Preservacin de eritrocitos y cambios fsicos ocurridos durante el almacenamiento

RESUMEN

Oscar Andrs Peuela B, Adriana Urbina B. Internos Especiales en Investigacin Fisiologa del Eritrocito Humano, Unidad de Fisiologa. Luis Fernando Palomino Q, MD. Profesor Asistente Unidad de Fisiologa. Departamento de Ciencias Fisiolgicas, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia

La preservacin de sangre y de sus derivados ha sido una constante en el desarrollo de los bancos de sangre modernos. Los dos mtodos actualmente utilizados son la fase lquida y la criopreservacin. Se revisaron las generalidades de cada uno de ellos, as como los cambios fsicos ocurridos a los eritrocitos durante su almacenamiento. Palabras clave: Eritrocitos, almacenamiento, criopreservacin, cambios fsicos. PRESERVATION OF ERITROCITOS AND HAPPENED CAMBIOS FISICOS DURING THE STORAGE Blood and blood components preservation have been keys in the modern blood banks development. There are two methods used actually for preserving: liquid and frozen preservation. We carried out a revision about them and some physical changes during red blood cells storage. Key words: Erythrocytes, storage, frozen preservation, physical changes. INTRODUCCIN Hasta 1616, fecha en la que W. Harvey propuso el concepto de la circulacin de la sangre, la transfusin careca de fundamento. Cuando se acept que la sangre circulaba y que el espacio intravascular poda rellenarse con lquidos introducidos desde el exterior, la idea de transfusin logr arraigarse. El primer procedimiento se llev a cabo en 1667 (1); los progresos fueron lentos por la complejidad de este enfoque, en particular la incompatibilidad entre las especies. A principios del siglo XX la transfusin como medida teraputica segua siendo laboriosa y riesgosa, pero durante y despus de la II Guerra Mundial los avances tcnicos permitieron la expansin rpida del almacenamiento y la administracin de sangre. El hecho ms importante fue el reconocimiento de las diferencias genticas entre los individuos, planteado por Landsteiner a partir de 1901. El desarrollo de los anticoagulantes, los conservadores y la esterilizacin, posibilit la recoleccin y la preservacin de la sangre para ser utilizada ms tarde. El empleo ms reciente de los hemoderivados ampli el campo de aplicacin limitado a la restauracin de la volemia, al reemplazo de la mayora de las clulas y muchas protenas plasmticas. Los adelantos continan en especial en lo que se refiere a la utilizacin ms eficiente de los componentes y fracciones de la sangre, la seguridad y la compatibilidad inmunolgica entre el dador y el receptor para poder transfundir a todos los pacientes (2). Cuando el eritrocito pierde el ncleo y los ribosomas ya no pueden sintetizar protenas. Al desaparecer las mitocondrias debe depender de la gluclisis anaerbica para el suministro de energa. En el hombre, debe sobrevivir 4 meses y superar muchos kilmetros de viaje peligroso con un equipo de mantenimiento

limitado. No obstante, conserva una capacidad de reparacin considerable. Puede preservar los niveles efectivos de adenosintrifosfato (ATP), nicotinamida-adenina dinucletido (NAD) y las formas reducidas del NAD (NADH) y el NAD fosfato (NADPH), adems de la composicin inica. Tambin reduce la metahemoglobina y el glutatin oxidado, genera glutatin y sella la membrana si se lesiona. A pesar de estas y otras propiedades, llega un momento en que ya no puede sostener su existencia (3). Al parecer, la "lesin de almacenamiento" del eritrocito funciona como un fenmeno de todo o nada, de manera que hay clulas que sobreviven ms de 24 horas y otras que no lo hacen (4). ALMACENAMIENTO DE SANGRE Y SUS DERIVADOS Para ser usados en un receptor, los eritrocitos transfundidos deben sobrevivir en la circulacin y ser capaces de transportar eficientemente el oxgeno a los tejidos. La viabilidad de los eritrocitos est definida como su capacidad para circular por 24 horas despus de la reinfusin; su funcionalidad est definida como su capacidad para liberar oxgeno a los tejidos de una forma normal. La preservacin ideal de eritrocitos debera ser una que permita su almacenamiento por un tiempo