Trabajo prctico N MEDICIN DE PIGMENTOS FOTOSINTTICOS La determinacin de la concentracin de pigmentos fotosintticos nos permite estimar la biomasa y la capacidad fotosinttica

del fitoplancton. La calidad, distribucin y relacin entre las distintas clases de pigmentos nos indica el estado fisiolgico de la comunidad y la composicin del fitoplancton en cuanto a grupos algales. La concentracin de pigmentos vara ampliamente y depende del metabolismo algal y de factores fsico-qumicos como la luz, la temperatura y la disponibilidad de nutrientes. Los pigmentos algales consisten principalmente en clorofilas (a, b y c) y carotenoides (carotenos y xantfilas). Para estimar su concentracin el mtodo consiste en extraer los pigmentos mediante un solvente orgnico y leer en un espectrofotmetro la absorcin de luz a la longitud de onda especfica para cada pigmento. Se toma una muestra de agua cuyo volumen vara entre 0,5 y 5 litros de acuerdo a la concentracin algal. La muestra se filtra con filtro de fibra de vidrio para retener las algas en el mismo. Luego el filtro se tritura agregndole un volumen de 10 ml de acetona al 90% para preparar un extracto. El mismo se coloca en un tubo de ensayo y se guarda a 4C durante 24 horas. La finalidad de estos procedimientos es que las clulas algales se rompan y los pigmentos se disuelvan en la acetona. Posteriormente los tubos de ensayo se centrifugan (2.000 a 3.000 rpm durante 10 minutos) para separar los restos del filtro. El extracto resultante se coloca en una celda de 1 cm de recorrido ptico (o de 5 cm si su concentracin de clorofila es muy baja) y se leen las densidades pticas (absorbancias) a las distintas longitudes de onda en un espectrofotmetro: 750 nm: turbidez de la muestra 664 nm: clorofila a 647 nm: clorofila b 630 nm: clorofila c 430 nm: carotenoides para el clculo del Indice de Margalef

Luego de realizar estas lecturas se agregan 3 gotas de HCl 0,1 N al extracto en la celda para acidificarlo, logrando que toda la clorofila se degrade y se transforme en feofitina, entonces se vuelve a leer la absorbancia a 665 y 750 nm. A las lecturas de absorbancia a 664, 647, y 630 nm se les debe restar la lectura a 750 nm, obtenindose las lecturas corregidas. Se utilizan diferentes frmulas para estimar la concentracin de pigmentos en la muestra de agua a partir de estos datos (Clesceri et al., 1998): Clorofila a, mg/m3= 26.7 (DO 664antes DO 665despus) V1 V2 L Feofitina a, mg/m3= 26.7 [1,7 (DO 665despus) DO 664antes] V1 V2 L V1= volumen del extracto en ml V2= volumen de la muestra filtrado en litros L= largo del paso de luz, o sea, ancho de la celda en cm 664antes = densidad ptica o absorbancia del extracto antes de acidificarlo 665despus = densidad ptica o absorbancia del extracto despus de acidificarlo Mtodo tricromtico para determinacin de clorofilas a, b y c Cl a = 11,85 (DO 664) - 1,54 (DO 647) 0,08 (DO 630) Cl b = 21,03 (DO 647) 5,43 (DO 664) 2,63 (DO 630) Cl c = 24,52 (DO 630) 7,60 (DO 647) 1,67 (DO 664) Luego de determinar la concentracin de estos pigmentos en el extracto (para celda de 1 cm de paso de luz) se calcula su concentracin en la muestra de agua con la siguiente frmula: Clorofila a, b o c, mg/m3= Cl a, b o c V1 V2 El Indice de Margalef (DO430/DO665) nos da una idea del estado de madurez de la asociacin algal y se calcula dividiendo las absorbancias a estas longitudes de onda (Margalef, 1983). El valor del ndice es bajo (alrededor de 2) cuando se trata

de una asociacin joven con alta productividad por unidad de biomasa y alto (de 5 a 7) cuando se trata de una comunidad madura con baja tasa de renovacin. BIBLIOGRAFIA Clesceri L. S., Greenberg A. E. & Eaton A. D. (Eds.). 1998. Standard methods for the examination of water and wastewater. (APHA, American Public Health Association, Washington D.C.) Margalef, R. 1983. Limnologa. Barcelona, 1010 p.

Grupos algales y sus principales pigmentos (+ = presente) (Margalef, 1983)

a
Cianofceas (Cyanophyta, Cianobacteria, Nostocophyceae, Schizomycophyta) Rodofceas (Rodophyta) Dinofceas (Dinophyta) Criptofceas (Cyptophyceae) Rafidofceas (Raphidophyceae, Chloromonadales) Crisofceas (Chrysophyceae+Haptophyceae+ Craspedophyceae) Diatomeas (Bacillariophyceae) Xantofceas (Xanthophyceae, Heterocontae+ Eustigmatophyceae) Feofceas (Phaeophyta, Fucophyceae) Euglenales (Euglenophyceae) Prasinofceas (Prasinophyceae) Clorofceas (Euchlorophyceae+Zygophyceae (conyugadas)+Charophyceae)

Clorofilas c1

c2

Ficobilinas

+ + + + + + + + + + + +

+ + +

+ + + + + + -

+ + -

+ -

+ + +? -

Carotenoides principales -caroteno, equinenona, zeaxantina, mixoxantofila, oscilaxantina - y -caroteno, lutena, zeaxantina, anteraxantina -caroteno, fucoxantina, diadinoxantina, peridinina -caroteno, aloxantina

- y -caroteno, fucoxantina, diatoxantina, diadinoxantina -caroteno, fucoxantina, diatoxantina, diadinoxantina -caroteno, diadinoxantina -caroteno, fucoxantina, violaxantina -caroteno, equinenona, anteroxantina, neoxantina - y -caroteno, neoxantina, violaxantina - y -caroteno, lutena, neoxantina, violaxantina, zeaxantina (macrfitos)

Muestra

V1 (ml) volumen solvente

Peso seco (g)

V2 (L) volumen filtrado

T Turbidez D750

D430

D430-T

D630

D630-T

D647

D647-T

D664

D664-T

D665a

D750a

D665a-Ta

Muestra

Clorofila a (g l-1)

Clorofila b (g l-1)

Clorofila c (g l-1)

Feopigmentos (g l-1)

D430/D665