entrer en contact avec des denrées
alimentaires

Tableau 3.10.1 : classe de simulants d’aliments pour les essais de migration spécifique (Règlement
n° UE 10/2011 de la Commission du 14 janvier 2011).

Simulant d’aliment Abréviation


Ethanol à10% (v/v) Simulant A
Acide acétique (3% p/v) Simulant B
Acide citrique (5 g/l)
Ethanol à 20% (v/v) Simulant C
Ethanol à 50% (v/v) Simulant D1
Huile végétale présentant une répartition Simulant D2
particulière d’acide gras.

208
Sélection des simulants

Les simulants A,B et C sont affectés aux denrées alimentaires à caractère hydrophile qui peuvent
extraire des substances hydrophiles.
Le simulant B est utilisé pour les denrées alimentaires dont le pH est inférieur à 4,5. Le simulant C est
utilisé pour les denrées alimentaires alcooliques ayant une teneur en alcool de 20 % maximum et les
denrées alimentaires contenant une quantité significative d’ingrédients organiques qui les rendent
d’avantage lipophiles. Les simulants D1 et D2 sont affectés aux denrées alimentaires à caractère
lipophile qui peuvent extraire des substances lipophiles. Le simulant D1 est utilisé pour les denrées
alimentaires alcooliques ayant une teneur en alcool supérieure à 20 % et pour l’huile dans les
émulsions aqueuses. Le simulant D2 est utilisé pour les denrées alimentaires contenant des matières
grasses libres en surface.

Les tests sont effectués en utilisant les simulants d’aliments considérés comme les plus stricts et
prévisibles dans la pratique.

Conditions d’essais : durée – température

Le couple durée / température doit correspondre aux conditions de contact prévisible les plus strictes
pour le matériau ou l’objet et à toute information relative à la température maximale d’utilisation
indiquée sur l’étiquette.
Tableau 3.10.2 : conditions d’essais couple durée/température-Directive CE n° 10/2011

Conditions de contact dans les pires conditions d’emploi Conditions d’essais


prévisibles
Durée de contact Durée de l’essai
t ≤ 5 mn 5 min
5 mn < t ≤ 30 mn 30mn
30 mn < t ≤ 1 h 1h
1h < t ≤ 2h 2h
2h < t ≤ 6h 6h
6h < t ≤ 24h 24h
1j<t≤3j 3j
3 j < t ≤ 30 j 10 j
T > 30 jours Conditions spécifiques pour un
essai accéléré (Règlement CE
n° 10/2011 pp/84).
Température de contact Température de l’essai
T ≤ 5°C 5°C
5°C < T ≤ 20°C 20°C
20°C < T ≤ 40°C 40°C
40°C < T ≤ 70°C 70°C
70°C < T ≤ 100°C 100°C ou température de reflux
100°C < T ≤ 121°C 121°C (1)
121°C < T ≤ 130°C 130°C (1)
130°C < T ≤ 150°C 150°C (1)
T > 150°C 175°C (1)
(1) : cette température n’est utilisée que pour le simulant D2 pour les simulants A, B et C, l’essai est remplacé par un essai à >
100°C.

209
3.10.2.3 Analyses

3.10.2.3.1 Aluminium

Troisième élément présent à la surface de la terre, il est le métal le plus utilisé dans l’industrie
notamment dans :

o Transports

o Bâtiment

o automobile

o Ustensiles de cuisine

o Emballages alimentaires (stockage, préparation).

Le projet des lignes directrices du Conseil de l’Europe retient une limite de migration spécifique (SML)
actuelle de 3,5 mg/l. L’analyse est réalisée par ICP-OES avec un atomiseur cyclonique afin
d’atteindre une LOQ suffisante.

3.10.2.3.2 Encres : Isopropylthioxanthone

L’isopropylthioxanthone est un constituant (photo-initiateurs permettant le durcissement par


polymérisation) de l’encre d’impression des emballages Tetra Pak et peut sous certaines conditions
migrer de l’extérieur de l’emballage vers le contenu de l’emballage.

Figure 3.10.1 : formule développée de l’isopropylthioxanthone

La méthode de détection la plus couramment utilisée après extraction est une séparation par HPLC
couplée à un spectromètre de masse.

3.10.2.3.3 Semicarbazide (SEM)

Le semicarbazide présent dans les denrées alimentaires trouve son origine dans :

o la dégradation de l’ azodiacarbonamide durant le process de chauffage,

o comme métabolite relativement stable des nitrofuranes utilisés en tant qu’ antibiotiques.

L’azodiacarbonamide est un agent « gonflant » utilisé dans les joints en polymères de couvercles de
certains conditionnements afin d’en assurer l’étanchéité.

210
Pour l’analyse chromatographique de ce composé, une étape de dérivatisation (2-NBA 2-
nitrobenzaldéhyde.) est rendue nécessaire par la structure de la molécule.

Figure 3.10.2 : dérivatisation du semicarbazide

Différentes études ont montré la présence de SEM à des concentrations pouvant atteindre 25 µg/kg
dans des sauces préparées, des conserves stérilisées et des aliments pour bébés.

Le semicarbazide (SEM) appartient à une famille de substances chimiques (les hydrazines) dont
l’innocuité pour la santé humaine et animale est largement mise en doute. La Directive 2004/1 en
interdit son usage depuis 2005. Son usage est interdit depuis 2005 (Directive 2004/1/CE).

La LC-MS constitue la méthode d’analyse de choix pour le contrôle de la migration du semicarbazide.

3.10.2.3.4 Formaldéhyde

La mélamine ou formaldéhyde de mélamine est un polymère faisant partie des résines aminées. Les
propriétés de résistance à la chaleur notamment font que ce polymère est largement utilisé pour des
objets destinés à entrer en contact avec des denrées alimentaires. Cependant, le processus de
polycondensation entre la mélamine et le formaldéhyde n’étant pas complet, les monomères libres
peuvent migrer vers les denrées alimentaires.
Les limites de migrations spécifiques de 15 mg/kg (Directive n° CE/72/2002) pour ces monomères
sont déterminées par chromatographie en phase gazeuse..

La chromatographie liquide avec post-dérivatisation pour le formaldéhyde est une des techniques
d’analyse. En effet, afin de rendre possible l’analyse de ce composé par HPLC, le formaldéhyde est
dérivatisé en présence d’une solution 2,4-dinitrophenylhydrazine (DNPH).

211
Figure 3.10.3 : schéma de post-dérivatisation du formaldéhyde.

3.10.2.3.5 4,4-diaminodiphenylmethane (DDM, MDA, DADP,DADPM)

Figure 3.10.4: molécule de DDM

Le 4,4-diaminophenylmethane, l’analine et le 2,4 toluènediamine font partie du groupe des amines


aromatiques primaires et peuvent être utilisé pour donner une couleur noire à certains ustensiles de
cuisine en nylon, elles servent aussi de durcisseur pour les résines époxydes.

La limite de migration spécifique de la somme des amines aromatiques ne peut dépasser 10 µg/kg.
La migration spécifique de la molécule des polymères est évaluée par HPLC-UV ou par GC-MS.

3.10.2.3.6 Huile de soja epoxydée (ESBO) :

L’ESBO (C57H106O10) est :

o un stabilisateur de matériaux en PVC.

o utilisé dans les joints en PVC dans le couvercle des bocaux en verres.

Selon le Règlement CE n° 372/2007 les limites de migration sont :

o produits destinés aux bébés et aux petits enfants ainsi que des produits à base de céréales:
LMS =30 mg/kg food
2
o tous les autres produits : LMS = 60 mg/kg food ou 10 mg/dm

212
L’ESBO n’est à priori pas toxique en tant qu’additif intervenant dans le processus de fabrication de
plastiques à usage alimentaire. Aux températures élevées utilisées (160°C-220°C ) pour la fabrication
des articles en PVC ou pour cuire les vernis des boîtes de conserve, les produits de conversion
d’huile de soja epoxidée (ESBO) donnent lieu à des produits non identifiés. Dans les films
alimentaires PVC et les joints PVC des couvercles des pots en verre, probablement moins de 10% de
produits de conversion sont formés
Par contre, dans les vernis des boîtes de conserve, ils dépassent souvent les 20%. Dès lors, certains
conditionnements pourraient conduire à ingérer jusqu’à plusieurs milligrammes de ces produits.
L’autorisation d’utilisation de l’ESBO comme additif pour plastiques et vernis a été établie sans que la
toxicité des produits de réaction n’ait été testée.

La méthode d’analyse de la migration spécifique de l’ESBO est effectuée, après une étape de
dérivatisation par chromatographie gazeuse.

La méthode GC-FID est préconisée dans de nombreuses publications. Mais une confirmation pour
des analyses sur des matériaux qui ont subi un chauffage durant le processus de fabrication exige
l’utilisation d’un GC-MS.

Figure 3.10.5 : Chromatogramme de l’ESBO n’ayant pas subi de chauffage.

Figure 3.10.6 : Chromatogramme de l’ESBO ayant subi un chauffage en présence d’ HCl.

213
3.10.2.3.7 Phtalates

Les phtalates sont couramment utilisés comme additifs dans une série de plastiques et autres
matières de conditionnements ou objets destinés à entrer en contact avec les denrées alimentaires.
Ils rendent les plastiques comme le PVC souples et flexibles. Ils ne forment pas de liens chimiques
avec les plastiques auxquels ils sont ajoutés. De ce fait les phtalates peuvent migrer vers
l’environnement alimentaire. Les phtalates migrent principalement vers les aliments riches en
graisses tels le fromage ou la viande.

Il existe une inquiétude générale sur les phtalates en raison de leur usage généralisé et de leurs
effets éventuels sur la santé.

Les cinq phtalates les plus répandus sont :

o DEHP :Diethyhexylphthalate

o DBP : Dibutylphthalate

o DINP :Di-isonoylphthalate

o DIDP :Di-isodecylphthalate

o BBP : Benzylbutylphthalate

3.10.2.3.8 Bisphenol A

Depuis plusieurs années, les perturbateurs endocriniens tels les alkylphenols, le bisphénol-A (BPA) et
le bisphénol-B (BPB) retiennent l’attention du monde scientifique pour leurs possibles effets négatifs
sur la santé humaine.
De récents rapports indiquent que les risques liés au bisphenol-A pour la santé humaine peuvent
résulter d’une exposition inférieure à la limite de 0.05 mg/kg de poids corporel définie par les
autorités sanitaires européennes et à 0,025 mg/kg par les autorités sanitaires canadiennes.
Le polycarbonate est un plastique clair, transparent, thermo-rigide et largement utilisé dans la
production de matériaux ou objets destinés à entrer en contact avec les denrées alimentaires. Il est
produit au départ de la réaction de polymérisation du bisphénol-A (monomère primaire) avec le
carbonyl chloride en présence d’hydroxyde de sodium.
Le bisphenol-A entre également dans la composition de résines époxy et comme additif de certains
plastiques.
Lors des processus de fabrication, la réaction de polymérisation n’étant pas complète, le bisphénol
résiduel peut être libéré.

Par contact, le bisphenol peut migrer du matériau vers les denrées alimentaires et une limite de
migration spécifique a été définie. La directive européenne 2002/72 a réduit la limite de migration
spécifique du bisphenol-A à 0,6 mg/kg dans les aliments ou les simulants alimentaires.

Le règlement UE n° 321/2011 de la Commission du 1 er avril 2011 modifie le règlement UE 10/2011


en ce qui concerne la restriction de l’utilisation du Bisphénol A dans les biberons en plastique pour
nourrisson en insérant dans son texte l’interdiction formelle de l’emploi du bisphenol A dans la
fabrication des biberons.

214
3.10.2.3.9 Mercaptobenzothiazole (MBT)

Le mercaptobenzothiazole est largement répandu dans des articles en caoutchouc comme agent de
vulcanisation non-volatil et entre notamment dans la composition de certaines tétines de biberons.

Le MBT provoque des agressions cutanées telle que des irritations de la peau. Le contrôle de
conformité de la limite de migration spécifique de 25 mg/kg est réalisé par HPLC-UV.

Figure 3.10.7 : chromatogramme du 2-mercaptobenzothiazole (HPLC-UV).

215
3.11 Vitamines

3.11.1 Introduction

Les êtres humains et les animaux sont dépendants d’environ 40 différents nutriments pour garantir le
bon fonctionnement de tous leurs processus physiologiques. L’absence ou l’insuffisance d’une seule
de ces substances provoquera des symptômes de déficience pouvant être fatals à plus long terme.
Ces nutriments essentiels se subdivisent en 6 groupes : hydrates de carbone, graisses, protéines,
minéraux, vitamines et oligo-éléments. Ils sont ensuite divisés en macronutriments (hydrates de
carbone, graisses et protéines) et micronutriments (minéraux, vitamines et oligo-éléments).

Les vitamines sont des substances nutritives essentielles qui, contrairement à d’autres nutriments
(hydrates de carbone, graisses, protéines) ne fournissent pas d’énergie ou de matériaux de base
mais qui sont toutefois nécessaires pour un bon déroulement du métabolisme. Ce sont des
micronutriments, des substances nutritives dont seule une faible quantité (quelques mg ou µg) doit
être quotidiennement ingérée par le biais de l’alimentation car elles ne sont peu ou pas suffisamment
synthétisées par l’organisme.

Pour chaque vitamine, il existe un apport journalier recommandé (AJR). La quantité réellement
nécessaire par individu est déterminée par différents facteurs : l’âge, le sexe, les facteurs
environnementaux, l’état de santé, les facteurs de stress, etc. Avec l’arrivée de l’élevage intensif dans
le secteur de l’agriculture, la nourriture naturelle a été remplacée ou complétée par des aliments pour
animaux industriels. Afin de pourvoir aux besoins naturels en vitamines et accroître la production
animale, des vitamines ont été ajoutées aux aliments pour animaux industriels. Un apport accru en
vitamines améliore la résistance, la fécondité et la productivité du cheptel.

Le nom vitamine est dérivé du mot latin ‘vita’ (vie) et ‘amine’ (un composé azoté organique). Ce nom a
été utilisé pour la première fois par Casimir Funk en 1912. Entre-temps, il est apparu que seule une
vitamine ou quelques vitamines sont réellement un amine, tandis que toutes les autres appartiennent
à d’autres groupes chimiques. Elles sont cependant toutes des composés organiques, contrairement
aux oligo-éléments comme le zinc et le fer.

A l’heure actuelle, 13 vitamines sont connues, chaque vitamine représentant un groupe de composés
organiques similaires avec la même activité. Lorsqu’on a donné un nom aux vitamines, on est
initialement parti du principe d’une dénomination simple à l’aide d’une lettre, comme vitamine A, B, C,
etc. Les vitamines ont ensuite été subdivisées sur base de leur structure et de leur effet fonctionnel,
des sous-groupes sont de ce fait apparus comme vitamine B1, B2, B3, etc. La plupart des vitamines
sont des composés sensibles et se dégradent rapidement lorsqu’ils sont exposés à l’air et/ou à la
lumière.

Les vitamines sont des régulateurs des processus de synthèse et de dégradation et constituent les
fondements des coenzymes, hormones et autres substances. Elles jouent un rôle dans la croissance,
le rétablissement et le bon fonctionnement du corps. On distingue deux groupes de vitamines, à
savoir les vitamines liposolubles et les vitamines hydrosolubles. La plupart des vitamines
hydrosolubles sont transformées in vivo en coenzymes qui, en collaboration avec les enzymes
métaboliques, réalisent leurs fonctions biochimiques. Certaines vitamines peuvent également être
directement actives en certains points du métabolisme. Les provitamines ne parviennent à leur forme
définitive que dans le corps. Quelques vitamines sont fabriquées dans le corps (la vitamine K par les
bactéries intestinales et la vitamine D dans la peau, sous l’influence de la lumière du soleil).

216
3.11.2 Vitamines, carence et excès

3.11.2.1 Hypovitaminose

Les vitamines remplissent toutes sortes de fonctions clés dans le métabolisme. Lorsqu’une ou
plusieurs vitamines ne sont pas disponibles ou le sont en insuffisance, certains processus
métaboliques sont perturbés et cela entraîne différentes carences. Bien que les vitamines remplissent
le même rôle dans toute forme de vie, les organismes supérieurs (comme l’homme) ont perdu leur
capacité à créer eux-mêmes toutes les vitamines. Le nombre de vitamines dont un individu a
précisément besoin est déterminé par différents facteurs. La grossesse, les activités physiques
intenses, certaines maladies et certains médicaments augmentent les besoins en certaines vitamines.
C’est pourquoi il est très difficile de donner un besoin en vitamines quotidien général. Le besoin
quotidien minimal en vitamines pour éviter des maladies de carence a toutefois été déterminé.

En cas de carence en une vitamine, des maladies peuvent se manifester. Une administration
opportune de la vitamine manquante y remédie la plupart du temps. Les maladies qui apparaissent
en raison d’une carence totale en une vitamine s’appellent avitaminoses, en cas d’une simple
carence en une vitamine, on les appelle hypovitaminoses. Les avitaminoses les plus connues comme
le béribéri, le scorbut et le rachitisme se manifestent lors de carences graves en vitamine B1, C et D
(principalement dans les pays en voie de développement). De faibles carences en vitamines peuvent
provoquer des troubles plus atténués et ne sont souvent pas clairement observables. Ce n’est qu’à
un stade ultérieur ou dans des circonstances de stress que la maladie apparaît véritablement.

Une carence en vitamines peut entre autres être occasionnée par une alimentation déséquilibrée :

o Étant donné que la vitamine B12 ne se rencontre que dans les produits d’origine animale, le
végétarisme ou végétalisme entraîne souvent une carence en vitamine B12.

o Les allergies ou intolérances occasionnent fréquemment un déséquilibre du régime


alimentaire et peuvent détériorer l’absorption de vitamines et minéraux. Les personnes
allergiques aux fruits peuvent ainsi, par exemple, avoir une carence en vitamine C.

o Il est connu que les patients atteints de maladie cœliaque (intolérance au gluten) souffrent de
toutes sortes de carences en vitamines et minéraux. La paroi intestinale enflammée peut
difficilement assimiler toutes sortes de nutriments présents dans la nourriture. Le traitement
consiste en un régime sans gluten qui ne contient souvent pas toutes les vitamines et
minéraux ce qui peut à nouveau entraîner des carences et des troubles. Les patients atteints
de maladie cœliaque encourent par exemple un risque accru d’ostéoporose.

3.11.2.2 Hypervitaminose

D’autre part, un excédent en vitamines peut s’accumuler dans le corps et cela peut être nocif pour
l’organisme. Un excès en vitamines hydrosolubles est rare car celles-ci sont évacuées par l'urine. Les
vitamines liposolubles au contraire sont plus difficiles à éliminer et un excès en vitamines, ou
hypervitaminose, se rencontre donc presque exclusivement avec des vitamines liposolubles (surtout
la vitamine D).

217
Tout être humain est unique, c’est pourquoi il est important de tenir compte des besoins individuels en
vitamines et minéraux. Les tablettes multivitaminées courantes sont en règle générale les plus sûres
pour quelqu’un qui ne connaît pas ses propres besoins.

3.11.3 Types de vitamines

Les 13 vitamines sont subdivisées en 2 groupes, à savoir les vitamines liposolubles et les vitamines
hydrosolubles.
osolubles. Les vitamines A, D, E et K (moyen mnémotechnique : KADE) font partie des vitamines
liposolubles. On les rencontre principalement dans les denrées alimentaires riches en graisse. Les
vitamines B et C solubles dans l’eau se rencontrent dans toutes sortes de denrées alimentaires.

Les vitamines solubles dans l’eau, principalement les vitamines B, ont surtout une fonction de
cofacteur dans de nombreuses réactions enzymatiques dans le métabolisme des hydrates de
carbone, des protéines et des graisses.
graisses. De ce fait, elles sont entre autres importantes pour la
libération d’énergie de l’alimentation et pour la formation d’éléments structuraux pour les tissus
organiques.

Les vitamines liposolubles ont un grand nombre de fonctions variées, allant d'un rôle dans la vision
(vitamine A) à la régulation de l'équilibre du calcium (vitamine D).

La plupart des vitamines sont constituées de plusieurs composés (apparentés) qui ont en commun
une activité biologique déterminée et qui sont désignés par un nom générique.
génériq

3.11.3.1 Vitamines liposolubles

Les vitamines liposolubles sont : les vitamines A, D, E et K. Ces vitamines se retrouvent


principalement dans la graisse des denrées alimentaires et peuvent être stockées dans les tissus
graisseux et le foie. Dans des circonstances défavorables, ces stocks sont sollicités.

3.11.3.1.1 Vitamine A

La vitamine A est une vitamine liposoluble,


liposoluble également appelée all-trans-rétinol
tinol ou simplement rétinol.
Les dérivés synthétiques rétinyl acétate et rétinyl palmitate sont ajoutés aux aliments
aliments pour animaux et
aux denrées alimentaires pour en augmenter la teneur en vitamine A.

Figure 3.11.1: Formule de la structure de la vitamine A

o Appellation chimique : Vitamine A, rétinol ou all-trans-rétinol


all

o Formule moléculaire : C20H30O

o Masse moléculaire : 286,46 g/mol.


g/mol

218
Le rétinol peut se former dans l’intestin grêle suite à une scission oxydative de bêta-carotène
(caroténoïde). C’est pourquoi le bêta-carotène est également appelé provitamine A.

Figure 3.11.2: Formule de la structure du bêta-carotène

o Appellation chimique : bêta-carotène ou provitamine A

o Formule moléculaire : C40H56

o Masse moléculaire : 536,9 g/mol.

Fonction

La vitamine A :

o a un effet protecteur par rapport à l’épithélium

o est essentielle à la formation de capillaires sanguins et contribue de ce fait à


l’approvisionnement en alimentation de tous les organes

o prévient et traite les problèmes de peau ainsi que le vieillissement cutané

o améliore la vue et prévient l’héméralopie

o améliore la capacité de guérison du corps

o stimule la croissance d’os, de cheveux, de dents, d’une peau et de gencives forts

o aide en cas de glande tyroïde fonctionnant trop rapidement.

Le bêta-carotène, précurseur de la vitamine A, est un antioxydant (rend les radicaux libres inoffensifs)
et a en outre des propriétés anti-cancérigènes (à condition que l’on ne fume pas).

Hypovitaminose

Les symptômes en cas d’une carence en vitamine A sont l’héméralopie, des maux de tête persistants,
une résistance diminuée aux infections (surtout des voies respiratoires), des problèmes de peau, des
cheveux secs et cassants et des pierres aux reins. Aucun effet spécifique n’est connu pour une
carence en bêta-carotène.
Une carence en vitamine A se manifeste en premier lieu là où la plupart des cellules sont dégradées
et continuellement remplacées (comme dans la peau). En cas de fabrication insuffisante et de
dysfonctionnement des capillaires, les produits de dégradation servant de nourriture aux bactéries
envahissantes s’amoncellent. Des lésions graves, souvent mortelles apparaissent alors.
L’héméralopie peut survenir suite à un trouble de la rétine.

Chez les animaux, une carence en vitamine A peut entraîner une perte d’appétit, des troubles de la
croissance, une perte de poids et finalement la mort. En outre, des problèmes peuvent également
surgir au niveau de la peau, des yeux, du système nerveux, des voies urinaires et de la reproduction.

219
Hypervitaminose

Un excédent en vitamine A comme le rétinol est toxique, surtout pour les femmes enceintes (danger
pour le fœtus). Les symptômes
ptômes sont entre autres un manque d’appétit, une diminution de l’acuité
visuelle, des maux de tête, des nausées, des vertiges, des douleurs musculaires, des anomalies
oculaires, des pertes de cheveux et/ou des rougeurs et desquamations de la peau.

Le bêta-carotène
carotène n’est pas considéré comme toxique. Il est préférable pour les fumeurs de ne pas
consommer de trop fortes doses de vitamine A ou de bêta-carotène
bêta carotène étant donné que cela augmente
la probabilité de développer un cancer des poumons.

Dosage et sources naturelles

La quantité journalière recommandée en vitamine A est de 0,8 mg (=800 microgrammes). Les


personnes ayant des besoins spécifiques (après une maladie, en cas d’infection ou de diabète) ont
besoin d’une plus grande quantité. La dose journalière maximale sûre est de 3 mg (= 3000
microgrammes).

D’importantes sources de vitamines A sont surtout des produits animaux dont le foie, l’huile de
poisson, l’huile de foie de morue, le lait, le beurre, la margarine, le fromage et le jaune d’œuf.

La quantité
té journalière nécessaire recommandée en bêta-carotène
bêta carotène est de 2 à 6 mg et plus durant la
grossesse. La dose journalière maximale sûre est de 25 mg.

D’importantes sources de bêta--carotène


carotène sont des produits végétaux, dont les légumes verts, les
carottes, les
es patates douces, les fruits jaunes ou orange et les herbes aromatiques vertes.

3.11.3.1.2 Vitamine D

La vitamine D est une vitamine liposoluble. Il existe deux formes de vitamine D, à savoir les vitamines
D3 et D2.

Figure
3.11.3. Formule de la vitamine D3 Figure 3.11.4. Formule de la vitamine D2

220
o Appellation chimique : Vitamine D3 ou cholécalciférol

o Formule moléculaire : C27H44O

o Masse moléculaire : 384,2 g/mol

o Appellation chimique : Vitamine D2 ou ergocalciférol

o Formule moléculaire : C28H44O

o Masse moléculaire : 396,6 g/mol.

La vitamine D2 ne diffère de la vitamine D3 que par une double combinaison avec un groupe méthyle
(indiqué en rouge). La vitamine D3 se forme dans l'organisme à partir de cholestérol sous l’influence
d’ultraviolets. La vitamine D2 se forme également à partir du cholestérol mais emprunte un autre
parcours et est d’ordre végétal. Les vitamines D2 et D3 ont le même fonctionnement biologique. C’est
pourquoi la vitamine D2 est également souvent utilisée comme complément alimentaire.

Fonction

La vitamine D est nécessaire au développement du squelette, surtout pour le métabolisme du


phosphate et du calcium. L’effet de la vitamine D dépend de la présence du complexe acide
pantothénique.

La vitamine D :

o protège contre l’ostéoporose

o peut aider dans le traitement du psoriasis

o renforce le système immunitaire

o peut aider à prévenir du cancer

o est nécessaire pour de bonnes dents et de bons os

o garantit un bon fonctionnement des muscles.

Hypovitaminose

Les symptômes en cas de carence en vitamine D sont le rachitisme (maladie anglaise), ostéomalacie,
des douleurs dans les os, l’hypotonie, des crampes musculaires et l’ostéoporose. La vitamine D
stimule l’assimilation de calcium et la constitution des os. Lorsque la vitamine D vient à manquer, ces
processus ralentissent ce qui résulte en rachitisme (maladie anglaise, une malformation du squelette)
chez les enfants et un ramollissement des os (ostéomalacie) chez les adultes. Chez les enfants, le
rachitisme perturbe le développement des os et ceux-ci sont alors déformés en raison d’une fixation
insuffisante du calcium et du phosphore ; les adultes ne minéralisent pas suffisamment la matrice
osseuse récemment formée ce qui rend les os cassants.

Chez les animaux, une carence en vitamine D peut provoquer le rachitisme, l’ostéomalacie, une perte
d’appétit, des troubles de la croissance et une perte de poids. Cela peut en outre causer une
irritabilité accrue, des problèmes au niveau des os et de la reproduction.

221
Hypervitaminose

Une prise trop importante de vitamine D durant une longue période peut endommager le cœur, les
reins et les vaisseaux sanguins. Cela peut également occasionner des nausées, des vomissements,
des maux de tête, des somnolences, des états dépressifs, la constipation et d’autres symptômes. Les
effets préjudiciables suite à un excédent en vitamine D sont très rares.
Dosage et sources naturelles

La quantité journalière recommandée en vitamine D est de 0,005 mg (= 5 microgrammes). La dose


journalière maximale sûre est de 0,05 mg (= 50 microgrammes). Une alimentation saine fournit en
principe suffisamment de vitamine D pour les personnes au teint clair et qui vont suffisamment à
l’extérieur. Tous les autres groupes ont besoin de vitamines D supplémentaires.

D’importantes sources de vitamines D sont les produits animaux comme poisson (l’huile de), l’huile
de foie de morue, le foie, les œufs et les produits laitiers.

Action biochimique spécifique

La formation de vitamine D3 à partir du cholestérol présent dans la peau se fait sous l’influence
d’ultraviolets. Le cholestérol est transformé en 7-déhydrocholestérol par expulsion de l’hydrogène en
position 7 et 8, cette réaction est catalysée par la réductase 7-déhydrocholestérol. La vitamine D3
(cholécalciférol) est formée à partir de ce 7-déhydrocholestérol sous l’influence d’ultraviolets.

Figure 3.11.5. Création de cholécalciférol

La vitamine D2 se forme également à partir du cholestérol mais emprunte un autre parcours dans les
champignons, levures et plantes. Le cholestérol est transformé en ergostérol végétal, cet ergostérol
est transformé en ergocalciférol sous l’influence d’ultraviolets (vitamine D2).

En soi, la vitamine D est inactive, elle est activée par des processus métaboliques ultérieurs, tout
d’abord l’hydroxylation en position 25 dans le foie et ensuite l’hydroxylation en position 1 dans les
reins. L’hormone qui apparaît maintenant s’appelle 1,25-dihydroxycholécalciférol ou 1,25(OH)2D et
est active dans le métabolisme du calcium et du phosphate et dans la croissance et la différenciation
de différents types de cellules.

222
Figure 3.11.6. Production de 1,25-dihydroxycholécalciférol
1,25

Cette hormone stimule l’absorption intestinale de calcium et phosphate et le transport des ions de
calcium et de phosphate. Elle est essentielle au développement, à la croissance, à la préservation et
à la guérison des os. On rencontre des hormones mais également du 1,25-dihydroxycholécalciférol
dihydroxycholécalciférol
en faibles concentrations dans le sang, ceci expliquant pourquoi nous
nous n'avons besoin que de peu de
vitamine D (5 µg) dans notre alimentation quotidienne.

3.11.3.1.3 Vitamine E

tocophérol est une vitamine liposoluble. Elle est souvent ajoutée aux denrées
La vitamine E ou alpha-tocophérol
alimentaires et aliments pour animaux sous la forme d’acétate d’alpha-tocophérol.
tocophérol.

Figure 3.11.7. Formule de la structure de la vitamine E

o Appellation chimique : Vitamine E ou alpha-tocophérol


alpha

o Formule moléculaire : C29H50O2

o Masse moléculaire : 430,7 g/mol.


g/mol

Fonction

Le tocophérol a un effet préventif sur


sur le vieillissement et les maladies nutritionnelles en raison de ses
propriétés fortement antioxydantes. A partir de 40 ans, la résistance naturelle aux radicaux libres
diminue progressivement et de plus en plus de personnes prennent de la vitamine E en supplément.
s
Elle est également nécessaire à la formation des globules rouges ainsi qu’à la constitution, à la
guérison et au maintien des tissus musculaires et autres tissus. Elle protège également de multiples
acides gras non saturés qui constituent un matériau
mat essentiel pour le corps.

223
La vitamine E :
o est un antioxydant (protection des membranes cellulaires)
o protège contre les neuropathies

o augmente la résistance

o protège contre les maladies cardio-vasculaires

o réduit les symptômes prémenstruels

o traite les problèmes cutanés et la calvitie

o aide à prévenir des fausses couches

o a naturellement un effet d’expulsion de l’humidité

o prévient de l’épaississement des tissus cicatriciels

Hypovitaminose

Des graves symptômes suite à une carence en vitamine E sont très rares chez l’homme et ne se
rencontrent presque que suite à un grave désordre de la prise de nutriments. D'éventuels symptômes
d'une carence en vitamine E sont l’anémie et des dommages au cerveau (encéphalomalacie ou
ramollissement cérébral). Chez les enfants, une carence peut entraîner l’anémie, des œdèmes, des
problèmes du système digestif et des troubles de la croissance.

Chez les animaux, une carence en vitamine E provoque des maladies s'attaquant au système
cardiovasculaire, au système reproducteur et au système nerveux central, de même qu'aux tissus
graisseux, au foie, aux reins et aux globules rouges.

Hypervitaminose

La vitamine E s’accumule dans le foie et le pancréas mais jusqu’à présent, on ne lui connait aucun
effet toxique.

Dosage et sources naturelles

La dose journalière recommandée en vitamine E est de 10 mg. Les dosages quotidiens en cas de
troubles de la santé sont de 250 à 280 mg mais dans certains cas, un dosage plus fort peut être
recommandé. La dose journalière maximale sûre est de 350 mg.

D’importantes sources en vitamine E sont les huiles végétales, les graines de soja, les brocolis,
épinards, noix, produits à base de farine complète, le poisson, la viande, les œufs et les produits
laitiers.

3.11.3.1.4 Vitamine K

Il existe trois formes de vitamine K, à savoir K1, K2 et K3. Toutes les formes ont la même structure de
base. Les vitamines K1 et K2 sont des vitamines liposolubles naturelles, la forme K3 synthétique est
liposolubles et dans une mesure limitée aussi hydrosolubles.

224
Figure 3.11.8. Formule de la structure de la vitamine K1

o Appellation chimique : Vitamine K1 ou phylloquinone

o Formule moléculaire : C31H46O2

o Masse moléculaire : 450,7 g/mol.


g/mol

Figure 3.11.9. Formule de la vitamine K2 Figure 3.11.10.


10. Formule de la vitamine K3

o Appellation chimique : Vitamine K2 ou ménaquinone

o Appellation chimique : Vitamine K3 ou ménadione.


ménadione

Fonction

La vitamine K est indispensable à la formation des différents composants de coagulation et donc


également à la coagulation lors de blessures.

Jusqu’à environ 3 mois après la naissance d’un bébé, il est nécessaire d’ajouter cette vitamine à
l’alimentation car il n’y a alors pas encore de bactéries intestinales en suffisance dans l’intestin. De
nos jours, la vitamine K est incorporée à l’alimentation des bébés ou bien on fait une injection de
vitamine K aux nouveau-nés nés afin d’éviter toute hémorragie cérébrale.
cérébra

Hypovitaminose

Une carence en vitamine K ralentit la coagulation du sang et peut entraîner des hémorragies. Une
carence en vitamine K est rare et se rencontre principalement chez les nouveau-nés,
nouveau les personnes
avec un grave trouble de l’assimilation et les patients ayant pris des antibiotiques pendant un long
laps de temps. Les antibiotiques peuvent notamment détruire les bactéries intestinales qui produisent
la vitamine K. Les nouveau-nés
nés ont toujours une carence en vitamine K car cette vitamine ne passe
pas au travers du placenta.

Chez les animaux, une carence en vitamine K résulte également en hémorragies et ralentit la
coagulation du sang.

225
Hypervitaminose

Aucun effet nocif n’est connu. Dans la pratique, un excédent en vitamine K ne se rencontre pas.

Dosage et sources naturelles

La dose journalière recommandée en vitamine K est de 0,08 mg (= 80 microgrammes). La dose


maximale sûre est de 50 x DJR, donc 4 mg (= 4000 microgrammes).

La vitamine K1 est naturellement présente dans les aliments végétaux (légumes verts). Dans les
intestins, elle est produite par des bactéries intestinales, comme la vitamine K2. La vitamine K
synthétique est appelée vitamine K3, notre corps la transforme en vitamine K active.

D’importantes sources de vitamine K naturelle sont entre autres : le chou-fleur, le brocoli, le chou
frisé, les épinards, les pois, les produits à base de farine complète, l’huile de colza, le lait, les produits
laitiers, les œufs et les viandes maigres.

Action biochimique spécifique

La vitamine K est indispensable à la formation de thrombine ou thrombinogène et à d’autres


composants de la coagulation dans le foie. Lorsque la vitamine K fait défaut ou qu’un inhibiteur
compétitif est présent comme la warfarine (raticide), la thrombine se forme alors de manière
anormale, ne fonctionnant qu’à 1% voire 2% de l’activité normale. La vitamine K fonctionne comme
un cofacteur dans les processus post-translationnels pour la formation de thrombine en transformant
l’acide glutamique (glu) en gamma-carboxyglutamate (gla). La vitamine K est toujours réutilisée
durant cette voie de réaction. Cela explique pourquoi nous n’avons besoin que de faibles quantités de
cette vitamine (80 microgrammes) dans notre alimentation quotidienne.

3.11.3.2 Vitamines hydrosolubles

Les vitamines hydrosolubles sont : les vitamines B1, B2, B3, B5, B6, B11 et B12, C et la vitamine H.
Ces vitamines sont présentes dans l’humidité contenue dans nos denrées alimentaires. Le corps ne
sait pas bien emmagasiner ces vitamines hydrosolubles (à l’exception de la vitamine B12), tout
excédent est évacué par l’urine ou la transpiration. Ces vitamines du complexe B se chargent
ensemble du métabolisme dans le corps et sont toutes des précurseurs de coenzymes. En présence
d’une carence en une vitamine B déterminée, s’en suit généralement une carence en d’autres
vitamines B. La prise d’une vitamine B déterminée entraîne de surcroît une augmentation des besoins
en autres vitamines B.

3.11.3.2.1 Vitamine B1 (Thiamine)

La vitamine B1 est une vitamine soluble dans l’eau et fait partie du complexe de la vitamine B. Il s’agit
d’une vitamine soufrée et elle est également appelée thiamine. Elle est surtout ajoutée aux denrées
alimentaires et aux aliments pour animaux comme la thiamine hydrochloride.

226
Figure 3.11.11. Formule de la structure de la vitamine B1

o Appellation chimique : Vitamine B1 ou thiamine

o Formule moléculaire : C12H17N4OS

o Masse moléculaire : 265,3 g/mol .

Fonction

La vitamine B1 est indispensable à l’approvisionnement énergétique du corps car elle règle


règ surtout la
dégradation des hydrates de carbone dégageant de l’énergie. La vitamine B1 est également
nécessaire au bon fonctionnement du cœur et du système nerveux et joue un rôle dans le
métabolisme des acides aminés.

La vitamine B1 :

o protège des conséquences de la consommation d’alcool

o peut aider dans le traitement des troubles neurologiques

o peut aider dans le traitement de l’anémie

o peut améliorer la flexibilité intellectuelle

o peut contribuer à réguler le diabète s'il a un lien avec une carence en vitamine B1

o contribue au traitement des infections à herpès

o contribue à transformer les hydrates de carbone en énergie dans les muscles.


muscles

Hypovitaminose

Les symptômes en cas de carence en vitamine B1 sont la fatigue, l’hypotonie, la perte d’appétit,
l’irritabilité,
rritabilité, un état dépressif, une mauvaise mémoire, une sensation de picotements dans les orteils
et la plante du pied, des troubles de la digestion et des nausées. Lorsque la vitamine B1 fait défaut et
en présence d’un excès en hydrates de carbone (sucres),
(sucres), apparaît alors le béribéri. Une carence
relative se rencontre très souvent.

Chez les animaux, une carence en vitamine B1 cause perte d’appétit, diminution de la croissance,
affaiblissement, réduit la température corporelle et provoque d’innombrables problèmes cutanés,
nerveux, cardio-vasculaires,
vasculaires, du système digestif et reproducteur.

227
Hypervitaminose

La thiamine n’est pas toxique mais il est recommandé de ne pas en prendre plus de 400 mg par jour.