ilimitado sin alterar su viabilidad o su funcin; es claro que este ideal no ha sido logrado todava (5). Preservacin lquida La hemoterapia slo adquiri valor prctico con el advenimiento de los anticoagulantes capaces de preservar la viabilidad eritrocitaria. Antes de la II Guerra Mundial la sangre se conservaba en citrato de sodio y dextrosa (6), y los glbulos rojos permanecan viables durante 1 semana a falta de purinas y de energa. El primero de los anticoagulantes efectivos fue el cido-citrato-dextrosa (ACD), descrito en 1943 (7) que contena glucosa como fuente energtica y permita el almacenamiento durante 21 das. Finch y cols (4) reconocieron que los eritrocitos que haban perdido sus compuestos de fosfato orgnico, particularmente ATP, no sobrevivan bien durante el almacenamiento. Inicialmente adicionaron adenosina como sustrato para la sntesis de ATP. Observaron que la adenina se deaminaba rpidamente a inosina y su atencin se centr entonces, en este compuesto (8). Estudios posteriores (9) establecieron que, s bien la adicin de inosina mejoraba la concentracin de ATP, no mejoraba los dems parmetros tenidos en cuenta para evaluar el deterioro de la clula durante el almacenamiento. Posteriormente, Nakao y cols demostraron la estrecha relacin entre los niveles de ATP y el mantenimiento de la forma normal del eritrocito (10). De la misma forma, demostraron la existencia de un mecanismo intracelular de sntesis y regeneracin de ATP a partir de inosina y adenina (11). Adems, evidenciaron que la viabilidad e integridad de los glbulos rojos dependa de los niveles de ATP (12). Luego Simon y cols comprobaron que la suplementacin del ACD con pequeas cantidades de adenina mejoraba la preservacin y viabilidad de los eritrocitos, y que este efecto era superior al de la inosina (13). Estos estudios llevaron a la aplicacin de los conservadores con adenina actuales. El descubrimiento en 1967 del papel del 2,3-DPG en la curva de disociacin del oxgeno de la hemoglobina por Chanutin y Curnish (14) y por Benesch y Benesch (15), centr la atencin en este compuesto. El citrato-fosfato-dextrosa (CPD) es el ACD con el agregado bifosfato de sodio (NaH2PO4H2O). Fue descrito por Gibson y cols (16) quienes demostraron que las concentraciones de fosfato y 2,3difosfoglicerato (2,3-DPG) de los eritrocitos eran ms altas, la hemlisis menor y la

viabilidad despus de las primeras 24 horas de la transfusin mayor comparada con el almacenamiento en ACD al cabo de 28 das. Wood y cols (17) utilizaron una solucin CPD enriquecida con adenina y ascorbato con una prolongacin en los niveles de 2,3-DPG y ATP y sin evidencia de toxicidad. El CPDA-1 (adenina, dextrosa, fosfato, citrato), el anticoagulante conservador estndar en este momento, permite almacenar los concentrados de glbulos durante 35 das (18). Las soluciones en evaluacin actual son el CPDA-2 y el CPDA-3, con ms adenina y glucosa que el CPDA-1 (19). Los nuevos esfuerzos para mantener el 2,3-DPG en altos niveles, llevaron al desarrollo de una nueva generacin de sustancias: las soluciones aditivas. El primer grupo de soluciones fue desarrollado por Wood y Beutler (20), quienes luego disearan una solucin aditiva basada en bicarbonato denominada BAGPM (21) (bicarbonato-adenina-glucosa-fosfato-manitol). El manitol se requera para prevenir la hemlisis excesiva de los eritrocitos privados de plasma a travs de un efecto osmtico al controlar su volumen (22). Solamente varios aos despus, cuando Hgman (23) introdujo una solucin aditiva simple, SAG (salina-adenina-glucosa) y subsecuentemente SAGMAN (SAG ms manitol), las soluciones aditivas se usaron clnicamente a gran escala. El efecto sobre el receptor de la disminucin en los niveles de 2,3,-DPG durante el almacenamiento es an controvertido. Histricamente se ha considerado que el nivel de ATP es un indicador de viabilidad; sin embargo, aunque los eritrocitos con muy bajos niveles de ATP no pueden fosforilar glucosa y mueren, altos niveles de ATP no aseguran su sobrevida durante el almacenamiento (5). Dentro de las soluciones aditivas utilizadas actualmente se encuentran AS-1 (Adsol), AS-3 (Nutricel) y AS-5 (Optisol), que permiten el adecuado almacenamiento de los eritrocitos durante 42 das (24). Recientemente han aparecido publicaciones que describen el uso de soluciones aditivas experimentales. Tal es el caso de la solucin EAS-61 (25) con la cual se logr un perodo de almacenamiento de 9 semanas. Otra de las soluciones aditivas experimentales es EAS-64 (26), con la que se alcanz un perodo de almacenamiento de 10 semanas. Los parmetros medidos al final del almacenamiento fueron mejores en comparacin con los resultados obtenidos en eritrocitos almacenados en AS-1 durante 6 semanas. Finalmente, con la solucin EAS-76 se alcanz un perodo de almacenamiento de 11 semanas cumpliendo con los criterios de hemlisis <1% y viabilidad >75% exigidos por la Administracin de Drogas y Alimentos de los Estados Unidos (FDA, por su siglas en ingls) (27). Adems de estas soluciones, que han sido diseadas p ara preservar eritrocitos que han sido recientemente recolectados, se han diseado soluciones para restaurar los niveles depletados de ATP y 2,3-DPG de clulas que han sido almacenadas por varias semanas. Estas soluciones rejuvenecedoras no son ampliamente usadas por su alto costo de produccin (28, 29).

Las tablas 1 y 2 demuestran algunas de las alteraciones fsicas y bioqumicas ocurridas a los eritrocitos durante el almacenamiento estndar. La temperatura aceptada y en la cual la sangre es almacenada es de 4C 2C. Otras temperaturas han sido estudiadas (30). Las temperaturas bajas proporcionan alguna mejora de la integridad bioqumica de la sangre almacenada, pero se incrementa el riesgo de congelamiento. Las temperaturas altas son indeseables ya que la tasa metablica de los eritrocitos almacenados se incrementa, resultando en una cada mayor del pH y en una prdida ms acelerada de 2,3-difosfoglicerato (2,3-DPG) y ATP, quiz debido al aumento en la concentracin de lactato y la disminucin del bicarbonato plasmtico (5, 31). Adicionalmente publicaciones recientes han demostrado que la hemlisis de los eritrocitos almacenados en la solucin aditiva AS-5 y expuestos a una temperatura de 25 durante 24 horas es inferior al 1%; la viabilidad de los eritrocitos almacenados en estas condiciones al cabo de 30 das se correlaciona con la obtenida en las unidades almacenadas convencionalmente 42 das despus de su recoleccin debido a la reducci n en la concentracin de ATP eritrocitario (32). Eritrocitos congelados Los eritrocitos se pueden conservar a travs de su congelacin. Esta prctica ha existido por ms de 50 aos (33), sin embargo, no es utilizada comnmente porque su tcnica es dispendiosa, costosa y con un potencial riesgoso de contaminacin bacteriana. En los diferentes mtodos utilizados para criopreservar los glbulos rojos se emplean agentes protectores como el glicerol. Cuando no se aaden dichos agentes se producen alteraciones por dos mecanismos. Durante el enfriamiento lento se destacan los efectos osmticos vinculados con el congelamiento del agua

extracelular, que precede al del agua intracelular. De esta forma, la concentracin de solutos extracelulares aumenta y crea un gradiente osmtico a travs de la membrana que deshidrata a la clula, cuando el enfriamiento es rpido se forma hielo en y alrededor de las clulas que se destruyen. El glicerol ingresa a la clula protegindola en virtud de sus propiedades coligantes o fijadoras de agua. La cantidad de hielo es menor y el nivel de solutos se reduce (3). El mtodo que usa glicerol al 40% (p/v) con almacenamiento congelado a -80C, aunque requiere lavado despus del congelamiento, es el mtodo ms aceptado. Los eritrocitos congelados as toleran amplias fluctuaciones de la temperatura sin deterioro, con la ventaja que no se requiere nitrgeno lquido para lograr -80C, usndose, en su lugar, congeladores convencionales (34). La sangre es recolectada en bolsas plsticas primarias de cloruro de polivinilo (PVC) de 800 mL en CPD o CPDA-1 con un sistema cudruple de bolsas de recoleccin (35). El congelamiento de los eritrocitos se puede realizar al cabo de 5 das o al final del tiempo mximo de almacenamiento, el cual depende de la solucin preservativa (CPD por 7-21 das o en CPDA-1 por 7-35 das). A su vez, antes de ser congelados los eritrocitos pueden ser rejuvenecidos con una solucin que contiene piruvato, inosina, fosfato y adenina (Rejuvesol), con lo cual se incrementan los niveles de 2,3-DPG y de ATP hasta un 150% de lo normal (34). Algunos estu dios han demostrado resultados satisfactorios con eritrocitos congelados con 40% (p/v) al -80C durante 21 aos (36). El mtodo para lavar los eritrocitos congelados con glicerol 40% (p/v) utiliza una solucin del cloruro de sodio (NaCl), glucosa y fosfato (37). La FDA permite almacenar los eritrocitos congelados con glicerol al 40% (p/v) a 80C hasta 10 aos luego de su recoleccin y requiere que las clulas descongeladas y desgliceroladas sean almacenadas a 4C por no ms de 24 horas porque las tcnicas de congelamiento utilizan sistemas abiertos con un potencial riesgo de contaminacin bacteriolgica. Sin embargo, recientemente algunos estudios (38) han mostrado que es posible mantener los eritrocitos despus del lavado almacenados a 4C en solucin AS-3 (Nutricell) durante 15 das y utilizando sistemas cerrados de congelamiento, conservando una calidad aceptable determinada por los parmetros actualmente admitidos para medir el deterioro metablico de los eritrocitos almacenados. Los eritrocitos humanos congelados con glicerol al 20% o al 40% tienen tasas de recuperacin de al menos 85%, valores de sobrevida postransfusin de 85% despus del lavado y almacenamiento a 4C por 24 horas, funcin transportadora de O2 normal, hemlisis mnima y no hay evidencia d e contaminacin (39). La posibilidad de almacenar eritrocitos durante mucho tiempo permite a los bancos de sangre asegurar el normal suministro en pocas de escasez o emergencia. Tambin es til congelar eritrocitos con antgenos seleccionados para pacientes con tipos sanguneos inusuales o mltiples anticuerpos. Adems, el transporte de sangre congelada es relativamente sencillo a cualquier parte. Si bien, la reduccin de las clulas blancas reduce la inmunogenicidad, la transmisin de citomegalovirus y el riesgo de enfermedad injerto contra husped (40); el congelamiento no inactiva los virus de la hepatitis B, C y el VIH (41). Otros estudios (42, 43) discuten la aplicabilidad de la radiacin gama sobre eritrocitos con el objeto de prevenir la enfermedad injerto versus hesped. CAMBIOS FSICOS Durante el almacenamiento los eritrocitos sufren una serie de cambios en sus propiedades fsicas que conllevan a alteraciones en su forma y funcin (44). Aparicin de formas anmalas y cambios en el volmen celular

El volumen de los eritrocitos durante el almacenamiento cambia relativamente poco; su forma en cambio, s tiene importantes modificaciones y pasa de ser un discocito a ser un equinocito o esferoequinocito. La transformacin discocitoequinocito ocurre cuando el ATP intracelular se agota (10), el contenido de calcio se eleva (45) y se exponen las clulas a pH alto. Tambin hay conversin discocitoequinocito cuando los eritrocitos son incubados en plasma a 37C durante 24 horas o es adicionado cido olico o lisolecitina al plasma fresco (46). Las clulas crenadas entonces aparecen en minutos con 10 a 30 espculas de longitud regular e igualmente distribuidas sobre la superficie. Se ha sugerido, pero no comprobado, que el mecanismo est relacionado con la lisolecitina y la enzima lecitina-colesterol acil-transferasa (L-CAT) (46). La deplecin de ATP provoca conversin reversible de los eritrocitos en esfero-equinocitos espiculados; la restauracin del ATP revierte el proceso (10). De otra parte, la transfor macin en discocitos-estomatocitos se produce por disminucin del pH, exposicin a agentes qumicos, particularmente compuestos detergentes catinicos, y aniones no penetrantes (47). Las clulas pierden la indentacin de un lado y la depresin opuesta se acenta. Como en los frotis fijados parece tener una boca o "estoma" en vez de un rea redondeada de palidez central, se los llama estomatocitos. Ms tarde se convierten en esferoestomatocitos y finalmente, en esferocitos con un hilio pequeo en el sitio del estoma previo. Estas clulas carecen de las espculas delicadas que caracterizan al estadio terminal del esferoctico preltico derivado de la discocitosis-equinocitosis (3). Se ha establecido que el discocito normal representa una forma ptima para la circulacin in vitro, ya que la transformacin a estomatocito podra alterar el paso a travs de la microcirculacin (por disminucin de la filtrabilidad celular), y la transformacin a equinocito podra alterar el flujo en los grandes vasos (por aumento de la viscosidad sangunea) (48). El almacenamiento de sangre reduce la deformabilidad del eritrocito por alteraciones en su morfologa y aumenta su agregabilidad en virtud de la disminucin del contenido de cido silico en la superficie, lo cual puede contribuir a desrdenes importantes en el flujo sanguneo, especialmente en pacientes con riesgo microcirculatorio (49). Hemlisis La hemlisis de las clulas ocurre gradualmente durante el almacenamiento. Ocurre mucho ms rpido cuando stas son almacenadas en soluciones aditivas que en su propio plasma (5). En las soluciones aditivas, el manitol tiene un importante efecto en la prevencin de la hemlisis y es uniformemente adicionado a estas soluciones por esta razn. Aunque inicialmente se pensaba que funcionaba como un sustituto osmticamente activo de las protenas plasmticas, evitando que las clulas sobrepasaran su "volumen hemoltico crtico" ste no es aparentemente su efecto principal. Cmo funciona el manitol es an desconocido (50). Al parecer, el equilibrio osmtico celular depende de otros factores tales como la deplecin del anin polivalente 2,3-DPG durante el almacenamiento y su reemplazo por otros aniones que ejercen un importante efecto osmtico por unidad de carga negativa, la parlisis que sufre la bomba Na+/K+ por la temperatura de almacenamiento y la cada progresiva del pH que afecta el movimiento de iones y lleva a un paulatino encogimiento celular. Fragilidad osmtica La fragilidad osmtica del eritrocito es la susceptibilidad que ste tiene de hemolisarse cuando es suspendido en un medio hipotnico. La fragilidad osmtica de los eritrocitos se incrementa durante el almacenamiento (51). Dicho incremento est relacionado con los cambios en la osmolaridad interna de las clulas

almacenadas. El principal factor que contribuye con este cambio es la acumulacin de lactato dentro de los eritrocitos. La segunda causa del incremento de la osmolaridad interna de los eritrocitos almacenados es probablemente el reemplazo del polianin 2,3-DPG por Cl-, que ejerce aproximadamente 3.7 veces ms efecto osmtico (52).Ya que la membrana es poco permeable al lactato, suspender los eritrocitos en soluciones salinas provoca el influjo de agua a la clula por el efecto osmtico de este soluto (53). Sin embargo, si los eritrocitos son equilibrados en una solucin salina isotnica, su fragilidad osmtica es cercana a la normal, an despus de un tiempo prolongado de almacenamiento (5). Hay si n embargo, alguna prdida de lpidos de membrana representada por una "cola frgil" en la curva de fragilidad osmtica. Dicha poblacin no recupera su fragilidad osmtica normal a pesar de ser resuspendidos en solucin isotnica. Al parecer existe una muy pequea correlacin entre el tamao de dicha cola y la viabilidad postransfusional (52). Durante el almacenamiento los eritrocitos se hacen menos deformables (54). Esta disminucin, demostrada por ectacitometra, se ha asociado con la prdida de lpidos de membrana (55). Sin embargo, la deformabilidad in vitro, aunque se correlaciona, no tiene el suficiente valor predictivo para predecir la viabilidad in vivo de los eritrocitos (5). Formacin de clulas densas Tradicionalmente se ha definido a las clulas densas como clulas falciformes (hemoglobina S) deshidratadas, rgidas y con una vida media reducida. La deshidratacin de las clulas falciformes homocigotas (SS) implica un incremento en la concentracin de hemoglobina corpuscular media (CHCM). Las clulas SS densas son reolgicamente incompetentes y contribuyen directamente a la vasoclusin. Tambin los eritrocitos normales pueden perder progresivamente su deformabilidad durante el almacenamiento, como bien se ha demostrado por ectacitometra (54), y podran llegar a producir vasoclusin, entre otros factores, por un incremento en la adherencia de la endotelio (56, 57). Las clulas SS son heterogneas con respecto al grado de deshidratacin, edad, niveles de hemoglobina F (HbF), y propiedades en el transporte de iones. Algunas clulas de densidad intermedia (ID) son discocitos densos, mientras que las clulas hiperdensas (HD) son en la mayora tanto de las clulas falciformes, como de los discocitos muy den sos (58). Los eritrocitos AA, CC y SS exhiben diferentes volmenes corpusculares, lo cual lleva a pensar que la estructura de la hemoglobina afecta la regulacin del volumen celular (59). Diversas interacciones entre transportadores de cationes median la deshidratacin de las clulas falciformes, incluyendo 1) un incremento no selectivo de la permeabilidad a cationes relacionado con alteraciones a nivel de la membrana; 2) un canal de potasio dependiente de Ca++ (Gardos), y 3) el cotransportador KCl. Los dos ltimos, vas normales en clulas eritroides inmaduras pero hiperactivos en las clulas falciformes. La formacin de las clulas ID ocurre principalmente a travs del cotransportador KCl. Inhibidores del cotransportador en eritrocitos humanos como el NO3-, el DIOA y el cido okadaico inhiben fuertemente la formacin de clulas ID (60). Tambin ocurre formacin de clulas ID en eritrocitos con rasgo falciforme (clulas AS), con otras hemoglobinopatas (enfermedad SC y enfermedad D) e incluso en eritrocit os normales durante el almacenamiento bajo condiciones de banco de sangre (61). En general, las clulas falciformes tienen anormalidades severas en su membrana en virtud de la alta oxidacin de sus componentes. Generan aproximadamente dos veces la cantidad de especies de oxgeno reactivas que los eritrocitos control. La razn de este incremento es el resultado de la autoxidacin acelerada de la HbS a metahemoglobina, una conversin que causa liberacin de Hem (62). Los niveles de glutatin reducido estn disminuidos en un 20% en los eritrocitos SS, comparados con reticulocitos control, y son bajos en los eritrocitos SS de alta densidad comparados con los eritrocitos SS de baja densidad. Los niveles disminuidos de glutatin reducido se relacionan con una menor

actividad de glutatin reductasa, una mayor actividad de glutatin peroxidasa, e inhibicin de la va de las pentosas fosfato en los eritrocitos SS. De esta forma, las clulas falciformes tienen incrementadas las especies reactivas del oxgeno y niveles disminuidos de GSH para protegerse contra el dao oxidativo. Esta combinacin es probablemente responsable de la oxidacin de los grupos tiol de muchas protenas. Experimentalmente se ha mostrado que la N-acetilcistena (NAC) puede bloquear la formacin de clulas densas in vitro (63). Ya que las clulas densas constituyen el mayor porcentaje de drepanocitos, la NAC tambin disminuye la formacin de estos. La reduccin de los drepanocitos relacionada con la NAC se acompaa de un incremento en los tioles de la -actina. Por lo tanto existen dos posibles mecanismos por los cuales la NAC bloquea la formacin de clulas densas y falciformes: los canales de K+ y la -actina. FICHA TCNICA Se realiz una bsqueda computadorizada de artculos sin lmite de idioma ni fecha de publicacin en las bases de datos PubMedQuery, PubMedCentral e Infotrieve de MEDLINE, adems en las bases de datos en CD Medical-Journals y Medical-Library, con lmites de fechas 1994 a 1999 y 1986 a 1999 respectivamente. Las palabras clave fueron: "red blood cells", "preservation", "blood bank", "transfusion", excluyendo las palabras "leukocyte" y "platelets". Se obtuvieron 388 resultados. El proceso de seleccin de los artculos fue segn la pertinencia del ttulo de cada registro para resolver el objetivo general de la revisin. Luego de los artculos seleccionados, se procedi a obtener algunas de las referencias citadas en dichos artculos y que tambin resultaban pertinentes. Para la evaluacin de la validez se tuvo en cuenta que todos los trabajos experimentales fueran llevados a cabo en sangre humana y que su metodologa fuera adecuada para alcanzar el objetivo que plantean y adems, permitiera llegar a las concl usiones propuestas. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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