Introduccin

La cromatografa en capa fina se basa en la preparacin de una capa, uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensin, otro para aplicar la capa de adsorbente, y una cmara en la que se desarrollen las placas cubiertas. Es preciso tambin poder guardar con facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas. La fase mvil es lquida y la fase estacionaria consiste en un slido. La fase estacionaria ser un componente polar y el eluyente ser por lo general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los componentes que se desplacen con mayor velocidad sern los menos polares. Polaridad de los compuestos orgnicos en orden creciente: hidrocarburos < olefinas < fluor < cloro < nitro < aldehdo aldehdo < ester < alcohol < cetonas < aminas < cidos < amidas

Ventajas de la cromatografa en capa fina

La cromatografa en capa fina presenta una serie de ventajas frente a otros mtodos cromatogrficos (en columna, en papel, en fase gaseosa, ...) ya que el utillaje que precisa es ms simple. El tiempo que se necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la separacin es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores corrosivos, que sobre papel destruiran el cromatograma. El mtodo es simple y los resultados son fcilmente reproducibles, lo que hace que sea un mtodo adecuado para fines analticos.

Adsorbentes
Al realizar la eleccin del adsorbente se debe tener en cuenta el tamao de las partculas del adsorbente, cuanto ms finamente dividido est mayor ser su adhesin al soporte, aunque tambin se le puede aadir un adherente (yeso,...). Algunos de los adsorventes ms utilizados son:
y y y y y y y

Celulosa Almidn Azucares Gel de slice (silicagel) xido de aluminio (almina) Carbn activo (carbn en polvo) Kieselguhr

Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales de plantas y animales.

Silicagel
El gel de slice o cido silcico es uno de los ms utilizados, es dbilmente cido, su pH oscila entre 4-5. Con lo cual no se deber utilizar con sustancias que se corrompan con los cidos. Los geles de slice normales suelen contener impurezas de hierro y/o aluminio, este factor tambin se debe tener en cuentas respecto al uso de componentes. El tamao del grano suele ser de 10 a 40 micras () y el tamao de poro vara de 20 a 150. Generalmente lleva incorporado un agente aglomerante, yeso (sulfato de clcico semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente. Tambin han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta, juntos o por separados (amarillo y/o verde), en diversos tipos de gel de slice. Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH, de forma que se haga apto para separar componentes lipfilos (esteroides, cidos grasos, ceras, vitaminas liposolubles, etc). A este proceso se le denomina cromatografa de fase reversa (silanizado).

Almina
La almina u xido de aluminio es un adsorbente ligeramente bsico debido a que en el proceso de extraccin de la almina a partir de la bauxita quedan algunas molculas de hidrxido de aluminio adheridas a la almina, dndole a sta un carcter bsico. No consigue un desarrollo tan alto de la sustancia depositada como el gel de slice. La almina puede ser tratada qumicamente para conseguir alminas cidas, bsicas y neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores ultravioletas. Es un adsorbente de carcter polar, de tal forma que retendr con mayor avidez a los componentes polares.

Preparacin de placas.
El adsorvente se desle en agua destilada. Para mezclar la papilla homogneamente es preferible agitar de modo mecnico. La proporcin de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. Dos parte de agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma general, no obstante, habrn de consultarse la instrucciones del fabricante. Originariamente se utilizaban, como soporte del adsorbente, lminas de vidrio, pero en la actualidad tambin se utilizan lminas de otros compuestos orgnicos ms flexibles. Dependiendo del tipo de separacin que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizar un tamao de placa u otro. En general para realizar una separacin preparativa de un gramo de muestra es necesario una placa de vidrio de 20x20 cm., 35 gramos de adsorbente y 80 ml. de agua destilada. Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la adicin de compuestos tales como disoluciones tamponadoras para mantener el pH deseado. En la preparacin de las placas tambin se pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes.

Cabe destacar la adicin de nitrato de plata (AgNO3), a este proceso se le denomina argentacin, y se utiliza para separar componentes insaturados. El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la placa, en general suele ser de: 0.1-0.2 mm. para separaciones analticas. 0.5- 2 mm. para separaciones preparativas. La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades, que afectaran al desarrollo del proceso cromatogrfico. Para ello existen en el mercado extensores que se utilizan para crear de forma mecnica placas homogneas del espesor deseado. Si no se disponer de extensor, el proceso a seguir es el siguiente: 1. 2. 3. 4. 5. Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente. Agitar enrgicamente. Extender la papilla sobre el soporte de vidrio. Hacer oscilar la papilla de un lado a otro. Golpear con el dedo la parte inferior del soporte.

Las placas, normalmente, se dejan reposar un corto espacio de tiempo despus de cubrirlas; luego se colocan en bandejas metlicas. En este momento puede activarse el agente adsorbente, bien dejando las placas reposar toda la noche a temperatura ambiente, bien calentndolas durante 30-60 minutos a 105-110 C (las placas de celulosa no deben calentarse ms de 10 minutos a 105 C) para expulsar as el aire. Es conveniente dejar secar las placas inicialmente al aire, para evitar los agrietamientos que se produciran por efecto del cambio de temperatura.