Dosage et sources naturelles

La dose journalière recommandée pour cette vitamine est de 1,1-1,4 mg. La dose journalière
maximale sûre est de 400 mg. La consommation d’alcool, drogue, café, nicotine et sucre requiert des
quantités supérieures de B1, jusqu’à 100-300 mg par jour.

Les denrées alimentaires riches en vitamine B1 sont les levures, la viande (de porc), les pois, les
haricots, les pommes de terre, le pain, les produits céréaliers, le lait et les produits laitiers ainsi que
les arachides.

Action biochimique spécifique

La vitamine B1 se rencontre dans le corps comme une coenzyme appelée thiamine diphosphate ou
thiamine pyrophosphate. Cette coenzyme est une molécule de thiamine à laquelle ont été ajoutés
deux groupes de phosphate au lieu d’hydrogène. Cette coenzyme joue un rôle important dans le
cycle de l’acide citrique, de cette manière, elle règle surtout la dégradation des hydrates de carbone
permettant le dégagement d'énergie.

Figure 3.11.12. Formation de la thiamine diphosphate

3.11.3.2.2 Vitamine B2 (Riboflavine)

Tout comme la vitamine B1, la vitamine B2 est une vitamine soluble dans l’eau, également appelée
riboflavine. Elle appartient en outre au complexe de la vitamine B. Étant donné que la riboflavine se
dissout difficilement dans l’eau, on utilise souvent la riboflavine 5-phosphate sodique dans les
denrées alimentaires et les aliments pour animaux.

228
Figure 3.11.13. Formule de la structure de la vitamine B2

o Appellation chimique : Vitamine B2 ou riboflavine

o Formule moléculaire : C17H20O6N4

o Masse moléculaire : 376,4 g/mol.

Fonction

La vitamine B2 est indispensable à l’approvisionnement énergétique du corps, principalement pour la


libération d’énergie à partir des hydrates de carbone, des protéines et des graisses apportés au corps
par le biais de l’alimentation. Il s’agit donc d’une vitamine importante pour le métabolisme et elle joue
un rôle dans le maintien du système nerveux. Elle est en outre importante pour une peau saine et des
cheveux en bonne santé.

La vitamine B2 :

o contribue au métabolisme des graisses, protéines et hydrates


hydrates de carbone

o stimule l’acuité visuelle

o favorise le bon fonctionnement du mécanisme de procréation

o stimule les prestations athlétiques

o offre une protection contre l’anémie.


l’anémie

Hypovitaminose

Les symptômes en cas de carence en vitamine B2 sont des gerçures de de la peau et des muqueuses,
rougeur de la langue, eczéma sur la peau et les parties génitales, sensation de brûlure sur la peau,
fatigue, parfois difficultés lors de l’hématopoïèse. En cas de carence en vitamine B2, apparaît
également une détérioration partielle
partielle de la respiration tissulaire et suite à cela, une stagnation de la
croissance, des malformations de l’abdomen, des malformations aux lèvres, une croissance tordue
des ongles des doigts et des maladies de l’estomac.

Chez les animaux, une carence en vitamine B2 cause des troubles de la croissance, une perte
d’appétit, une faible température corporelle, des problèmes de peau, aux yeux, au niveau du système
nerveux, du système digestif et du système reproducteur.

229
Hypervitaminose

La riboflavine n’est toxique


oxique qu’à très forte dose. Des symptômes que l’on rencontre rarement sont des
démangeaisons et une sensation de brûlure sur la peau.

Dosage et sources naturelles

La dose journalière recommandée pour la riboflavine est de 1,1-1,6


1,1 1,6 mg. Une plus forte dose est
nécessaire en cas de stress, de grossesse, d’allaitement au sein, de prise de la pilule et de forte
consommation d’alcool. La dose journalière maximale sûre est de 400 mg.

Le foie, les reins, les œufs, le fromage, la levure, le lait, les germes, le brocoli, les champignons, le
poisson, les fruits, le pain, les produits à base de farine complète et les viandes sont riches en
vitamines B2.

Action biochimique spécifique

Les vitamines B2 sont actives lors de la dégradation des hydrates de carbone, des protéines et des
graisses. Dans le corps, on rencontre la riboflavine dans les coenzymes flavine adénine dinucléotide
(FAD) et flavine mononucléotide (FMN). La FAD est active en tant que potentiel redox, cela signifie
pour ainsi dire que de l’énergie peut y être stockée. Elle est entre autres active dans le cycle de
l’acide citrique.

3.11.3.2.3 Vitamine B3 (Niacine)

La vitamine B3 est soluble dans l’eau, elle fait partie du complexe de vitamine B et existe sous deux
formes, à savoir l'acide nicotinique et la nicotinamide.
nicotinamide. La vitamine B3 est également appelée niacine
ou vitamine PP (Pellagra Preventing factor).

Figure 3.11.14. Formule de la structure de la vitamine B3 (acide nicotinique)

o Appellation chimique : Vitamine B3, acide nicotinique ou niacine

o Formule moléculaire : C6H5NO2

o Masse moléculaire : 123,1 g/mol.


g/mol

230
Figure 3.11.15. Formule de la structure de la vitamine B3 (Nicotinamide)

o Nom chimique : Vitamine B3, acide nicotinique ou niacine

o Formule moléculaire : C6H6N2O

o Masse moléculaire : 122,1 g/mol.

Fonction

La vitamine B3 contribue à l’approvisionnement en énergie des cellules par la dégradation des acides
gras, des hydrates de carbone et des acides aminés et stimule le fonctionnement du système
nerveux. La nicotinamide est le groupe actif de nicotinamide adénine dinucléotide (NAD) et
nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADP). L’acide nicotinique est transformé dans le
corps en nicotinamide. NAD et NADP jouent un rôle important dans divers processus de dégradation
et dans la libération d’énergie et de matériaux essentiels.

La vitamine B3 :

o prévient et traite la schizophrénie

o favorise la respiration cellulaire

o puise l’énergie du sucre, de la graisse et des protéines

o garde la peau propre, les nerfs et la langue sains et favorise une bonne digestion

o peut diminuer le niveau de cholestérol et ainsi offrir une protection contre les affections
cardiaques

o est considérée comme un antioxydant

o peut prévenir les migraines

o diminue la pression artérielle.

Hypovitaminose

Une carence est rare mais d’éventuels symptômes en cas de carence en vitamine B3 sont la
dermatite, rougeur de la langue, insomnie, diarrhée, démence et pellagre (était très fréquent en
Amérique du Sud il y a soixante ans).

Chez les animaux, une carence en vitamine B3 diminue la croissance et l’appétit, provoque des
dermatites, des problèmes au niveau du système nerveux et du système digestif, aux os et cause
l’anémie.

231
Hypervitaminose

Des symptômes en cas de fortes doses sont entre autres des problèmes de peau et de membranes,
membrane
des états dépressifs, un dysfonctionnement du foie et des maux de tête.

Dosage et sources naturelles

La dose journalière recommandée pour cette vitamine est fixée à 15 voire 18 mg. Des dosages de 20
à 100 mg par jour peuvent avoirir un effet favorable. La dose maximale sûre pour cette vitamine est
différente pour les deux formes. Pour l’acide nicotinique, elle est de 120 mg et pour la nicotinamide,
elle est de 300 mg par jour.

D’importantes sources de vitamine B3 sont entre autres les produits à base de farine complète et les
produits céréaliers, le riz complet, le lait, le fromage, les viandes, le poisson et les noix de cajou.

Action biochimique spécifique

Dans le corps, on rencontre la niacine dans une coenzyme appelée nicotinéamine nicotiné adénine
dinucléotide (NAD). Cette coenzyme est active en tant que potentiel redox, cela signifie que l’on peut
pour ainsi dire y stocker de l’énergie et l’y puiser. Étant donné que la NAD est toujours recyclée par
« chargement » (dans le catabolisme)
catabolisme) et à nouveau utilisée (lors de l’anabolisme), seules de faibles
quantités de cette vitamine sont nécessaires dans notre alimentation quotidienne. La coenzyme est
entre autres active dans le cycle de l’acide citrique et dans la glycolyse.

3.11.3.2.4 Vitamine B5 (Acide


cide pantothénique)

Comme toutes le vitamines du complexe de vitamine B, la vitamine B5 est soluble dans l’eau et est
également appelée acide pantothénique. Au niveau commercial, elle est souvent ajoutée comme
pantothénate de calcium.

Figure 3.11.16. Formule de la structure de la vitamine B5

o Appellation chimique : Vitamine B5 ou acide pantothénique

o Formule moléculaire : C9H16O5N

o Masse moléculaire : 218,2 g/mol.


g/mol

Fonction

La vitamine B5 est indispensable à l’approvisionnement énergétique du corps, surtout du fait du


dégagement d’énergie à partir d’acides gras. Cette vitamine joue également un rôle important lors de
la dégradation des protéines et hydrates de carbone. Dans le corps, l’acide pantothénique fait partie

232
de la coenzyme A (CoA). Cette coenzyme décompose les protéines de notre alimentation en acides
aminés. Par la suite, elle recompose des protéines humaines à partir de ces éléments. La coenzyme
A est également active dans la transformation d’hydrates de carbone en énergie corporelle, entre
autres au début du cycle de l’acide citrique. Elle est également importante lors de la formation et de la
régulation d’un certain nombre d’hormones.

La vitamine B5 :

o favorise la guérison de blessures

o aide le corps lors de la production d’énergie

o réduit le stress

o régule la résistance

o prévient la fatigue

o réduit le cholestérol et offre ainsi une protection contre les affections cardiaques

o aide à prévenir et traiter l’arthrite

o peut éviter la calvitie et la blancheur des cheveux

o est essentielle à la production de certaines hormones.

Hypovitaminose

Une carence se rencontre rarement mais des symptômes éventuels en cas de carence en vitamine
B5 sont des vomissements, convulsions, de la fatigue, des insomnies, une diminution de la résistance
aux infections et des maux de ventre.

Une carence en vitamine B5 est plus fréquente chez les animaux et peut causer une diminution de la
croissance et de l'appétit, une perte de poils, l'irritabilité, des mouvements perturbés, l'anémie, des
problèmes au niveau du système digestif et du système reproducteur.

Hypervitaminose

On ne connait aucun effet nocif à la vitamine B5. Certaines personnes ont des maux d’estomac en
cas de prise de doses supérieures à 10g.

Dosage et sources naturelles

La dose journalière recommandée (DJR) pour cette vitamine est de 6 mg. Pour une application
médicale, il est préférable de prendre la vitamine dans une préparation de complexe de vitamine B à
raison de maximum 300 mg par jour. Un dosage normal devant contribuer à prévenir les maladies est
d'environ 100 mg par jour. La dose journalière maximale sûre est fixée à 1000 mg.

On rencontre entre autres la vitamine B5 dans les substances alimentaires suivantes : levure,
produits à base de farine complète, mélasse, brocoli, épinard, poivron vert, champignons, viandes,
foie, riz complet, œufs et noix.

233
3.11.3.2.5 Vitamine B6 (Pyridoxine)

Comme toutes les vitamines du complexe de vitamine B, la vitamine B6 est soluble dans l’eau et est
également appelée pyridoxine. Au niveau commercial, on la retrouve presque exclusivement sous
forme d’hydrochloride de pyridoxine.

Figure 3.11.17. Formule de la structure de la vitamine B6

o Nom chimique : Vitamine B6 ou pyridoxine

o Formule moléculaire : C8H11NO3

o Masse moléculaire : 169,18 g/mol.


g/mol

Fonction

La vitamine B6 joue un rôle important dans le métabolisme et la résistance de l’organisme. Elle régule
le fonctionnement de certaines hormones dans le corps. C'est une substance indispensable au
niveau de la défense immunitaire et de la croissance. Avec la vitamine B11 (acide folique) et la
vitamine B12, la pyridoxine assure l’assimilation de fer par le corps, elle est également impliquée
dans la formation de globules rouges. Ces trois vitamines garantissent également le bon
fonctionnement du système nerveux et sont impliquées dans le métabolisme de l’acide aminé.

Dans le corps, cette vitamine est transformée en coenzyme PLP (pyridoxal-


(pyridoxal-5-phosphate). Cette
coenzyme est importante pour plus de 100 enzymes et joue un rôle dans presque toutes les réactions
biochimiques (métabolisme du glycogène, acide gras et acide aminé).

La vitamine B6 :

o augmente la résistance

o aide à réguler le diabète

o garantit la prise de protéines et graisses

o soulage les nausées

o contribue à prévenir les troubles cutanés et nerveux

o traite les symptômes


mes prémenstruels (PMS) et la ménopause

o réduit les tensions musculaires

o agit comme moyen diurétique naturel

o aide à protéger contre le cancer.


cancer

234
Hypovitaminose

Les symptômes en cas de carence en vitamine B6 sont l’anémie, la névrose et les problèmes de
peau.

Chez les animaux, une carence en vitamine B6 provoque une diminution de l’appétit, un
ralentissement de la croissance, des problèmes cutanés, une vue troublée, l’anémie, la névrose, une
diminution de la reproduction et l’ascite.

Hypervitaminose

Une consommation
nsommation prolongée de doses élevées peut entraîner de graves anomalies au niveau du
système nerveux. Une photosensibilité ou une détérioration des processus cognitifs de mémorisation
et raisonnement peuvent en outre apparaître.

Dosage et sources naturelles

La dose journalière recommandée pour cette vitamine est de 1,6 à 2 mg. Ne pas utiliser cette
vitamine en forte concentration (25-50
(25 50 mg) de manière prolongée. La dose journalière maximale sûre
est de 200 mg.
Des substances alimentaires riches en vitamine B6 sont les poireaux, le chou blanc, le brocoli, les
pommes de terre, les bananes, les produits à base de farine complète, le lait, les œufs, les
légumineuses, les noix, le poisson et la viande.

3.11.3.2.6 Vitamine B11 (Acide folique)

Comme toutes le vitamines


mines du complexe de vitamine B, la vitamine B11 est soluble dans l’eau et est
également appelée acide folique.

Figure 3.11.18. Formule de la structure de la vitamine B11

o Appellation chimique : Vitamine B11, B9 ou acide folique

o Formule moléculaire : C19H19N7O6

o Masse moléculaire : 441,4 g/mol.


g/mol

235
Fonction

L’acide folique stimule la formation de suc gastrique et est important pour un bon fonctionnement du
foie. Cette vitamine est impliquée dans le métabolisme des protéines et graisses, elle est nécessaire
à la formation des globules rouges et contribue au métabolisme cérébral. L'acide folique est
également nécessaire au métabolisme de l'ADN et de l'ARN. Cette vitamine est indispensable lors
des processus de division cellulaire du corps, c’est pourquoi il est recommandé aux femmes
enceintes ou souhaitant l’être de consommer un supplément d’acide folique. Dans le corps, l’acide
folique peut se transformer en une coenzyme appelée tétrahydrofolate (THF). Durant le métabolisme,
l’acide folique agit en étroite collaboration avec la vitamine B12 (et B6).

La vitamine B11 :

o améliore la lactation

o peut aider à protéger contre le cancer

o améliore la peau

o est un antidouleur naturel

o améliore l’appétit

o procure aux bébés et aux enfants une certaine résistance contre les infections

o est nécessaire lors de la production d’ADN et d’ARN (les molécules de l’hérédité)

o contribue à prévenir du Spina bifida.

Hypovitaminose

Les symptômes en cas de carence en vitamine B11 sont une sensation de faiblesse, apathie, fatigue,
perte d’appétit, somnolence, irritabilité, démence et Spina bifida (fœtus).

Chez les animaux, une carence en vitamine B11 résulte en un ralentissement de la croissance, une
perte d’appétit, la dermatite, une dépigmentation, la perte de poils, une paralysie, l’anémie, la
diarrhée et des problèmes de fécondité.

Hypervitaminose

Aucun effet indésirable n’est connu pour l’absorption à partir de l’alimentation. La forme synthétique
est toxique en grandes quantités et peut provoquer de graves problèmes neurologiques ainsi que la
somnolence et peut entraver l’assimilation de zinc dans le corps.

Dosage et sources naturelles

La dose journalière recommandée pour cette vitamine est de 0,2 à 0,36 mg. Les grands buveurs, les
femmes enceintes, les personnes âgées et les personnes qui suivent un régime pauvre en graisses
risquent une carence. La dose journalière maximale sûre d’acide folique est de 1 mg.

236
D’importantes sources de vitamine B11 sont entre autres les légumes verts, les choux de Bruxelles, le
brocoli, les œufs,, les lentilles, le riz, le pain, les germes de blé, le foie, les rognons, les bananes, les
oranges et les pêches.

3.11.3.2.7 Vitamine B12 (Cobalamine)

La vitamine B12 est la seule vitamine soluble dans l’eau qui est stockée dans le corps. La vitamine
B12 fait partie du complexe de vitamine B et est également appelée cobalamine. La cyanocobalamine
est la forme synthétique stable ajoutée aux denrées alimentaires et aliments pour animaux.

Figure 3.11.19. Formule de la structure de la vitamine B12

o Appellation chimique : Vitamine B12 ou cobalamine

o Formule moléculaire : C63H88CoN14O14P

o Masse moléculaire : 1355,4 g/mol.


g/mol

Fonction

Avec la vitamine B6 (pyridoxine) et la vitamine B11 (acide folique), la cobalamine assure l’assimilation
de fer par le corps, elle est également
galement impliquée dans la formation de globules rouges. Une carence
de ces vitamines peut entraîner l’anémie. Ces trois vitamines garantissent également le bon
fonctionnement du système nerveux et sont impliquées dans le métabolisme de l’acide aminé.

237
La vitamine B12 :

o est nécessaire au maintien du système nerveux

o améliore la mémoire et la concentration

o est nécessaire pour pouvoir utiliser les graisses, hydrates de carbone et protéines

o donne plus d’énergie

o favorise une croissance saine chez les enfants

o peut offrir une protection contre le cancer

o protège contre les allergènes et éléments toxiques

o Hypovitaminose

o Les symptômes en cas de carence en vitamine B12 sont l’anémie pernicieuse, des troubles
menstruels, déclin mental et tremblements.

o Chez les animaux, une carence en vitamine B12 peut entraîner une diminution de croissance,
une réduction de la consommation alimentaire, la dermatite, l’irritabilité, des mouvements
désordonnés, l’anémie, une perte d’appétit, la diarrhée, une diminution de la reproduction,
etc.

Hypervitaminose

La vitamine B12 n’est pas considérée comme toxique.

Dosage et sources naturelles

La quantité journalière recommandée en vitamine B12 est de 0,001 mg (= 1 microgramme). Des


dosages de 5-50 microgrammes sont généralement suffisants. La dose journalière maximale sûre est
de 200 mg.

Les substances alimentaires riches en vitamine B12 sont exclusivement des produits animaux : œufs,
fromage, fromage blanc, lait, poisson et viande.

Action biochimique spécifique

La vitamine B12 peut se transformer dans le corps en coenzyme B12 qui est essentielle pour 2
enzymes. Tout d’abord, pour une enzyme impliquée dans le métabolisme des acides gras,
notamment la méthylmalonyl-CoA mutase. Cette enzyme contribue à la dégradation des acides gras
avec un nombre impair d’atomes de carbone. Deuxièmement, la coenzyme B12 est nécessaire lors
de la biosynthèse de l’acide aminé méthionine et aussi pour l’enzyme homocystéine
méthyltransférase. Cette enzyme ajoute un groupe méthyle à l’homocystéine, ce qui produit la
méthionine.

238
3.11.3.2.8 Vitamine C (Acide L-ascorbique)

La vitamine C est une vitamine soluble dans l’eau également appelée acide ascorbique.

Figure 3.11.20. Formule de la vitamine C Figure 3.11.21. Formule de


l’acide déhydroascorbique

o Appellation chimique : Vitamine C ou acide L-ascorbique

o Formule moléculaire : C6H8O6

o Masse moléculaire : 176,1 g/mol.

Fonction

La vitamine C est l’une des vitamines les plus importantes pour le système immunitaire, elle favorise
l’activité des globules blancs et garantit une meilleure résistance aux infections et maladies. C’est en
outre un puissant antioxydant (rend les radicaux libres inoffensifs). La vitamine C est axée sur la
régénération et garantit l’évacuation des produits de dégradation. La vitamine C est rapidement
attaquée par l’oxygène (en cas de chaleur) et est l’une des vitamines les plus sensibles. Une carence
en vitamine C est partiellement la cause de la fatigue de printemps.

La vitamine C :

o est un antioxydant

o accélère la guérison de blessures

o maintient les os, dents et vaisseaux sanguins en bonne santé

o agit comme un antihistaminique naturel

o contribue à l’assimilation du fer

o peut aider à lutter contre la stérilité chez l’homme

o réduit la durée des refroidissements et autres virus.

239
Hypovitaminose

Les symptômes en cas d’une carence en vitamine C sont le scorbut, une sensation de faiblesse, une
perturbation de la guérison des blessures, l’irritabilité, le saignement des gencives, des ecchymoses
et des bleus, le déchaussement des dents, des douleurs articulaires, manque d’appétit et troubles
cardiaques.

La plupart des animaux produisent eux-mêmes


eux mêmes la vitamine C. Une carence est très rare et provoque
parfois le scorbut chez les jeunes animaux et les animaux stressés.

Hypervitaminose

Un excès en vitamine C peut causer des pierres aux reins et la goutte. En En cas de fortes doses,
certaines personnes souffrent de diarrhée et de crampes à l’estomac, bien que cette vitamine ne soit
pas estimée nocive, même à très fortes doses. De très fortes doses de vitamine C font augmenter la
teneur en cholestérol dans le sang,
sang, ce qui accroît la probabilité de maladies cardiaques.

Dosage et sources naturelles

La dose journalière recommandée en vitamine C est de 70 mg. Les fumeurs ont besoin de plus de
vitamine C, il en va de même en cas de stress, de l'usage d'antibiotiques, d'infections, de forte
consommation d'alcool ou de blessure. La dose journalière maximale sûre est fixée à 1000 mg.

L’acide L-ascorbique
ascorbique se rencontre beaucoup dans les agrumes, les légumes verts, les tomates, les
asperges, les aubergines, les poireaux, les radis, les pommes de terre, le lait et le foie.

3.11.3.2.9 Vitamine H (Biotine)

Bien que la biotine soit appelée vitamine H, cette substance appartient à la famille B et est également
appelée vitamine B8. La biotine est une vitamine soluble dans l’eau et fait partie du complexe de
vitamine B.

Figure 3.11.22. Formule de la structure de la vitamine H

o Appellation chimique : Vitamine H, B8 ou d-Biotine


d

o Formule moléculaire : C10H16N2O3S

o Masse moléculaire : 244,3 g/mol.


g/mol

240
Fonction

La biotine joue un rôle important dans la synthèse et la dégradation des hydrates de carbone et des
protéines. Dans le corps, elle peut se transformer en biocytine, une coenzyme. La biocytine contribue
à dégager de l’énergie à partir de l’alimentation ainsi qu’à la formation d’anticorps. Elle est en outre
importante pour la formation d’acides gras et est responsable d’une bonne condition de la peau et des
cheveux.

La vitamine H :

o empêche les cheveux de grisonner

o soulage diverses formes de douleurs musculaires

o aide à lutter contre l’eczéma, la dermatite et les autres problèmes de peau

o aide à lutter contre la calvitie.

Hypovitaminose

Une carence est rare, toutefois les symptômes en cas de carence en vitamine H sont les suivants :
eczéma, fatigue, inflammation de la langue, douleur musculaire, anémie, dépression et altération du
métabolisme des graisses.

Une carence en vitamine H se rencontre parfois chez les bébés sous forme de dermatite (peau irritée,
squameuse). Dans les intestins des adultes, la biotine est généralement produite en quantités
suffisantes par les bactéries intestinales.

Chez les animaux, une carence en vitamine H entraîne une diminution de la croissance et de l’appétit,
provoque dermatite, dépigmentation et assombrissement de la peau, perte de poils, paralysie et
diminution de la reproduction.

Hypervitaminose

On ne lui connait aucun effet nocif.

Dosage et sources naturelles

La dose journalière recommandée est fixée à 0,03-0,15 mg (= 30-150 microgrammes). La dose


journalière maximale sûre est de 300 mg.

D’importantes sources de biotine sont entre autres les œufs, le lait, les fruits, les noix, le soja, la
levure de bière, le riz sauvage, la viande et le poisson.

241
3.11.4 Techniques d’analyse des vitamines

Les matrices qui sont essentiellement analysées quant à la section vitamines sont les aliments pour
animaux (aliments pour animaux complets, aliments complémentaires pour animaux et prémélanges),
les compléments alimentaires, l’alimentation pour bébés et les boissons. En général, une procédure
d’analyse se compose des étapes suivantes : extraction, purification (si nécessaire) et quantification
via HPLC ou turbidimétrie.

La méthode choisie pour l’extraction dépend du résultat exigé, de la matrice, de la forme naturelle ou
synthétique des vitamines, des composés interférents, de la résistance à la chaleur et aux valeurs pH
extrêmes.

3.11.4.1 Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)

Les vitamines liposolubles A, D et E sont déterminées à l’aide d’une phase inverse HPLC après
l’extraction par hydrolyse alcaline (saponification) et purification sur une colonne. Les vitamines A, E,
D, C et K3 sont déterminées quantitativement à l’aide d’une HPLC et d’un détecteur UV. Les vitamines
B1, B2 et B6 sont en outre déterminées quantitativement à l’aide d’une HPLC et d’un détecteur de
fluorescence.

3.11.4.2 Microbiologie (Turbidimétrie)

Les vitamines B3, B5, B11, B12 et H sont actuellement quantifiées à l’aide de méthodes
turbidimétriques. On utilise à cet effet une souche spécifique d’un organisme test dont la croissance
est définie par la présence d’une vitamine déterminée. Une série étalon (avec des concentrations
connues en vitamine) et une série de l’extrait d’échantillon sont inoculées avec l’organisme spécifique
et incubées jusqu’à ce que l’organisme ait crû suffisamment et que le milieu devienne trouble.
En mesurant la turbidité à l’aide d’un spectrophotomètre et en comparant la courbe de l’échantillon
avec la courbe étalon, on obtient un résultat quantitatif. Cette méthode est suffisamment sensible pour
observer les teneurs en vitamines B que l’on rencontre naturellement et elle mesure généralement
l’activité vitaminique totale, contrairement à certaines méthodes HPLC.

3.11.4.3 Nouvelles évolutions

A l’avenir, les méthodes seront adaptées aux différentes matrices et si nécessaire, une méthode
spécifique sera développée pour certaines matrices. A terme, les méthodes biologiques seront autant
que possible remplacées par des méthodes HPLC ou par une méthode microbiologique plus rapide
sous forme de kits commerciaux disponibles (avec plaques de microtitration). Des méthodes distinctes
pour l’analyse d’1 vitamine du complexe B seront combinées en méthodes permettant d’analyser
simultanément plusieurs vitamines B.

242
Tableau 3.11.1 : Tableau récapitulatif ‘Vitamines essentielles pour l’homme’

Substance Synonymes Propriétés Hypovitaminose Hypervitaminose Se retrouve dans DJR


Améliore la vue et la résistance, prévient Lait, beurre, fromage,
l’héméralopie et le vieillissement cutané, rôle Les femmes margarine, œufs, foie, huile
Héméralopie, problèmes
Vitamine A all-trans retinol dans le processus de renouvellement cellulaire, enceintes doivent de foie de morue, poisson, 0,8 mg
de peau et de cheveux
pour une peau, des dents, des gencives et des faire attention pommes, légumes verts,
cheveux sains carottes, maïs, abricots
Variétés de choux, légumes
Provitamine Antioxydant, mêmes propriétés que la vitamine
Bêta-carotène Idem vitamine A vert foncé, carottes, oranges 2-6 mg
A A
et fruits et légumes jaunes
Nausées,
vomissements,
Vitamine Stimule la résorption et la fixation du calcium, Rachitisme, douleur dans (huile de) poisson, huile de
maux de tête,
D3 Cholécalciférol surtout dans les os et la dentition. Protège les os, hypotonie et foie de morue, levure,
dépression, 0,005 mg
Vitamine Ergocalciférol contre l’ostéoporose, renforce le système crampes musculaires, légumes verts, viande et
maladies
D2 immunitaire, les dents et les os ostéoporose produits laitiers
cardiaques et
rénales
Antioxydant, protège les membranes
Huiles végétales, soja,
cellulaires, protège contre les neuropathies et
Alpha- Rarement: anémie, haricots, noix, produits à base
Vitamine E les maladies cardio-vasculaires, réduit les / 10 mg
tocophérol œdème de farine complète, œufs et
symptômes prémenstruels, pour une peau
margarine, légumes verts
saine et des cheveux sains
(K1) Tomates, froment, œufs,
foie, poisson, chou-fleur,
Vitamine K1 Phylloquinone Empêche les hémorragies, essentiel pour la
brocoli, chou frisé, épinards,
Vitamine K2 Ménaquinone production de thrombine et la constitution des Problèmes de coagulation / 0,045 mg
pois, produits à base de
Vitamine K3 Ménadione os, ajouté à la nourriture pour bébés
farine complète, huile de
colza et viande maigre
Coenzyme impliquée dans le métabolisme Fatigue, hypotonie, pas Viande, pain, levure, pois,
1,1-1,4
Vitamine B1 Thiamine cellulaire, traitement de l’anémie, régulation du d’appétit, irritabilité, état / haricots, pommes de terre et
mg
diabète, dégradation des hydrates de carbone dépressif, mauvaise produits laitiers

243
Substance Synonymes Propriétés Hypovitaminose Hypervitaminose Se retrouve dans DJR
et des acides gras pour l’énergie, essentielle au mémoire, nausées,
fonctionnement des cellules nerveuses et du béribéri
cœur
Coenzyme impliquée dans le métabolisme Uniquement à très
cellulaire (dégradation des hydrates de Gerçure de la peau et forte dose : Rognons, jaune d’œuf,
1,1-1,6
Vitamine B2 Riboflavine carbone, des protéines et des graisses), pour muqueuses, langue rouge, démangeaisons et fromage, levure, lait, germes,
mg
une peau saine et des cheveux sains, eczéma, fatigue sensation de pain, légumes verts et viande
protection contre l’anémie brûlure
Partie de la coenzyme A impliquée dans le
En cas de forte
cycle de l’acide citrique, stimule la respiration Céréales complètes, riz brut,
Dermatite, diarrhée, dose : état
cellulaire et le fonctionnement du système lait, fromage, viande, poisson
Vitamine B3 Niacine, PP démence, insomnie, dépressif, 15-18 mg
nerveux, production d’énergie, réduit le et noix de cajou, pain,
pellagre problèmes de peau
cholestérol, antioxydant, diminue la pression légumes, levure
et maux de tête
artérielle, prévient la migraine
Vomissements, crampes, Levure, produits à base de
Partie de la coenzyme A, métabolisme des
fatigue, insomnie, farine complète, sirop,
graisses et sucres, guérison des blessures,
résistance diminuée, légumes verts, champignons,
Acide production d’énergie, réduction du stress, En cas de forte
Vitamine B5 maux de ventre, viande, viande organique, riz 6 mg
pantothénique régulation de la résistance, prévention de la dose : diarrhée
anomalies sauvage, œufs et noix,
fatigue, diminution du cholestérol, contre
cardiovasculaires, légumineuses, produits
l’arthrite, la calvitie et les cheveux gris
anomalies nerveuses laitiers et fruits
Impliquée dans le métabolisme cellulaire
(protéines et hormones), assimilation du fer, Légumes, pommes de terre,
formation des globules rouges, fonctionnement En cas de forte bananes, fromage, soja,
Anémie, névrose,
Vitamine B6 Pyridoxine du système nerveux, métabolisme acide aminé, dose : détérioration produits à base de farine 1,6-2 mg
problèmes de peau
augmente la résistance, régulation du diabète, nerveuse complète, lait, œufs, noix,
assimilation des protéines et graisses, contre poisson et viande
les symptômes prémenstruels et la ménopause
Acide folique Coenzyme impliquée dans le métabolisme, Sensation de faiblesse, En cas de forte Légumes verts, œufs,
Vitamine 0,2-0,36
(Vitamine B9 formation de suc gastrique, fonctionnement du apathie, fatigue, insomnie, dose : insomnie, lentilles, riz, pain, germes de
B11 mg
ou M) foie, assimilation de protéines et de graisses, irritabilité, démence, Spina mauvaise blé, foie, rognons, bananes,

244
Substance Synonymes Propriétés Hypovitaminose Hypervitaminose Se retrouve dans DJR
formation de globules rouges, métabolisme bifida, anémie assimilation du oranges et pêches
cérébral et ADN/ARN et processus de division zinc viande, lait, levure
cellulaire (grossesse)
Coenzyme, assimilation du fer, synthèse de
l’ADN, formation de globules rouges,
Uniquement les produits
fonctionnement du système nerveux, Anémie, troubles
Vitamine animaux comme les œufs, le 0,001-
Cobalamine métabolisme acide aminé, améliore la mémoire menstruels, déclin mental, /
B12 fromage, le fromage blanc, le 0,002 mg
et la concentration, assimilation de graisses et tremblements
lait, le poisson et la viande.
d’hydrates de carbone, stimule la croissance,
protège des allergènes
Scorbut, sensation de
faiblesse, irritabilité,
Antioxydant, guérison des blessures, En cas de très
saignement des gencives,
antihistaminique naturel, dents et gencives forte dose : pierres Fruits, légumes verts,
Acide ecchymoses, douleurs
Vitamine C saines, os et organes sexuels, fécondité chez aux reins, goutte, pommes de terre, lait et foie, 60 mg
ascorbique articulaires, troubles
l’homme, activité globules blancs, contre les diarrhée, crampes poivron et choux de Bruxelles
cardiaques,
refroidissements et autres virus à l’estomac
perturbation de la
guérison des blessures
Coenzyme impliquée dans le métabolisme, la Peau squameuse chez les
production d’énergie, la formation d’anticorps, bébés, eczéma, fatigue,
Œufs, lait, fruits, noix, soja,
Biotine pour une peau saine, des cheveux et des mauvais métabolisme des 0,03- 0,15
Vitamine H / levure de bière, riz non
(Vitamine B8) ongles sains, soulage les douleurs musculaires, graisses, douleur mg
décortiqué, viande et poisson
contre l’eczéma, la dermatite, la calvitie, le musculaire, anémie,
diabète dépression

DJR = dose journalière recommandée


mg = milligramme

245
Tableau 3.11.2 : Dose journalière recommandée par catégorie d’âge

DJR
Enfants Adultes Seniors
Enfant
a Bébé Bébé en bas Enfants Ados Homme Femme Femme Femme
Vitamine 51-70 a 70 a +
(0-5 m) (6-11 m) âge (5-12 a) (13-18 a) (19-50 a) (19-50 a) (enceinte) (allaitant)
(1-4 a)
b 800- 800-
A (µg) 450 400 400 500-1000 800-1000 1000 800 1000 1250
1000 1000
d d d d d d d d d
D (µg) 5-10 5-10 5-10 2,5-5,0 2,5-5 2,5 2,5 7,5-10 7,5 -10 5-10 12,5-15
e
E (mg) 2,6 3,3 5 6,5-9,2 9,6-12,1 10,7-11,8 8,5-9 9 10,9 7,9-9,7 7,5-8,5
K (µg) 25 25 30 50 80 80 80 80 80 80 80
B1 (mg) 0,2 0,2 0,3 0,5-0,8 1,1 1,1 1,1 1,4 1,7 1,1 1,1
B2 (mg) 0,4 0,4 0,5 0,7-1,0 1,1-1,5 1,5 1,1 1,4 1,7 1,1-1,5 1,1-1,5
b
B3 (mg) 2 2 4 7-11 13-17 17 13 17 20 13-17 13-17
B5 (mg) 2 2 2 3-4 5 5 5 5 7 5 5
c c
B6 (mg) 0,12-0,20 0,2 0,4 0,7-1,1 1,5 1,5 1,5 1,9 1,9 1,5-1,8 1,5-1,8
B11 (µg) 50 60 85 150-225 300 300 300 400 400 300 300
B12 (µg) 0,4 0,5 0,7 1,3-2,0 2,8 2,8 2,8 3,2 3,8 2,8 2,8
C (mg) 35 35 40 45-55 65-70 70 70 90 110 70 70
H (µg) 4 4 8 20 30 30 30 30 35 30 30

a
Unités exprimées en milligramme (mg) ou microgramme (µg)
b
En supposant un allaitement maternel exclusif
c
En cas d’allaitement maternel exclusif 0,12 mg/jour; alimentation au biberon (par rapport à une teneur accrue en protéines) 0,20 mg/jour
d
Vaut pour les personnes à la peau claire allant au moins 15 minutes par jour à l’extérieur avec en tout cas les mains et le visage découverts.
e
Lorsque non nourri au sein maternel

246
4 TECHNIQUES D’ANALYSE

4.1 Chromatographie en phase liquide

4.1.1 Aspects généraux

La chromatographie est un procédé de séparation des constituants d’un mélange. Elle est devenue
une méthode analytique pour identifier et quantifier les composés d’une phase liquide ou gazeuse
homogène. Le principe de base repose sur les équilibres de concentration des composés présents,
entre deux phases non miscibles dont l’une, dite stationnaire, est emprisonnée dans une colonne ou
fixée sur un support et l’autre, dite mobile, se déplace au contact de la première. Chaque constituant
adopte une vitesse de migration qui lui est propre en fonction de sa solubilité dans la phase mobile et
de son affinité pour la phase stationnaire qui tend à la retenir pour, au final, obtenir la séparation des
constituants du mélange initial.

On peut classer les différents types de chromatographies de plusieurs façons différentes selon que
l’on considère la nature des phases utilisées ou les mécanismes de séparation des composés

4.1.2 Classification selon la nature des phases

o La phase mobile est un fluide, donc soit un liquide, soit un gaz, soit encore un fluide
supercritique.

o La phase stationnaire est soit un solide, soit un liquide (fixé sur un support solide).

La combinaison de ces possibilités conduit à plusieurs possibilités :

o Chromatographie liquide-solide (LSC)

o Chromatographie liquide-liquide (LLC)

o Chromatographie gaz-solide (GSC ou GC)

o Chromatographie gaz-liquide (GLC ou GC)

o Chromatographie supercritique (SFC).

La SFC représente un cas intermédiaire entre LC et GC, les fluides supercritiques possédant des
propriétés à la frontière entre celles de liquides et celles des gaz.

4.1.3 Classification selon le phénomène chromatographique

Cela dépend de la nature et de la structure de la phase stationnaire, on distinguera donc :

o La chromatographie d’adsorption lorsque la phase stationnaire est un solide (LSC, GSC) ;


par extension on peut y rattacher la chromatographie d’affinité quand les propriétés
d’adsorption de la phase stationnaire sont spécifiques d’un ou d’une famille de composés.

o La chromatographie de partage (LLC, GLC) lorsque la phase stationnaire est un liquide non
miscible avec la phase mobile (mise en jeu de coefficients de partage).

247
o La chromatographie d’échange d’ions (IEC) où la phase stationnaire porte des groupes
fonctionnels acides ou basiques, destinés à séparer des composés ionisés.

o La chromatographie d’exclusion où la phase stationnaire poreuse se comporte comme un


tamis et sépare les composés selon leur taille. Une autre appellation est la chromatographie
de perméation sur gel (GPC).

4.1.4 Classification selon le procédé utilisé

Selon le conditionnement de la phase stationnaire, on distinguera :

o La chromatographie sur colonne.

o La chromatographie sur papier

o La chromatographie sur couche mince

Selon les modalités de migration de la phase mobile, on distinguera :

o La chromatographie par développement (les constituants de l’échantillon restent sur la phase


stationnaire ).

o La chromatographie d’élution (les substances sont entraînées hors de la phase stationnaire).

4.1.5 Classification selon les phénomènes intervenants dans la séparation

Les paramètres physico-chimiques responsables des principes de séparation sont :

o La polarité et/ou l’hydrophobicité ; polarité de phase normale ou inversée

o La charge électrique : échange d’ions.

o La taille et la forme : exclusion ou perméation sur gel

o L’existence de structures particulières qui permettent d’établir des liaisons spécifiques :


chromatographie d’affinité.

4.1.6 Phases stationnaires en HPLC

La phase stationnaire (PS), au contact de la phase mobile (PM) mais insoluble dans celle-ci, est le
second milieu avec lequel les composés initialement dissous dans la phase mobile vont également
interagir. Il apparaît dans la colonne une association particulière à trois constituants (PM/composé/PS)
pour chaque analyte dans l’échantillon.

248
4.1.6.1 Le gel de silice

C’est la matière de base des phases actuelles. C’est un solide amorphe et rigide ayant pour formule
SiO2(H2O)n (avec n très proche de 0). Ce matériau de base tout à fait différent de la silice naturelle
(SIO2) qui peut servir de matière première à sa synthèse, est préparé sous forme de micro sphères de
diamètre sensiblement constant pouvant varier de 2 à 5 µm. Le diamètre doit-être le même pour
toutes les particules et assurer un remplissage compact des colonnes si l’on veut éviter la création de
chemins préférentiels.

Ces micro sphères sont obtenues par agglutination en présence d’un liant organique (urée/formol) de
micro particules (appelées sol-gel) elles mêmes obtenues par polymérisation puis hydrolyse basique
contrôlée du tétraéthoxysilane. Le traitement final est une pyrolyse conduisant aux micro sphères de
silice utilisées pour le garnissage des colonnes (cf Figure 4.1.1).

Le gel de silice est un matériau très polaire correspondant à un maillage tridimensionnel. Il n’a pas la
structure ordonnée de la silice cristalline, mais il reste bâti sur l’agencement tétraédrique des quatre
liaisons de l’atome de silicium. C’est un polymère inorganique réticulé comportant des groupements
silanols, en nombre variable, ayant résistés à la phase de cuisson.

Figure 4.1.1

Remarque : Les gels de silice sont stables dans une grande gamme de pH mais ne supportent pas
des pH trop extrêmes. Il existe des risques de dissolution à des pH trop acides ou trop basiques. On
se limite à une gamme de travail 2 < pH < 12.

Un agrandissement d’une micro sphère est schématisé dans la Figure 4.1.2 et l’on constate que ces
sphères sont en réalité inhomogènes et irrégulières et qu’il existe des lacunes appelées pores. Ces
pores jouent un rôle important car sont des zones d’adsorption préférentielles.

249
Figure 4.1.2

La surface des micro sphères de silice est composée de groupement silanol Si-OH (cf Figure 4.1.3)
qui sont responsables des phénomènes d’adsorption car ils permettent la formation de liaisons
hydrogène et sont responsables de la polarité et de l’acidité de la silice. Ces groupements silanol s’ils
sont trop nombreux entraînent des adsorptions trop importantes et leur nombre doit-être
soigneusement contrôlé.

Les figures dans le cours servent seulement pour information.

Figure 4.1.3

4.1.6.2 Les silice greffées

Bien qu’ayant une capacité d’adsorption élevée, le gel de silice est de moins en moins utilisé tel quel
pour les analyses. Ses caractéristiques évoluent au cours du temps entraînant un manque de
reproductibilité des séparations ; ainsi, pour beaucoup d’applications, il est partiellement réhydraté (3-
8 % d’eau) pour le désactiver.

Pour diminuer cette polarité excessive, on fixe par liaisons covalentes des molécules organiques sur
les fonctions silanol. Le gel de silice modifié devient ainsi assimilable à un liquide, la séparation
mettant en jeu des coefficients de partage et non plus des coefficients d’adsorption. Ces phases
greffées dont la polarité peut être ajustée facilement sont à l’origine de la chromatographie de partage
en phase inversée. Comme le schématise la figure ci-dessous distinguant les phénomènes
d’adsorption et de partage, l’adsorption est un phénomène d’interface à la différence de l’absorption ;
par exemple, si l’on greffe une mono couche d’hydrocarbure à la surface du gel de silice, les

250
molécules qui présentent une partie lipophile et l’autre hydrophile s’orientent à l’interface. L’adsorption
est le phénomène qui consiste en l’accumulation d’une substance à l’interface entre deux phases
(gaz-solide, gaz-liquide, liquide-solide, liquide-liquide, solide-liquide).

En chromatographie en phase inverse les groupements silanol très polaires sont donc éliminés vu leur
grande affinité avec les solutés polaires ainsi retardés.

Pour résoudre ce problème, on utilise un procédé nommé « end-caping » retraitant la phase greffée à
l’aide d’un silane porteur de groupements méthyle. La polarité du gel en est ainsi considérablement
réduite (cf Figure 4.1.4) :

Figure 4.1.4

La qualité d’un gel de silice pour la chromatographie dépend de plusieurs paramètres, à savoir : la
structure interne, la taille des grains, la porosité ouverte (dimensions et répartition des pores), la
surface spécifique, la résistance à l’écrasement et la polarité.

Les gels courants en HPLC ont les caractéristiques suivantes : diamètre de 2 à 5 µm avec 5 groupes
silanol par µm² ; surface spécifique variant de 4 à 350 m²/g s’il s’agit d’une silice poreuse ou non avec
des pores de 10 nm.

251
Figure 4.1.5

4.1.6.3 Chromatographie de partage

Cette chromatographie a pour principe la différence de solubilité d’un soluté entre deux liquides qui
sont non miscibles ; il s’agit ici d’un équilibre de partage.

Autrefois, les phases stationnaires étaient composées d’un solide poreux imbibé par un liquide. Bien
que toujours utilisée en chromatographie gazeuse, cette technique est abandonnée en
chromatographie liquide. La cause en est le phénomène de lessivage par l’éluant du liquide imbibant
les solide poreux.

De nos jours, ce sont des gels de silice sur lesquels on greffe une fonction chimique par liaison
covalente. Ce greffon va se comporter comme un liquide fixé sur la phase stationnaire solide.

Deux types de chromatographie de partage sont envisagés selon la polarité de la phase mobile et de
la phase stationnaire.

4.1.6.3.1 Chromatographie en phase normale

La phase stationnaire est très polaire tandis que la phase mobile est peu polaire (solvants
organiques). Les composés qui sont faiblement polaires ont donc une plus grande affinité pour la
phase mobile et sont ainsi élués rapidement. A l’inverse, les composés polaires ayant une plus grande
affinité pour la phase stationnaire seront élués lentement. Les solutés sont donc élués en sens inverse
de leur polarité.

252
Greffons utilisés en phase normale

Les phases stationnaires de silice pure sont moins utilisées en raison de quelques propriétés
défavorables :

o elles sont sensibles à l'humidité, l'eau dans ces colonnes doit être à tout prix évitée

o tendance au « tailing » ce qui peut provoquer une interprétation erronée du pic

o tendance au « bleeding », phase stationnaire se détachant de la colonne

o l'élution de gradient n'est pas possible.

En raison de ces inconvénients, on privilégie des greffons comportant des fonctions polaires :

o Amine : NH2

o Nitrile : CN

o Diols : CH2-CHOH-CH2OH.

4.1.6.3.2 Chromatographie en phase inverse

La phase stationnaire est peu polaire ou apolaire tandis que la phase mobile est généralement polaire
(solvants aqueux et organiques). Les composés polaires ont donc une plus grande affinité pour la
phase mobile et sont ainsi élués rapidement. A l’inverse, les composés peu polaires ayant une plus
grande affinité pour la phase stationnaire seront élués lentement. Les solutés sont donc élués dans le
sens de leur polarité.

Greffons utilisés en phase inverse

Il s’agit de greffons comportant des fonctions de nature apolaire :

o Diméthylsillyle : C2

o Octylsillyle : C8

o Octadécylsillyle : C18

o Phénylsillyle : C6 cyclique.

4.1.6.3.3 Synthèse des silices greffées

On distingue deux types de synthèse conduisant à des surfaces monomères ou polymères greffées
(cf schéma « formation d’organosilanes greffés à l’interface du gel de silice) :

o Phases monomériques (10-15 µm d’épaisseur) : on fait réagir un monochlorosilane de type


ClSiMe2R (méthylchlorosilane) avec les silanols de surface.

253
o Phases polymériques (25 µm) on utilise cette fois ci un di- ou trichlorosilane (Cl2-3SiMeR) en
présence de vapeur d’eau ce qui provoque une polymérisation réticulée dans laquelle les
groupes silanold initiaux seront en partie reliés entre eux .

On atteint ainsi 4 ou 5 % de carbone après greffage sur les silanols accessibles, cela représente un
greffage de 40 à 50 % de la surface totale.

Le groupement R représente la fonction greffée : NH2, CN, CH2CHOHCH, OH, CH3 en phase normale
et C8H17, C8H37, C6H5 en phase inverse.

Figure 4.1.6 : Formation d’organosilanes greffés à l’interface du gel de silice. Représentation de


quelques groupements monomériques ou polymériques rencontrés en surface du gel de silice.
L’enchaînement Si-O-Si-C est plus stable que Si-O-C. On atteint 4 ou 5 % de carbone après greffage
sur les silanols accessibles.

4.1.6.3.4 Mécanisme de partage liquide/liquide

Les phases greffées ne sont pas de véritables liquides car la couche monomérique ou polymérique
est de très faible épaisseur et se compare à un film liquide. Le partage entre la phase fixe et mobile
fait intervenir l’adsorption des solutés et du solvant organique sur la couche monomoléculaire du
greffon.

Pour rappel, la phase mobile en phase inversée met en jeu un solvant organique (classiquement
méthanol ou acétonitrile) et de l’eau. Le solvant organique moins polaire présente une affinité pour la
phase greffée qui est apolaire. Les solutés devant être séparés sont potentiellement apolaires et
présentent une affinité pour le greffon apolaire. Le solvant organique M et les solutés S vont donc être
adsorbés à la surface de la phase stationnaire. Il s’établira ensuite un équilibre de partage entre les
composés adsorbés et les composés restés libres dans la phase mobile.

Madsorbé + Smobile = Mmobile + Sadsorbé (cf Figure 4.1.7)

254
Figure 4.1.7

Il s’établit une suite d’équilibres successifs entre la couche liquide d’adsorption et la phase mobile. Les
constituants les plus polaires qui ont une plus grande affinité pour la phase mobile seront élués plus
rapidement que les composés plus apolaires ayant une plus grande affinité pour la phase stationnaire.

4.1.6.3.5 Interactions hydrophobes

En plus du phénomène d’adsorption à l’interface, les solutés présentent en général un pôle hydrophile
et un pôle hydrophobe ; l’extrémité hydrophobe s’orientera donc vers la phase stationnaire (en phase
inverse) et l’extrémité hydrophile vers la phase mobile polaire (aqueuse). En réalité, le soluté de part
la répulsion de son pôle hydrophobe avec la phase mobile polaire sera obligé de pénétrer plus ou
moins profondément la couche d’adsorption ce qui augmentera son temps de rétention (cf schéma).
La géométrie de la partie hydrophobe joue également un rôle : plus la surface hydrophobe sera
grande plus le composé sera retenu donc son temps de rétention sera élevé.

Figure 4.1.8

4.1.6.3.6 Influence de la teneur en solvant organique dans la phase mobile

Plus la tension superficielle de l’éluant sera forte et plus le temps de rétention d’un composé sera
long.

L’eau étant un des solvants présentant la plus grande tension superficielle, plus la teneur en eau de
l’éluant sera importante, plus les composés seront retenus dans la phase stationnaire. Donc, pour
diminuer le temps d’analyse, on pourra augmenter la proportion en solvant organique mais cela se
fera souvent au détriment de la résolution.

255
4.1.6.3.7 Influence de la teneur en solvant organique dans la phase mobile

La polarité des composés joue également un grand rôle en chromatographie. Il est donc important de
savoir classer les fonctions organiques par ordre de polarité, ici croissant :

Alkyle < fluoro < chloro < nitro < aldéhyde < acétyle < hydroxyle < cétone < amine < carboxyle <
amide

R < F < Cl < NO2 < CHO < O-CO-CH3 < CO-R < NH2 < COOH < CO-NH2
Pour les groupes alkyles, la polarité est fonction de la longueur de la chaine ; pour les cycles, c’est la
surface : Plus la longueur ou la surface sera importante, plus la polarité sera faible (interaction
hydrophobe).
Quand un composé comporte plusieurs fonctions, c’est la fonction la plus polaire qui est considérée

4.1.6.3.8 Théorie simplifiée de la chromatographie de partage

Le facteur de rétention k

Considérons le soluté A en équilibre entre la phase mobile et la phase stationnaire :

A(m)  A(s)

En modifiant la polarité de la phase mobile, on agit directement sur le coefficient de distribution ou de


partage K = (Cs/CM) régissant l’équilibre ci-dessus ; Cs est la concentration du soluté dans la phase
stationnaire et CM la concentration du soluté dans la phase mobile.

Le coefficient de distribution K ou constante de Nernst est le paramètre physico-chimique de base en


chromatographie qui quantifie le rapport de concentration de chaque composé entre les deux phases
en présence ; K, pour un soluté, ne dépend que de la température, est indépendant du débit ou de la
longueur de la colonne ; il rend compte de la capacité de la colonne à retenir chaque composé.

En chromatographie, on utilise plutôt une grandeur proportionnelle à K que l’on désigne par k nommé
facteur de rétention :

k = K*Vs/VM

Vs est le volume de la phase stationnaire contenu dans la colonne et VM est son volume mort c’est-à-
dire le volume occupé par le solvant lors de l’utilisation de la colonne.

La porosité d’une colonne est définie par la relation : p = VM/Vs.

256
Figure 4.1.9

De ces relations, on conclut que plus un composé aura une affinité pour la phase stationnaire, plus K
et k seront élevés, plus le composé sera retenu donc plus grand sera son temps de rétention.

Par extension, plus un composé aura une grande affinité pour la phase mobile, plus k et K seront
faibles, moins le composé sera retenu donc plus faible sera son temps de rétention

En phase inverse, le solvant est polaire et aqueux :

o Les substances polaires et/ou peu hydrophobes seront éluées rapidement

o Les substances apolaires et/ou très hydrophobes seront éluées lentement.

Ainsi, pour faire varier le temps de rétention des composés et optimiser une séparation, on pourra
jouer sur la teneur en solvant organique de l’éluant.

Classiquement on observe souvent une corrélation linéaire entre les logarithmes des facteurs de
rétention et le logarithme de la teneur en solvant organique :

log(k) = a*log(X) + b (équation d’Everett)

L’augmentation de la teneur en solvant organique (moins polaire que l’eau) X permet souvent de
diminuer les temps de rétention et donc raccourcir la durée de l’analyse.

Cependant les composés seront alors moins bien séparés car les valeurs de k des composés seront
proches. Il est aussi courant d’observer une inversion dans l’ordre de sortie des composés comme le
montre le croisement de courbes (Figure 4.1.10) pour deux composés A et B.

257
Figure 4.1.10

Le facteur de séparation (ou sélectivité) entre deux solutés

On définit la sélectivité α d’une séparation par le rapport k2/k1 des facteurs de rétention de deux
composés. Plus α sera élevé, meilleure sera la séparation. Le facteur de séparation α précise les
positions relatives de deux pics adjacents 1 et 2 (Figure 4.1.11). Par définition, il ne peut être < 1.

Sachant que le temps de rétention d’un composé tR est tel que tR = tM + ts, la valeur de k est donc
accessible à partir du chromatogramme (tS = t’R). tM étant le temps de rétention d’un composé non
retenu sur la colonne.
t R' t −t
k= = R M
tM tM

t R' ( 2) k2
α= '
ou α =
t R (1) k1

Figure 4.1.11

258
Le facteur de résolution entre deux pics

Afin d’exprimer numériquement une plus ou moins bonne séparation entre deux composés, on utilise
le facteur de résolution R calculé à partir du chromatogramme ci-dessous.

Figure 4.1.12

t R ( 2) − t R (1)
R=2
w1 + w2

où :
o tR est le temps de rétention des composés respectifs, exprimé en secondes

o W est la largeur de pic à mi-hauteur de l'analyte correspondant, exprimé en secondes.

L’expression ci-dessous montre l’influence, sur la résolution, de l’efficacité, du facteur de capacité et


de la sélectivité :

N  α − 1   k2 
R= *  * 
4  α   1 + k2 
où :
o N est le nombre de plateaux théoriques qui est une mesure de l'efficacité de la colonne; plus il
y a de plateaux, meilleure est la séparation (défini dans le paragraphe suivant)

o α est le facteur de sélectivité, qui dépend de la force des solvants utilisés et de la température
à laquelle a lieu la séparation
o k est le facteur de capacité; décrit la vitesse de progression des solutés dans la colonne,
également dépendant de la force des solvants utilisés.

259
La Figure 4.1.13 ci-dessous montre l’aspect visuel d’une variation de R entre 2 pics adjacents. A partir
de R = 1.5, on considère que les pics sont résolus.

Figure 4.1.13

L’efficacité N d’une colonne

On défini l’efficacité N d’une colonne par son nombre de plateaux

Le nombre de plateaux N peut se calculer à l'aide de la formule suivante :

2
 T 
N = 5,54 R 
 W1 / 2 

L’efficacité d’une colonne dépend de trois facteurs :

o de sa géométrie : plus une colonne sera longue et/ou diamètre interne gros, plus elle sera
efficace.

o du garnissage : plus les particules de silice de la phase stationnaire seront fines, plus la
colonne sera efficace.

o du débit de l’éluant : il existe un débit optimal pour laquelle l’efficacité de la colonne est la plus
grande (loi de Van Deemter).

A partir du nombre de plateaux N et de la longueur de la colonne analytique L, on calcule le HETP


(appelé H en abrégé) (Hauteur équivalente d’un plateau théorique).
L
H=
N

H est fonction de 3 termes qui sont la cause d'un élargissement du pic :

B (l'équation de Van Deemter)


H = A+ + Cµ
µ
où :
A: Diffusion d’Eddy  la garniture de la colonne analytique (phase stationnaire) peut allonger le
chemin parcouru des composants et provoquer des écoulements préférentiels, si bien que les pics
deviennent plus larges que voulus
B: Diffusion longitudinale  élargissement des pics du fait que les composants dans la colonne
analytique ne migrent pas seulement avec le sens d'écoulement de la phase mobile

260
C: Transfert de masse  dans la colonne analytique, il y a une résistance au transfert de masse du
soluté entre les 2 phases. Comme la phase mobile perturbe l'équilibre, il peut se produire un
élargissement du pic. En utilisant une plus faible granulométrie de particules, l'équilibre est atteint plus
rapidement et il y aura un moindre transfert de masse, donc aussi moindre élargissement du pic
µ: flow ou vitesse d'écoulement de la phase mobile

Lorsqu'on met ces 3 termes dans un graphique, on peut déterminer le flux optimal pour lequel le
nombre de plateaux N est le plus grand.

Il est toutefois important de savoir qu'on ne doit pas toujours travailler avec un flux optimal. Parfois il
est plus rapide de travailler avec un débit plus élevé, tout en conservant une bonne séparation du
mélange.

Figuur 4.1.14

4.1.6.3.9 Elargissement des pics

Il est provoqué par :

o le volume de l'échantillon : si on injecte un trop grand volume d'échantillon, il ne peut pas se


produire une bonne séparation dans la colonne et les pics seront trop larges sur le
chromatogramme.

o un mauvais tubing entre l'extrémité de la colonne et l'entrée du détecteur. Lorsque le tubing


entre la colonne et le détecteur est trop long ou a un trop grand diamètre, il y a un risque de

261
voir les pics qui ont été séparés dans la colonne à nouveau se réunir et donc de détecter des
pics plus larges.

o le volume de détection : On peut agrandir la cellule du détecteur dans le but d'augmenter la


sensibilité. L'inconvénient est que cela risque de diminuer la résolution, et donc élargir les
pics.

o le temps de réponse du détecteur : La vitesse à laquelle le détecteur mesure des points de


données est parfois trop faible pour distinguer 2 pics l'un de l'autre avec le risque de ne
considérer qu’un seul pic.

4.1.7 Choix de la méthode HPLC

En plus de la chromatographie classique en phase normale ou inverse, d’autres techniques sont


parfois employées, à savoir :

4.1.7.1 Chromatographie d’appariement d’ions (paired ion chromatography)

Cette technique a pour avantage d’améliorer la séparation de composés ioniques ou très polaires
ayant une trop faible affinité pour la phase stationnaire dans le cas où celle-ci est apolaire.

Pratiquement, on ajoute à la phase mobile un composé à la fois porteur d’une chaîne carbonée (peu
polaire) et d’un groupement de charge opposée à celle du composé à séparer. On crée ainsi une paire
d’ions globalement neutre, assez stable et qui sera retenue par la phase stationnaire. Il est même
possible de séparer des cations ou anions minéraux sur une phase stationnaire inversée classique.

o analyse de composés acides: utilisation d'un contre ion avec une chaîne hydrophobe et une
fonction basique (ex: triethylamine). Phase mobile a pH 7-8 qui permet d'avoir le contre ion et
l’acide ionisé.
o analyse de composés basiques: utilisation d'un contre ion avec une chaîne hydrophobe et une
fonction acide (ex: hexanesulfonate). Phase mobile à pH 3-4 qui permet d'avoir le contre ion
et la base ionisés.

Figure 4.1.15

Une exemple pratique est le dosage de l’histamine sur une colonne C18 classique par appariement de
la molécule d’histamine (composé basique) à un contre-ion à fonction acide (octanesulfonate) évitant
ainsi une étape de dérivatisation, longue, fastidieuse et délicate.

262
4.1.7.2 Chromatographie par échanges d’ions (ionique)

Pour la séparation de: mélanges d'ions, y compris ions inorganiques

Phase stationnaire: présente à sa surface des groupes fonctionnels ioniques qui engagent des
interactions avec des ions d'analyte de charge opposée

Phase mobile : solution aqueuse contenant le contre-ion, on utilise parfois aussi des tampons.

La technique est détaillée dans le paragraphe : chromatographie ionique.

4.1.7.3 Chromatographie d’exclusion (de taille)

Ce type de chromatographie est encore appelé : tamisage moléculaire, gel-filtration (phase mobile
aqueuse) ou perméation sur gel (phase mobile organique).

Cette technique permet la séparation des molécules en fonction de leur taille et de leur forme. On
utilise pour ce faire des granules de gel poreux.

Les grosses molécules (dont le diamètre est supérieur à celui des pores) sont exclues et sont donc
éluées les premières. Les petites et moyennes molécules sont éluées plus tardivement, car elles sont
incluses dans le gel, leur migration est ainsi freinée.

Donc, les solutés sont éluées dans l’ordre inverse des masses moléculaires comme le montre le
schéma suivant :

Figure 4.1.6 : principe de perméation sur gel

1 : Dépôt d'un mélange de deux molécules (des grosses et des petites) sur une colonne remplie d'un
gel.
2 : Les petites molécules peuvent pénétrer dans les billes de gel car leur diamètre est inférieur à celui
des pores du gel. Les grosses molécules ne le peuvent pas en raison de leur grande taille; elles sont
donc exclues du gel (d'où le nom de chromatographie d'exclusion).
3 : Les grosses molécules ont donc un trajet plus court à parcourir pour arriver en bas de la colonne;
elles sont donc éluées les premières.
4 : Les petites molécules sont éluées ensuite car elles ont une plus grande distance à parcourir pour
arriver en bas de la colonne.

263
Résultat sur un chromatogramme (Figure 4.1.17):

Figure 4.1.17

Pour la séparation de:: composants de masse moléculaire élevée ou polymères comme les époxydes,
polystyrènes, silicones, PVC ou lipides (avec perméation de gel), ou peptides, protéines, enzymes,
acides nucléiques, oligo ou polysaccharides (avec filtration de gel)

Phase stationnaire:: ne peut pas réagir avec la phase mobile, gels cross-linked
cross linked avec des pores d'une
taille spécifique. Filtration sur gel (support hydrophile) ; perméation sur gel (support hydrophobe)

Phase mobile:: ne peut pas réagir avec la phase stationnaire, pour la filtration sur gel, utilisation de
solutions aqueuses ; pour la perméation sur gel, utilisation de solutions organiques

Cette méthode
de est souvent utilisée pour déterminer la masse moléculaire moyenne des polymères,
comme analyse qualitative et quantitative de molécules biologiques et comme méthode de séparation
de petites molécules.

La technique de perméation sur gel est notamment utilisée


utilisée pour séparer les composants de la matière
grasse en acides gras, diglycérides, triglycérides et polymères de triglycérides afin de doser le % de
triglycérides polymérisés dans la matière grasse. La phase stationnaire est un gel styrène- styrène
divinylbenzène
ne et la phase mobile du THF pur.

4.1.7.4 Chromatographie d’interaction hydrophobe

Cette technique permet d’améliorer la séparation de composés biorganiques tels que les protéines
solubles dans l’eau.

1ère étape : On fixe la protéine à séparer sur le support chromatographique en présence d'une forte
concentration en sel :

264
o dans un milieu à haute force ionique, les molécules d'eau de l'enveloppe d'hydratation des
protéines sont "mobilisées" pour hydrater les anions et les cations issus de la dissociation du
sel, c'est le phénomène de "salting -out" ;

o il en résulte une modification de l'organisation des molécules d'eau autour des protéines et ce
changement d'environnement est thermodynamiquement favorable à l'établissement
d'interactions hydrophobes entre les régions hydrophobes à la surface des protéines et le
groupement hydrophobe porté par la phase stationnaire.

2ème étape : Après rinçage du gel afin d'éliminer les protéines non adsorbées, l'élution des protéines
fixées est obtenue :

o en faisant passer un tampon de force ionique décroissante, les ions du sel étant ainsi
progressivement éliminés ;

o les acides aminés chargés ou polaires à la surface des protéines peuvent de nouveau établir
des liaisons hydrogène avec la phase mobile, c'est-à-dire que la solubilité des protéines dans
la phase mobile redevient maximale et elles sont éluées.

Il en résulte que les molécules sont éluées dans l’ordre décroissant de leur caractère hydrophile

Figure 4.1.18

Pour la séparation de: protéines et peptides sans dénaturation.

Phase stationnaire: colonnes reversed phase, avec petite quantité d'atomes de C, groupes courts
fixés à la silice.

Phase mobile: eau pure avec sel.

265
4.1.8 Aspects instrumentaux

Figure 4.1.19 : Schéma général d’un HPLC

4.1.8.1 Solvants

Le choix du solvant est très important en HPLC parce qu'une très grande quantité de liquide est
pompée par le système.

Les solvants doivent être très purs et il existe plusieurs qualités en fonction de l'application. Souvent,
l'éluant est encore filtré une nouvelle fois avant utilisation.

Afin d'empêcher que d'éventuelles petites particules ne soient aspirées dans le système, un filtre est
généralement posé à l'aspiration.

Un appareil HPLC peut être équipé d'un dégazeur. Il est cependant conseillé d'encore dégazer l'éluant
avant utilisation, que l'appareil soit équipé ou non d'un dégazeur interne. On peut le faire en plaçant
l'éluant dans un bain à ultrasons, faire barboter de l'hélium gazeux à travers la solution ou filtrer sous
vide. Les bulles de gaz doivent être évitées parce qu'elles sont source de bruit de fond au niveau du
détecteur.

Lors du choix du solvant, il faut aussi tenir compte de l'absorbance de chaque solvant. La valeur d'UV-
cutoff est indiquée sur la bouteille de solvant et doit être la plus faible possible afin de donner le moins
possible de perturbations supplémentaires. La valeur d'UV-cutoff de l'acétonitrile et de l'eau est de 190
nm, alors que celle du méthanol est de 210 nm, ce qui peut être proche de l'absorbance des
composants recherchés.

4.1.8.2 Pompes

La pompe d'un appareil d'HPLC se compose généralement d'une pompe à piston comprenant une
petite chambre cylindrique qui se remplit d'éluant lorsque le piston se déplace vers l'arrière, et injecte
le solvant vers la colonne lorsque le piston se déplace vers l'avant. Le retour du liquide n'est pas
possible parce que l'entrée et la sortie de la pompe sont fermées par une valve anti-retour.

266
Pour obtenir un écoulement stable, on fait usage d'une pompe à double pistons d’un l’un est de
volume double du second (cf Figure 4.1.20).

Figure 4.1.20 : le pompe à piston

Lorsque le réservoir de solvant est raccordé au système, on va 'primer' avec la pompe. C'est à dire
pomper séparément dans chaque réservoir, mais sans envoyer le solvant par la colonne, seulement
pour expulser le plus d'air possible des conduites. On peut aussi purger, en pompant les liquides en
proportion de l'éluant par la conduite et non par la colonne.

‘Primer’ permet de changer facilement la composition du solvant.

Lorsque les conduites ont été le mieux possible vidées de leur air, l'éluant peut s'écouler dans la
colonne. Généralement, 15 minutes suffisent pour atteindre un équilibre, à moins que l'on utilise des
solutions tampons. Celles-ci doivent souvent se stabiliser pendant plus de 30 minutes. Sur un
chromatogramme, il est nettement visible qu'une colonne n'est pas assez stabilisée lorsque les temps
de rétention vont se déplacer entre les différentes injections, ou si la ligne de base se met à
augmenter graduellement pendant une injection. (ceci vaut uniquement pour l'élution isocratique, étant
donné qu'avec l'élution par gradient il est nécessaire qu'au début d'une injection suivante, le système
revienne en équilibre avec la composition initiale de l'éluant.)

267
Les pompes doivent répondre aux exigences suivantes :

o fournir des pressions élevées jusqu’à 400 bars

o débit stable, non pulsé et réglable de 0.1 à 10 ml/min avec un contrôle meilleur que 0.5 %

o résistance à la corrosion quelque soit le solvant utilisé.

Il existe deux modes de fonctionnement :

o Le mode isocratique pour lequel la composition de la phase mobile est fixe.


o Le mode gradient de solvant où l’on fait varier la composition du solvant pendant l’analyse en
vue d’optimiser la séparation et diminuer le temps d’analyse.

La variation en gradient est programmable principalement sous 3 types de profil : linéaire, concave ou
convexe.

Figure 4.1.21 : le mode gradient d’élution

Figure 4.1.22

En pratique, l’on procède par tâtonnement pour obtenir le résultat le plus satisfaisant. Les pompes
actuelles peuvent mélanger jusqu’à quatres solvants différents, chacun d’entre-eux pouvant déjà être
un mélange de solvants. Pour les éluants qui sont composés de plusieurs solvants, il est préférable
(en raison des erreurs possibles) de laisser la pompe composer le solvant, plutôt que de mélanger
soi-même les solvants. La plupart des systèmes HPLC ont une chambre de mélange basse pression.

268
Il n'y a qu'une pompe qui pompe tous les solvants. Dans une chambre à mélange haute pression, il y
a une pompe prévue pour chaque solvant. Ce dernier système est considérablement plus coûteux à
l'achat.

La Figure 4.1.23 ci dessous donne la configuration pour gradient basse (a) et haute pression (b).

Figure 4.1.23 : configuration pour gradient basse (a) et haute pression (b).

4.1.8.3 Injecteur

Pour l'injection, on utilise un robinet à six voies, pouvant prendre une position de chargement et une
position d'injection.

Figure 4.1.24 : robinet à six voies

En position de chargement, la boucle (loop) est remplie avec le volume d'échantillon voulu. Le loop
est raccordé à l'injecteur et au waste, tandis que de l'éluant s'écoule par la colonne.

Lorsque le loop est rempli, on tourne le robinet de telle façon que le loop rempli soit raccordé à la
pompe de l'éluant et à l'entrée de la colonne analytique : c’est l’injection.

269
4.1.8.4 La colonne

C’est la partie du système qui permet la séparation des composés. Il s’agit d’un cylindre calibré en
acier inoxydable et parfois en matériaux inerte (verre ou plastique). Classiquement le diamètre varie
de 0.5 à 5 mm et de longueur 10 à 30 cm. La phase stationnaire est calée entre deux disques frittés.
Le diamètre intérieur sont classiquement entre 4 et 10 mm. La granulométrie de la phase stationnaire
est comprise entre 5 et 10 µm pour une efficacité de l’ordre de 50000 plateaux/m.

Il existe aussi des micro-colonnes de 3 à 7 cm de long, de diamètre interne de 1 à 5 mm, et de 3 à 5


µm de granulométrie. Leur efficacité est de l’ordre de 100000 plateaux/m ; l’intérêt d’une telle colonne
est la rapidité d’analyse, l’économie de solvant mais nécessite des pompes plus puissantes
permettant des débits rapides.

Outre la colonne analytique qui fait la séparation des composants dans le mélange, on peut aussi
utiliser des colonnes de protection (pré colonne très courte de 0.5 à 1 cm) remplies de la même phase
que la phase stationnaire.

Les colonnes de protection sont placées entre l'injecteur et la colonne analytique et doivent enlever,
en cas d'échantillons 'sales', le plus gros des impuretés de telle sorte qu'elles n'arrivent pas au début
de la colonne analytique. Dès qu'on voit se produire un tailing dans les chromatogrammes, on doit
remplacer la colonne de protection. Cette pré colonne fixe les composés dont l’affinité avec la phase
stationnaire est trop élévé et qui ne migrent pas dans les conditions utilisée. La pré colonne doit être
changée périodiquement.

Figure 4.1.25 : colonne et pré colonne

Filtration de l’échantillon :

En HPLC, il est recommandé de filtrer en amont avant la mise en vial. A l’aide d’une seringue on filtre
l’échantillon à travers un disque de porosité 0.2 ou 0.45 µm dont la membrane est compatible avec le
solvant utilisés. Le filtrat est récolté dans le vial d’injection ; l’injecteur est ainsi protégé des particules
insolubles.

270
Figure 4.1.26 : Filtration de l’échantillon

Pour un fonctionnement optimal plus long de la colonne analytique, les points suivants sont
importants:

o si l'on utilise des tampons comme solvant d'élution, la colonne doit être bien rincée à l'eau
pure après analyse afin de prévenir une cristallisation du tampon

o lorsqu’une colonne n'est pas utilisée, le mieux est de la conserver fermée

o les colonnes ne peuvent pas être conservées au sec ou dans l'eau pure, mais bien dans de
l'acétonitrile par exemple.

o veillez à ce que le solvant d'élution ne soit pas trop acide ou trop basique car cela pourrait
faire se décomposer la phase stationnaire dans la colonne

o évitez les gros écarts de pression; laissez d'abord baisser la pression avant de débrancher
une colonne, car un déplacement de pression peut déplacer le packing, ce qui donne
naissance à des volumes morts qui provoquent une interprétation erronée des
chromatogrammes

o ne laissez pas tomber les colonnes, car cela peut aussi provoquer l'apparition de volumes
morts

o veillez à ce que les colonnes soient toujours mises dans le bon sens du flux.

4.1.8.5 Détecteurs

4.1.8.5.1 Détection par IR

10 % de toutes les détections se font par détection d'Indice de Réfraction. L'usage est universel, mais
comme lors de la mesure le solvant d'élution est lui-même détecté, la concentration de l'analyte
recherché doit être assez élevée.

Ces détecteurs sont également sensibles à la température (attention aux courants d'air et systèmes
d'air conditionné).

271
La limite de détection (LOD, Limit Of Detection) se situe autour de 1 µg, alors qu'elle est beaucoup
plus basse pour d'autres systèmes de détection.

Ce détecteur est inutilisable en mode gradient sauf si les solvants utilisés ont des indices de refraction
très proches. Les pics obtenus peuvent être positif ou négatifs selon que l’indice de refraction
augmente ou diminue.

Avec la détection par IR, il y a dans le détecteur une cellule qui est remplie d'un côté de solvant A
(référence) et de l'autre côté de solvant B (le solvant d'élution avec ou sans l'analyte). Si B contient
uniquement le solvant d'élution, il aura le même indice de réfraction que le solvant A. Si l'analyte est
présent dans B, la lumière quittera la cellule sous un autre angle de réfraction et un pic sera détecté.

4.1.8.5.2 Détection par UV

La détection par UV/VIS se fait dans environ 2/3 des cas. Contrairement à la détection par IR, il n'y a
ici qu'une petite détection de second plan du solvant d'élution. Chacun des composants qui se
trouvent dans le solvant d'élution absorbe ici la lumière UV/VIS, ce qui rend cette détection beaucoup
plus sensible. Plus la concentration du composant présent est élevée, plus il y a de lumière absorbée.
La LOD est ici proche des 10 ng.

Une condition importante pour pouvoir travailler par détection par UV/VIS est qu'il y ait des
chromophores (par exemple double liaison) présents dans l'échantillon injecté.

Différents détecteurs sont possibles pour la détection par UV :

Détection de longueur d'ondes fixe et longueur d'onde variable

Dans la détection de longueur d'onde fixe, la LOD peut s'élever jusqu'à 1 ng.

Pour la détection de longueur d'onde variable, la longueur d'onde optimale (donnant la meilleure
absorbance) pour chaque composant est réglée en fonction du temps de rétention. Pour la détection à
longueur d'onde fixe, on mesure toujours à une même longueur d'onde.

Pour pouvoir obtenir plusieurs longueurs d'onde en détection à longueur d'onde variable, un
monochromateur est intégré dans le détecteur, celui-ci peut émettre la longueur d’onde voulue à
travers le flow cell.

Figure 4.1.27 : Détecteur UV/VIS avec un seul élement de détection

272
Détecteur à diode array (DAD)

Cette méthode de détection est très intéressante en HPLC parce que bien que le nombre de plateaux
en HPLC soit beaucoup plus faible qu'avec la GC, avec cette méthode, la pureté d'un pic peut être
déterminée s'il y a 2 pics qui se chevauchent ou si un pic en couvre un autre. Cette méthode permet
aussi de s’assurer de l’identité du composé séparé et ainsi être considérée comme méthode de
confirmation.

Le détecteur à diode array utilise une lampe au deutérium qui envoie un large spectre d'UV/VIS. Le
faisceau lumineux polychromatique traverse l’échantillon puis est séparé en diverses longueurs
d’ondes par un monochromateur avant d’être dirigée sur une barrette de diodes. Chaque diode reçoit
alors une bande spectrale étroite. Les absorptions peuvent maintenant être mesurées à plusieurs
longueurs d'ondes différentes et donner un spectre continu du composé.

Figure 4.1.28 : Détecteur UV/VIS avec diode array

Ci-dessous (Figure 2.1.29), pour exemple, une détection DAD dans le VIS (300-600 nm) appliquée à
la bixine et la norbixine, colorants naturels interdits dans certaines denrées épices :

273
Chromatogramme (480 nm)

Norbixine Bixine

274
Figure 4.1.29 : Dessus : chromatogramme, Centre : profil DAD spécifique des deux molécules et
maxima spécifiques d’absorbance, Dessous : Vue en 3 D.

4.1.8.5.3 Détection par fluorescence

Cette détection n'est utilisée que dans environ 10 % des détections et est plus sensible que la
détection par UV, la LOD est de 10 – 50 pg.
Le principe est que de la lumière d'une longueur d'onde spécifique est projetée sur l'analyte et
absorbée ; le composé ré-émet sous forme de lumière tout ou une partie du rayonnement absorbé.
L'émission ou radiation de l'analyte est mesurée à une longueur d'ondes plus élevée.

Cette méthode est utilisable de façon limitée, à moins que l'on ne dérivatise l'analyte par liaison avec
un groupe fluorescent. Ce type de détecteur est utilisable en mode gradient.
Cette détection est beaucoup utilisée pour la détermination de vitamines, mycotoxines, acides aminés,
drogues et pour le contrôle de la qualité de produits pharmaceutiques.

4.1.8.5.4 Détection électrochimique

A cause de l'utilisation d'électrodes, ces détecteurs se salissent très facilement. Dans ce détecteur, un
potentiomètre mesure la différence entre une électrode de référence et une électrode de travail qui
sont plongées d'abord dans la phase mobile et ensuite dans l'échantillon dissous. Par une oxydation
ou une réduction, il y a un transfert d'électrons de l'analyte à l'électrode ou inversement. En cas
d'oxydation, l'électrode agit comme une cathode, en cas de réduction comme une anode.

En fonction du métal qui se trouve sur l'électrode, on peut déterminer des groupes différents.

Cette méthode est utilisée à raison de 10 %, surtout dans la chromatographie ionique et elle a une
sensibilité d'environ 100 pg.

275
4.1.8.6 Techniques associées (HPLC-MS)

La spectrométrie de masse (MS) est utilisée pour la détermination du poids moléculaire (formule
brute), l’identification des structures par la fragmentation de la molécule en fragments typiques
reconnaissables, et comme système de détection dans la chromatographie. La spectrométrie de
masse est une méthode de détection dont le fonctionnement est basé sur le fait que les molécules
sont ionisées et éventuellement fragmentées puis séparées sur base du rapport de la masse sur la
charge. Aucun spectromètre de masse ne peut mesurer la masse d'un atome ou d'une molécule non
chargé(e). Les parties non chargées doivent d'abord être ionisées avant de pouvoir être repoussées
ou attirées par les champs magnétiques générés dans le spectromètre de masse. Un spectromètre de
masse détermine le rapport de la masse à la charge d'un ion, exprimé comme m/z.

4.1.8.7 Dérivatisation pré- et post-colonne

Comme on l'a déjà signalé pour la détection par fluorescence, on peut faire réagir un analyte de
l'échantillon avec un groupe fluorescent.

La dérivatisation peut se faire avant que le mélange ne passe par la colonne analytique (pré-colonne)
ou après que le mélange soit passé par la colonne analytique (post-colonne).

La dérivatisation pré-colonne implique que l'échantillon et le réactif de dérivatisation soient mélangés


dans la chambre de mélange.

o Avantages : on peut choisir soi-même les conditions de réaction, la dérivatisation peut servir
d'étape de purification, l'excédent de réactif de dérivatisation peut être éliminé,
o Inconvénients : les résidus de la réaction de dérivatisation peuvent provoquer des pics, la
réaction doit être reproductible, la séparation après coup peut être difficile.

Dérivatisation post-colonne

o Avantages : on peut utiliser plusieurs détecteurs en même temps, moindre formation de


résidus, plus besoin d'une séparation après coup
o Inconvénients : la réaction doit être rapide, une dispersion secondaire est possible, la réaction
doit se faire dans la phase mobile, le réactif de dérivatisation peut donner des signaux
supplémentaires

4.1.9 Application pratique

Exemple : la détermination des aflatoxines B1, B2, G1 et G2 :

Dans l'analyse HPLC classique pour les aflatoxines, 4 types d'aflatoxines (B1, B2, G1 et G2) sont
extraits de l'échantillon (chloroforme) et purifiés au moyen d'une SPE (Solid Phase Extraction) en un
extrait qui est injecté dans l’HPLC. Le système HPLC travaille avec une dérivatisation post-colonne,
ce qui signifie qu'il se produit d'abord une séparation des 4 composants sur une colonne HPLC
normale, et qu’ensuite (='post') il y a une dérivatisation des aflatoxines à l'iode (dans une colonne de
réaction APRES la colonne HPLC).

276
Cette dérivatisation est nécessaire pour rendre 'visibles' par fluorescence les 4 aflatoxines.

Pour ce montage, on utilise 1 pompe HPLC et une pompe à réactif de dérivatisation car la solution
iodée doit être pompée dans le système après le circuit de séparation primaire.

La Figure 4.1.30 a été reprise de la norme européenne officielle :

Figure 4.1.30
Une alternative à cette disposition est possible avec ce qu'on appelle une cellule Kobra; cette cellule
se trouve après la cellule de séparation et est un système électrolytique qui donne une dérivatisation
au brome. Ici aussi c'est la fluorescence qui donne la mesure finale.

L'avantage de la cellule Kobra est qu'on n'a pas besoin d’une seconde pompe dans le circuit.

A l'avenir, on fera également de plus en plus l'usage de colonnes dites d'immuno-affinité afin de
remplacer l'extraction classique au chloroforme et la purification. L'avantage est ici que le chloroforme,
toxique, disparaît de la procédure, que celle-ci devient plus simple et que la limite de détection peut
être abaissée du fait qu'il devient plus facile de travailler sur de plus grandes quantités d'extrait par
rapport à la méthode classique.

Exemple : dosage des avermectines dans les foies :

Les avermectines sont extraites d’un échantillon de foie à l’aide d’acétonitrile. La purification de
l’extrait (clean up) est réalisée par extraction en phase solide (SPE) en deux étapes successives sur
cartouches alumine puis C18.

L’extrait purifié est évaporé à environ 65 °C et ensuite dérivatisé (pré-colonne) par le TFAA (acide
trifluoroacétique anhydre) et le MMI (méthylimidazole), en un dérivé hautement fluorescent et analysé
par HPLC-fluorimétrie (excitation : 361 nm et émission : 465 nm).

277
La séparation des composés se fait sur colonne C18 classique en utilisant un gradient d’eau et de
méthanol/acetonitrile). Dans cette méthode, les concentrations des composés sont corrigés par l’ajout
d’un standard interne (némadectine) contrôlant l’extraction, le clean-up et la dérivatisation.

Cette méthode permet de séparer et de quantifier en un seul run, 5 composés en plus du standard
interne. La LOQ est < 4 ng/g. Ci-dessous (Figure 4.1.31) une chromatogramme d’un échantillon de
foie « blanc » spiké à 4 ng/g.

Figure 4.1.31 : Analyse des avermectines

278
4.2 Chromatographie ionique

4.2.1 Principe

Cette technique chromatographique est orientée vers la séparation des ions et des composés
polaires. Pour cela on utilise des phases stationnaires comportant des sites ioniques afin qu’il se crée
des interactions dipolaires avec les différents analytes de l’échantillon. Plus grande est la charge
portée par un soluté, plus ce dernier est retenu par la phase stationnaire.

Figure 4.2.1

4.2.2 Applications

- - - 2-
Détermination d'anions inorganiques : Cl , NO3 , Br , SO4 , …

Détermination d'acides organiques : propionate, formiate, acétate, …

Détermination de chélates (un complexe métallique d'un chélateur, par ex. l'EDTA, avec un ion
métallique via une liaison réversible): EDTA.

4.2.3 Choix de l'éluant

Les éluants des phases mobiles sont des solutions aqueuses chargées d’ions salins (contre-ions) ou
organiques et, si nécessaire, d’un peu de méthanol ou d’acétone pour faciliter la dissolution de
certains échantillons. Suivant le type de garnissage de la colonne, les ions de l’éluant sont apportés
soit par des acides minéraux ou organiques, soit par des bases (potasse, carbonate). Le pH est ajusté
en fonction de la séparation à réaliser. On utilise un générateur d’éluant (basique ou acide) qui se
présente comme un module intercalé entre la pompe et l’injecteur. Connaissant le débit d’eau et
l’intensité du courant d’électrolyse, on peut connaître avec précision la concentration de l’éluant et
même faire des gradients de concentration.

279
Figure 4.2.2

4.2.4 Préparation de l'échantillon

Les échantillons broyés (aliments ou engrais) sont pesés ; l’extraction se fait à l’eau Milli-Q sous
ultrasons pendant environ 15 minutes. On filtre (20 µm) et au besoin on dilue. Le filtrat est récolté en
vial et injecté.

4.2.5 Colonnes

Si on veut séparer des espèces cationiques, on choisira une colonne, dite cationique, dont la phase
stationnaire comporte des sites aptes à échanger les cations (par exemple un polymère greffé avec
des anions sulfonates).
Inversement, pour séparer des anions, on choisira une colonne dite anionique (par exemple un
polymère greffé avec des groupes ammonium).

La séparation est basée sur le processus d'échange ionique dans la colonne. La séparation dépend
du diamètre et de la charge de l'ion (les ions d'un plus petit diamètre ou de plus faible charge sortent
les premiers de la colonne). Le pH de l'éluant influence l'équilibre de répartition d'ions pouvant avoir
des valences différentes ou qui ont plusieurs groupes fonctionnels (la valence de l'ion dépend du pH
de l'éluant). La colonne est le plus souvent précédée d'un filtre in-line. Celui-ci élimine les particules
jusqu'à 5 µm de l'éluant avant son arrivée sur la colonne.

280
4.2.6 Détection

4.2.6.1 Détecteur de conductivité

Le principe de fonctionnement est basé sur la propriété des électrolytes de conduire le courant
électrique. On mesure, en sortie de colonne, la conductance (inverse de la résistance) de la phase
mobile entre 2 électrodes. Par la présence des ions dans la solution, le courant peut aller d'une
électrode à l'autre. Le courant est une mesure de la concentration.

4.2.6.2 Détecteur d'absorbance

C'est un photomètre à longueur d'onde variable dual-beam. Les longueurs d'onde sont générées par
deux sources lumineuses : une lampe au deutérium pour la détection des UV et une lampe au
tungstène pour le spectre visible de la longueur d'ondes. L'absorbance est une mesure de la
concentration.

4.2.7 Le suppresseur d’ions de l’électrolyte

Au sein de l’éluant fortement ionique, il est parfois difficile de repérer le signal apporté par les faibles
concentrations de l’ion de l’analyte. Pour améliorer la sensibilité de la détection, on intercale entre la
colonne et le détecteur, un dispositif destiner à échanger par capture les ions apportés par
l’électrolyte, appelé suppresseur. Le but est de remplacer les ions initiaux de l’éluant par d’autres de
plus faibles conductivité.

Le modèle le plus simple de suppresseur consiste en une colonne de type échangeur d’ions.

281
4.3 La chromatographie en phase gazeuse

4.3.1 Généralités

La séparation en chromatographie gazeuse repose, comme pour les autres techniques


chromatographiques, sur le partage biphasique entre une phase mobile et une phase stationnaire
(Figure 4.3.1).

Figure 4.3.1 : schéma d’un chromatographe en phase gazeuse

Actuellement, on utilise presque exclusivement la GLC (Gas Liquid Chromatography) où la phase


mobile est un gaz et la phase stationnaire un liquide non volatil.

Auparavant, on se servait de colonnes remplies, un tube en verre épais contenant des granules, la
phase stationnaire. Celles-ci présentent un pouvoir de séparation beaucoup moindre que les colonnes
capillaires.

Les colonnes capillaires possèdent un pouvoir de séparation très élevé. Les colonnes capillaires sont
faites en silice fondue, recouverte de verre extérieurement, ce qui fait qu’elles ne cassent pas. Elle
sont très souples en comparaison avec les colonnes en verre très fragiles utilisées auparavant. La
longueur va de 10 à 50 m, le diamètre varie entre 0,1 mm et 0,53 mm et l’épaisseur de film entre 0,1
µm et 3 µm. La phase stationnaire se trouve sur la paroi interne de la colonne. Elle est souvent
4 5
apolaire et greffée (crosslinked ) pour prévenir son relargage (bleeding ) et pouvoir supporter de
hautes températures.

4
Crosslinked : ce sont des liaisons covalentes qui relient les chaînes de polymères entre elles.
5
Bleeding : à haute température, la phase stationnaire peut s’évaporer, être entraînée par le gaz
vecteur et perturber le détecteur.

282
4.3.2 Dérivatisation

La chromatographie en phase gazeuse exige que les substances à chromatographier se trouvent


dans la phase gazeuse. Donc, la température doit être suffisamment élevée, ou les composés
suffisamment volatils.
Cependant, de nombreux composés ne sont pas suffisamment volatils pour être chromatographiés à
haute température, même pas sur des colonnes à phase stationnaire greffée qui peuvent supporter
des températures plus élevées et qui présente moins de bleeding. En outre, une série de substances
sont thermolabiles, de sorte qu'elles ne peuvent pas être chromatographiées à haute température.

Le point d’ébullition élevé de beaucoup de liaisons est engendrés par la présence de groupements
hydroxyles qui créent des ponts hydrogène intermoléculaires. En éliminant ces groupements, en les
remplaçant par d’autres groupements, on peut supprimer les ponts hydrogène et augmenter la
volatilité. C'est ce qu'on appelle la dérivatisation. La dérivatisation augmente non seulement la
volatilité, mais elle présente aussi quelques autres avantages. En dérivatisant, on peut augmenter la
stabilité thermique de substances thermolabiles de sorte qu’elles puissent être plus facilement
chromatographiées.

Une colonne chromatographique est rarement parfaite. Une colonne apolaire présente souvent des
endroits actifs. La chromatographie de composants non dérivatisés entraîne un pic traînant ou 'peak
tailing' par adsorption à ces endroits actifs. Une adsorption peut également avoir lieu dans l'injecteur.
En outre, des dérivés spéciaux peuvent faciliter ou améliorer la détection. Ainsi, la dérivatisation avec
des composés polyfluorés améliore aussi bien la détection par capture d’électrons que la détection
par spectrométrie de masse.

La dérivatisation doit être facile, reproductible, sans réaction secondaire et aussi complète que
possible. Souvent, les groupes hydroxyles sont transformés en esters ou en éthers. Les esters de la
molécule mère sont généralement formés à l'aide d'anhydride d'acide acétique ou de composés
polyfluorés, qui donnent des dérivés plus volatils. Les groupes carboxyles sont généralement
méthylés en esters de méthyle. Une méthode couramment utilisée est la transformation d'alcools, de
phénols, d'amines, de cétones ou d'acides en éthers de triméthylsilyle. Cette dérivatisation peut se
faire avec différents réactifs qui ont chacun leur propre force de réaction, ou avec un mélange de ces
réactifs, accompagné ou non d'un catalyseur.

Dans le choix d'une réaction de dérivatisation, il y a lieu de tenir compte de différents facteurs, comme
les produits à déterminer, le détecteur utilisé, les paramètres de la GC et le coût.

4.3.3 Injection de l’échantillon

4.3.3.1 Généralités

Une bonne introduction de l'échantillon sur une colonne capillaire est primordiale pour une bonne
chromatographie. Différents types d’injecteurs ont été développés vu la diversité des colonnes,
comme le diamètre, l'épaisseur du film, la capacité d'échantillon, le gaz porteur, la vitesse du gaz et la
diversité des échantillons par exemple en ce qui concerne la composition, la pureté, la volatilité des
composants et la stabilité thermique.

Le but de l'injection est d’introduire une fraction de l'échantillon dans la colonne, et ce en une petite
bande la plus étroite possible, qui a une composition ”identique” à l'échantillon. L’injection a lieu soit

283
directement dans la colonne (injection on-column), soit l’échantillon est vaporisé et ensuite entraîné
sur la colonne par le gaz vecteur.

La composition de l'échantillon peut changer suite aux 'effets "discriminants", c'est à dire que certains
composants ne sont pas amenés de manière quantitative vers la colonne. Cette discrimination peut
être provoquée de différentes manières.
En cas d'injections dans un injecteur chaud, les substances moins volatiles peuvent rester dans
l'aiguille d'injection froide. C'est pourquoi pour l'injection manuelle la technique de la "hot needle" est
conseillée : injecter après avoir réchauffé l'aiguille quelques secondes dans l'injecteur.

La discrimination est également possible par dégradation de composants à haute température, par
adsorption ou par réaction catalytique de substances sur des surfaces actives. La colonne peut aussi
présenter une discrimination par adsorption réversible ou irréversible.

L'échantillon doit être injecté dans la colonne en une bande aussi étroite que possible, de sorte que la
largeur initiale soit négligeable par rapport à l'élargissement du pic consécutif au processus
chromatographique. Autrement, on assiste à un élargissement excessif du pic, voire à des pics
scindés. Une faible largeur de bande s’obtient de deux manières :

o soit seule une très petite quantité est amenée sur la colonne comme en injection split ;
o soit l’entièreté de l’échantillon est amené sur le colonne et re-concentré par concentration du
solvant, concentration thermique et concentration sur le phase stationnaire (au moyen d’un
retention gap) en injection splitless ou on-column.

Figure 4.3.2

284
4.3.3.2 L’injecteur Split/Splitless

L’injecteur combiné split/splitless est un injecteur très utilisé en chromatographie gazeuse capillaire. Il
est adapté à la plupart des applications parce qu’il peut être utilisé aussi bien en mode split qu’en
mode splitless. L’échantillon est introduit dans l’injecteur chaud au moyen d’une seringue et est
immédiatement vaporisé. C’est pourquoi la température doit être suffisamment haute. Si elle est trop
élevée, il risque de se produire une dégradation de l'échantillon. Pour empêcher le backflush de
l'échantillon, il faut tenir compte du volume que prendra l'échantillon après évaporation à la
température et à la pression régnant dans l’injecteur. Il y a lieu de choisir un insert adéquat. Le
transfert de l’échantillon de l’insert vers la colonne sous forme gazeuse présente l’avantage que les
composés non volatils ne se retrouvent pas dans la colonne mais restent dans l’insert qui peut être
facilement remplacé.

Figure 4.3.3

4.3.3.2.1 L’injection Split

Ce fut le premier injecteur en chromatographie gazeuse capillaire. Le flux de gaz est divisé en deux.
La plus grosse partie s’échappe après passage dans le liner et une petite fraction est envoyée sur la
colonne. De la sorte, une bande étroite apparaît et une re-concentration n'est pas nécessaire.
L'élargissement du pic consécutif à l'injection est minimal. La colonne peut rester à haute température,
de sorte que la séparation chromatographique peut commencer directement. Comme une petite
fraction seulement de l'échantillon parvient dans la colonne, cette technique d'injection convient moins
à l'analyse des résidus.

4.3.3.2.2 L’injection Splitless

Dans une injection splitless, une valve, la valve split, est fermée avant l'injection. Le flux de gaz
passant par l’insert est réduit au flux de gaz passant dans la colonne. L'échantillon évaporé est amené
dans la colonne par la vitesse du flux gazeux passant par l’insert, et, dans la colonne, il se condense
en une bande étroite. La presque totalité de l'échantillon présent est amenée dans la colonne de sorte
que la sensibilité est fortement accrue. Ensuite, la valve split s’ouvre et les vapeurs restant dans

285
l’insert sont entraînées vers la purge. Cela empêche le tailing de pics. Le temps après lequel la valve
s’ouvre dépend des caractéristiques du solvant, du volume de l’insert, du volume d'échantillon, de la
température et du débit de gaz.

4.3.3.3 L’injecteur PTV

Un injecteur PTV (Programmed Temperature Vaporisation) est un type d'injecteur dérivé de l’injecteur
split/splitless, et qui convient pour l'injection de grands volumes. Cela provient du fait que l'injecteur
peut rapidement chauffer et refroidir. A basse température, on injecte une grande quantité de liquide.
Le solvant est volatilisé par le gaz vecteur et évacué via la conduite split. Les analytes restent dans
l'injecteur. Après volatilisation du solvant, la vanne split est fermée et l'injecteur est très rapidement
chauffé. Les analytes entrent en phase gazeuse et sont amenés par le gaz vecteur en début de
colonne, où ils se recondensent en une bande étroite. Un injecteur PTV convient très bien pour
l'analyse de résidus parce qu'une grande partie de l'échantillon purifié est amené dans la colonne.

Figuur 4.3.4

4.3.3.4 L’injecteur on-column

L'injection on-column est la technique d'injection la plus exacte et la plus précise pour les petits
volumes. Dans l'injection on-column, comme son nom l’indique, l'échantillon est injecté directement
dans la colonne, et son évaporation n'est pas nécessaire. De cette manière, on peut amener dans la
colonne des volumes jusqu'à 2 µl.

286
Figure 4.3.5

La température de l'injecteur doit être inférieure au point d'ébullition du solvant, de sorte qu'il ne se
produise pas d'évaporation, mais elle doit toujours être supérieure à la température du four. Cette
dernière peut être plus élevée que dans une injection splitless, parce que l'échantillon ne doit pas être
recondensé.

L'échantillon est diffusé par le gaz vecteur sur la paroi de la colonne en un film stable. Pour concentrer
les composants en une bande étroite, on peut faire usage d'un "retention gap", une portion de colonne
sans phase stationnaire qui ne donne pas de rétention. De plus, un retention gap capture tous les
composants non volatils, qui autrement parviendraient à la colonne et influenceraient la séparation
chromatographique.

L'injection on-column se fait à basse température de sorte qu'il ne se produit pas de dégradation de
l'échantillon ou de réactions de transformation dues à la température élevée. De ce fait, la
chromatographie de substances thermolabiles peut se faire. La discrimination est également
minimisée : grâce à la température basse, la discrimination dans l'aiguille est négligeable et celle due
à l'injecteur est inexistante puisque l'échantillon est amené directement dans la colonne. C'est pour
ces raisons que l'injection on-column est la plus exacte et la plus précise des injections.

Outre ces nets avantages, l'injection on-column présente aussi quelques inconvénients. La colonne
est facilement surchargée et il peut donc parvenir une moindre quantité de l'échantillon à la colonne
qu'avec d'autres techniques d'injection. On peut partiellement y remédier avec un retention gap.
L'échantillon doit être relativement propre parce que tout parvient dans la colonne. Les matières non
volatiles s'accumulent à l'entrée de la colonne, perturbent l'efficacité de la séparation et créent des
endroits actifs sur la colonne. Un meilleur clean-up de l'échantillon est donc nécessaire. On peut
toutefois y remédier en utilisant un retention gap. Enfin, le choix de paramètres comme le solvant, la
température initiale, etc., demande une meilleure optimalisation.

287
4.3.3.5 L’injecteur à espace de tête (Headspace injector)

L'injection headspace est utilisée pour l’analyse de composés très volatils. Ici, le gaz dans un flacon
(éventuellement chauffé) contenant l’échantillon est injectée. Ce gaz contient des composés volatils
qui sont en équilibre avec la phase liquide. Le gaz est injecté dans le chromatographe via une boucle.
Cette technique n’est pas très sensible mais elle demande peu de préparation de l’échantillon.

4.3.3.6 L’injecteur Purge and trap

Cette technique d’injection est utilisée pour l’analyse des substances volatiles mais dont la volatilité
est moindre que dans l’injecteur Headspace. Un gaz inerte (par exemple, l’azote) barbotte dans un
échantillon aqueux et entraîne les composés volatils (purge). Ces substances sont piégées (trap) sur
une colonne d’adsorption (par exemple Tenax ®). Les composés très volatils ne peuvent pas être
piégés, contrairement à l’injecteur Headspace où ceux-ci peuvent bien être analysés. Ensuite, la
colonne d’adsorption est chauffée de sorte que les composés retenus sont vaporisés et amenés à la
colonne via un injecteur split/splitless. Grace à cette « concentration », le sensibilité est beaucoup plus
élevée que dans un injecteur Headspace.

Figure 4.3.6 : injecteur Purge and Trap

4.3.3.7 La SPME (Solid Phase Micro Extraction)

Cette technique utilise une fibre qui est recouverte d’une phase liquide fixe. Celle-ci est plongée dans
l’échantillon (liquide ou gazeux) de sorte que les analytes (volatils et non volatils) forment un équilibre
entre l’échantillon et la phase couvrant la fibre. Ensuite, cette fibre est introduite dans un injecteur
split/splitless dans lequel les composés sont vaporisés et chromatographiés (Figure 4.3.7). Cette
technique est simple, rapide et peut être utilisée comme préparation de l’échantillon. En outre, elle
peut être utilisée directement pour le prélèvement de l’échantillon, de sorte qu’il peut être analysé de
suite après stockage et transport au laboratoire.

288
Figure 4.3.7

4.3.3.8 La pyrolyse

Par cette technique, l’échantillon est chauffé à une température tellement haute (> 600°C) que les
grosses molécules se dissocient en fragments plus petits et plus volatils. Cela peut se produire au
contact d’un fil de platine chauffé ou dans une coupelle en quartz. Les injecteurs PTV plus récents ont
été adaptés pour atteindre ces températures. Cette technique convient très bien à l’analyse des
polymères.

4.3.4 La séparation

Les principes et les paramètres d’utilisation pour la séparation par chromatographie en phase
gazeuse sont les mêmes que pour l’HPLC (voir 4.1), à savoir la rétention, la résolution, le nombre de
plateaux, le facteur de sélectivité, le facteur de capacité et la hauteur équivalente d’un plateau
théorique HETP. La grande différence avec l’HPLC est que la phase mobile est un gaz et que la phase
stationnaire est généralement un liquide (qui est fixé sur la colonne).

Le gradient en chromatographie gazeuse est un gradient de température à la place d’un gradient


selon la force du solvant en HPLC. La pression nécessaire pour pousser dans la colonne une quantité
déterminée de gaz dépend de la température du four. Plus haute est la température du four, plus
élevée est l’énergie cinétique des molécules de gaz et donc plus grande est la pression nécessaire
pour pousser le gaz dans la bonne direction. Pour obtenir un débit constant durant un gradient de
température la pression du gaz peut être adaptée électroniquement.

Il existe cependant d’autres différences par rapport à l’HPLC. Actuellement, la chromatographie


gazeuse emploie presque toujours des colonnes capillaires pour lesquelles le terme A de l’équation de
Van Deemter (voir 4.1.1.3) disparaît. Cette équation peut être représentée pour différents gaz.

289
Figure 4.3.8 : l’équation de Van Deemter
Deemter pour des gaz différents

De ce graphique, il s’avère que l’hydrogène donne les meilleurs résultats chromatographiques. A


cause du risque d’explosion de l’hydrogène (fuites !), on opte souvent pour l’hélium. Le risque
d’explosion peut être éliminé par
ar l’utilisation d’un générateur d’hydrogène. Il produit juste la quantité et
la pression nécessaire.

4.3.5 Les détecteurs

Trois caractéristiques importantes des détecteurs sont la sensibilité (sensitivity), la sélectivité et la


portée dynamique (dynamic range).
range). Ils demandent en outre une bonne stabilité et reproductibilité.

La sensibilité est la réponse du détecteur par quantité d'échantillon. Elle est influencée par la
préparation de l'échantillon, l'injection, la chromatographie, l'intégration et le bruit du système. La
quantité minimale détectable est la quantité qui donne un rapport signal/bruit de 2 ou 3.

La portée dynamique est la gamme de concentration qui peut être exactement quantifiée.

Certaines techniques de détection se basent sur la destruction des molécules, par ex. par incinération
ou par bombardement d'électrons, ce sont les détecteurs dits destructifs. Cette propriété est
importante pour l'accouplement de plusieurs détecteurs. Les détecteurs non destructifs peuvent être
couplés en série. Le TCD (détecteur à conductivité thermique) et le PID (détecteur à photo-ionisation)
photo
sont des détecteurs non destructifs.

290
4.3.5.1 Classement des détecteurs

Les détecteurs peuvent être classés en détecteurs universels, sélectifs ou spécifiques.

o Les détecteurs universels donnent une réponse à tous les produits qui éluent dans la
colonne. Un TCD, par exemple, est un détecteur universel car toutes les substances donnent
un changement de conductivité thermique. Un spectromètre de masse, en mode scan, est
aussi un détecteur universel. La détection universelle a aussi des inconvénients. Une
mauvaise séparation chromatographique peut donner une interférence avec les composants à
déterminer, et les détecteurs peuvent être sensibles au column bleeding et aux fluctuations de
pression et de température du gaz.
o Les détecteurs dits sélectifs le sont pour un élément, une structure, un groupe fonctionnel ou
pour une autre propriété. Des exemples sont le détecteur à capture d’électron (ECD), le
détecteur azote-phosphore (NPD) ou le détecteur à photo-ionisation (PID).
o Les détecteurs spécifiques sont des détecteurs qui sont tellement sélectifs qu'ils peuvent
détecter certaines structures ou éléments avec une grande certitude. Exemples : le FPD
6
(Détecteur à photométrie de flamme), le MS (spectromètre de masse) en mode SIM et l'AED
(Détecteur à émission atomique).

Les détecteurs spectraux, par exemple un spectromètre de masse, sont capables de provoquer des
transitions moléculaires ou électroniques, ce qui permet d'obtenir des informations structurelles sur le
composant élué. Ceci est d'une importance extrêmement grande dans un but de confirmation.

4.3.5.2 FID (Détecteur à ionisation de flamme)

Le FID est le détecteur le plus répandu. Les substances éluées sont brûlées dans le détecteur et
portées à haute température et il se forme des ions qui génèrent un faible courant électrique qui est
amplifié. Ce détecteur n’est pas sélectif. Il s’en suit qu’ il est peu utile pour l'analyse de résidus.
Sélectivité : tous les composés qui s’ionisent dans une flamme H2/air.

Figure 4.3.9 : le détecteur FID

6
SIM: selected ion monitoring

291
4.3.5.3 ECD (Détecteur à capture d’électrons)

Dans le détecteur, l'éluat est irradié dans un champ électrique au moyen d'une source radioactive β
63
(Ni ). Le gaz vecteur est ionisé et les électrons libérés provoquent un courant permanent. Certains
composés capturent ces électrons lors de l'élution, ce qui fait diminuer le courant mesuré. Le
détecteur est très sensible et il est sélectif pour les composés qui absorbent facilement les électrons,
comme par ex. les composés halogénés ou leurs dérivés. De plus, les molécules peuvent être
dérivatisées avec des composés halogénés, par ex. l'acide butyrique heptafluoré, qui rend la molécule
très apte à la détection. Ce détecteur ne donne toutefois pas d'information structurelle, ce qui fait qu'il
ne convient pas pour les confirmations.

Sélectivité : dépend de l'affinité des électrons; la réponse aux composés polychlorés est un million de
fois plus grande que pour les hydrates de carbone.

Figure 4.3.10 : le détecteur ECD

4.3.5.4 TCD (Détecteur à conductivité thermique)

C’est un détecteur universel, non destructif, qui est basé sur le changement de conductivité thermique
du gaz porteur par les analytes éluants.

Figure 4.3.11 : le détecteur TCD

292
4.3.5.5 NPD (Détecteur azote-phosphore)

Il s'agit d'un détecteur destructif, sélectif pour les atomes de N et de P. Le signal apparaît par un
courant généré après ionisation des analytes dans un plasma.

Figure 4.3.12 : le détecteur NPD

4.3.5.6 FPD (Détecteur à photométrie de flamme)

C'est un détecteur destructif, sélectif pour les atomes de S et de P. L'éluat est brûlé ce qui excite les
atomes de soufre ou de phosphore (selon le filtre).

Figure 4.3.13 : le détecteur FPD


4.3.5.7 PID (Détecteur à photo-ionisation)

Les éluats sont ionisés par des rayons UV. Ce détecteur est sélectif ou universel en fonction de
l'énergie de la lampe.

293
Figure 4.3.14 : le détecteur PID

4.3.5.8 AED (Détecteur d’émission atomique)

C'est un analyseur d'éléments universel et sélectif, et il est donc sensible à la présence des différents
atomes de l'échantillon. L'éluat se retrouve dans un plasma induit à l'aide de micro-ondes. Dans le
plasma, les molécules sont atomisées. Lorsque les électrons reviennent à l'état fondamental, ils
émettent une lumière dont la longueur d'onde est spécifique à chaque atome, et qui est mesurée à
l'aide d'une barrette de diodes (photodiode array ou PDA).

Figure 4.3.15 : le détecteur AED

4.3.5.9 Spectromètre de masse (MS)

Ce type de détecteur sera développé largement dans une autre partie de ce syllabus.

294
4.4 Spectrométrie de masse

4.4.1 Généralités

La spectrométrie de masse est une technique analytique polyvalente basée sur la masse atomique ou
moléculaire de composants d’un échantillon et pouvant être utilisée pour de l’identification, de la
quantification, de la caractérisation des isotopes, des molécules ou des complexes de molécules dans
de très petites quantités de matrices chimiques et biologiques.

La technique MS possède les caractéristiques suivantes :

o Sensibilité élevée

o Spécificité élevée

o Flexibilité élevée.

Un spectre de masse reflète l’abondance statistique des ions formés en fonction du ratio m/z dans
une relation linéaire, en d’autres mots un spectre de masse est un graphique dans lequel l’intensité
(relative) des ions est donnée depuis les faibles masses jusqu’au plus hautes. Un spectre de masse,
sous les mêmes conditions de travail est reproductible et caractéristique d’un analyte (Figure 4.4.1).

Figure 4.4.1: spectre de masse du toluène

4.4.2 Principe

Indépendamment du type d’instrument, un MS est toujours constitué de trois parties (Figure 4.4.2) :

o une source d’ions

o un analyseur de masse
o un détecteur

295
L’échantillon arrive dans la source d’ions via l’admission. Dans la source, l’analyte est transformé en
ions. Ces ions peuvent être séparés dans l’analyseur sur base de leur rapport masse/charge (m/z). Le
détecteur mesure la quantité d’un certain rapport m/z, les données sont ensuite transposées en un
spectre de masse. Si le MS est couplé à un chromatographe, on obtient pour chaque temps du
chromatogramme un spectre de masse.

Figure 4.4.2 : schéma d’un spectromètre de masse

4.4.3 Introduction de l’échantillon

La façon d’introduire l’échantillon dans le MS dépend de la technique d’ionisation et du type


d’échantillon. Un échantillon peut être introduit directement dans la source ou peut y être introduit
après séparation chromatographique, p.ex. la chromatographie gazeuse (GC-MS) ou la
chromatographie liquide (LC-MS). Dans le cas du GC-MS, l’introduction de l’échantillon (et l’ionisation)
se passe sous-vide, en LC-MS, cela se passe sous pression atmosphérique (Figure 4.4.3).

Figure 4.4.3: introduction de l’échantillon en GC-MS et LC-MS

296
Il existe beaucoup de techniques d’ionisation, chacune avec ses avantages et ses inconvénients. La
source d’ionisation transforme les molécules présentes en ions. Des ions positifs et négatifs sont
formés, dépendant de l’affinité protonique de l’analyte. Les ions positifs ou négatifs sont ensuite
mesurés ou alternativement, en fonction du du réglage de la polarité de l’appareil. Les ions négatifs
sont moins souvent formés que les positifs mais il y a également moins de bruit chimique, de ce fait,
les mesures en mode négatif procurent un gain en sensibilité pour les analytes qui produisent
facilement des ions négatifs.

Suivant l’énergie appliquée, apparaît un (pseudo-) ion moléculaire où la fragmentation a lieu. Plus la
technique d’ionisation est douce, au moins on aura de fragmentation. Le tableau 4.4.1 reprends les
types les plus importants. On peut les classer selon le tableau ci-dessous et le champ d’application.

Tableau 4.4.1 les principaux types d’introduction d’échantillons en MS

Méthode Technique
Ionisation sous vide (GC) EI
CI
Ionisation sous pression atmosphérique après ESI
vaporisation (LC) APCI
APPI
Transfert d’énergie à l’échantillon MALDI

Dans la figure 4.4.4 on retrouve les champs d’application des différents types

Figure 4.4.4: représentation des champs d’application des différents types

297
4.5 ICP / OES

4.5.1 Principe de l’ICP-OES

L’ICP-OES ou « Inductive Coupled Plasma – Optical Emission Spectrometry » est une technique qui
permet de mesurer simultanément des concentrations de différents éléments. Dans les documents
internationaux cette technique est généralement abrégée en ICP-AES : Inductive Coupled Plasma
- Atomic Emission Spectrometry.

4.5.2 Emission

L’émission de rayonnement est un processus par lequel un système (atome, ion) qui se trouve lui-
même dans un état excité, perd son énergie excédentaire par émission de rayonnement
électromagnétique ou, autrement dit, l’émission est la production d’un photon d’énergie hν01 par la
retombée, dans un atome, d’un électron d’un niveau d’énergie haut E1 à un niveau fondamental E0.
Les couleurs (longueur d’onde, fréquence) qu’ont les photons émis dépendent de la nature du
matériau (quel atome, ion…) et de la température.

La relation entre le nombre de particules dans l’état excité et dans l’état fondamental est donné, selon
Boltzmann, par :

− ( Es − E0 )
Ns gs
= ⋅e kT
N0 g0

Avec Ns et N0 respectivement, le nombre de particules dans l’état d’énergie le plus haut Es et dans
l’état fondamental E0 ; gs et go les facteurs de poids de chaque niveau d’énergie ; k la constante de
Boltzmann et T la température absolue (en degrés Kelvin).

A température ambiante, tous les électrons d’un atome se trouvent à l’état fondamental. A
température ambiante, aucun objet n’émettra de rayonnement visible (400 – 800 nm). Mais dès qu’on
chauffe dans une flamme (2500 k) ou dans un plasma inductif couplé (4000 – 10.000 K), les hauts
niveaux d’énergie sont occupés et il y a une émission spontanée et mesurable de rayonnement.

Les atomes émettent des photons dans un grand nombre de longueurs d’ondes. Chaque élément a
donc un spectre discret de raies. Une explication possible de ces spectres a été donnée, en 1913,
par Bohr qui proposa que la distance moyenne d’un électron par rapport au noyau positif de l’atome
n’est pas quelconque mais liée à des valeurs bien établies. A l’exemple de Bohr, on dit que l ‘électron
décrit des trajectoires déterminées autour du noyau. Une trajectoire correspond à une valeur
déterminée de l’énergie potentielle de l’atome. Un rayonnement ne peut être émis que si l’électron,
d’un niveau plus lointain de haute énergie retombe à un niveau situé plus près du noyau et de plus
basse énergie. L’énergie libérée l’est sous forme d’un photon.

L’intensité des différentes raies d’un élément donné diffère de raie à raie. Les transitions dans
lesquelles l’état fondamental est impliqué sont souvent les plus fortes. Ce sont les raies de
résonance. Par exemple, les raies de résonance du sodium sont les raies à 589,0 et 589,6 nm.
Celles-ci occasionnent la couleur jaune criard quand un sel de sodium est porté dans une flamme.

298
Pour le sodium et d’autres métaux alcalins (K, Li,…) il y a peu de transitions et donc peu de raies dans
le spectre car ces éléments n’ont qu’un seul électron de valence dans la couche externe. S’il se
trouve plus d’électrons dans la couche externe comme pour les alcalino-terreux (Mg, Ca, Sr, Ba,…) et
surtout chez les métaux de transition comme Fe, W, Ni, Cr, Mn,… et les terres rares (Sc, Y, Ce, Th,…),
alors le nombre de raies spectrales émises par ces éléments est particulièrement élevé. A ces
spectres appartiennent autant des raies atomiques que ioniques (raies envoyées par un atome
ionisé).

La majeure partie des éléments montre des raies d’émission avec une longueur d’onde comprise
entre 190 et 380 nm, c’est la partie ultra-violet du spectre électromagnétique. Les longueurs d’ondes
plus grandes (>380 nm, c’est le domaine du visible) se présentent moins souvent. Les longueurs
d’ondes plus courtes (<190 nm, l’ultra-violet sous vide) se voient, par exemple, pour les éléments Al,
S, P et C.

Exemples de longueurs d’ondes utilisées pour la détermination de certains éléments ainsi que du
nombre total de raies spectrales pour ces éléments :

Al : 167,237,308 et 396 nm (40 raies)


As : 188, 193 et 228 nm (19 raies)
Br : 700 nm (1 raie)
Cd : 214, 226, 228 et 361 nm (50 raies)
Ca : 227, 317, 422 et 610 nm (72 raies)
Ce : 401, 413, 418 et 456 nm (520 raies)
P: 177, 213 et 214 nm (39 raies)
Au : 208, 242 et 267 nm (44 raies)
Fe : 234, 238 et 259 nm (413 raies)
I: 178 et 206 nm (8 raies)
K: 766 nm (10 raies)
Cu : 213, 221, 224 et 324 nm (78 raies)
Pb : 220 et 283 nm (35 raies)
Ni : 221, 231 et 341 nm (102 raies)
S: 178 nm (23 raies)

Toutes les raies d’un élément ne sont pas utilisables pour la mesure de la concentration de cet
élément dans un échantillon. Beaucoup de raies ont une intensité trop faible. Dans un échantillon, il y
a plusieurs éléments présents dont les spectres se recouvrent l’un l’autre. Les recouvrements sont
appelés « interférences spectrales ». Pour faire une bonne détermination quantitative, il faut faire une
sélection adéquate de raies qui ont une intensité satisfaisante et le moins possible d’interférences
spectrales. Pour effectuer cette sélection, il existe des tables de longueurs d’ondes. Ces tables sont
présentes dans les software des instruments et permettent une sélection rapide des raies atomiques
et ioniques.

En pratique, pour une méthode de détermination, il est souhaité, au moins, deux raies adéquates.
Cela permet de dépister, plus facilement, dans le spectre d’éventuels pics gênants. La raie
d’interférence d’un élément gênant ne va pas recouvrir exactement la raie de l’élément à déterminer et
les résultats des deux raies vont différer.

299
4.5.3 L’origine du plasma

Un plasma est un nuage de gaz ionisé et à haute température. En ICP, on utilise un gaz inerte,
l’argon, et une décharge électrique pour allumer le plasma.

En ICP, le plasma prend naissance en haut de la « torche », un système de trois tubes par chacun
desquels de l’argon est injecté (voir Figure 4.5.1). Une bobine en cuivre pour radiofréquence est
enroulée autour de la torche. La bobine est raccordée à un générateur de haute fréquence. En
envoyant à travers la bobine un courant qui change rapidement de phase, il se forme à l’intérieur de la
bobine des champs magnétiques à fluctuations rapides. Lorsqu’on insuffle alors de l’argon dans la
torche, il n’y a initialement dans le gaz, que des atomes insensibles au champ magnétique.
Pour la formation d’un plasma, il faut des électrons et des ions qui sont générés par ionisation de
l’argon par une étincelle (décharge Tesla). Les étincelles rendent le gaz conducteur et ainsi apparaît le
plasma.

Vision axiale

Vision radiale

Figuur 4.5.1 : Schéma de la torche et du plasma

Le plasma ainsi formé doit ensuite être entretenu par un échauffement par induction du flux de gaz
argon.

300
En ICP, il y a trois flux de gaz argon :

o dans le tube central de la torche, passe un petit flux d’argon (0 – 2 l/min) dans lequel se
trouve l’échantillon en aérosol. Ce flux de gaz est appelé le nébuliseur du flux porteur
d’échantillon. Le flux du nébuliseur est l’un des trois paramètres cruciaux pour l’optimalisation
de l’ICP. Un deuxième paramètre est la puissance du RF (radio-fréquence) (voir infra). Un
troisième paramètre est la hauteur d’observation dans le plasma (voir infra). De petites
variations dans le flux du nébuliseur provoquent une différence de vitesse de l’apport de
l’échantillon et donc une différence dans l’intensité d’excitation de l’émission,
Si le flux du nébuliseur est trop faible, le flux de gaz de l’échantillon ne parvient pas à passer
le « mur » du plasma. Une partie de l’échantillon n’arrive pas dans le plasma et n’émettra pas
avec, en conséquence, une sous-estimation de la concentration.
Un flux de nébuliseur trop haut raccourcit le temps de passage de l’échantillon dans le plasma
et provoquera aussi une moindre émission, à moins que cette « perte de temps » ne soit
combinée avec un plus long temps d’aspiration de l’échantillon (mais cela nécessite plus de
solution d’échantillon). Un débit moyen pour le flux du nébuliseur est de 0,7 l/min.

o par le tube intermédiaire de la torche passe un gaz « intermédiaire » (0 – 2 l/min) qui sert à
former le plasma et à le repousser un peu du sommet de la pointe du tube intérieur de la
torche. Comme gaz intermédiaire, on utilise l’argon. Le débit moyen de gaz intermédiaire est
de 1 l/min.,

o par le tube externe, on envoie un gaz de refroidissement. Ce gaz de refroidissement peut être
de l’azote ou de l’argon et sert à éviter la fusion de la torche. Ce flux de gaz externe forme
une mince couche de gaz relativement froid et empêche le plasma de venir contre la paroi du
tube.

Au total il y a un débit de 7 à 20 l/min d’argon dont la majeure partie est utilisée par le gaz de
refroidissement.

4.5.4 Le processus de transformation de l’échantillon en particules rayonnantes

La solution d’échantillon est transportée, avec l’aide du gaz nébuliseur, au travers d’un nébuliseur qui
transforme la solution en aérosol. C’est un fin brouillard constitué de petites gouttelettes de différents
diamètres. Cet aérosol est transporté, via le tube central, dans le plasma où la température est
d’environ 4000 à 5000 K. Comme la température dans le plasma est très haute, il suffit de quelques
milli-secondes durant le séjour dans le plasma pour évaporer l’échantillon et l’atomiser.

Les différentes étapes de ce processus sont :

o désolvatation : le solvant (eau) s’évapore et il reste une petite particule de sel

o évaporation : la particule de sel se transforme en molécules

o dissociation : les molécules se transforment en atomes


o ionisation : les atomes s’ionisent

o excitation : atomes et ions excités

301
o émission : quand les atomes ou ion excités retombent d’un haut niveau d’énergie, l’énergie
libérée se transforme en rayonnement avec une longueur d’onde caractéristique de l’élément
ou ion.

Figuur 4.5.2 : Processus dans le plasma

4.5.5 Générateur RF et puissance

Le flux d’échantillon qui arrive dans le plasma va absorber l’énergie du plasma et provoquer une
émission. Pour entretenir le plasma et le maintenir stable alors que la solution d’échantillon le
traverse, il faut un générateur RF puissant et stable.

La stabilité du plasma peut être mesurée par le rapport d’intensité de raies du magnésium : un plasma
est robuste si le rapport Mg II (280,270 nm raie ionique) / Mg I (285,213 nm raie atomique) est plus
grand que 8. Un plasma robuste est insensible aux changements de composition de matrice et donne
donc une intensité égale pour le même élément dans différentes matrices.

Une très haute valeur du rapport Mg II / Mg I peut être obtenue avec une puissance de 1400 Watt ou
plus. (Une autre manière est d’optimaliser le débit du nébuliseur ainsi que la hauteur de mesure : voir
infra).

Il est certain que des matrices chargées avec beaucoup de matières organiques nécessitent un
générateur RF qui a la puissance suffisante pour exciter haut assez la bobine de cuivre, compenser
ainsi la perte d’énergie due à l’introduction de l’échantillon dans le plasma, dissocier complètement la
matrice et ne créer ainsi aucune interférence due à cette matrice. (comme, par exemple, des raies
gênantes du carbone qui troublent le spectre).

La puissance du RF appliquée varie de 750 à 1600 Watt.

302
Une puissance suffisamment haute est aussi importante quand il faut mesurer des éléments
« sensibles » (As, Se, S, Sn…) en faible concentration. Les éléments sensibles ont un très haut
potentiel d’ionisation. L’intensité du rayonnement émis par ces éléments peut être rehaussée par
l’augmentation de la puissance tandis que le bruit de fond n’augmentera que très peu. Pour ces
éléments, l’augmentation de la puissance du RF abaissera la limite de détection.

Pour des éléments très faciles à ioniser (par ex. les alcalins Ca, Mg, Sr), l’augmentation de la
puissance aura très peu d’effet sur l’intensité de l’émission de ces éléments tandis qu’on observera
une hausse de l’émission des autres éléments présents dans la matrice. Par augmentation de la
puissance, le bruit de fond va augmenter et, par conséquent, la limite de détection sera moins bonne.

C’est entre autres pour ces raisons que la technique de l’ICP, qui est une technique simultanée, doit
être optimalisée en regroupant dans une même méthode des éléments qui réagissent de la même
manière.

4.5.6 Plasmas axial et radial

La forme du plasma est celle d’un tore, ce qui signifie que la zone axiale du milieu du plasma est
relativement froide comparée à celle qui l’entoure. La forme de tore du plasma découle de « l’effet de
peau » du courant de radio-fréquence. Le couplage de l’énergie du champ de radio-fréquence se
produit surtout dans la zone extérieure du plasma, la « profondeur de la peau ». Il y a une zone qu’on
appelle « endroit faible » et, juste là, un trou peut se créer avec un faible courant d’argon et
transporter l’aérosol de l’échantillon dans tout le plasma sans troubler sa stabilité.

Dans un ICP-OES, la torche peut être montée de manière horizontale ou verticale.

Dans un ICP-OES radial, la torche est montée verticalement et le rayonnement est observé de
manière radiale, c-à-d par le côté, à une hauteur de 10 à 20 mm au dessus de la bobine et sur une
zone d’observation (la « fenêtre de vision ») d’environ 5 mm. Le paramètre hauteur de vision est
important pour limiter au minimum les interférences de matrices s’il y a présence, dans l’échantillon,
d’éléments facilement ionisables. A une hauteur de vision de 20 mm, l’émission est détectée dans une
partie plus froide du plasma (+ 6000 K) qu’à 10 mm (+ 6200 K). Dans une zone plus froide, tous les
éléments montrent moins d’ionisation et réduisent aussi l’effet de matrice.

Explication par un exemple :

o la concentration en K dans une solution aqueuse à 2 mg/l de K est mesurée radialement à 10


et 20 mm : résultat pour chacune des hauteurs : + 2 mg/l

o la même solution avec, en plus, 2 % Ca est mesurée radialement : résultat à 10 mm : 4 mg/l


et résultat à 20 mm : 2,2 mg/l.

o dans le plasma chaud à 10 mm, la facilité du Ca de s’ioniser a transporté une grande quantité
d’électrons dans le plasma. Ces électrons empêchent K de s’ioniser (équilibre K  K+ +
e- ) de la même manière que dans la solution aqueuse ne contenant pas Ca. Par quoi une
plus haute intensité des raies atomiques de K est mesurée par rapport à l’intensité des raies
atomiques de K dans une solution aqueuse standard sans Ca. Cet effet est moins important à
20 mm parce qu’il y a là une température moins haute et Ca est moins ionisé. Une alternative
à la modification des hauteurs de lecture est l’ajustement de la solution standard en la

303
calibrant comme la solution d’échantillon. Cette technique de « matrix-matching » est
seulement possible quand la composition de la solution est connue.

Un plasma radial est intéressant pour des éléments en haute concentration (0,1 mg/l et plus dans la
solution de l’échantillon) et pour des matrices chargées.

Dans un ICP axial, la torche est montée horizontalement et l’émission est prise sur l’entièreté du canal
central, ce qui, en principe, donne une plus haute intensité et donc de plus larges limites de détection.
En plasma axial, il est important que la mesure soit faite dans le centre. Cela peut aussi être contrôlé
par le rapport Mg II / Mg I : plus la mesure se fait proche du centre du plasma, plus la température est
haute et il y aura plus de raies ioniques émises que de raies atomiques.

En axial, il y a plus d’interférences. Pour les diminuer, la partie supérieure du plasma, appelée
« plume axiale », doit être enlevée. Pour cela, on emploie, soit de l’air comprimé pour souffler la
plume, soit un cône en céramique pour étêter le plasma. Le but est de détecter l’émission dans la
partie la plus chaude du plasma. La mesure axiale est donc indiquée pour mesurer les éléments
sensibles mais pas pour déterminer les fortes concentrations d’éléments faciles à ioniser (ceux-ci sont
correctement quantifiés en radial dans une partie plus froide du plasma ou après matrix-matching, cfr
Hoger).

Il existe aussi des ICP-OES avec torche horizontale où l’émission peut-être réalisée aussi bien en
axial qu’en radial

4.5.7 Détection

En ICP-OES, on utilise des détecteurs à l’état solide dans lesquels on mesure suivant le principe du
2
déplacement de charge. Un tel détecteur est un chip carré (1 cm ) sur lequel se trouvent jusqu’à 2000
x 2000 photo-détecteurs. La variation de tension est une mesure du nombre de photons reçus et
donc de la concentration d’un élément.

La position des éléments sur le chip est telle que chaque petit élément peut recevoir le rayonnement
d’une longueur d’onde définie. Comme le rayonnement de différentes longueurs d’ondes peut être
reçu en même temps, on peut donc parler de technique simultanée.

Figure 4.5.3

304
4.6 Dosage des métaux lourds et autres éléments par AMA, SAAFG, SAA GH,
ICP-OES et ICP-MS

4.6.1 Quels éléments dans quelles matrices

Les denrées alimentaires sont contrôlées quant à la présence des contaminants, notamment les
métaux lourds Cd, Pb et Hg et les éléments As, Sn, Al et Cu.
Les teneurs en Cd, Pb, Sn et Hg sont comparées aux normes définies dans la Réglementation
Européenne. Pour le Cu les normes sont définies dans l’AR (arrêté royal) pour les résidus de
pesticides. L’AFSCA applique une limite d’action pour l’aluminium dans les pâtes. L’élément Al est
entre autres analysé dans le chocolat et les produits chocolatiers dans le cadre du monitoring. Pour
l’arsenic total il y a des normes pour les compléments alimentaires. Dans d’autres aliments l’arsenic
est déterminé dans le cadre de la surveillance pour l’arsenic total, mais aussi pour l’arsenic
inorganique. La future réglementation sera principalement axée sur l’arsenic inorganique, qui est plus
toxique.

Les métaux lourds sont analysés dans tous types d’ aliments, aussi bien les aliments d’origine
végétale que d’origine animale. Les échantillons sont frais, congelés, conservés ou transformés. Pour
chaque type d’aliment des normes différentes sont en vigueur. Les normes peuvent différer largement
selon la nature de l’aliment (p.ex. max 0,010 mg/kg Cd dans des œufs versus 1 mg/kg Cd dans les
reins).
L’étain est contrôlé dans les aliments pour bébés et dans les aliments en conserves.

De plus, on examine si les concentrations des éléments nutritifs présents dans les denrées
alimentaires sont conformes aux tolérances définies. Les exemples incluent le sel (NaCl) dans le pain,
les minéraux Ca, Mg, Na, et K et les éléments Fe, Cu, Zn et P dans les aliments pour bébés, I, Mn,
Mo et Se dans les aliments enrichis et les compléments alimentaires. Dans les compléments
alimentaires à base d’argile, l’aluminium est analysé pour déterminer quelle quantité d’aluminium ils
contiennent (ordre de grandeur de l’Al dans ces silicates d’aluminium est de 3% !).

Dans les eaux destinées à la consommation humaine, les eaux qui sont conditionnées ou qui sont
utilisées dans les établissements alimentaires pour la fabrication et/ou la mise dans le commerce de
denrées alimentaires, différents éléments sont contrôlés : Al, As, B, Cd, Cr, Cu, Fe, Hg, Mn, Ni, Pb, Sb
et Se. Des normes pour les métaux lourds et les éléments dans l’eau sont fixées dans un AR.

4.6.2 Préparation des échantillons

La préparation des échantillons pour l’analyse des éléments signifie qu’un échantillon partiel
représentatif est prélevé, qui est ensuite homogénéisé et raffiné, tandis qu’on veille à ce qu'aucune
contamination ne se produise lors de ces opérations.
Seule la partie comestible est utilisée pour l’analyse (p. ex. désosser les viandes, enlever la croûte du
fromage à pâte dure). L’homogénéisation se fait par broyage. Une partie de l’échantillon homogénéisé
est utilisée pour l’analyse.

Pour l’analyse du mercure avec AMA, aucune manipulation supplémentaire n’est exigée. On peut
directement procéder à la détermination du mercure avec AMA.

Pour l’analyse des éléments avec ICPOES, ICPMS ou AAS un autre traitement est nécessaire sous la
forme d’une destruction pour obtenir les éléments en solution. Une technique courante est la digestion

305
en four micro-ondes fermé, une acidité, une pression et une température élevées (180 – 200 °C) se
traduisant par la décomposition de la matière organique des échantillons et par la libération des
éléments dans la solution restante. Pour la destruction par micro-ondes on utilise par exemple l’acide
nitrique et le peroxyde d'hydrogène. Pour l’étain un acide supplémentaire est ajouté en très petites
quantités (HCl ou HF) pour maintenir l’étain stable dans la solution. Pour le mercure de l’or est ajouté
pour maintenir le mercure stable dans la solution.

Figuur 4.6.1 : photo d’un appareil de destruction par micro-ondes

4.6.3 Détection du mercure avec l’AMA

Pour déterminer la teneur en mercure au moyen de la technique AMA (Advanced Mercury Analyser),
aussi appelée DMA (Direct Mercury Analysis), on travaille directement sur l'échantillon homogénéisé.
La limite de détection du mercure par cette technique est de l’ordre de grandeur 0,01 mg/kg.

Figure 4.6.2 Schéma de travail de l’AMA

306
La figure 4.6.2 illustre le processus d’analyse. Un échantillon d’une masse ou d’un volume connu est
pesé dans une nacelle en nickel et introduit dans l’AMA. La nacelle est introduite dans la première
partie du tube de catalyse avec four de décomposition. L’échantillon est d’abord séché et ensuite
thermiquement détruit ou calciné à 750 °C.

Les produits de décomposition sont ensuite transportés par un flux d’oxygène vers la deuxième partie
du tube de catalyse. Dans cette partie du tube de catalyse, l’oxydation est complétée et les
halogènes, les oxydes d’azote et de soufre sont fixés sur un filtre. Ensuite les produits de
décomposition sont introduits dans l’amalgamateur où le mercure est fixé sélectivement sur l’or. Le
reste, donc ce qui n’est pas du mercure, est transporté à travers la cellule de mesure jusqu’à la sortie.
L’amalgamateur est maintenu à l'état froid à 120 °C afin d’empêcher la condensation d’eau.

Afin de pouvoir mesurer la quantité de mercure amalgamé, l’amalgamateur est chauffé à 900 °C pour
une courte durée, afin de libérer le mercure sous forme d’un nuage. Le nuage de mercure est
transporté par un flux d’oxygène jusqu’à la cellule de mesure. Le mercure est d’abord amassé dans
une cellule de ralentissement et de là, il part vers une deuxième cellule de mesure plus petite. La
quantité de mercure est mesurée dans chacune des cellules à 250 nm par une lampe à cathode
creuse pour mercure.

Comme le mercure est mesuré deux fois avec des sensibilités différentes, l’AMA a une gamme de
mesure dynamique de 0,05 à 600 ng de mercure.

Les avantages de la technique sont le court temps d’analyse (+ 6 min pour un run), la basse limite de
détection et la haute précision.

Les inconvénients sont liés à la capacité de la nacelle en nickel : on peut y peser au maximum 100 mg
d’échantillon.

Pour les échantillons contenant beaucoup de matières organiques, de graisse ou de sucre, la masse
est limitée à 50 mg. Pour les matrices hétérogènes, il faut une homogénéisation poussée pour avoir
des résultats corrects.

Si la teneur attendue en mercure est basse, la limite de détection peut cependant encore être
améliorée par accumulation, c-à-d que les résultats de plusieurs sous-échantillons sont regroupés
pour produire un résultat final.

4.6.4 Détection des métaux par SAA four graphite

Des éléments, parmi lesquels le Cd, Pb, Cu, Co, Mo, Ni, … peuvent être quantifiés par four graphite
(SAAFG : Spectroscopie d’Absorption Atomique Four Graphite). L'AAS par four graphite est un
système de SAA où aucune flamme n'est utilisée, mais un four avec un tube de graphite, qui a environ
1,5 à 23 cm de longueur et 7 mm de diamètre.
La solution de mesure avec l’élément à déterminer est mise dans un four graphite. Par l’application
d’un programme de température spécifique à chaque élément, on peut doser l’élément à l’état libre en
phase gazeuse.
Le programme de température comporte en règle générale les étapes suivantes: phase de séchage à
110°C pour l’évaporation du solvant, phase de calcination à 500 à 900 °C pour la décomposition de la
matière organique, phase d’atomisation à 2000 à 2500 °C pour la décomposition en atomes des
composés restants.

307
Durant l’étape de l’atomisation on fait passer par le petit tube graphite un rayonnement ayant une
longueur d’onde caractéristique de l’élément impliqué et l’absorption est une mesure de la
concentration de cet élément (loi de Lambert-Beer).
Chaque élément est mesuré dans un programme spécifique.
Pour le cadmium et le plomb, des limites de détection de respectivement 0,010 mg/kg et 0,020 mg/kg
peuvent être obtenues.

Injectie
staal

HC lamp Grafietoven

Figure 4.6.3 Schema AAS à Four Graphite

4.6.5 Détection des métaux par ICP-MS

Dans l’ICP-MS (Inductive Coupled Plasma – Mass Spectrometry), les éléments à doser sont amenés
semblablement en solution et nébulisés par un gaz neutre dans une torche à plasma. L’échantillon
est alors atomisé puis ionisé. Les ions sont alors transportés par le gaz porteur inerte dans un champ
magnétique qui est perpendiculaire au sens de déplacement des ions. A force égale du champ, les
ions de masse différente et de même charge sont déviés différemment et donc séparés. En variant la
force du champ, les ions sont séquentiellement envoyés dans le détecteur et dosés. Ceci se fait
toutefois de façon tellement rapide qu’on peut pratiquement considérer cela comme une détection
simultanée.

Avec cette technique, les limites de détection sont de 10 à 100 fois inférieures à celles du four
graphite.

308
Figure 4.6.4 Schema ICPMS

4.6.6 Detection d'éléments par la technique de SAA Génération d’Hydrure

La spectrométrie d’absorption atomique avec Génération d’ Hydrure (SAA GH) est une technique de
SAA spécifique dont certains éléments peuvent être mesurés dans une solution d’analyse. Des
éléments typiques que l'on peut mesurer avec la technique de SAA GH sont l’arsenic, l’ antimoine, l’
étain, le sélénium, le bismut (les semi-métaux).
En SAA GH la chaleur nécessaire pour obtenir l’ atomisation est générée par une réaction exotherme
de l’acide chlorhydrique (HCl) avec une solution aqueuse de borohydrure de sodium (NaBH4) qui sont
mélangés avec l’échantillon. A cause de cette réaction l’ élément à déterminer est transformé en une
hydrure gazeuse (H+) et ensuite transportée par un gaz porteur inerte, l’ argon, à la cellule de mesure.
Dans la cellule de mesure en forme de T, la température est de 900 °C (obtenue soit par une flamme
soit par chauffage électrique) et là l’hydrure est de nouveau divisé pour que l’élément sous forme
atomique puisse être mesuré avec spectrométrie d’absorption atomique, donc en exposant la phase
gazeuse à une lampe à cathode creuse spécifique pour l’élément à quantifier.
Une variante de la SAA GH est la technique de SAA à vapeur froide pour la détermination du mercure.
Un réaction exotherme similaire est utilisée pour mettre le mercure en phase gazeuse, habituellement
avec du chlorure d’étain et de l’acide chlorhydrique comme réactifs, et un gaz porteur inerte (argon)
transporte l’hydrure de mercure à la cellule en forme de T. Celle-ci n’est pas chauffée à température
élevée, mais seulement jusqu’à 100 °C étant donné que le mercure reste sous forme gazeuse à
température ambiante. Les atomes de mercure sont quantifiés par SAA avec une lampe à cathode
creuse spécifique pour le mercure.
Avec la SAA GH, on obtient de très basses limites de détection, de l'ordre de 0,1 mg/kg et même
µg/kg pour le mercure avec SAA à vapeur froide.

4.6.7 Detection des éléments par ICPOES

Voir le chapitre ICPOES.

309
4.7 Immuno-assays

4.7.1 Introduction

Nous savons que pendant une maladie infectieuse apparaissent de nouveaux facteurs de résistance
qui peuvent subsister après la maladie comme immunité durant une certaine période (plus ou moins
longue). Cette réponse immunitaire est le plus souvent spécifique, donc dirigée contre le même
pathogène et non contre d'autres pathogènes.

Dans le sérum, on a trouvé des protéines qui réagissaient avec le pathogène ou ses produits
(agglutination de bactéries ou neutralisation de toxines). Ces protéines sont appelées anticorps. La
notion d'anticorps a mené à la définition de la notion d'antigène. Un antigène est une substance qui,
chez une espèce animale, peut provoquer la production d’anticorps pouvant réagir spécifiquement
avec les antigènes.

Ce sont surtout les substances de grande masse moléculaire qui se sont avérées être de bons
antigènes, à condition qu'elles soient étrangères à l’organisme vivant, devant produire les anticorps.
L'hôte possède donc la propriété remarquable de faire la distinction entre ses propres substances et
des substances étrangères.

Les principaux antigènes sont des protéines, bactéries et virus étrangers au corps, mais les hydrates
de carbone et les acides nucléiques peuvent également être de bons antigènes.

Un anticorps réagit spécifiquement avec son antigène correspondant. Ainsi, un anticorps contre
l'albumine du sérum ne réagira pas à l'hémoglobine. Nous obtenons une sorte de réaction clé-serrure,
telle que nous la connaissons entre l'enzyme et le substrat, mais ici encore, cette spécificité n'est pas
absolue. Il y a toujours une réaction croisée possible avec des antigènes apparentés.

4.7.2 Principe général

Le principe des tests immunologiques repose sur la compétition entre le composant et un autre
composant étiqueté (marqué) pour l'occupation d'un certain nombre de sites. Le marquage du
composant peut être un radio-isotope (RIA), une enzyme (EIA), une molécule fluorescente (FIA) ou
luminescente.

4.7.3 RIA

Le marquage d'antigènes et d'anticorps avec des radio-isotopes a mené au développement des radio-
immuno-assays (RIA). Les RIA ont un champ d'application étendu, sont sensibles, spécifiques et
faciles à réaliser. Par contre, la stabilité des molécules radio-marquées est faible à cause de la courte
demi-vie des radio-isotopes, et le rayonnement cause des dégâts aux molécules marquées. Qui plus
est, à cause des dangers pour la santé et du problème des déchets qui accompagnent l'utilisation de
radio-isotopes, les RIA sont de plus en plus remplacés par des techniques immunologiques non
radioactives.

310
4.7.4 ELISA

Une technique de la plus grande importance dans le développement d'immuno-assays ne faisant pas
appel à un isotope radioactif est la technique où des antigènes et des anticorps peuvent être étiquetés
par des enzymes : c’est un dosage immuno-enzymatique connu sous le nom d’ELISA : Enzyme
Linked Immuno Sorbent Assay.

On peut appliquer différents principes de réaction. Les plus importants sont l'ELISA compétitif et la
méthode sandwich.

4.7.4.1 ELISA compétitif

Dans l'ELISA compétitif, les parois des puits d'une microplaque sont recouvertes d'anticorps
spécifiques du composant à déterminer. Dans chaque puit, on introduit une solution de l'échantillon
contenant l'antigène à doser ; en même temps, on introduit un volume connu d’une solution de ce
même antigène marqué par une enzyme (conjugué enzymatique). L'antigène de l'échantillon ainsi que
l'antigène marqué par l’enzyme entrent en concurrence (compétition) et ont la même probabilité de se
lier aux anticorps fixés à la paroi des puits de la microplaque.

Une fois l'équilibre atteint (incubation), les antigènes non fixés aux anticorps sont éliminés par une
étape de lavage. Seuls les antigènes fixés aux anticorps sous la forme d'un complexe antigène-
anticorps restent dans les puits.

Après l'étape de lavage, on ajoute un substrat-chromogène spécifique de l’enzyme destiné à réagir


avec le produit de réaction anticorps-conjugué enzymatique pour former un produit coloré pendant
l’incubation. L'absorption mesurée est directement proportionnelle à la quantité d'enzyme dans le puit,
donc inversement proportionnelle à la concentration d'antigène de l’échantillon.

Le principe est représenté schématiquement ci-après :

311
Figure 4.7.1

312
4.7.4.2 Méthode sandwich

Ici, on fait réagir des antigènes de l'échantillon avec un excès d'anticorps de « capture » fixés à la
paroi. Ensuite, après lavage pour éliminer les antigènes non fixés, un excès d'anticorps marqués avec
une enzyme est ajouté. Ces anticorps marqués réagissent avec des sites libres des antigènes fixés
aux anticorps de capture. Plus il y a d'antigènes fixés aux anticorps de capture, plus il y aura des
anticorps marqués d'une enzyme fixés à ces antigènes. Il existe donc un rapport proportionnel entre
l'absorption mesurée et la concentration d'antigènes dans l'échantillon.

Schématiquement :

Figure 4.7.2

4.7.4.3 Avantages et inconvénients

Avantages :

o ELISA est une technique rapide et simple : des kits tout prêts sont disponibles sur le marché,
et la préparation des échantillons ne demande pas de purification compliquée. De plus, on
peut analyser un grand nombre d'échantillons en même temps, et il y a une possibilité
d'automatisation.

o La technique est sûre et relativement bon marché : à part un lecteur de microplaque, nul
besoin d'acheter d'appareillage coûteux.

o ELISA est, en outre, une technique très sensible : niveau ppb, voire ppt.

o La méthode est sélective : elle offre la possibilité de détecter, parmi différentes substances,
une substance spécifique (par ex. du chloramphénicol) ou un groupe spécifique (par ex. des
ß-agonistes).

Inconvénients :

o Il y a toujours possibilité de réactions croisées avec des antigènes apparentés, ce qui peut
entraîner de faux résultats non conformes (faux positif). Une confirmation d'échantillons
suspects est nécessaire.

313
o Pour chaque substance ou groupe de substances à déterminer, un kit ELISA spécifique est
requis.

o Parfois, il n'y a pas une réaction croisée suffisante pour toutes les substances faisant partie
d'un groupe donné.

314
4.8 Microscopie

4.8.1 Généralités

Aperçu historique du microscope

- 1590: Hans et Zacharias Janssen fabriquent le premier microscope optique composé. Celui-ci
comprenait un objectif et un oculaire.
- 1665: Robert Hooke décrit dans son livre "Micrographia" un microscope optique composé.
- 1673: Antoni van Leeuwenhoek fabrique un microscope avec des lentilles simples qui
permettent un grossissement pouvant aller jusqu’à 275 fois. Les microscopes composés
existants jusque-là, ne pouvant effectuer un grossissement que de 20-30 fois.
- 1730: Chester More Hall et George Bass utilisent une lentille concave après une lentille
convexe réalisant première lentille achromatique. Cela corrige les déviations de la lumière de
deux longueurs d'onde
- 1827: Giovanni Battista Amici fabrique le premier microscope achromatique, et reconnaît
l'importance de l'épaisseur de lamelles et le concept de « l’immersion dans l'eau ».
- 1830: Joseph Jackson Lister résout le problème de la diffusion sphérique de la lumière.
- 1877: Ernst Abbe et Carl Zeiss publient la loi de Abbe qui donne l'explication physique de la
résolution de l'objectif et fabrique les premières lentilles apochromatiques. Cette correction
des aberrations de faisceau lumineux s pour trois longueurs d’onde. Plus tard, ils ont
développé « immersion d’huile » avec le même indice de réfraction que le verre.
- 1893: Dr. Otto Schott fabrique les premiers objectifs de correction-couleur et les premiers
objectifs apochromatiques.
- À la fin du 19e siècle, les premiers stéréo-microscopes ont été fabriqués en partie pour
répondre à la demande de l’industrie métallurgique.
- 1893: le professeur Köhler découvre comment la lumière homogène peut être redirigée en
utilisant le système d’exposition de Köhler.
- 1924: Carl Zeiss utilise pour la première fois des lentilles avec une correction «infini». Il faudra
la fin des années 1980 pour que ces lentilles soient standards dans tous les microscopes.
- Aujourd’hui, en plus de l'exposition normale (à fond clair) on utilise aussi de nouvelles
méthodes et techniques de contraste, fond sombre, fluorescence, contraste de phase,
contraste interférentiel différentiel (ou DIC) et bien sûr aussi la microscopie par imagerie en
temps réel.

4.8.2 Microscopie optique

- Absorption: Lorsque la lumière passe au travers d’une lentille ou d’un filtre, l’absorption dépendra
de la couleur absorbée par la lentille ou le filtre, l'intensité de la lumière peut être réduite.
- Réfraction: Phénomène par lequel les rayons lumineux changent de direction lorsqu’il passe d'un
milieu à un autre
- Diffraction : déviation due au passage de l’onde lumineuse au travers d’une fente présente dans
un obstacle impénétrable.
- Dispersion de la couleur: décomposition de la lumière en différentes vagues de couleurs dont il
est construit.

315
4.8.3 Le microscope

4.8.3.1 Chemin optique

Microscopes sont constitués de composants mécaniques et optiques.

Parties mécaniques:
- Table d’objectif avec pinces sur laquelle on présente les
préparations à observer
- Bouton de mise au point fine et grossière.
- Tourelle sur laquelle sont placés les lentilles de l’objectif.
- Lampe ou une autre source de lumière qui peut briller au
travers de la subtance à regarder.

Composantes optiques:
- Plateau tournant pour les filtres.
- Zone du diaphragme.
- Condenseur avec diaphragme à iris propre.
- Les lentilles de l’objectif (qui sont sur la tourelle).
- Oculaires pour observer.

4.8.3.2 Diascope (vertical et inversé) – épiscope

Dans un Diascope, la lumière est projetée à travers la préparation. En général,


la lumière vient d’en-dessous du condenseur et se concentre sur la
préparation et la préparation est visualisée en vue du dessus (verticalement).
Pour certaines applications spécifiques, telles que l'utilisation de boîtes de
Petri la lumière est projetée au-dessus de la préparation et la préparation est
vu de dessous («microscopes inversés).

Pour les substances qui ne laissent pas passer la lumière, on peut utiliser un épiscope (similaire à un
stéréo-microscope). L’épiscope nous montre l’image de la lumière réfléchie par la préparation.
La source lumineuse est alors située sur le côté des lentilles d'objectif.

4.8.3.3 Le microscope conventionnel

Le microscope conventionnel est fabriqué selon des caractéristiques standards internationales

- La distance focale de la lentille de l’objectif est de 45 mm, celle-ci ne devra pas se re concentrer
lors de la modification du grossissement (lentilles parafocales).
- La distance entre la tourelle et la fin de la lentille de l'oculaire est de 160 mm.

Les lentilles de l'objectif avec une correction infinie, les ondes lumineuses devront toujours être
projetée en parallèle. Par conséquence, la longueur entre la tourelle et la fin des lentilles d'oculaire
peut varier. D’autres accessoires peuvent être placés entre pour les aberrations sphériques.

316
4.8.3.4 Parties du microscope

4.8.3.4.1 Oculaires

Le champ visuel d'un oculaire est indiqué par le Numéro de Champ (FN). Ce nombre correspond au
nombre de mm que vous voyez à un grossissement de 1x.
Le grossissement est le nombre de fois que l'objet est agrandi par la lentille.
Si on divise le Numéro de champ par le grossissement, on calcule la dimension du champ visuel qui
est observé.
Il y a aussi des ajustements pour les personnes qui portent des lunettes et il ya toujours un des deux
oculaires avec un ajustement appart. Il s'agit de compenser la différence entre les deux yeux de
chaque personne.
Il est également possible d'ajouter un abaque ou micromètre à un oculaire, de façon à pouvoir
mesurer les distances.

4.8.3.4.2 Objectif

Le choix d’un objectif dépend de l’objet que l’on souhaite examiner. Il y a différentes sorte de lentilles
selon le type d’aberration que l’on peut avoir durant la recherche. Il est possible qu’une aberration ait
un grand impact lors d’une étude tandis que d’autres ne nécessitent pas d’être notées.

Les données suivantes sont trouvées sur chaque objectif.


- Correction pour l’obtention d’une image plan (PLAN PL) (contre courbure de champ)
- Le grossissement
- L’ouverture numérique (NA)
- Qualité colorimétrique de la lentille (achromatique, fluorite FL ou apochromatique APO)
- La longueur focale (160mm ou infinie)
- L’utilisation liquide d’immersion et la distance de celui-ci
- L’épaisseur des lamelles

C’est lentilles sont para focale (l’ouverture entre la lentille et l’objectif est toujours de 45mm, donc on
ne doit pas être ajusté lorsqu’on utilise un autre objectif) et para centrique (L’objet sur lequel on est
cadré reste dans le champ lorsqu’on prend un autre objectif)

Qualité de l’objectif- actions correctives


Les lentilles achromatiques corrigent les écarts dans le rouge et dans le bleu plan mais pas
dans le jaune.
Les lentilles fluorites corrigent le jaune à raison de 80%
Les lentilles apochromatiques corrigent le rouge, le bleu comme le jaune à raison de 100%.
Celles-ci sont nettement plus chères que les précédentes.

Liquides d’immersion – indice de réfraction


Les liquides d’immersion sont mis de sorte qu’il y ait plus de lumière qui passe à travers
l’échantillon parce que la différence entre l’indice de réfraction des différents médias peu
diminuer et même chuter. L’indice de réfraction n de l’air est de 1, pour l’eau il est de 1,33.
Pour l’huile d’immersion et le verre, il est de 1,52 c’est pourquoi le choix de l’utilisateur se
porte sur l’huile d’immersion.

317
L’ouverture numérique (N.A) et la résolution
L’ouverture numérique est la quantité de lumière qui peu être perçue
Elle est décrite par l’équation suivante NA = n.sin(a) (a = l’angle sous lequel la lumière nous
parvient). Pour les objectif qui n’emploie pas de liquide d’immersion, le NA est inférieur à 1.

La résolution peut être définie comme la capacité pour deux points d’être distingués l’un de
l’autre, bien qu’il soit près l’un de l’autre.
Plus haute est la résolution, plus on peut distinguer les détails
La résolution dépend de l’ouverture numérique.
Plus élevée est le N.A., plus petite peut être la distance entre 2 points, et donc la résolution
élevée,

Profondeur de champs (Depth of Focus, D.O.F.)


La profondeur de champs détermine à quelle hauteur vous pouvez capturer une image nette.
Cette profondeur de champs dépend également de l’ouverture numérique mais de manière
inversement proportionnelle. Plus élevé est le N.A. plus faible est la valeur pour D.O.F.

UIS (Universal Infinity System)


Chez ces lentilles est fournie une seconde lentille qui produit faisceau lumineux parallèle à la
lentille de l’objectif. Le faisceau est à nouveau mis au point dans l’oculaire ou en avant.
L'avantage de cette correction est que l’on peut ajouter des pièces optiques sans perte de
qualité d'image.

Clarté et grossissement
La luminosité diminue lorsque le grossissement diminue et augmente à mesure que le NA
augmente.

318
En bref : l'utilisation d'un faible grossissement et d’une ouverture numérique élevée assure
une bonne luminosité.

Couvercle de verre et distance de travail (W.D.)


Les objectifs peuvent être corrigés par l’utilisation d‘un petit couvercle de verre d’une
épaisseur de 0,17 mm. Se trouve alors indiqué ‘-‘ sur la lentille, alors on n’utilise pas de
lamelle. L’indication ‘0’ signifie qu’on ne doit pas utiliser de couvercle de verre.
La distance de travail est la distance entre l’objectif et l’objet.

Vis de partage
Selon le fournisseur il y a des différences entre l’orifice de la partie avec laquelle on augmente
la lentille.

4.8.3.4.3 Condenseur

Le condenseur à différentes applications. Il doit diriger la lumière sur la préparation et peut remplir de
lumière la totalité de l’ouverture.

Exposition: Critique contre Köhler

a) Exposition critique (Figure 4.8.1)


Le faisceau lumineux provenant de la source de lumière est sans
modification, projetée sur l'échantillon et ensuite sur l'œil. Cette
lumière est la même partout "forte" et même si nos yeux ne
peuvent s'adapter à cela, cela peut causer des maux de tête à long
terme.

Figure 4.8.1 : Exposition critique

b) Exposition Khöler (Figure 4.8.1)


Avec l’exposition de Khöler toute l’image est uniformément éclairée par un faisceau large. De
cette manière 2 images sont formées. L’une est l'image de l'échantillon (en rouge), l'autre est
celle de la lumière (jaune).

319
Pour une exposition uniforme c’est l’exposition de Khöler qui est
recommandée.
En exposition critique est une luminosité inégale qui apparait
sous la forme d’une brume dans l’image.

Pour obtenir une exposition de Khöler on travail comme suit :


1. Ajuster sur la préparation.
2. Fermer le diaphragme du faisceau lumineux.
3. Ajuster la hauteur du condenseur de sorte que le diaphragme
soit accessible.
4. Centrer le condenseur sur l’image.
5. Ouvrir le diaphragme du faisceau lumineux.

Figure 4.8.2 : l’exposition de Khöler

4.8.4 Méthodes de contraste

Le choix de la méthode de contraste est dépend du type de préparation qu’on souhaite observer.

Champs sombre
Cette technique est utilisée pour des compositions pratiquement incolores dans laquelle la
composition est éclairée alors que le fond projeté est sombre.
Cela vient du fait que la partie centrale de la source de lumière est bloquée, et seuls les rayons de
lumière le long du côté de l'objet exposé.

La lumière = onde électromagnétique


La lumière est une onde électromagnétique et a des lors une longueur d’onde.
L’inverse de la longueur d’onde est la fréquence et s’exprime en Hz.

320
Lorsque les ondes lumineuses doivent traverser un milieu autre que l’air, ils sont retardés à une
fréquence plus faible.
La comparaison entre la vitesse de la lumière dans l’air et la vitesse dans un autre milieu est l’indice
de réfraction.
Parce que le verre, l’huile et l’eau font diminuer la vitesse de la lumière, leur indice de réfraction est
supérieur à 1, tandis que dans l’air il est de 1.

Contraste de phase
En contraste de phase, on utilise différentes phase pour
changer l’amplitude de la lumière aux endroits où la hauteur de
l’objet change. Cette méthode peut-être aussi utilisée avec des
préparations incolores.
A cet effet, dans le condenseur est place un anneau de phase
qui permet qu’une partie de la lumière soit déviée et un
deuxième anneau de phase est placé dans l’objectif
Ces deux anneaux doivent être alignés l’un au-dessus de
l’autre pour obtenir un bon contraste.

Le résultat est que les objets sombres ont un bord blanc et un


arrière gris, cela donne une sorte de profondeur.
Cette technique est aussi applicable pour étudier les objets
vivants.

Polarisation
Comme mentionné plus haut, la lumière se compose d’ondes lumineuses émises dans toutes les
directions.
Lorsqu’on utilise d’un polarisateur, seules les ondes émises dans 1 une direction sont encore
transmises.

321
4.8.5 Application pratique

4.8.5.1 Analyse de composants d’origine animale

4.8.5.1.1 Introduction

Les farines animales et les farines de poisson étaient auparavant beaucoup utilisées comme source
de protéines dans l’alimentation animale. Elles sont meilleur marché que les sources végétales de
protéines comme le soja.

Après avoir constaté le lien entre l’utilisation de farine animale, contenant des prions, et la maladie de
la vache folle (Creutzfeld-Jacob) chez l’homme, son utilisation a été fortement réduite.

Poisson

Animaux
Aliments des (agriculture)
Farine animale
(prions)
animaux
(proteïnes) porc
volaille
Animal
terrestre
ruminant

Contamination

Ruminants
(vache,chèvre,mouton...)

Vache
Alimentation SRM
BSE

CJ
CJ Creutzveld Jacob

SRM Specified Risk Material


Principalement cerveau et moelle épinière

Figure 4.8.3: Schéma de transmission de l'ESB à l'homme

En 1994, les protéines de mammifères ont été interdites dans les aliments pour ruminants. En 1997,
les conditions ont été fixées pour la transformation des protéines animales: après broyage, les sous-
produits animaux sont chauffés à la vapeur saturante sans interruption pendant au moins 20 minutes
à une pression (absolue) d’au moins 3 bars jusqu’à une température à cœur de 133 °C.

En 2001, le “feed ban” a été étendu à une interdiction presque totale de nourrir de protéines
transformées de mammifères, d’oiseaux et de poissons, les animaux élevés pour la production
alimentaire. Quelques exceptions sont par exemple faites pour nourrir de farine de poisson les non-

322
ruminants ou pour utiliser des farines animales pour les animaux de compagnie ou pour d’autres
applications
cations comme dans les installations de biogaz ou la transformation en engrais biologique ou en
amendements du sol sous des conditions strictes.

La législation avec l'emploi sur l'interdiction des protéines animales a été décrite dans les règlements
999/2001
001 européens et 1774/2002 (anti-cannibalisme).
(anti cannibalisme). L'interaction entre les deux règlements est
synthétisée dans le tableau ci-dessous.
dessous.

Pour la production de farine animale, on peut uniquement utiliser des matières de catégorie 3 (sous-
(sous
produits animaux qui ne comportent pas de danger grave pour la propagation de maladies
transmissibles à l’homme ou à l’animal, comme les abats d’animaux approuvés pour la consommation
humaine) comme spécifié dans la législation relative aux sous-produits
sous produits animaux. Les catégories
catégori 1 et 2
comprennent les produits qui comportent un danger pour la santé de l’homme et de l’animal, comme
les animaux contaminés à l’ESB, et doivent être détruits par exemple par incinération.

Dans la deuxième feuille de route EST qui a été publiée le 16 Juillet 2010, Il a été présenté des
changements possibles des mesures EST en l'UE pour la période 2010-2015.
2010 2015. La plupart des mesures
prévues dans la première feuille de route pour le court et moyen terme ont été maintenant atteintes et
une tendance positive e a en outre été observée en 2005 (voir la figure 4.8.4). ). L'un des objectifs du
deuxième plan d'action est un nouvel assouplissement de l'interdiction alimentaire de 2001 en raison
du fait que les protéines animales transformées (PAT) peuvent être une source sour importante de
protéines de haute qualité. Actuellement,
Actuellement, l'utilisation de PAT, autres que la farine de poisson sont
interdites aux animaux d'élevage selon le règlement 999/2001. Pour l’assouplissement il est envisagé
de définir un niveau de tolérance pour les PAT dans les aliments à condition que les analyses
quantitatives développées soit suffisamment fiable et de lever l’interdiction des farines animales pour
les non-ruminants.
Dans la première étape vers l’assouplissement de l’interdiction d’aliment est proposer de permettre les
PAT aux non-ruminants
ruminants dans les farines de poissons prises en charge par les états membres de l’UE
lors du vote du 18 juillet 2012 au Standing Committee on the Food Chain and Animal Health. Notons
que la limitation pour les farines de poisson est provisoire mais que la feuille de route permet
explicitement les PAT pour les non-ruminants.
non ruminants. Cet assouplissement n’est possible seulement que

323
quand les méthodes d’analyses validées pour déterminer la provenance des espèces dans les PAT
sont disponibles.

Figure 4.8.4: Evolution du nombre de cas d’ESB en Belgique et en Europe (source: rapport annuel
2009 AFSCA)

4.8.5.1.2 Méthode d’analyse

La méthode d’analyse officielle pour les protéines animales est une méthode microscopique en
combinaison ou non avec la RT-PCR et publiée en annexe VI du le règlement européen 152/2009.

Cette méthode s’applique à la détection de constituants d'origine animale (définis comme produits de
la transformation de carcasses ou parties de mammifères, de volailles ou de poissons) dans les
aliments pour animaux

En fonction de la nature des constituants d'origine animale, de très petites quantités (< 0,1 %) peuvent
être détectées dans les aliments pour animaux.
Les constituants d'origine animale sont identifiés sur la base de caractéristiques typiques, identifiables
au microscope (c'est-à-dire fibres musculaires et autres particules de viande, cartilages, os, corne,
poils, soies, sang, plumes, coquille d'œufs, arêtes de poisson, écailles). L'identification doit porter tant
sur la fraction tamisée que sur le résidu concentré de l'échantillon.
.

324
Un échantillon représentatif est utilisé.

Les aliments pour animaux en granulés peuvent être pré tamisés si les deux fractions sont analysées
en tant qu'échantillons distincts. Deux portions représentatives sont prélevées du matériau broyé,
l'une pour la fraction tamisée (au moins 5 g), l'autre pour le résidu concentré (au moins 5 g). Des
agents de coloration peuvent également être utilisés à des fins d'identification.

Afin d'identifier la nature des protéines animales et de l'origine des particules on peut utiliser des
échantillons de référence.

Identification des constituants d'origine animale dans les fractions tamisées

La ou les fractions tamisées comportant les grosses particules (ou une partie représentative de la ou
des fractions) sont étendues sur un support approprié de façon à former une fine couche et observées
systématiquement au microscope stéréoscopique à différents grossissements pour détecter les
constituants d'origine animale.

Des lames préparées avec la ou les fractions tamisées comportant les particules fines avec une
solution d’NaOH sont observées systématiquement au microscope composé à différents
grossissements pour détecter les constituants d'origine animale Les substances contenant de la
kératine comme les cheveux et les plumes peuvent être révélées par une solution d'acétate de plomb.

Identification des constituants d'origine animale dans le résidu concentré

L'échantillon est transvasé dans une ampoule à décanter. Le tétrachloréthylène est ajouté et le
mélange est agité.

Avec le tetrachloroéthylène a une haute densité (1,62), les particules végétales légères restent en
suspension et les minéraux lourd sédimentent. Le résidu total est séché, séparé et coloré avec du
rouge d’alizarine et ensuite pesé (exactitude de 0,001 g). La pesée ne s'impose que si une évaluation
est requise. Le résidu séché est examiné au microscope stéréoscopique et au microscope composé
pour détecter les constituants osseux. Dans le microscope composé, on utilise le glycérol en tant que
résine.

Afin d'identifier la nature des protéines animales et de l'origine des particules on peut utiliser des
échantillons de référence.

325
4.8.5.1.3 Structures microscopiques

Fibres musculaires

Figure 4.8.5 Fibres musculaires

Les fibres musculaires sont regroupées en fascicules ; ces fibres musculaires sont composées de
myofibrilles. Nous discernons 3 sortes de fibres musculaires : les fibres musculaires lisses, les fibres
musculaires striées et les tissus musculaires cardiaques. Par traitement à haute température et
pression élevée, la structure striée des fibres musculaires n'est plus toujours visible (cf. Figure 4.8.6).

Figure 4.8.6: Fibre musculaire striée

326
Les fibres musculaires sont observables dans la fraction tamisée brute (grosses particules) et sont
reconnaissables comme des bâtonnets cylindriques (voir Figure 4.8.7)

Figure 4.8.7 : fibre musculaire dans la fraction tamisée brute

Dans la fraction tamisée fine, les fibres musculaires sont reconnaissables comme des structures
rectangulaires (cf. Figure 4.8.8).

Figure 4.8.8

327
Fragments d’os et arêtes

Figure 4.8.9

Les os sont organisés en osteons qui contiennent les caneaux de Havers avec les faisceaux
sanguins, les canalicules et les lacunes contenant les ostéocytes. La microscopie permet de faire la
distinction entre les fragments d’os d’animaux terrestres et de poissons.

Figure 4.8.10 : arête Figure 4.8.11 : os d’animal terrestre

Une première base pour la reconnaissance est la forme des fragments. La forme des fragments
d’arêtes est plutôt oblongue,e, tandis que la forme des fragments d’os terrestres plutôt arrondie. Une
autre différence importante est la forme des lacunes. Pour les arêtes, la forme des lacunes est
allongée et ramifiée, pour les os terrestres, les lacunes sont plutôt ovales ou rondes.
rondes

Autres structures

Les autres structures dans le sédiment sont des indications quant à l’identité du matériel
maté animal; il est
possible de distinguer la présence des dents, de coquilles d’oeufs, d’écailles de poissons.

328
Figure 4.8.12 : dent Figure42.8.13 : coquilles ’oeufs

Figure 4.8.14 : écaille

D’autres structures pouvant être observée dans la fraction tamisée sont les cheveux et les plumes.

Figure 4.8.15 : cheveux Figure 4.8.16 : plumes

329
4.8.5.1.4 RT-PCR

La méthode PCR a été validé en 2012 et la mise en œuvre de cette analyse ne peut être faite selon le
selon le protocole validé.

L'extraction d'ADN pour la détection de l'ADN dans l'alimentation des ruminants doit être fait avec le
Wizard® Magnetic DNA Purification System for Food (Promega) sur une portion représentative de 100
mg. En outre, l'analyse est effectuée en double. Pour chaque doublon d’extraction est réalisé deux
extraction contrôle suivant la norme ISO 24276: Une extraction blanche et un contrôle d’extraction
ADN positif.
Chaque extraction ADN est analysée sous au moins deux dilutions pour identifier les éventuelles
inhibitions.
L’amplification de l’ADN est réalisée à l’aide d’amorces et des mélanges réactionnels (master mix) qui
sont validés. En outre un ADN-contrôle positif et un « no template control » sont inclus dans la
plaque.

Figure 4.8.17 : Courbes de RT-PCR: ligne plate pour échantillons négatifs, courbe croissante dans les
échantillons positifs

4.8.5.2 Analyse de pignons de pain

Certaines espèces peuvent donner un arrière-goût amer et métallique qui se produit parfois plusieurs
jours après la consommation et qui peuvent même persister 2 semaines. Les symptômes
disparaissent d'eux-mêmes et semblent causer aucun dommage résiduel. Ce "syndrome dit de noix
de pin" a été rapporté il ya 10 ans. Des recherches sur la cause n’ont rien révélé : les tests n'ont pas
permis de détecter des contaminants ou des résidus qui pourraient être liés à cet arrière-goût étrange.

Depuis 2009, les États membres de l'UE font état d'une augmentation du nombre de plaintes à propos
d'un arrière-goût amer. La cause à enfin été identifiée en 2010. Elle nous conduit en Chine. 2009 a été
une mauvaise année pour les pignons de pin en Chine. Une baisse de l’offre et une forte hausse de la

330
demande sur le marché international, à conduit vers une hausse des prix. Des commerçants
astucieux en quête de profit mélangent des espèces non-comestibles dans les parties destinées à
l’exportation.

Sur base d'échantillons de référence de P. pinea, P. sibirica, P. koraiensis et P. gerardian une


identification final était effectuée basée sur des caractéristiques visuelles. Les caractéristiques qui
contribuent le plus à l'identification en plus de la distinction visuelle sont le nombre de pignons par
100 g et le tamisage avec un tamis d'une ouverture de maille de 4 mm. Si grain passant est détectée
et si le nombre de pin supérieure à 1,200 pour 100 g, cela indique la présence de P. armandii.

En plus de l'identification visuelle, l'identification peut également être faite sur la base du profil d'acide
gras dans lequel le motif d'acide gras est différent pour les différents types de pignons. En outre,
l'identification par PCR est l'une des possibilités.

331
332
4.9 L’ionisation des aliments

4.9.1 Définition et objectifs

L’ionisation ou irradiation (ou encore pasteurisation à froid) des aliments est une technique de
conservation des aliments. L’aliment est soumis à des rayons gamma, X ou faisceaux d’électrons.
Une partie des microorganismes contenus dans l’aliment est ainsi détruite. Le but recherché peut
être :
- Augmentation de la durée de conservation par diminution de la charge microbienne de
l’aliment
- Destruction de germes pathogènes
- Neutralisation de la germination des bulbes, tubercules et graines.

L’avantage de la technique est qu’elle est réalisée à température ambiante (ou même à la température
du frigo) ce qui ne provoque pas de variation au niveau du goût, de la texture, de l’odeur ou de
l’apparence de l’aliment, comme c’est le cas pour un traitement thermique.
C’est également une alternative à la stérilisation par fumigation chimique pour les herbes
condimentaires séchées par exemple.
Des modifications chimiques mineurs surviennent cependant. Certaines de celles-ci sont à la base
des techniques de détection de ce traitement comme expliqué ci-dessous.

4.9.2 Réglementation européenne

Au niveau communautaire, les aliments et ingrédients alimentaires irradiés sont réglementés par les
instruments suivants:

o Directive cadre 1999/2/CE du Parlement européen et du Conseil relative au rapprochement


des législations des États membres sur les denrées et ingrédients alimentaires traités par
ionisation. La directive couvre les aspects généraux et techniques de l'exécution de la
transformation, les modalités d'étiquetage des aliments irradiés et les conditions d'autorisation
de l'irradiation alimentaire.

o La directive de mise en oeuvre 1999/3/CE du Parlement européen et du Conseil établissant


une liste communautaire de denrées et ingrédients alimentaires traités par ionisation. À ce
jour, la liste de produits pouvant être irradiés sur le territoire de l'UE ne contient qu'une seule
catégorie d'aliment, à savoir les « herbes aromatiques séchées, épices et condiments
végétaux ».

La directive cadre précise que:


L'irradiation des denrées alimentaires n'est autorisée que si :

o elle est justifiée et nécessaire d'un point de vue technologique,

o elle ne présente pas de risque pour la santé et est pratiquée conformément aux conditions
proposées,

o elle est bénéfique pour le consommateur,

o elle n'est pas utilisée pour remplacer des mesures d'hygiène et de santé ou de bonnes
pratiques de fabrication ou de culture.

333
o toutes les denrées alimentaires traitées par ionisation ou contenant des ingrédients
alimentaires ionisés doivent être étiquetées.

o un avis favorable du comité scientifique de l'alimentation humaine est requis avant de pouvoir
mettre un aliment spécifique sur la liste européenne des produits pouvant être irradiés.

4.9.3 Réglementation nationale

Les directives européennes ont été transcrites dans l’Arrêté Royal du 12 mars 2002 relatif au
traitement par ionisation des denrées et ingrédients alimentaires et portant modification de l’arrêté
royal du 20 juillet 2001 portant règlement général de la protection de la population, des travailleurs et
de l’environnement contre le danger des rayonnements ionisants.

Cet arrêté précise notamment le type de rayonnement qui peut être utilisé, les produits qui peuvent
être ionisés et les doses auxquelles ils doivent être soumis.
Les exigences d’information du consommateur via l’étiquetage y sont également reprises. En effet, le
traitement par ionisation doit être mentionné sur l’étiquette

La liste des produits pouvant être ionisés est reprise dans le tableau suivant :

Dose d’irradiation
Produit absorbée moyenne
totale maximale
1. Pommes de terre 0,15 kGy
2. Aliments composés pour certains animaux de laboratoire 10 à 30 kGy pour
radicidation
30 à 60 kGy pour
radappertisation
3. Fraises 2 kGy
4. Oignons 0,15 kGy
5. Aulx 0,15 kGy
6. Echalotes 0,15 kGy
7. Paprika 10 kGy
8. Poivre 10 kGy
9. Gomme arabique 3 kGy
10. Epices et aromates 10 kGy
11. Légumes 1 kGy
12. Produits destinés à la préparation d’infusions 0 kGy
13. Crevettes (crustacea natantia) cuites, épluchées, surgelées, n’ayant 3 kGy minimum
pas subi de traitement de décontamination ou de conservation et
préalable par voie chimique ou par irradiation 5 kGy maximum
14. Cuisses de grenouille congelées n’ayant pas subi de traitement de 5 kGy
décontamination ou de conservation préalable par voie chimique ou
par irradiation
15. Viande de volaille désossée mécaniquement et surgelée 5 kGy
16. Blanc d’œuf 3 kGy

334
4.9.4 Les contrôles de l’AFSCA

Les contrôles réalisés visent deux objectifs. Le premier est de vérifier que des produits qui ne sont pas
sur la liste autorisée ne sont effectivement pas ionisés. Le deuxième objectif est de vérifier que pour
les produits se trouvant sur la liste, ceux-ci sont correctement étiquetés. Dans ce deuxième cas, des
produits présents sur la liste, mais dont l’étiquette ne mentionne pas de traitement ionisant sont
prélevés pour vérifier effectivement qu’ils n’ont pas été traités par cette technique.

4.9.5 Technique de détection

Les techniques de détection développées et normalisées sous la responsabilité du CEN (CEN/TC


275/WG 8, ) se basent sur les modifications mineures des aliments ou de leurs contenus au cours du
processus d’ionisation. Suivant le type d’aliments, des techniques différentes sont préférables à
d’autres.

Ces normes européennes ont été adoptées par la Commission du Codex Alimentarius comme
méthodes générales et sont reprises sous la section 6.4 (Vérification post-irradiation) de la 'Norme
Générale Codex pour les Aliments Irradiés'.

4.9.6 La thermoluminescence (MET-LFSAL-033)

La détection est basée sur l’isolation de minéraux silicatés contaminant la nourriture (EN 1788). Ces
minéraux stockent de l’énergie durant le traitement ionisant dans des porteurs de charges piégés
dans des sites structuraux, interstitiels ou d’impuretés. Lors du chauffage des minéraux silicatés, les
porteurs de charges libèrent l’énergie accumulée sous forme de lumière.

Les courbes de luminescence des aliments ionisés présentent un pic entre 150°C et 250°C alors
qu’en présence d’un faible niveau de radioactivité naturelle, le signal apparaît au dessus de 300°C.

Figure 4.9.1 : courbe caractéristique des minéraux extraits d’un aliment ionisé à 1 kGy. Le maximum
de la courbe apparaît entre 150°C et 250°C.

335
Figure 4.9.2 : courbe caractéristique des minéraux extraits d’un aliment non ionisé.. Le maximum de la
courbe apparaît vers 300°C.

L’identification d’aliments ionisés par le biais de l’analyse par thermoluminescence est fondée sur la
valeur du rapport des signaux. Lors d’une programmation de température contrôlée, l’émission conduit
à une courbe (Courbe1). Cette première courbe est comparée à une seconde courbe obtenue par une
seconde mesure de thermoluminescence (courbe2) des minéraux isolés et exposés à une dose
normalisée. La comparaison du rapport des courbes révèle, au départ des minéraux isolés, si
l’échantillon a été ionisé ou non.

Le rapport de l’intégration des courbes de thermoluminescence, à savoir, la courbe 1 sur la courbe 2,


évalué dans un intervalle de température défini, est typiquement supéreur à 0.1 pour les échantillons
ionisés et inférieur à 0.1 pour des échantillons non ionisés. L’absence de signal lors de la première
lecture ne signifie pas que l’échantillon n’a pas subi de traitement ionisant. Seule la seconde lecture
permet de mettre en évidence un éventuel traitement ionisant et d’éviter les faux négatifs.

Figure 4.9.3 : épices non ionisées : courbe caractéristique de luminescence lors de la première lecture
de luminescence L1.

Figure 4.9.4 : épices non ionisées : courbe caractéristique de luminescence lors de la seconde lecture
L2. Ionisation des minéraux à une dose de 1kGy.

336
Figure 4.9.5 : épices ionisées (1kGy) : courbe caractéristique de luminescence lors de la lecture L1.

Figure 4.9.6 : épices ionisées : courbe caractéristique de luminescence lors de la lecture L2. Ionisation
des minéraux à une dose de 1kGy.

337
Flowchart : Détection d’aliments ionisés par thermoluminescence

Bécher de 2 L
Agitateur à hélice

Eau déminéralisée

échantillon
(3) Agiter jusqu’à
regroupement des
minéraux (v = ±
(2) Evacuer l’échantillon 50trs/mn)

(4) Aspirer l’eau jusque


± 1cm du fond
(1) 15 min. bain
ultrasons (5) Transférer quantitativement
dans un bécher de 250ml

(7) Aspirer toute l’eau


(9) Lecture du disque au
(6) Agiter jusqu’à thermoluminomètre
regroupement des (8) Ajouter ± 1ml d’acétone et à
minéraux (v = ± l’aide d’une pipette pasteur
150trs/mn) transférer les minéraux sur un
disque en inox

Minéraux + acétone Thermoluminomètre : Modèle


3500 Manual TLD

338
5 QUALITÉ

5.1 Système de gestion de la qualité

Gestion de la qualité = les activités coordonnées pour diriger et contrôler une organisation du point de
vue de la qualité.

La gestion de la qualité englobe les aspects suivants :

o L’élaboration d’une politique de la qualité (objectifs généraux et but de l’organisation du point


de vue de la qualité, tels qu’annoncés formellement par le management) ;

o L’élaboration des objectifs de qualité (plus concrètement ce qui est visé) ;

o L’établissement du planning de qualité (spécifier quels sont les processus nécessaires) ;


o Le contrôle de la qualité (ciblé sur le respect des exigences de qualité) ;

o L’assurance qualité (avec pour objectif de donner confiance au niveau des exigences fixées) ;

o L’amélioration de la qualité via un cycle PDCA (cycle Plan Do Check Act) composée des
étapes suivantes : planning, réalisation, contrôle et correction. (voir figures ci-dessous)

Le processus de l’amélioration

339
5.1.1 ISO 9001 / ISO 17025

5.1.1.1 La norme 9001

La norme ISO 9001 spécifie des exigences pour les organisations qui :

o doivent démontrer leurs compétences relatives à la fourniture de produits et services qui


répondent aux besoins des clients et aux exigences réglementaires, et

o qui visent une amélioration de la satisfaction du client.

Les exigences sont génériques et s’appliquent au sein des organisations dans n’importe quelle
industrie ou secteur économique.

Caractéristiques essentielles :

o Orientation résultat ;

o Orientation client ;

o Leadership et direction ;

o Management en utilisant des processus et faits ;

o Implication et évolution des collaborateurs ;

o Apprentissage continu, innovation et amélioration ;

o Développement de partenariats ;

o Responsabilité sociale.

Une caractéristique de cette philosophie est une attention identique à l’égard de tous les intéressés :

o Les clients et fournisseurs ;

o Les collaborateurs et managers (l’organisation) ;


o les bailleurs de fonds ;

o La société.

5.1.1.2 ISO 17025 par rapport à ISO 9001

L’ISO 17025 comporte toutes les exigences auxquelles les laboratoires d’analyse et d’étalonnage
doivent satisfaire s’ils souhaitent démontrer :

o Qu’ils disposent d’un système de gestion opérationnel ;


o Qu’ils sont compétents sur le plan technique ;

o Qu’ils peuvent produire des résultats valables techniquement.

340
Certaines clauses ont également été modifiées ou ajoutées dans l’ISO 17025 par rapport à l’ISO
9000. C’est pourquoi il a été fait en sorte de reprendre dans l’ISO 17025 toutes les exigences de
l’ISO 9001 qui sont pertinentes pour le domaine d’action des laboratoires d’analyse et d’étalonnage.
L’ISO 17025 ne constitue pas une application spécifique à un secteur d’ISO 9001.

ISO 17025 met l’accent sur le maintien de l’aptitude technique.

Le fait que le système de gestion de la qualité du laboratoire réponde aux exigences de la norme ISO
9001 ne démontre en soi pas l’aptitude du laboratoire à produire des données et résultats valides d’un
point de vue technique.

Les laboratoires d’analyse et d’étalonnage qui répondent aux exigences de l’ISO 17025 travailleront
conformément à l’ISO 9001 pour les clauses en question qui sont reprises dans les deux normes.

5.1.1.3 ISO 17025 - Clauses

La norme ISO 17025 est basée sur :

o Des exigences en matière de management,

o Des exigences techniques.

Exigences en matière de management :

o Organisation

o Système de management
o Gestion documentaire

o Evaluation des demandes, offres et contrats

o Sous-traitance d’analyses et d’étalonnages


o Achat de biens et de services

o Prestation de service au client

o Plaintes
o Gestion des non-conformités dans les analyses et/ou étalonnages

o Amélioration

o Mesures correctives
o Mesures préventives

o Gestion des enregistrements

o Audits internes
o Revue de direction.

341
Exigences techniques :

o Personnel

o Equipement technique et conditions de travail

o Méthodes d’analyse et d’étalonnage et validation de méthodes


o Equipement

o Réductibilité des mesures

o Echantillonnage
o Traitement des objets à analyser et/ou à étalonner

o Garantie de la qualité des résultats d’analyse et d’étalonnage

o Rapportage des résultats.

5.1.2 Accréditation

5.1.2.1 Qu’est-ce qu’une accréditation ?

Une accréditation est la délivrance d’une attestation, par un tiers, concernant un organisme qui évalue
la conformité de produits ou services. Cette attestation permet à l’organisme de prouver ses
compétences, son indépendance et son impartialité.

Elle concerne :

o Les laboratoires,
o Les organismes d’expertise,

o Les organismes de certification.

L’accréditation renforce la confiance des acteurs économiques et des autorités chargées du contrôle
du marché à l’égard des documents délivrés par les organismes accrédités : rapports de laboratoires
ou d’organismes d’expertise, certificats.

BELAC est l’organisme d’accréditation belge. Il a été institué dans un cadre légal et placé sous la
responsabilité du SPF Economie.

5.1.2.2 Procédure d’accréditation

Un laboratoire qui souhaite se faire accréditer selon l’ISO 17025 doit entreprendre les démarches
suivantes (la chronologie peut différer suivant la situation) :

o Examiner si la possession d’une accréditation est utile ou indispensable et s’assurer de


l’engagement du management.

o Décider quelles activités on souhaite réaliser sous l’accréditation (déterminer le scope).

342
o Veiller à ce que l’on comprenne entièrement la norme en vue d’implémenter, d’adapter ou de
créer correctement des outils de gestion nouveaux ou déjà existants.

o Fournir les collaborateurs, l’infrastructure et les appareils requis.

o Développer un système de gestion documenté.


o Mener une campagne de sensibilisation auprès de tous les membres du personnel.

o Implémenter le système de gestion documenté.

o Assurer la communication.

Après les préparatifs, les étapes suivantes sont suivies dans la procédure d’accréditation :

o Introduction d’une demande auprès de BELAC, p.ex. Pour la réalisation d’un pré-audit.
o Le pré-audit est effectué.

o Traiter les remarques du pré-audit dans le système de gestion.

o Introduire une demande auprès de BELAC pour la réalisation de l’audit initial.


o L’audit initial est effectué.

o Rapportage provisoire par les auditeurs

o Les non-conformités de type A doivent être rectifiées avant que l’accréditation ne puisse être
octroyée, pour les non-conformités de type B un plan d’action adéquat doit être mis en place.

o Après résolution des non-conformités de type A et acceptation du plan d’approche pour les
non-conformités de type B, un rapport définitif est rédigé et un avis positif est transmis au
Bureau d’accréditation pour l’octroi de l’accréditation.

o Le bureau d’accréditation se prononce et l’accréditation est octroyée.

o Le cycle d’accréditation est commencé.

5.1.3 Contrôle de la qualité

L’ISO/IEC 17025 (critère 5.9) exige des laboratoires un contrôle de la qualité afin de surveiller la
validité des tests réalisés. En règle générale, différents niveaux de contrôle sont ici pris en compte.

Le contrôle a lieu par l’exécutant lui-même. La procédure appliquée à cet effet décrit :

o La fréquence du contrôle de qualité ;


o Les critères d’acceptation ;

o Les étapes qui doivent être suivies en cas de dépassement des critères d’acceptation.

Possibilités :

o L’analyse de matériaux de référence certifiés ou non ;

o L’analyse d’un échantillon de contrôle ;

o L’analyse d’un blanc ;

343
o L’analyse d’un échantillon en double ;
o Le contrôle des étalons;

o Le contrôle du matériel de contrôle dopé.

Une distinction est faite entre différents types de contrôles afin de garantir la qualité des résultats
d’analyse ou d’étalonnage. Il existe en fait 3 niveaux de contrôle de la qualité :

re
o Contrôle de 1 ligne : contrôle par le laborantin même ;
e
o Contrôle de 2 ligne : contrôle indépendamment des laborantins, gestion par le laboratoire en
lui-même ;
e
o Contrôle de 3 ligne : ring tests, tests interlaboratoires, etc.

re
5.1.3.1 Contrôle de 1 ligne

5.1.3.1.1 Généralités

re
Contrôle de 1 ligne = contrôle du processus d’analyse.

re
Caractéristiques du contrôle de 1 ligne :

o Régulier avec une fréquence fixe

o Réalisé par le laborantin même

o Contrôle en utilisant des matériaux de référence et/ou des étalons internes

o Reproduction graphique à l’aide de cartes de contrôle

o Critères d’acceptation fixés au préalable pour chaque paramètre et pour chaque système
analytique.

Le matériel de contrôle doit répondre aux points suivants :

o Même matrice que les échantillons de routine ;


o Homogénéité et stabilité suffisante ;

o Valeur de référence située dans les environs des échantillons de routine ;

o Différent de l’étalon utilisé pour l’étalonnage de l’appareil.

5.1.3.1.2 Cartes de contrôle Shewart

Objectif

Le but d’une carte de contrôle est de contrôler la variabilité naturelle du processus analytique et de ce
fait de garder le processus sous contrôle. Cela consiste précisément à découvrir les événements en
dehors du contrôle et même à les anticiper à l’aide de décisions étayées par des statistiques.

344
On se base sur le calcul de la moyenne et de l’écart type (ou étendue), qui est
est suivi en fonction du
temps sur une carte de contrôle Shewart.

Carte X

Les résultats individuels sont comparés avec la valeur de référence du matériel de contrôle ou la
moyenne des analyses du matériel de contrôle.

Carte R

Les résultats sont comparés du point de vue de la reproductibilité du paramètre en question.


En cas de doubles, la carte R sert à évaluer la répétabilité du processus.

Interprétation des résultats individuels

Les limites sont fixées à :

o ± 3 fois l’écart type = limite d’action (Control level (CL) en anglais) : le processus analytique
est hors contrôle

o limite d’action supérieure = UCL

o limite d’action inférieure = LCL


o ± 2 fois l’écart type = limite d’avertissement (Warning level (WL) en anglais) : le laborantin doit
doi
être avertit d’une
une menace potentielle du contrôle de la qualité

o limite d’avertissement supérieure (UWL)


o limite d’avertissement inférieure (LWL)

Exemples de cartes de contrôle :

345
Pour l’identification de changements fortuits ou systématiques, des règles de contrôle sont
appliquées, qui sont déterminées par le laboratoire même.

Ci-dessous, quelques-unes des règles les plus utilisées susceptibles d’indiquer qu’une analyse tombe
hors contrôle :

o 1 résultat individuel en dehors des limites d’action ;

o 3 résultats successifs entre la limite d’action et la limite d’avertissement ;

o analyse de tendance :
• 8 résultats successifs du même côté que la valeur de référence ou de la moyenne (le
8e point est considéré comme “hors contrôle”) ;

• 6 résultats croissants ou décroissants successifs (le 6e point est considéré comme


“hors contrôle”) ;

• 14 résultats successifs alternativement croissants et décroissants ;

• 4 résultats successifs qui sont éloignés de plus d’un écart type de la valeur de
référence ou de la moyenne.

346
Exemples de processus “hors contrôle” :

1 valeur dépasse la limite d'action

85
75
concentration (ppb)

65
55
45
35
25
15
5
1

11

13

15

17

19

21

23

25

27

29
concentratie (ppb) -3s
-2s GEM
+2s +3s

3 valeurs successives situées entre la limite d'avertissement et


la limite d'action

85
75
concentration (ppb)

65
55
45
35
25
15
5
1

11

13

15

17

19

21

23

25

27

29

concentratie (ppb) -3s


-2s GEM
+2s +3s

347
une tendance croissante ou décroissante de 6 points successifs
où le 6e point est considéré comme anormal

85
75
concentration (ppb)

65
55
45
35
25
15
5
1

11

13

15

17

19

21

23

25

27

29
concentratie (ppb) -3s
-2s GEM
+2s +3s

8 valeurs successives supérieures ou inférieures à la moyenne


où le 8e point est considéré comme anormal

85
75
concentration (ppb)

65
55
45
35
25
15
5
1

11

13

15

17

19

21

23

25

27

29

concentratie (ppb) -3s


-2s GEM
+2s +3s

Une carte de contrôle doit être recommencée si un changement radical se produit à la méthode.

Interprétation à long terme

Sur base périodique, les résultats des cartes de contrôle, la moyenne et l’écart type doivent être
évalués (p.ex. après 30 points) et, si nécessaire, les limites de contrôle et la moyenne doivent être
adaptés. Ceci a lieu via un test t pour la moyenne et un test F pour l’écart type.

348
Comparaison de l’écart type de deux cartes shewart (test F)

Pour la comparaison de l’écart type de 2 cartes de contrôle, on utilise le test F :

F = s12 / s 22
s1 et s2 sont respectivement les écarts types des deux dernières cartes de contrôle complète

La valeur F obtenue est comparée avec la valeur F pour un risque de dépassement unilatéral de 5%
pour n1 -1 et n2 -1 degrés de liberté, où n1 et n2 sont le nombre d’observations dans les deux
dernières cartes de contrôle complète. Ces valeurs peuvent par exemple être recherchées dans les
tableaux du livre “Use of Statistics to Develop and Evaluate Analytical Methods” de Grant T.
Wernimont ; Edited by William Spendley.

Si F-calculé > F-tableau pour 5%, les écarts types sont alors significativement différents.

La réalisation des calculs nécessaires pour le test F peut également se faire via un programme,
Statgraphics. On teste ici l’hypothèse nulle (H0), où l’on suppose la similitude des deux écarts types,
par rapport à l’hypothèse alternative (H1), où ceux-ci ne sont pas similaires. Si la valeur P obtenue est
supérieure ou égale à 0,05, on peut alors accepter l’hypothèse nulle.
Comparaison des moyennes de deux cartes shewart (test t)

Pour la comparaison des moyennes de 2 cartes de contrôle, on utilise le test t. Avant de réaliser le test
t, le test F ne peut présenter de différences significatives entre l’écart type des deux cartes :

(n − 1) s + (n − 1) s 2 2

s =
2 1 1 2 2

( n + n − 2) 1 2

o s1 et s2 sont respectivement les écarts types des deux dernières cartes de contrôle complète.

o n1 et n2 sont le nombre d’observations des deux dernières carte de contrôle complète

x −x
t= 2 1

s (1 / n + 1 / n ) 1 2

o x1 et x2 sont les moyennes des deux dernières cartes de contrôle complète


o s = erreur type de l’écart entre les moyennes

La valeur-t obtenue est comparée avec la valeur-t pour 5% de probabilité de dépassement avec (n1 +
n2 - 2 ) degrés de liberté. Ces valeurs peuvent par exemple être recherchées dans les tableaux du
livre “Use of Statistics to Develop and Evaluate Analytical Methods” de Grant T. Wernimont ; Edited by
William Spendley.

Si t-calculé > t-tableau pour 5%, les moyennes sont alors significativement différentes.

349
La réalisation des calculs nécessaires pour le test t peut également se faire via Statgraphics. On teste
ici l’hypothèse nulle (H0), en supposant la similitude des deux moyennes, par rapport à l’hypothèse
alternative (H1), où celles-ci ne sont pas similaires. Si la valeur P obtenue est supérieure ou égale à
0,05, on peut alors accepter l’hypothèse nulle.

e
5.1.3.2 Contrôle de 2 ligne

Le contrôle est effectué de préférence à l’insu du laborantin, un échantillon étant placé anonymement
dans le processus d’analyse.

Ceci est souvent considéré comme un complément du contrôle de troisième ligne.

On utilise souvent du matériel dopé, de sous-échantillons ou de doubles.

e
Les résultats des contrôles de 2 ligne sont acceptés si l’écart reste inférieur à la limite de
reproductibilité ou à la limite de répétabilité, en fonction ou non des conditions dans lesquelles le
contrôle est effectué.

e
5.1.3.3 Contrôle de 3 ligne (ring tests)

5.1.3.3.1 Principe

Les ring tests sont un moyen de démontrer l’aptitude technique et l’opérationnalité du système de
gestion de la qualité.

BELAC part du principe que chaque test ou type de test est contrôlé au moins une fois tous les 3 ans.
En cas de modifications importantes apportées à la méthode, la fréquence de participation doit être
revue.

5.1.3.3.2 Organisateurs de ring tests

L’organisateur de ring tests est un fournisseur de services et la sélection de l’organisateur doit


s’appuyer sur une évaluation de l’adéquation des services proposés avec les besoins. Ce fournisseur
de services doit être évalué conformément aux exigences de la clause 4.6.4 de la norme NBN EN
ISO/IEC 17025.

En général, l’évaluation se rapportera aux éléments suivants :

o La compétence de l’organisateur des essais d’aptitude : celle-ci peut être démontrée par la
détention d’une accréditation qui prend en compte les exigences du Guide ISO/IEC 43.
Cependant, si un labo fait appel à un organisateur non accrédité, la labo doit réaliser et
documenter sa propre évaluation.

o Le type de matériel / matrice doit autant que possible correspondre au matériel et aux
matrices analysés dans le laboratoire.

350
o Les paramètres demandés doivent comprendre autant de paramètres possibles analysés par
le laboratoire.

o La zone de mesure doit correspondre autant que possible à la situation réelle du laboratoire.

o La fréquence doit permettre de répondre aux besoins du laboratoire. La participation à des


ring tests doit constituer un moyen efficace de gestion de la qualtié.

o Le protocole utilisé pour l’analyse statistique des résultats doit être défini clairement.

5.1.3.3.3 Score z

Formule :

score z = (xlab - xref) / s


xlab: résultat moyen du laboratoire
xref: valeur de référence/ valeur de consensus certifiée
s: estimation appropriée de la dispersion, choisie de telle manière qu’elle répond aux
objectifs du ring test et qu’elle est fiable, c’est-à-dire basée sur un nombre suffisant
d’observations.

Deux méthodes sont souvent utilisées pour le calcul de “s” :

o “s” est calculé comme l’écart type pour chaque ring test et pour chaque combinaison “matrice
/analyte”, sur base des résultats des participants après l’élimination des observations
aberrantes ou en utilisant ce que l’on appelle la statistique robuste ;
o Une valeur fixe est attribuée à “s”. Ce choix est le plus utilisé car il permet de comparer les
scores z d’un laboratoire donné pour différents ring tests.

o Il existe différentes possibilités pour déterminer cette valeur :

o Par “acceptation” (sur base arbitraire, selon ce qui est convenu entre l’organisateur et les
participants) ;

o Une dispersion prescrite (en fonction de la précision requise pour une bonne interprétation
des données en fonction de la concentration) ;

o Par comparaison avec une méthode validée. Lorsqu’une méthode de référence doit être
utilisée lors du ring test, on peut utiliser la reproductibilité interlaboratoire de cette méthode ;
o À défaut de ce qui précède, par comparaison avec un modèle général comme la courbe
d’Horwits, qui fournit une reproductibilité typique par niveau de concentration.

Evaluation du score z

o score z ≤ 2 : favorable

o 2 < score z ≤ 3 : résultat douteux

o score z > 3 : défavorable

351
5.1.3.3.4 Score zeta

Afin d’évaluer la consistance de l’incertitude de mesure avec les résultats du ring test, donc afin de
vérifier si l’incertitude de mesure calculée est réaliste, on utilise des scores zeta.

Formule:

zeta = (xlab - xref) / [√ (uref ² + ulab ²)]


uref: incertitude de mesure type de la valeur de référence
ulab: incertitude de mesure type du laboratoire
xlab: résultat moyen du laboratoire
xref: valeur de référence / valeur de consensus certifiée

Evaluation du score zeta

o |zeta| ≤ 2 : favorable
o 2 < |zeta| ≤ 3 : résultat douteux

o |zeta| > 3 : défavorable

5.1.4 Validation des méthodes

5.1.4.1 Sujet et champ d’application

Cette procédure de validation mentionne les directives générales relatives à l’application maîtrisée de
méthodes d’analyse normalisées et à la validation de méthodes d’analyses développées
personnellement qui sont utilisées dans la recherche routinière et la recherche scientifique.

o Pour les méthodes d’analyse développées personnellement, des plans de validation sont
élaborés avec une description des paramètres de validation qui doivent être analysés dans le
cadre des normes nationales et internationales en vigueur, en fonction des exigences du client
ou en fonction de l’objectif prévu.

o Pour les méthodes d’analyse normalisées, une procédure est mise au point afin que les
opérateurs puissent démontrer qu’ils savent appliquer et maîtriser la méthode d’analyse.

5.1.4.2 Définitions et abréviations de plusieurs concepts

Il est important de mentionner qu’il n’existe pas de consensus pour la définition des paramètres de
validation utilisés pendant la validation. On peut se baser sur les documents suivants : ISO 5725 (1 –
6), ISO 17025, ISO 3534-1, Décision européenne 2002/657/CE (SANCO), pharmacopée,
AOAC/IUPAC, ….

352
Terme / Abréviation Définition
Méthode qualitative Méthode d’analyse permettant d’identifier une substance sur la
base de ses propriétés chimiques, biologiques ou physiques.
Méthode quantitative Méthode d’analyse permettant de déterminer la quantité ou la
fraction pondérale d’une substance de manière à pouvoir
l’exprimer sous forme de valeur numérique dans les unités
appropriées.
Méthode de dépistage Méthode servant à détecter la présence d’une substance ou d’une
classe de substances au niveau de concentration considéré. Si un
résultat non conforme présumé est obtenu avec cette méthode, le
résultat doit alors être confirmé par une méthode de confirmation.
Méthode de confirmation Méthode qui fournit des informations complètes ou
complémentaires qui doivent permettre l’identification univoque de
la substance et, le cas échéant, la quantification de la substance
au niveau de concentration considéré.
Scope flexible La possibilité d’ajouter une nouvelle propriété au scope (par ex.
nouvel analyte et/ou nouvelle matrice) moyennant une validation
adaptée et sans qu’un audit externe ne soit effectué.
Validation Ensemble des activités nécessaires pour démontrer que la
méthode d’analyse décrite est fiable et fournit des résultats exacts
qui satisfont à l’objectif prévu.
Justesse (EN :Trueness) Le degré de concordance entre la valeur moyenne obtenue dans
une série de valeurs de mesure et la valeur réelle (ISO 3534-1).
Ce paramètre est d’application si un matériau de référence certifié
(CRM) peut être utilisé.
La mesure généralement utilisée pour la justesse est le biais, qui
correspond donc à l’erreur systématique positive ou négative.
Rendement (EN :Recovery) Le pourcentage de la concentration réelle d’une substance qui est
retrouvé dans l’analyse.
Ce paramètre est d’application si aucun CRM n’est disponible.
Répétabilité (EN: Une mesure pour la dispersion entre les résultats de mesure
Repeatability) obtenus en effectuant une analyse du même échantillon à
plusieurs reprises avec la même méthode, par le même laborantin,
avec les mêmes appareils de mesure et à des moments les plus
proches possible (ISO 3534-1).
La mesure généralement utilisée est l’écart type de répétabilité Sr
ou l’écart type relatif en conditions de répétabilité ou le coefficient
de variation de répétabilité (CVr).
Reproductibilité Une mesure pour la dispersion entre les résultats de mesures
intralaboratoire obtenus par le même laboratoire, avec la même méthode,sur des
(EN : Intra-reproducibility) matériaux identiques dans des conditions différentes, c’est-à-dire
dans différents endroits du laboratoire, par différents laborantins,
avec différents appareils et lots de réactifs/étalons, à différents
moments les plus espacés dans le temps (ISO 3534-1).
La mesure généralement utilisée est l’écart type de reproductibilité
intralaboratoire (sL) ou le coefficient de variation de reproductibilité
intralaboratoire (CVL).

353
Terme / Abréviation Définition
Reproductibilité Une mesure pour la dispersion entre les résultats de mesures
interlaboratoires obtenus dans différents laboratoires (ringtests), avec la même
(EN : Inter-reproducibility) méthode, sur des matériaux identiques dans différentes conditions,
c’est-à-dire par différents laborantins, avec différents appareils et
lots réactifs/étalons, à différents moments les plus espacés dans le
temps (ISO 3534-1).
La mesure généralement utilisée est l’écart type de reproductibilité
interlaboratoires sR ou le coefficient de variation de reproductibilité
interlaboratoires (CVR).
Limite de détection La plus faible concentration mesurée d’un composant qui peut être
(EN : Limit of detection ou détectée dans l’échantillon d’analyse, avec une certaine probabilité
LOD) statistique, à l’aide de la méthode d’analyse. Il s’agit d’un critère
qualitatif qui résulte en un rapport signal/bruit de 3.
Limite de quantification La plus faible concentration mesurée d’un composant qui peut être
(EN : Limit of quantification quantifiée dans l’échantillon d’analyse, avec une certaine précision
ou LOQ) et justesse, à l’aide de la méthode d’analyse. Il s’agit d’un critère
quantitatif qui résulte en un rapport signal/bruit de 6.
Linéarité La linéarité d’une méthode d’analyse peut être définie comme la
(EN : Linearity) possibilité d’obtenir, au sein d’une série donnée de résultats de
mesure, ceux qui sont directement proportionnels à la
concentration (quantité) du composant à mesurer dans
l’échantillon à analyser.
Les paramètres de régression qui sont déterminés par la
régression linéaire sont le coefficient angulaire (pente) et l’intercept
ou point d’intersection de la droite avec l’axe des y.
Des intervalles de fiabilité ou de confiance des deux paramètres de
régression peuvent être calculés, ainsi que de l’ensemble de la
ligne de régression et des valeurs de x ou y, déduits de la ligne de
régression.
Avant d’effectuer une analyse de régression, il faut examiner au
préalable si la ligne d’étalonnage est une droite. Lorsqu’une non-
linéarité se produit, cela peut être dû à un problème à l’un des
niveaux de concentration extrêmes de la gamme, et cette
validation est alors effectuée sur une gamme de concentration plus
petite.
Zone de travail L’intervalle entre la plus petite et la plus grande quantité
(EN : Range, Measuring (concentration) du composant à déterminer pour lequel la méthode
range, Working range) d’analyse a été validée, en d’autres termes au sein duquel les
caractéristiques de performance satisfont à des exigences
définies.
Sélectivité Une méthode d’analyse est sélective si elle est capable, avec une
(EN : selectivity) probabilité et une erreur de mesure définie, de discerner le
composant à déterminer des autres composants.
La mesure avec laquelle une méthode peut distinguer des autres
éléments le composant à déterminer dans un mélange ou une
matrice. Les contributions potentielles concernent tant les
interférences que les matrices.

354
Terme / Abréviation Définition
Spécificité Une méthode d’analyse est spécifique si elle ne mesure que la
(EN : Specificity) caractéristique (par ex. composant) que l’on souhaite mesurer.
Robustesse L’insensibilité d’une méthode aux petites variations qui sont
(EN : Ruggedness, apportées aux conditions d’expérience de la procédure analytique.
Robustness)
Incertitude de mesure L’incertitude de mesure (U) est définie comme la demi-longueur
(EN : Expanded uncertainty) d’un intervalle dans laquelle est attendue la valeur vraie, et ce avec
un certain niveau de fiabilité. (U = [b] + 2 CVtot).

5.1.4.3 But de la validation

Lors de la validation d’une méthode d’analyse, on se fixe comme objectif d’obtenir des informations
sur le champ d’application de la méthode et sur l’incertitude de mesure des résultats d’analyse, de
manière à pouvoir déterminer si la méthode répond à l’objectif analytique prévu. Dans ce cadre, le
responsable d’analyse et les laborantins doivent essayer d’apporter une réponse aux questions
suivantes :

o La méthode d’analyse est-elle adéquate ? (adaptée au champ d’application défini et à la


caractéristique à mesurer)
o La méthode d’analyse est-elle robuste ? (dans quelle mesure le temps, le laborantin, le type
d’appareil, les conditions d’environnement, les variables de la méthode, etc, ont une influence
sur le résultat d’analyse ?)

o Quelle est l’incertitude de mesure de la méthode d’analyse ?

5.1.4.4 Types de méthodes

On distingue 4 catégories de méthodes :

o La méthode qualitative ;

o La méthode quantitative ;

o La méthode de dépistage ;

o La méthode de confirmation.

Parmi les méthodes mentionnées, une distinction doit encore être faite entre :

o Les nouvelles méthodes ;

o Les méthodes normalisées, validées ou équivalent (méthodes de référence ou standard) ;

o Les méthodes modifiées ;

o Scope flexible.

355
5.1.4.4.1 Nouvelle méthode

Méthode qui a été développée par le laboratoire lui-même et dont les paramètres de validation n’ont
pas été définis auparavant. Dans ce cas, l’exécutant doit élaborer un plan de validation en
mentionnant les paramètres de validation qui seront étudiés conformément aux critères des normes
nationales et internationales en vigueur (par ex. Décision 2002/657/CE portant modalités d’application
de la Directive 96/23/CE), aux exigences du client ou à l’objectif analytique prévu.

Pour les méthodes qualitatives, il est recommandé, sans restriction toutefois, d’analyser les
paramètres de validation suivants :

o Sélectivité / spécificité ;

o Justesse / récupération ;
o Limite de quantification.

Pour les méthodes quantitatives, il est recommandé, sans restriction toutefois, d’analyser les
paramètres de validation suivants :

o Justesse / récupération ;

o Zone de travail ;
o Précision (répétabilité et reproductibilité intralaboratoire) ;

o Sélectivité ;

o Robustesse ;
o Limite de quantification ;

o Linéarité.

5.1.4.4.2 Méthode normalisée, validée ou équivalent (Méthodes de référence ou standard)

Méthode qui a été approuvée par une organisation agréée nationale ou internationale (ISO, CEN,
AFNOR, etc.) et/ou dont les paramètres de validation sont connus entièrement ou en partie pour le
champ d’application décrit. L’exécutant doit démontrer qu’il peut obtenir les spécifications décrites
dans la norme (par ex.: critères de répétabilité). Pour une méthode quantitative, la justesse ou la
récupération, la répétabilité et la reproductibilité intralaboratoire doivent dans tous les cas être
déterminées.

Pour une méthode normalisée, validée ou équivalent (p.ex. kits commerciaux), il suffit généralement
de démontrer que l’on maîtrise la méthode d’analyse. Par conséquent, l’analyse de validation se
limitera généralement à la détermination de :

o La justesse / récupération ;

o La répétabilité ;
o La reproductibilité intralaboratoires.

356
5.1.4.4.3 Méthode modifiée

Méthode normalisée, validée, à laquelle des modifications ont été apportées en raison des
circonstances. Le laboratoire doit pouvoir démontrer que les modifications apportées n’ont pas
d’influence sur les spécifications décrites dans la méthode normalisée. Pour les méthodes
quantitatives, il faut déterminer :

o La justesse / récupération ;
o La répétabilité ;

o La reproductibilité intralaboratoire.

5.1.4.4.4 Scope flexible

Analyses portant exécution de la directive 96/23/CE conformément à la décision 2002/657/CE : après


l’obtention du scope flexible, un nouvel analyte et/ou une nouvelle matrice peut être ajouté à la liste
sans qu’un audit soit effectué, moyennant une validation complète ou secondaire. Une liste est tenue
au laboratoire reprenant les analytes, le niveau et les matrices individuelles sur lesquels la validation
(secondaire) a été effectuée, avec mention de la date de cette validation.

Lorsque, par exemple, la méthode peut être appliquée inchangée ou moyennant de petites
adaptations (mineures) (par ex. méthode de purification légèrement modifiée) à une nouvelle matrice
ou nouvelle sous-matrice, on peut passer sous scope flexible à cette sous-matrice moyennant une
validation secondaire.

En cas d’adaptations importantes (majeures), une validation complète doit être effectuée.
L’élargissement du scope ne peut être réalisé que lorsque les critères spécifiques sont respectés.

5.1.4.5 Choix des échantillons

La règle générale d’application est que les échantillons doivent être les plus représentatifs possible du
champ d’application (ou du domaine). Dans un ensemble d’échantillons, les matrices les plus
courantes doivent donc être représentées.

La reproductibilité, la répétabilité, la sélectivité et la robustesse sont en principe déterminés sur des


échantillons naturellement contaminés ou des échantillons qui s’en rapprochent le plus possible. Pour
l’évaluation de la linéarité, on utilise la même matrice que pour l’étalonnage.

Pour la validation de la justesse (ou du rendement ; voir définitions), on utilise, en ordre de


prédilection, mais toujours en gardant à l’esprit la similitude avec les échantillons naturellement
contaminés :

o Des matériaux de référence certifiés ;

o Un échantillon d’analyse circulaire avec une valeur consensus ;

o Des échantillons naturellement contaminés supplémentaires ;


o Des matériaux de référence non certifiés avec une valeur indépendante du système à valider.

357
5.1.4.6 Plan de validation

5.1.4.6.1 Plan échelonné

Effectuez successivement les étapes suivantes :

o Déterminez, sur base de l’objectif et du statut de la méthode d’analyse (normalisée, dérivée


de la méthode normalisée, développée personnellement), quels sont les paramètres de
validation qui doivent être déterminés.

o Déterminez le champ d’application (matrices et zone de travail) pour lequel la méthode


d’analyse doit être validée, en ce compris les groupes principaux et leurs groupes
secondaires.

o Vérifiez si des conditions externes sont d’application pour certains paramètres de validation.
o Déterminez quels échantillons sont nécessaires pour l’examen de validation.

o Exécutez l’examen de validation.

o Évaluez le résultat des mesures en fonction d’exigences externes éventuelles ou directement


par rapport à l’objectif d’utilisation.

o Rapportez les résultats dans le rapport de validation.

5.1.4.6.2 Examen de validation

Afin de pouvoir reconstituer l’examen de validation, il faut disposer des informations suivantes :

o Qui est responsable du processus de validation ?

o Qui effectue le processus de validation ?

o Quand le processus de validation est-il effectué ?

o Quels paramètres de validation sont examinés ?

o Quels moyens (appareils, matériaux, substances de référence, etc.) sont utilisés ?

o Comment sont enregistrées les données de validation ?

o Comment les données de validation sont-elles traitées d’un point de vue statistique ? (par ex.:
quelle est la méthode utilisée, combien de mesurages sont effectués pour évaluer
statistiquement les paramètres de validation, etc.)

o Comment les données sont-elles interprétées (par ex.: détermination de critères et


d’incertitudes de mesure) ?
o Qui approuve la méthode ?

358
5.1.4.7 Rapport de validation

Le rapport de validation peut être un document distinct, un dossier de validation ou une partie d’une
procédure d’analyse. Le rapport doit comporter au minimum les éléments suivants :

o L’identification (par ex.: titre, code) du processus de validation ;

o Le nom du laboratoire (section) ;

o Le nom du responsable du projet de validation ;


o Le nom de la (des) personne(s) qui a (ont) exécuté la validation ;

o Le titre de la méthode d’analyse ;

o L’objectif et le champ d’application de la méthode d’analyse validée ;


o Une description détaillée de la méthode d’analyse ;

o La période à laquelle la validation a été effectuée ;

o Toutes les données brutes ;


o Les conclusions, y compris les spécifications des divers paramètres de validation.

Tous les documents qui se rapportent à la validation d’une méthode (processus de validation,
données brutes, rapport, correspondance) doivent être conservés afin de pouvoir effectuer une
reconstitution totale de la validation.

Tous les documents relatifs à la validation effectuée doivent être archivés dans le laboratoire tant que
la méthode est appliquée.

5.1.5 Incertitude de mesure pour les analyses chimiques quantitatives

5.1.5.1 Définitions et abréviations

Abréviation Définition
b et %b biais / biais relatif
Cdopé la valeur avec laquelle un échantillon d’analyse est dopé (spiked)
Ccons la valeur de consensus lors d’un ring test
Cref la valeur de référence
CRM matériau de référence certifié (certified reference material)
%d différence relative des doubles
k facteur de couverture pour passer de l’incertitude de mesure relative
%u à l’incertitude de mesure relative élargie %U
%MSbias le carré moyen relatif (Mean Square) du biais
R la reproductibilité (= 2,8 sR)
%Rmoy l’étendue moyenne relative (pour les doubles : la moyenne des
différences relatives des doubles %d entre deux valeurs liées)
RSD l’écart type relatif, calculé comme RSD = 100 * s/X avec s pour l’écart
type et X pour la valeur de mesure. RSD est exprimé en %.
RSDbias l’écart type relatif du biais

359
Abréviation Définition
RSDCC l’écart type relatif déduit d’une carte de contrôle
s l’écart type
sCRM et RSDCRM l’écart type (relatif) déduit de la carte de contrôle d’un CRM
sr et RSDr l’écart type (relatif) dans des conditions de répétabilité
sR et RSDR l’écart type (relatif) dans des conditions de reproductibilité
ubias et %ubias l’incertitude de mesure (relative) liée au biais
uc l’incertitude de mesure combinée
uRw et %uRw l’incertitude de mesure (relative) liée à la reproductibilité
intralaboratoire
uCref et %uCref l’incertitude de mesure (relative) liée à la valeur de référence d’un
CRM
%u l’incertitude de mesure relative, %u = 100 * u/X avec X pour la valeur
de mesure. %u est exprimé en %.
%udopé l’incertitude de mesure relative liée à la valeur dopée (spike) lors
d’une expérience de recouvrement
%uCref, dopé l’incertitude de mesure relative liée à la solution étalon utilisée lors
d’une expérience de recouvrement
%uCons l’incertitude de mesure relative de la valeur consensus lors d’une
analyse interlaboratoire
%uref l’incertitude de mesure relative de toutes les valeurs consensus lors
de plusieurs études interlaboratoires
%up le biais relatif du volume de pipette tel qu’utilisé lors d’une expérience
de recouvrement
%uv l’incertitude de mesure relative du pipetage lors d’une expérience de
recouvrement
U et %U l’incertitude de mesure élargie (relative)

5.1.5.2 Généralités

Lors du calcul de l’incertitude de mesure pour un résultat d’analyse, on peut en principe appliquer
deux approches : l’approche ‘Bottom-up’, où toutes les sources possibles de variation sur le résultat
sont répertoriées séparément et où est déterminée la contribution de chaque source à l’incertitude de
mesure, et l’approche ‘Top-down’, où l’on part d’une évaluation statistique de résultats d’analyse qui
ont suivi l’ensemble du parcours d’analyse.

En raison de la difficulté de déterminer toutes les sources possibles de variation avec l’approche
‘Bottom-up’ d’une analyse chimique, on a opté dans ce document pour une approche ‘Top-down’.

L’incertitude de mesure élargie U est définie comme 2 fois l’incertitude de mesure combinée uc.
L’hypothèse ici est que l’incertitude de mesure combinée possède suffisamment de degrés de liberté
(= déduit d’un nombre suffisant de valeurs de mesure), de telle sorte que, lors de la détermination de
l’intervalle de 95%, la valeur arrondie de 2,0 de la distribution t puisse être utilisée.

Les calculs sont effectués avec un nombre suffisant de chiffres significatifs ; on arrondit seulement à la
fin du calcul de l’incertitude de mesure élargie U.

360
5.1.5.3 Approche top-down via la justesse et la reproductibilité

Lors du calcul de l’incertitude de mesure élargie U, différentes approches peuvent être appliquées en
fonction des données disponibles. Les trois approches principales sont les suivantes :

o Partir des données obtenues lors de la validation originale de la méthode normalisée


appliquée,

o Partir de données obtenues via la participation à des études interlaboratoires,


o Partir de données obtenues dans son propre laboratoire lors de l’exécution routinière de la
méthode.

La première approche a pour avantage que l’incertitude de mesure élargie U peut être déduite des
résultats de l’analyse interlaboratoire avec laquelle la méthode normalisée a été initialement validée.
Elle vaut alors U = 2sR, où sR représente l’écart type de la reproductibilité. La part de dispersion entre
laboratoires est de cette manière déjà comprise dans sR. Les inconvénients de cette approche sont
les suivants : elle n’est valable que si la méthode est effectuée de manière exacte telle que décrite
dans la norme, on doit pouvoir démontrer que son propre biais est négligeable et, lors d’analyses de
routine, les données des cartes de contrôle doivent toujours se situer dans les valeurs pour la
répétabilité r (dispersion des déterminations des duplos) et la reproductibilité R (dispersion sur plus
long terme).
Un autre inconvénient est que l’incertitude de mesure propre peut être plus faible que celle déduite de
l’analyse interlaboratoire pour la validation et que l’on surestime donc sa propre incertitude de mesure.
Et, bien évidemment, cela ne peut être appliqué que lorsque les données d’une analyse
interlaboratoire sont disponibles.

La deuxième approche – l’incertitude de mesure élargie U tirée d’analyses interlaboratoires


auxquelles on a participé – a également pour avantage que la dispersion entre laboratoires est déjà
comprise dans l’incertitude de mesure. U est alors calculé d’une manière analogue U = 2sR, où sR
représente l’écart type de la reproductibilité lors des analyses interlaboratoires. Une condition pour
pouvoir appliquer cette approche est que son propre laboratoire ait obtenu de bons résultats lors de
ces analyses interlaboratoires. Ici aussi, l’inconvénient est que l’incertitude de mesure propre peut être
inférieure à celle déduite des analyses interlaboratoires et que l’on peut donc ainsi surestimer sa
propre incertitude de mesure. Et ici aussi cela ne peut être appliqué que si des analyses
interlaboratoires sont organisées pour la méthode, la matrice et le paramètre concernés.

La troisième approche – l’incertitude de mesure élargie U tirée des données obtenues dans son
propre laboratoire – présente plusieurs avantages par rapport aux approches précédentes : le résultat
se rapporte à la méthode telle que réellement appliquée dans le laboratoire (donc y compris les
modifications par rapport à la norme) et on peut utiliser des résultats obtenus dans le cadre d’analyses
de routine (cartes de contrôle, différences des duplos, etc). Si souhaité, on peut également prendre en
compte les résultats d’analyses interlaboratoires. Enfin, cette approche permet d’avoir un meilleur
aperçu de l’importance relative des différentes sources d’incertitude de mesure.

361
5.1.6 Le scope d’accréditation : méthodologie DG Labo

5.1.6.1 Le scope fixe

Le scope « fixe » inclut des activités décrites claires et sans équivoques dont la conformité aux les
exigences d'accréditation a été formellement établie lors d’un audit. Des modifications et/ou des
extensions aux activités soumises à l’évaluation de la conformité et décrites dans le scope fixe,
exigent toujours une intervention de l'institution de l'accréditation. Seulement après avoir traversé un
processus d’évaluation et l'approbation définitive du projet de modifications et/ou extensions par
l'organisme d'accréditation, le domaine d’application peut être adapté.

Les domaines d’activité couverts par le scope fixe doivent toujours être validés selon le concept de
validation totale.

5.1.6.2 Le scope flexible

Le scope « flexible » couvre un ensemble précis d'activités pour lesquelles l'institution déjà a montré
ses connaissances générales, ses capacités et son expérience pour pouvoir mettre en œuvre de
nouvelles activités. Les laboratoires peuvent ainsi être autorisés à introduire de nouvelles méthodes
ou à modifier des méthodes existantes, dans le cadre du domaine d'application de leur accréditation
et sans devoir obtenir une approbation préalable de BELAC.
L'accréditation par type d'essais vise à permettre au laboratoire de répondre plus rapidement aux
demandes de ses clients, en particulier dans les secteurs d'activités où les demandes sont très
individualisées ou en évolution constante ou pour faire face à des situations d'urgence.

Une application flexible ne permet pas sans l’évaluation de BELAC :

o d’ajouter des activités sous accréditation couvertes par une autre norme d'accréditation;

o d’ajouter des activités sous accréditation reprises sous un autre domaine de compétence;

o d’ajouter ou changer d’autres endroits critiques du scope.

S’il est nécessaire de passer à une nouvelle technique d’analyse, il faut toujours demander une
extension à BELAC car cela ne peut pas être fait par le scope flexible.

Le laboratoire à l’obligation de tenir actualisée une liste des essais spécifiques qu’il réalise sous
accréditation dans le cadre du scope. Cette liste reprend, pour chaque activité, les mêmes
informations que nécessaire pour la description d'un scope fixe et doit être mises à la disposition sur
demande par BELAC et par tout autre intéressés. En tout cas, cette liste doit être transférée à BELAC
avant chaque audit de renouvellement ou de surveillance.
L’enregistrement d’une nouvelle activité dans la liste ne peut être fait si toutes les mesures
nécessaires, qui montrent que l'activité est sous contrôle et qu'il donne des résultats fiables, sont pris
et après approbation formelle par le management.
L’informations sur quelles activités sont couvertes ou ne sont pas couvertes par le domaine
d’'accréditation doit être transparente et précise.

La DG Labos a opté pour n'autoriser dans le cadre du scope flexible que la validation secondaire pour
les domaines d'activité suivants :

362
o Analyses de résidus de pesticides dans les denrées alimentaires et les aliments pour animaux
o Analyses en exécution de la directive 96/23/CE conformément à la Décision 2002/657/CE

Pour tous les autres domaines d'activité, une validation totale est effectuée, y compris dans le cas
d'un scope flexible.

Il faut toutefois aussi tenir compte les exigences spécifiques au domaine.

5.1.6.3 Scope flexible : Catégorie de matrice et Sous-catégorie de matrice

Ci dessous, les principales catégories de matrices et de sous-catégories de matrices associées,


utilisées par les laboratoires AFSCA. La liste n'est pas limitative, et sera étendue si cela s’avère
nécessaire.

Domaine d'activité Catégorie de matrice Sous-catégorie de matrice


Analyse de résidus de pesticides tableau 3.1.1 du document BELAC tableau 3.1.1 du document BELAC
2-104 2-104
Méthodes chimiques (dans et hors tableau 3.1.1 du document BELAC tableau 3.1.1 du document BELAC
Décision 2002/657/CE) 2-105 2-105
OGM
Mycotoxines
Méthodes chimiques (hors Décision Engrais Engrais minéraux
2002/657/CE) Engrais organiques

Phytopharmacie Produits phytopharmaceutiques *


Phytopathologie Végétaux • Boutures de plantes
• Tubercules de plantes
• Plantes complètes

OGM & mycotoxines Denrées alimentaires** Denrées alimentaires d'origine


animale
Denrées alimentaires d'origine
végétale
Migration Matériaux de contact • Composant principal :
plastique
• Composant principal :
aluminium
• Composant principal : métaux
• Composant principal :
céramique
* Il s'agit de préparations contenant une ou plusieurs substances actives et qui sont destinées à :
• protéger les végétaux ou produits végétaux contre tout organisme nuisible ou à empêcher l'action
de pareils organismes
• influer sur les processus vitaux des végétaux, pour autant qu'il ne s'agisse pas de substances
nutritives

363
• préserver les produits végétaux, pour autant que ces substances ou produits ne relèvent pas des
dispositions particulières du Conseil ou de la Commission des Communautés européennes en
matière de produits conservateurs
• détruire des parties de végétaux ou inhiber ou empêcher une prolifération indésirable de végétaux
(Directive 91/414/CEE, décret 94-359 du 5 mai 1994)
Dans la pratique, les termes "pesticide", produit phytosanitaire", "produit agro-pharmaceutique" ou
"produit de protection des végétaux" sont également souvent utilisés dans une signification proche
de celle des produits phytopharmaceutiques.

** Les denrées alimentaires sont des produits ou des ingrédients de base qui sont utilisés pour la
consommation humaine.

5.1.6.4 La flexibilité de la matrice et la validation

364
5.1.6.5 La flexibilité du paramètre et la validation

5.1.6.6 La flexibilité du matrice et du paramètre et la validation

Dans ce cas, l'évaluation est faite en tenant compte des exigences énoncées ici-dessus et détermine
la méthode d'évaluation la plus difficile à suivre.

5.1.6.7 Activités dites “dormantes”

Les activités “dormantes” sont des activités qui ne sont plus exécutées pendant une certaine période.
Le maintien d’activités « dormantes » dans le scope d’accréditation est limité à une période de 5 ans
et en cas de respect des conditions suivantes :

ième ième
• Les activités « dormantes » font partie du programme de contrôle 2 et/ou 3 ligne et des
audits internes ;
• Les moyens nécessaires pour l’exécution restent disponibles : appareils, la connaissance et la
compétence du personnel (selon la procédure LAB 00 P 161 le personnel doit faire l’analyse
au moins une fois par ans pour conserver la qualification) ;
• BELAC est informé des activités « dormantes » avant l’audit.

365
5.1.7 Etalonnage

5.1.7.1 Introduction

L'étalonnage est la comparaison des caractéristiques (mesures) d'un dispositif (UUT = Unit Under
Test) avec celles d’une référence ou d’un standard dans des conditions aussi identiques que possible.
La référence est réputée pour donner la valeur «juste» et les caractéristiques (mesures) de l'UUT sont
donc comparées.

De cette comparaison de mesures d’une UUT, deux caractéristiques importantes sont étudiées:
• l'erreur systématique (biais) par rapport à la valeur de référence,
• l’incertitude de mesure (élargie) sur la valeur mesurée.

Ces données doivent permettre à l'utilisateur de l'UUT d'évaluer la pertinence de l’UUT.

Lorsque, après un étalonnage, il apparait que l'appareil ne répond pas aux exigences fixées, un
réajustement peut être réalisé pour assurer la conformité avec les prescriptions attendues. Ce
processus est appelé ajustage; après ajustage un nouvel étalonnage doit être effectuée pour
déterminer les caractéristiques (modifiées) de l'UUT. Notez que l’ajustage ne fait pas partie du
processus d'étalonnage.

5.1.7.2 Principe

L'étalonnage est basé sur le principe de la chaîne ininterrompue de comparaisons («chaîne


ininterrompue de références) : le calibrage de l'UUT se fait par comparaison avec une référence ou un
standard qui a été à son tour étalonné par rapport à une référence (exacte) ou un standard…

Cette chaîne de comparaisons ne peut évidemment pas se poursuivre indéfiniment, le point final est
une constante physique ou une norme internationalement acceptée.

En raison d'un étalonnage à partir de mesures et qu’à chaque mesure indépendante est associée une
imprécision, il en ressort que pour chaque étalonnage, l'incertitude de mesure est déterminée.
Chaque maillon de la chaîne de comparaison est caractérisé par une incertitude de mesure qui est
calculé à partir de l'incertitude de la référence utilisée et des mesures de l’UUT. Etant donné que cette
dernière n'est jamais nulle, cela signifie que l’incertitude de mesure augmente avec chaque étape
dans le circuit d’étalonnage.

Dans ce qui suit, deux techniques d'étalonnage sont décrites plus en détail: l'étalonnage de la
température (thermomètres) et l’étalonnage des volumes (pipettes).

5.1.7.3 Etalonnage de la température

5.1.7.3.1 Chaleur et température

La chaleur est une sensation subjective. Si l'on passe d'un endroit chaud à un endroit plus frais, ce
dernier semble « froid », tandis que si on provient d’un endroit encore plus froid, cet endroit semblera
«chaud». L’impression personnelle de la chaleur et du froid n'est pas une base fiable de comparaison.

366
ième
On recherche donc depuis le 17 siècle, une manière objective de mesurer les différences de
températures entre différents objets. Il est donc recherché une méthode plus objective pour mesurer
des différences de température entre les différents objets; il a été découvert que certaines substances
ont la faculté de changer de propriétés avec la température : en effet, beaucoup de matériaux se
dilatent quand ils sont chauffés et se contractent en refroidissant.

5.1.7.3.2 Thermomètre et échelle de température

A l'origine, chaque chercheur avait sa propre échelle de température et donc seuls les changements
relatifs de l'appareil pouvaient être suivis. En l'absence d’une échelle internationale, les mesures avec
des thermomètres d’échelles de température différentes ne sont pas comparables.

A partir du 18ème siècle, plusieurs propositions ont été formulées afin de définir une échelle de
température qui pourrait être utilisée et ainsi servir de base de comparaison. Les chercheurs les plus
connus sont :
• Anders Celsius, défini deux points fixes que sont la température de congélation de l’eau et la
température d’ébullition de l’eau dans des conditions atmosphériques normales et il divise la
différence en 100 unités. Dans l'échelle Celsius d’origine, le point de congélation est noté 0
°C et le point d’ébullition 100 °C ;
• Daniel Fahrenheit, définis trois points fixes : la chlorure d'ammonium dans la glace fondante
(0 ° F), la fonte de la glace (32 ° F) et la température du corps humain (96 º F); Plus tard,
l'échelle a été redéfinie de telle sorte que l'intervalle entre fusion de la glace - eau bouillante
soit exactement de 180 º F.

La caractéristique de ces systèmes est que les points zéro des différentes échelles sont purement
conventionnels. Il n'y a pas une température "naturelle" zéro. C'est seulement plus tard qu’a été trouvé
un zéro «naturel» (zéro absolu) ; ainsi est défini une nouvelle échelle de température, l'échelle
Kelvin, (le kelvin (K) dans le système international SI).

5.1.7.3.3 Types de thermomètres

Dans la pratique, les thermomètres peuvent être classés dans les groupes suivants

- Thermomètres d'extension, dans lequel une colonne de liquide (mercure, alcool) se dilate
et se contracte en fonction de la température. Il est couramment utilisé quand une grande
précision n’est pas requise.

- Thermomètre au gaz, dans lequel la détente d'un gaz (l'hydrogène) est fonction de la
température. C'est le thermomètre de référence dans la recherche en métrologie, mais il est
difficile à appliquer dans la routine.

- Thermomètre à résistance, dans lequel la résistance électrique d'un élément,


généralement le platine, varie avec la température. Il est couramment utilisé, est robuste et
applicable sur un grand intervalle de températures.

- Thermomètre à thermocouple, dans lequel la différence de température est obtenue à


partir de l'effet thermoélectrique d’un conducteur. Il est couramment utilisé, mais sa mise en
œuvre correcte n’est pas aisée.

367
- Thermomètre à rayonnement (généralement des thermomètres infrarouges), dans lequel la
température est indirectement dérivée de la distribution de Planck du rayonnement d’un
l'objet à une température donnée. C’est pratique, sans contact, mais beaucoup de précaution
à prendre pour une utilisation correcte.

5.1.7.3.4 L'échelle internationale de température (ITS)

L'unité de température dans le système SI est le kelvin K, qui est défini sur la base du point triple de
l'eau (définition : le kelvin est la fraction 1/273,16 de la température thermodynamique du point triple
de l’eau).

Dans la pratique, il est difficile de travailler avec une échelle de température thermodynamique, c’est
pourquoi on a établi une échelle internationale de température (ITS) qui se rapproche le plus
possible de l'échelle de température thermodynamique et bien utile dans la pratique. En raison des
progrès de la métrologie au cours du temps, cette ITS est occasionnellement ajusté. La dernière
version est l’ITS- 90 qui a été adapté en 1990. Dans l'industrie, c’est l’ITS-68 qui est encore souvent
utilisée. .

L'échelle de la température internationale ITS-90 est définie sur la base de trois principes:

o Des points de références. Ce sont des températures qui sont relativement simples à mettre
en œuvre et dont les valeurs dans l'échelle de température théorique sont déterminées avec
une grande précision. Ces repères sont le point de fusion, le point de congélation et le point
triple de substances de haute pureté. Par exemple, dans ITS- 90, le point triple de l'eau a une
température de 273,16 K et le point de solidification de l’étain pur, sous une pression de
1013,25 hPa, est de 505,078 K.

Rappel :
• le point de fusion est la température à laquelle la phase solide et liquide d'une substance
sont en équilibre. Quand on chauffe lentement la phase solide, il y a transition du solide
vers le liquide.
• Le point de congélation/solidification est la température à laquelle la phase solide et
liquide d'une substance sont en équilibre, et si on laisse refroidir progressivement une
phase liquide, on passe d’une transition liquide => solide.
• Le point triple de la substance est la température à laquelle coexistent les trois phases
(solide, liquide et gazeuse).

Dans chacun de ces cas, une modification d’une fraction de composition de phase est
synonyme d’une quantité de chaleur absorbée (fusion) ou relâchée (solidification) permettant
ainsi de garder une température stable. Des mesures très précises montrent une petite
différence entre le point de fusion et le point de congélation (solidification) de quelques
substances.

Voici une liste de points de référence fixés dans l’ITS- 90 en K et ºC (les points de référence
avec des valeurs inférieures à 24 K ont été omis) :

368
Component T90 (K) T90 (ºC)
Ne (T) 24,5561 -248,5939
O2 (T) 54,3584 -218,7916
Ar (T) 83,8058 -189,3442
Hg (T) 234,3156 -38,8344
H2O (T) 273,16 0,01
Ga (M) 302,9146 29,7646
In (S) 429,7485 156,5985
Sn (S) 505,078 231,928
Zn (S) 692,677 419,527
Al (S) 933,473 660,323
Ag (S) 1234,93 961,78
Au (S) 1337,33 1064,18
Cu (S) 1357,77 1084,62

T = point triple, S = point de congélation (solidification), M = point de fusion

Figure 5.1.1 : points de référence de l’ITS-90

369
o L’interpolation des températures comprises entre les points de référence fixes se fait à l’aide
d’un thermomètre d’interpolation.
d’interpolation Un tel thermomètre montre une bonne caractéristique aux
changements de température et peut donc être utilisée pour déterminer les températures
entre les points de référence. Ces thermomètres d’interpolation sont étalonnés à l’aide d'un
certain nombre de points de référence fixés dans l’échelle ITS.

o Des équations d’interpolation sont établies à l’aide des valeurs des points de références
permettant ainsi de mesurer des températures entre ces points de référence.

5.1.7.3.5 Etalonnage des sondes thermométriques

Principe

Pour effectuer un étalonnage de température d’une sonde thermométrique dans une gamme de
température de -20
20 º C à 250 º C, il faut disposer des équipements / appareils suivants:

- Plusieurs thermomètres de référence calibrés à résistance istance de platine (SPRT, Standard


Platinum Resistance Thermometer).
Thermometer Un tel type de thermomètre est constitué d'une unité de
lecture numérique (le " thermomètre ") et une sonde qui lui est associé. À l'intérieur de la
sonde se trouve un élément de mesure sous sous forme d’un bobinage en platine très pur dont
chaque extrémité est connectée à deux fils ; les quatre fils sont reliés par l'intermédiaire d’un
connecteur à l’unité de lecture. Vu que la résistance de platine est traversée par un courant
constant (typiquement
quement 1 mA), il en résulte une mesure de la tension (en mV). Sur la base de
la formule R = U/ I, la résistance R du circuit (= fils conducteurs + élément de mesure) varie
en fonction de la température et peut donc être calculée via la mesure d’une modification
modifi de la
tension. Cependant, comme on ne s'intéresse qu'à la résistance de l’élément de mesure et
non la combinaison (composée des fils conducteurs), les deux fils supplémentaires sont
utilisés pour corriger la résistance des fils de connexion. De cette
cette manière, on obtient la
résistance "pure" de l'élément de détection.

Figure 5.1.2
.2 : schéma d’un élément de mesure SPRT. Les 4 bobinages font partie de la sonde
en platine.

Différents type de résistances sont utilisées


utilisé pour une sonde ; ces sondes en platine sont
appelées PT25, PT100 ou PT1000. Le nombre après l’abréviation PT indique la résistance de
la sonde en Ω à 0 ° C. Ainsi,
Ainsi une sonde PT25 dans un bain de glace en fusion possède une
résistance de 25 Ω. Pour l'étalonnage du thermomètre de référence,
référence, les coefficients sont
calculés par l’équation d'interpolation qui permet d'afficher la résistance de mesure afin de la

370
convertir en une température ; ces coefficients peuvent être programmés dans l'unité de
lecture de sorte que l'on peut lire (soit la résistance Ω ou la température en K, ° C ou ° F).

- Un ou plusieurs bains d'étalonnage. leurs fonction est de pouvoir comparer les


thermomètres à calibrer (UUT’s) par rapport à la sonde de référence dans un environnement
thermiquement stable et homogène. La stabilité est importante afin de limiter les variations au
cours de la durée du cycle de mesure. L’homogénéité est importante afin d'être sûr que les
UUT’s qui se trouvent à quelques centimètres de la sonde de référence soient toujours dans
un médium de même température.

Figure 5.1.3 : Etalonnage des sondes thermométriques dans un bain de silicone. La “tige” verticale est
la sonde de référence, les thermomètres de référence autour donnent une précision jusqu’à 0,001 ºC.

- Un bain de glace: constitué par un vase de Dewar (bouteille thermos) remplis de glace en
fusion. L'équilibre entre la glace, l'eau et la vapeur d'eau est une approche simple du point
triple. Avant et après chaque série d'étalonnages, la sonde de référence est mesurée dans un
bain de glace. L'objectif est triple :

o Avoir un suivi de l'évolution de la mesure de température dans le bain de glace. Ces


mesures peuvent donner un aperçu de la variation de la résistance de la sonde au
cours du temps ("drift").
o Vérification de l'effet du chauffage et du refroidissement sur les mesures
("hystérésis"). En particulier lorsque des températures élevées sont mesurées au

371
cours du cycle de mesure, il peut y avoir un décalage systématique entre les mesures
dans le bain de glace avant et après le cycle de mesure.
o le contrôle de l'élément de mesure: un changement soudain de la valeur peut indiquer
des problèmes avec la sonde. D’ailleurs des chocs peuvent fausser l'étalonnage;
l’utilisation du bain de glace est donc une simple vérification.

Pour l'étalonnage, le thermomètre de référence et les UUT’s sont placés dans le bain d'étalonnage.
Après l'établissement de l'équilibre, la lecture de la température de la sonde de référence et des
UUT’s sont enregistrées au cours d’une période déterminée. Ensuite, le biais et l'incertitude des
UUT’s sont calculés à partir des valeurs enregistrées (voir ci-dessous).

Les points suivants doivent aussi être pris en compte :


- La profondeur d'insertion de la sonde, à la fois de la sonde de référence et des l'UTT’s. Si
la profondeur d’insertion est insuffisante, la sonde perdrera ou absorbera de la chaleur
provoquant des températures mesurées incorrectes.
- La stabilité et l'homogénéité du bain d'étalonnage utilisé doivent être connues et peuvent
être déterminées sur la base d'un certain nombre de tests. Ces valeurs sont importantes car
elles sont toutes deux incluses dans le budget d'incertitude.

Mise en œuvre pratique

La mise en œuvre pratique d'un étalonnage de la température se déroule selon les étapes suivantes:
- Enregistrement des thermomètres et opération de contrôle (contrôle d’entrée et technique),
- Suivi de la sonde de référence dans un bain de glace,
- Immersion de la sonde de référence + UUT’s dans bain d’étalonnage à la température
désirée et attendre jusqu'à ce que le bain soit stable,
- Enregistrement pendant un temps déterminé de la température de la sonde de référence et
des UUT’s.
- Lorsque toutes les mesures ont été effectuées: contrôle de la sonde de référence dans un
bain de glace.
- Calcul de l'erreur systématique (biais) et de l'incertitude élargie des UUT’s à partir des
données enregistrées.

L'étalonnage est généralement effectué à trois températures couvrant l'ensemble du processus dans
lequel le thermomètre est utilisé.

Parce que pour un étalonnage tout dépend de la fiabilité de la sonde de référence, des mesures
doivent être prises pour veiller à ce que les sondes utilisés ne subissent d’altérations.
Ce contrôle respecte 3 règles :
- Le laboratoire d'étalonnage doit avoir plusieurs sondes de référence (de préférence 3 ou
plus).
- Chaque sonde de référence doit être étalonnée périodiquement à l'extérieur, mais pas toutes
en même temps.
- Les sondes de référence doivent être périodiquement comparées entre elles (de préférence
après l'étalonnage externe de l’une d’elles) pour pouvoir suivre les différences entre elles.

Plusieurs sondes sont nécessaires pour identifier si le problème vient de la sonde ou pas. Si vous
avez seulement une sonde disponible, il n’est pas possible d’identifier le problème. Lorsque l’on
dispose de deux sondes, on peut alors comparer l’écart entre-elles, mais sans savoir qu’elle sonde est

372
défectueuse. A partir de trois sondes, on peut déterminer celles qui s’éloignent de la valeur
« majoritaire ».

Calcul du budget d’incertitude

Lors d’un étalonnage, il est nécessaire de calculer pour chaque UUT le biais et l’incertitude de
mesure.

Le biais ou erreur systématique est la différence entre les valeurs moyennes de la sonde de référence
et UUT à la température appropriée; On tient aussi compte du biais du thermomètre de référence
(connu dans le certificat de l'étalonnage externe).

L’incertitude de mesure élargie de l'UUT est déterminée par la méthode bottom-up. Cela signifie que
l’on établit un budget d’incertitude dans lequel tous les types de sources de variation du processus de
mesure sont répertoriés et on détermine la dispersion correspondante (variabilité) pour chaque
source.

Les sources de variation peuvent être divisées en sources constantes et variables. Les sources
constantes sont identiques pour chaque étalonnage (comme l'incertitude de la chaine de référence
ou la stabilité du bain d’étalonnage) et peuvent donc être regroupées en un seul terme. Les sources
variables sont fonction des caractéristiques de l’UUT (comme la résolution de la lecture) donc des
mesures prises au cours de l’étalonnage.

En pratique, certaines sources de variation sont négligeables. Si dans la pratique, pour un même type
d’UUT étalonnée, les changements dans le budget d'incertitude pris en compte ne sont que la valeur
de la variation enregistrée au cours du cycle de mesure alors cela simplifie grandement les calculs.

Certificat

Le certificat d’étalonnage établi pour une UUT doit contenir les informations suivantes:

- Les données administratives sur l'UUT (origine, marque, modèle, caractéristiques, plage de
mesure, ...)
- Brève description de la méthode d’étalonnage,
- Référence à la traçabilité,
- Vue d'ensemble des conditions environnementales lors de l'étalonnage (seulement dans les
limites prescrites d’utilisation de l'équipement),
- Résultats : la température nominale, la température enregistrée, le biais et l'incertitude de
mesure élargie,
- Indication du facteur k utilisé pour passer de l'incertitude de mesure standard à l'incertitude de
mesure élargie U (k est habituellement = 2). Il s'agit de permettre à l'utilisateur de pouvoir
revenir à l'incertitude de mesure standard si cela était nécessaire.

5.1.7.3.6 Vérification des thermomètres IR

Les points précédents ont trait à la calibration des thermomètres sondes; A côté de ceux-ci il y a
également des thermomètres à rayonnement ou infrarouge (IR) qui donnent la température d’un objet
en fonction du rayonnement (chaleur) qu’ils émettent.

373
Base : chaleur

Le principe d’un thermomètre à rayonnement est basé sur la loi de rayonnement de Planck. Celle-ci
décrit comment un rayonnement émis par un objet à une certaine température (idéalement un “corps
noir”) change avec la longueur d’onde.

Figure 5.1.4: répartition du rayonnement d’un corps noir idéal à différentes températures

Pour un objet avec une température de 6000 K (couche supérieur du soleil) le maximum d’énergie
rayonnée est à une longueur d’onde de 550 nm, dans la région jaune du spectre. C’est ainsi que nous
percevons ces objets comme jaune. Un objet avec une température de 3000 K rayonne le plus dans
le proche infrarouge (1200 nm) de sorte que le rayonnement maximal est invisible pour nous. Nous ne
pouvons voir alors que la partie du rayonnement située dans la partie rouge du spectre (à gauche de
la répartition) c’est pourquoi ces objets ont pour nous une couleur rouge profond. Pour les objets
ayant une température encore plus basse, le rayonnement est émis dans sa totalité dans des régions
invisible pour nous, couvrant les infrarouge, les micro-ondes et ondes radio. Pour les objets ayant
une température entre 0°C et 200°C le maximum de rayonnement se situe entre 5 et 10 µm.
A noter que l'intensité du rayonnement (l'aire sous la courbe) augmente très rapidement avec
l'augmentation de la température (le total de l'énergie rayonnée augmente avec T).

Afin de déterminer la température sur la base du rayonnement, on peut utiliser différentes méthodes.
Trois d'entre elles sont:
• Détermination de la longueur d’onde du maximum (le sommet du pic sur la figure). La
longueur d’onde du maximum est fonction de la température (selon la loi de Wien) et on peut
en déduire celle-ci. Cette détermination est cependant peu pratique.
• Détermination du rayonnement total dans une zone de longueur d’onde déterminée (‘spectral
band thermomètre’), souvent entre 0.5 et 20 µm. La plupart des thermomètres à rayonnement
qui sont utilisés sont des thermomètres à bande spectrale.
• Détermination du rapport de l’intensité du rayonnement dans deux régions de longueurs
d’onde et déduction de la température. Ces thermomètres sont aussi connus sous le nom de
thermomètres à deux couleurs ou thermomètre fraction (‘ratio thermomètre’) et sont utilisés en
routine pour des applications spéciales.

374
Aspects spécifiques

En mesurant la température avec un thermomètre à rayonnement, il faut tenir compte d’un certain
nombre d’aspect :

- La théorie est basée sur le rayonnement d’un corps noir idéal, ce qui n’existe pas dans la
nature. En pratique la courbe spectrale est plus irrégulière que sur la figure et de ce fait, il
existe une différence entre la température théorique et la température pratique. On peut en
partie corriger cela en choisissant des régions de longueur d’onde de mesure librement large.

- Un corps noir idéal absorbe tous les rayonnements qu’il reçoit et n’émet que le rayonnement
lié à sa propre température. En pratique, les objets n’absorbent pas tous le rayonnement qu’ils
reçoivent, mais réverbèrent une partie et/ou en laisse passer une partie (transparence), et ces
sources sont également mesurées.

Le paramètre qui caractérise la réflexion est l’émissivité de la surface mesurée. La quantité


totale de rayonnement qui atteint la surface du détecteur est la somme de l’émission (ce qui
est émis par l’objet), de la réflexion (ce qui est réfléchi par l’objet) et de la transmission (ce qui
traverse l’objet). Pour les objets opaques, il n’y a pas de transmission et on obtient :

Réflexion + émission = 1

Seule l’émission est liée à la température de l’objet; le réflexion est liée à l’environnement et
interfère donc avec la mesure.

La mesure dans laquelle une surface réfléchi un rayonnement est caractérisée par le
coefficient d’émission ε. Si on réalise toujours des mesures pour un même type de matériel
pour lequel ε ne varie pas, alors on peut corriger la température mesurée. Quand on mesure
avec le même thermomètre des surfaces différentes (pour lesquelles on ne connait souvent
pas ε) alors on peut constater des différences dans les températures mesurées dépendantes
des différences du terme ε.

Parfois on peut dans un thermomètre IR adapté la valeur de ε dans certaines limites (p.ex.
entre 0.95 et 1.00). Il faut noter que la valeur de 1.00 est pour un corps noir idéal et qu’une
surface noir mat a déjà une valeur ε = 0.95.
L’émissivité de l’aluminium poli est inférieure à 0.10. Heureusement, la plupart des composés
organiques (aliments) ont une valeur élevée d’ ε pour laquelle 0.95 donne en pratique de bons
résultats.

Afin de réaliser une correction pour la réflexion, on peut différencier trois cas :
• La température de l’objet diffère peu de la température de l’environnement (Tobj ≈
Tenv). Dans ce cas, le rayonnement réfléchi a les même caractéristiques que le
rayonnement émis par l’objet et on peut considérer la combinaison objet +
environnement comme un corps noir. Dans un tel cas on peut poser ε = 1.00 car
réflexion + émission = 1.
Attention, cela signifie que les produits refroidis doivent être mesuré dans un frigo ou
congélateur afin de réduire les erreurs dues à un environnement plus chaud.
• La température de l’objet à mesurer est nettement supérieure à la température de
l’environnement (Tobj >Tenv). Dans ce cas, l’intensité du rayonnement réfléchi est
nettement inférieure à celle de l’objet et peut être négligée. La meilleure stratégie est

375
d’utiliser le coefficient d’émission de l’objet (p.ex. 0.95 pour les produits organiques
comme de l’huile de friture).
• La température de l’objet est nettement inférieure à la température de l’environnement
(Tobj < Tenv). Dans ce cas, la contribution du rayonnement réfléchi est importante et le
sera d’autant plus que l’émissivité de l’objet est petite (plus de réflexion). Vu que le
coefficient des produits organiques est élevé (peu de réflexion) l’erreur due à la
réflexion est la plupart du temps limitée à la lecture. Il est à noter que le détecteur lui-
même émit aussi de la chaleur et, par conséquent, doit avoir la température de
l’environnement : un thermomètre à rayonnement dans sa poche et le tirer dans une
chambre froide pour prendre une mesure n’est pas la bonne façon de procéder.

- Un thermomètre à rayonnement capte le rayonnement selon un angle déterminé, souvent


exprimé comme un cercle d’un diamètre spécifique à une distance spécifique (p. ex. un cercle
d’un diamètre de 10 cm à 50 cm de distance) ou comme un rapport (p.ex. 6 :1 qui indique un
diamètre de 1m à une distance de 6 mètre). Tous les rayonnements dans ce cercle sont
mesurés ; vu cependant que l’intensité du rayonnement augmente très rapidement avec la
température, l’objet avec la température la plus élevée dans la région de mesure dominera le
résultat de la mesure. Ce qu’on mesure n’est donc pas une température moyenne dans une
région de mesure ! Le mieux est de s’assurer que la surface mesurée contienne l’entièreté de
la région de mesure (mesure suffisamment large).

- Une erreur qui est parfois commise est de mesurer à travers le verre : on a alors à faire à des
effets d’émissivité (température du verre), de réflexion (effet miroir du verre) et de
transmission à travers le verre. Vu que le verre est nettement moins perméable aux ondes-
infrarouge (c’est pourquoi les lentilles d’un thermomètre à rayonnement ne sont pas faites en
verre), la température lue n’est pas du tout une indication de la température de l’objet derrière
le verre mais bien la température du verre lui-même. Un jour où il gèle par exemple, la mesure
à travers une fenêtre donnera une température de 16°C alors que la même mesure fenêtre
ouverte donnera -4.5 °C, une différence de plus de 20 °C !

- Une autre source d’erreur peut être la colonne d’air entre l’objet et le thermomètre. La
poussière et la vapeur d’eau dans cet espace peuvent avoir une influence néfaste sur la
lecture.

- Et surtout : nous mesurons une surface ! une contamination de la surface (pollution,


étiquettes…) peuvent modifier le coefficient d’émission de sorte que la température mesurée
diffère de la température réelle. Et la température de l’emballage ne peut refléter la
température du contenu que quand la température du produit contenu est en équilibre avec la
température de l’environnement. C’est pourquoi, en cas de doute, il faut toujours utiliser un
thermomètre à sonde !

Verification

Pour toutes les raisons ci-dessus (émission, réflexion, transmission, température du détecteur,
répartition irrégulière du rayonnement,…) la calibration d’un thermomètre à rayonnement n’est pas
une sinécure.

376
Vu le travail intensif que demande un tel étalonnage et que la précision est nettement supérieur que
ce qui est nécessaire en pratique, on réalise au LFSAM un contrôle limité, ou vérification. Une
vérification implique que la chaine de comparaison aux standards internationaux ne peut être assurée
car une ou plusieurs étapes de ce processus manquent.

En pratique, une vérification est réalisée à des températures entre -18°C et 125°C en lisant la
température d’un disque de mesure mat noir avec un UUT. Ce disque fait partie d’un calibrateur
infrarouge, le coefficient d’émission est de 0.95. Avec le calibrateur, la température du disque peut être
ajustée à différentes valeurs; la température réelle est mesurée à l’arrière du disque par un
thermomètre à sonde.

Pour des températures supérieurs, en particulier 200 °C, on mesure la température de l’huile dans un
bain de calibration avec comme référence un thermomètre de référence.

L’enregistrement et le traitement se fait de manière analogue aux thermomètres à sonde.

Figure 5.1.5 : Calibrateur infrarouge avec le thermomètre de référence. La sonde du thermomètre de


référence passe derrière le disque de mesure.

5.1.7.4 Calibration volumétrique (pipettes)

Lors de la calibration des températures, on réalise une comparaison directe du paramètre que l’on a
sous les yeux (la température). Lors d’une calibration volumétrique, on suit une méthode indirecte : ce
n’est pas le volume, mais la masse qui est déterminée.

377
5.1.7.4.1 Volume et masse

Un volume a comme dimension (longueur)³ et comme unité m³. Cela signifie que si on veut déterminer
directement un volume, on doit pouvoir déterminer très précisément la forme et les mesures du
récipient (chambre de piston par exemple). Dans la plupart des cas ce n’est guère possible. Le
volume est donc déterminé de manière indirecte par détermination de la masse d’un liquide contenu
dans ce volume. Une mesure de la masse est nettement plus simple qu’une mesure du volume. 0
partir de cette masse et de la densité du liquide utilisé, on peut déterminer le volume.

Le principe d’une calibration volumétrique est donc une détermination massique.

5.1.7.4.2 La calibration des pipettes

Les types de pipettes

Les normes ISO 8655-2 (appareil volumétrique à piston – pipette à piston) et ISO 8655-6 (appareil
volumétrique à piston – détermination gravimétrique de l’erreur de mesure) sont d’application pour les
caractéristiques des pipettes et leur calibration. L’ISO 8655-7 concerne des méthodes de calibration
non gravimétriques.

L’ISO 8655-2 fait une différence entre différents types de pipettes :


- Les pipettes à volume fixe
- Les pipettes à volume variable

Ces deux types de pipettes peuvent utiliser un des principes de pipetage suivant :
- Pipette à piston à déplacement d’air (‘Air’ – type A)
- Pipette à piston pour lesquelles le piston est en contact direct avec le liquide (‘déplacement
positif ou direct’ – type D). Dans ce cas, le pison est dans le tips comme dans une seringue
d’injection et il n’y a pas d’air entre le piston et le liquide. On peut encore distinguer les types
D1 (réutilisable) et D2 (usage unique).

La norme ISO 8655-2 établit également les spécifications pour les déviations systématiques et les
variations d’une pipette en fonction de son type et de son volume.

Mode opératoire

L’ISO-8655-6 décrit le mode opératoire de calibration d’une pipette via la méthode gravimétrique.
Cette méthode repose sur les principes suivants :
- Pour les pipettes à volume variable, la calibration est réalisée:
o Au volume nominal (maximal)
o À la moitié du volume nominal
o Au plus petit volume ou au dixième du volume nominal (la plus haute valeur des deux)
- La calibration est réalisée au moyen d’une balance calibrée dont la résolution dépend du
volume nominal de la pipette à calibrer. Ainsi, pour les volumes nominaux entre 10 et 100 µl
on utilise une balance ayant une résolution de 0.01 mg. Pour les volumes entre 0.1 et 10 ml,
une résolution de 0.1 mg est suffisante.
- Durant la calibration, les conditions ambiantes sont enregistrées (température, humidité
relative, pression atmosphérique).
- Le liquide utilisé est l’eau.

378
- L’humidité relative durant la calibration doit être supérieure à 50 % de façon à limiter
l’évaporation.
- Pour les volumes inférieurs à 50 µl d’autres mesures doivent encore être prises afin de limiter
l’évaporation. On peut utiliser un piège à évaporation : il s’agit d’une pièce de verre autour du
récipient dans lequel on pipette£. On place de l’eau dans ce piège, ce qui assure un taux
élevé d’humidité relative à l’ouverture du récipient. On peut également utiliser un récipient
avec un couvercle.

Figure 5.1.6 : Le récipient de pesée sans (gauche) et avec (droite) le piège à évaporation.

La calibration en utilisant le piège à évaporation se déroule comme suit :


Pour les pipettes de type A :
- régler la pipette au volume nominale, insérer un tips et aspirer rejeter 5 * le liquide de test afin
de saturer en vapeur d’eau l’air de la chambre du piston.
- Démarrer le chronomètre
- Enregistrer les conditions ambiantes, ainsi que la température de l’eau utilisée
- Réaliser 10 fois les étapes suivantes
o Tarer la balance
o Insérer un nouveau tips
o Aspirer le liquide dans le tips et le rejeter dans le bac à déchet (pré humidification)
o Aspirer le liquide et le dispenser dans le récipient de la balance
o Enregistrer le poids
o Oter le tips
- Après le dixième cycle, noter le temps du chronomètre et laisser celui-ci tourner le même
temps. Noter la différence de poids après ce temps.

379
Pour les pipettes de type D, on peut omettre les 5 premier pipetage de saturation de l’air de la
chambre du piston (il n’y en a pas…) ainsi que le pipetage de pré humidification. Pour les volumes
supérieurs à 50 µl on peut négliger le chronométrage et le calcul de la perte par évaporation.

Calcul et budget d’incertitude

Des poids enregistrer on calcul la moyenne et la déviation standard. La moyenne est corrigée en
fonction de la perte par évaporation. LE poids moyen est alors transformer en volume à l’aide de la
densité de l’eau à la température enregistrée et de la pression atmosphérique.

La différence entre la moyenne et la valeur nominale (déviation systématique) ainsi que la déviation
standard sont évaluées par rapport aux critères de l’ISO 8655-2 afin de déterminer si la pipette est
conforme pour ce volume nominal.

La valeur de l’incertitude étendue est ensuite calculée suivant la procédure décrite dans la norme
ISO/TR 20461 Determination of uncertainty for volume measurements made using the gravimetric
method.

Cette procédure est suivie pour chaque volume auxquels la pipette doit être calibrée: 1 volume pour
les pipettes à volume fixe et 3 volumes pour les pipettes à volume variable.

Certificat

Le certificat de calibration qui est établi par pipette doit contenir au moins les données suivantes:
- Données administratives de la pipette : origine, marque, type, caractéristiques, portée…)
- Courte description de la méthode de calibration
- référence à la traçabilité
- description des conditions ambiante et de la méthode durant la calibration
- une référence aux tips utilisés
- les résultats: valeur nominale, moyenne, biais, déviation standard, incertitude étendue
- mention du facteur k utilisés pour calculer l’incertitude étendue (U) à partir de l’incertitude de
mesure standard (k est le plus souvent égal à 2). Ceci afin de permettre à l’utilisateur de
recalculer cette incertitude étendue si c’est utile à d’autres fins.

Ajustement

Si lors de la calibration, la pipette ne répond pas aux exigences de l’ISO 8655-2, la pipette doit être
ajustée et la procédure de calibration répétée. La calibration doit également être répétée après un
démontage et un ajustage.

380
5.2 EMAS / OHSAS

5.2.1 Système de management de la sécurité au travail

5.2.1.1 Base de la norme OHSAS 18001

5.2.1.2 OHSAS 18001

OHSAS = Occupational Health and Safety Assessment Series.

OHSAS 18001 est une norme développée en Angleterre en collaboration avec diverses institutions
normatives européennes et australiennes. Ce N’est PAS une norme internationale comme les normes
ISO, mais elle est acceptée dans beaucoup de pays comme norme de certification pour le système de
management de la sécurité.

OHSAS 18001 contient les exigences pour un système de mangement de la sécurité grâce
auxquelles l’organisation peut maîtriser les risques en rapport avec ses activités et peut améliorer le
fonctionnement du système.
La directive OHSAS se rapporte en premier à la sécurité au travail et non à la sécurité des produits et
des services.

381
Le système de management de la sécurité basé sur la norme OHSAS 18001 comprend cinq parties:

o Politique de sécurité.

o Planning.

o Implémentation et développement.
o Contrôle et actions correctives.

o Revue de direction.

5.2.1.2.1 Politique de sécurité du travail

Dans cette partie du système de management de la sécurité, l’organisation détermine sa politique


générale pour la gestion de la sécurité. En ce qui concerne cette politique, l’organisation doit se
référer à trois obligations de base:

o Satisfaire à la loi et aux règlements pertinents.

o Aspirer à l’amélioration continue au sujet des risques et des dangers.

o Informer tous les collaborateurs pour qu’ils soient conscients de leurs obligations quand à la
sécurité.

Beaucoup d’organisations présentent leurs intentions dans une déclaration de politique.

5.2.1.2.2 Planning

La politique est traduite en objectifs concrets, attribution des tâches et programme de management
de la sécurité.

Les objectifs de la politique doivent tenir compte du contexte spécifique, et définir des objectifs et
programmes qui sont dirigés vers la diminution des risques et des accidents. Pour cela il est essentiel
que tous les risques et dangers soient inventoriés.

En fonction de l’importance du risque ou du danger il est nécessaire de tenir compte de la loi et des
règlements. Les exigences de la loi et des règlements sont la base pour déterminer des objectifs.

5.2.1.2.3 Implémentation et développement

Pour la réalisation des objectifs, des tâches et du programme de management, des règles
d’organisation doivent être déterminées. Cela comprend:

o La détermination des tâches et des responsabilités;

o La rédaction de procédures et d’instructions de travail pour l’exécution des activités avec des
risques élevés d’accident;

o La formation du personnel;

382
o La communication interne et externe ;
o La gestion de l’information et des documents.

5.2.1.2.4 Contrôle et actions correctives

L’organisation doit se contrôler elle même en organisant des réunions et en effectuent des monitoring
au sujet des prestations de sécurité et également en réalisant des audits de sécurité internes.

Pendant les audits on analyse le bon fonctionnement et la cohérence du système dans son ensemble.
Un critère important est de voir si le système de management de la sécurité en place réalise le
objectifs fixés. Pour les non conformités constatées on prend des actions correctives et préventives.

5.2.1.2.5 Déclaration de la direction

La direction doit évaluer périodiquement le système de management et pour cela voir si les objectifs
ne doivent pas être adaptés, par exemple la volonté d’adhérer à l’amélioration continue comme fixée
dans la politique de sécurité.

Du fait de l’adaptation de la politique et des objectifs on redémare un nouveau cycle d’amélioration.

383
5.2.2 Système de management de l’environnement – ISO 14001

5.2.2.1 Base de la norme ISO 14001

5.2.2.2 ISO 14001

L’ISO 14001 est la norme acceptée mondialement pour les exigences d’un système de management
de l’environnement. Le système de management de l’environnement y est défini comme un système
de management général de l’organisation qui est utilisé pour développer la politique environnementale
et implémenter les aspects à maîtriser.

Les exigences de l’ ISO 14001 sont réparties en cinq parties:

o Politique environnementale.

o Planning.
o Implementation et développement.

o Controle et actions correctives.

o Revue de direction.

384
5.2.2.2.1 Politique environnementale

Dans cette parie du système de management de l’environnement l’organisation défini la politique


générale pour la gestion de l’environnement.

En ce qui concerne la politique environnementale l’organisation doit se’engager sur trois points
essentiels:

o Satisfaire à la loi et aux règlements pertinents.

o Aspirer à l’amélioration continue du respect de l’environnement.

o Aspirer à la prévention des risques environnementaux.

Beaucoup d’organisations ont fixés leur politique environnementale dans la déclaration


environnementale.

5.2.2.2.2 Planning

On y détermine des objectifs concrets, on y fixe les tâches et on détermine un programme de


management environnemental.

La politique de la direction doit être traduite en objectifs et en programme. Ceux-ci doivent


comprendre:

o L’amélioration des prestations environnementales;

o La maitrise des activités critiques pour l’environnement.

Pour celà il est esssentiel que tous les aspects environnementaux (toutes les intéractions entre
l’activité et l’environnement) soient inventoriées, comme par exemple :

o Les émissions dans le milieux;

o Les produits ayant un effet sur l’environnement ;

o Les aspects environnementaux concernant les fournisseurs et les sous traitants.

Indépendemment de la gravité des effets (possibles) sur l’environnement, la loi et les règlements sont
importants. Les exigences légales et règlementaires doivent être prises en compte pour ce fixer les
objectifs. Au niveau du planning, on peux développer également un plan environnemental pour la
société.

5.2.2.2.3 Implementation et développement

Pour la réalisation des objectifs, la répartition des tâches et la détermination d’un programme de
management de l’environnement, une série de règles sont nécessaires.

385
Cela concerne:

o La détermination des tâches et des responsabilités;

o La rédaction de procédures et d’instructions de travail pour la réalisation des activités en


rapport avec les aspect environnementaux importants;
o La formation du personnel;

o La communication interne et externe;

o La gestion des informations et des documents;


o Prendre des mesures pour prévenir les situations d’urgence.

5.2.2.2.4 Contrôle et actions correctives

L’organisation doit se contrôler elle-même lors de réunions et de monitoring à propos des activités
critiques pour l’environnement et par la réalisation d’audits internes.

Pendant les audits on analyse entièrement le le bon fonctionnement et la cohérence du système.

Un critère important est de voir si le mangement environnemental en place permet la réalisation des
objectifs. En cas de non conformités, des mesures correctives et préventives sont prises.

5.2.2.2.5 Revue de direction

La direction doit régulièrement évaluer le fonctionnement du système de management


environnemental et se poser la question de savoir si les objectifs doivent être adaptés, par exemple
l’intention d’amélioration continue comme déclarée dans la politique environnementale.

Avec l’adaptation de la politique et des objectifs, on recommence un nouveau cycle.

5.2.3 Système de management environemental – EMAS

5.2.3.1 EMAS

EMAS = Eco Management and Audit Scheme

Ceci est le titre du règlement de la Comission Européenne qui recommande aux états membres de
développer un système grâce auxquels les organisations peuvent obtenir le logo environnemental
Européen.

La participation au règlement EMAS est volontaire.

5.2.3.2 Objectifs EMAS

Les objectifs du règlement sont de stimuler toutes sortes d’organismes à améliorer leur gestion du
respect de l’environnement.

386
L’optique est de favoriser l’amélioration continue de la gestion du respect de l’environnement en
développant un système de management environnemental, des audits internes et en publiant d’un
rapport annuel.

5.2.3.3 Quand un organisation peut-elle être certifiée?

Une organisation peut être certifiée EMAS quand:

o Un système de management de l’environnement est développé.


o Un rapport annuel de la gestion environnementale est rédigé (dans le règlement EMAS on
parle de déclaration environnementale).

o Une instance de controle environnementale reconnue à approuvé le système de management


environnemental et la déclaration environnementale.

Dans le texte du règlement il y a des exigences auxquels le système de management et la déclaration


environnementale doivent répondre.

La norme ISO 14001 constitue la base des exigences d’un système de management
environnemental.

La déclaration environnementale est comparable à un rapport annuel. Les exigences concernant cette
déclaration sont fixées dans le règlement.

Quand l’instance de certification reconnue a approuvé le système de management et la déclaration


environnementale, l’organisation peux demander un enregistrement à l’institution compétente de l’état
membre concerné.

5.2.3.4 Correspondance avec la certification selon l’ISO 14001

Les exigences concernant le système de management du règlement EMAS sont identiques à celles
de l’ISO 14001. Pour répondre à l’ISO 14001 le système de management de l’organisation doit remplir
certaines conditions. L’organisation, par exemple le laboratoire, doit:

o Identifier et contrôler les impacts sur l’environnement de ses activités et de ses produits;

o Améliorer en continu la gestion de l’environnement;

o Implémenter une approche systématique pour définir les objectifs, les atteindre et les diffuser
quand ils sont réalisés.

EMAS accorde avant tout beaucoup d’importance aux éléments suivants:

o Être en règle avec les règlements;

o Améliorer le respect de l’environnement;

387
o La communication externe;
o Une implication des collaborateurs.

Les exigences pour le rapport sont décrites séparément dans le règlement EMAS.

En pratique une organisation qui possède un certificat ISO 14001, peux recevoir un enregistrement
EMAS en faisant valider un rapport sur l’environnement selon les règles déterminées.
C’est la différence entre l’ISO 14001 et EMAS. L’ISO 14001 n’exige pas que l’organisation publie
régulièrement des informations sur ses prestations environnementales. EMAS l’exige.

5.2.4 Certification

5.2.4.1 Qu’est ce qu’une cer