Aplicacin de las muestras

Los productos a examinar se disolvern, cuando sea posible, en un disolvente orgnico no polar que tenga un punto de ebullicin lo suficientemente bajo para que se evapore despus de la aplicacin.. Sin embargo a menudo se necesitan disolventes polares; la mezcla cloroformo:metanol (1:1) es efectiva. Frecuentemente se emplean disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 l resulta en la carga 20 g de producto slido. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar 0.1 g de material; por esto con esta carga puede llegarse a observar un 5% de impurezas. Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para realizar el proceso de siembra de la muestra a analizar. Tambin pueden usarse tubos capilares. El proceso de siembra se realiza tocando con la punta del capilar (micropipeta, jeringuilla, etc) sobre la placa preparada. Dejando una distancia al borde inferior de un centmetro aproximadamente. El punto de aplicacin de la muestra se denomina toque. Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de forma que en la placa solo quedar la muestra a analizar.

Eleccin del eluyente

La eleccin del eluyente depender lgicamente del componente que se va a separar y del material en que la separacin se lleva a cabo. Principales eluyentes en orden creciente de polaridad: Eter de petrleo. Eter dietlico. Ciclohexano. Acetato de etilo. Tetracloruro de carbono.* Piridina. Benceno.* Etanol. Cloroformo.* Metanol. Diclorometano. Agua. cido actico.
*compuestos cancergenos.

En la eleccin del eluyente influyen varios factores:

y y y y y

Precio. Pureza. No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad). No utilizar compuestos muy voltiles. Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).

La eleccin del eluyente se realiza de forma emprica. Hay que estudiar la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.

a) Toque de la muestra sin aplicar ningn eluyente. b) Aplicando un eluyente poco polar. c) Aplicando un eluyente ms polar. Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes ms polares, hasta dar con el ms apropiado. Otra tcnica para realizar la eleccin del eluyente consiste en sembrar varias muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se aprecie el eluyente con el cual la separacin se realiza de una manera ms eficaz.

Desarrollo de la cromatografa
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente por el mtodo ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda por una placa casi en vertical, por la accin de la capilaridad. La cromatografa se realiza en una cubeta. Para conseguir la mxima saturacin posible de la atmsfera de la cmara, las parades se tapizan con papel impregnado del eluyente. A veces pueden obtenerse separaciones mejores sin poner papeles en las paredes, cosa que no debe olvidarse. Generalmente el eluyente se introduce en la cmara una hora antes del desarrollo, para permitir la saturacin de la atmsfera. El tiempo de desarrollo, por lo general, no llega a los 30 minutos. El tiempo de una cromatografa cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que el tiempo de una cromatografa preparativa puede llegar a un par de horas. Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta que se alcance una lnea dibujada a una distancia fija desde el origen. Esto se hace para estandarizar los valores de RF. Frecuentemente esta distancia es de 10 cm.; parece ser la ms conveniente para medir valores de RF. Despus del desarrollo, las placas pueden secarse rpidamente con una corriente de aire caliente.

La mejor posicin de desarrollo para un componente es el punto medio entre el origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. El frente del eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa. Si la placa se estropea por accin del aire o de la luz, se secar en una cmara que contenga un gas inerte o aislada de la luz.

Localizacin de sustancias
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la posicin de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de mtodos:
y y

Mtodos qumicos. Mtodos fsicos.

Mtodos qumicos
Consisten en ralizar una reaccin qumica entre un reactivo revelador y los componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los reactivos reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una pera de goma, o mediante un dispositivo que proporcione aire comprimido. Es preferible pulverizar con las placas en posicin horizontal. Si el reactivo revelador es peligroso o muy corrosivo, la pulverizacin deber realizarse en una vitrina de gases bien ventilada. La pulverizacin se realizar poco a poco. En cromatografa en capa fina no puede realizarse el baado del cromatograma (en cromatografa en papel s). Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma complejos coloreados con los componentes orgnicos (con tonos amarillo-marrn), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo que es conveniente sealar las manchas aparecidas. Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que reacciona con los componentes orgnicos produciendo manchas negras. El tamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de componente separado. Adems de estos reveladores generales, existen otros especficos:
y y y y

2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas). Verde de bromocresol (para cidos carboxlicos). Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas). Ninhidrina (para aminocidos).

Mtodos fsicos.

El ms comn consiste en aadir al adsorbente un indicador fluorescente. De tal forma que al colocar la placa bajo una lmpara ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda, aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente excepto donde hay componentes. Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal) con lo que pueden ser detectados directamente en una lmpara de ultravioleta.

Constantes Rf Y Rx
La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de expresar la posicin de un compuesto sobre una placa como una fraccin decimal, mide la retencin de un componente. Se define como:

La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el centro de la mancha, los clculos se simplifican si el denominador es 10. Para que los RF sean reproducibles deben ser fijadas una serie de condiciones (Espesor de la placa, fase mvil, fase estacionaria, cantidad de muestra). El mximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo ideal es un RF entre 0.65 y 0.7. Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez desarrollados se calculan los RF y si son distintos, puede deducirse con toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. Por el contrario si los RF son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo. Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, hasta apreciar una separacin mnima. En este caso no se pueden usar reveladores qumicos, ya que alteraran los compuestos, sino indIcador ultravioleta. Tambin se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un compuesto (X), que tenga una posicin de desarrollo conveniente; todos los dems compuestos sobre la placa se relacionan con ste. De esta manera se tiene el , RX , ya que: