DIAGNOSTICO DE LAS ENFERMEDADES VIRALES El diagnostico virolgico requiere comunicacin entre el mdico y su laboratorio; adems, depende de la calidad de las

muestras y del a informacin suministrada por el laboratorio. La eleccin de los mtodos para confirmacin de una infeccin viral en el laboratorio depende de la etapa de la enfermedad (cuadro 47-4). Las pruebas anticuerpos requieren muestras recolectadas a intervalos apropiados, y el diagnostico a menudo no se confirma sino hasta la convalecencia. Se requiere aislamientos de virus o deteccin de antgenos cuando: 1)aparecen nuevas epidemias, como la influenza. 2)las pruebas serolgicas no son tiles; y 3)varios agentes diferentes pueden causar la misma enfermedad clnica. Por ejemplo, la meningitis asptica (no bacteriana) puede ser causada por muchos virus diferentes: de manera similar, los sndromes de enfermedades respiratorias pueden ser causados por muchos virus y tambin por micoplasma y otros agentes.

Los mtodos diagnsticos basados en las tcnicas de amplificacin de cidos nucledos pronto reemplazaran algunas, pero no todas, las tcnicas de cultivo de virus. Sin embargo, la necesidad de recoleccin apropiada de muestras y la correcta interpretacin de las pruebas no cambiaran. Adems, siempre habr ocasiones en que sea deseable la recuperacin del agente infeccioso. El aislamiento de un virus puede no establecer la causa de una determinada enfermedad, deben considerarse muchos otros factores. Algunos virus persisten en el husped humano durante periodos prolongados y, por tanto, el aislamiento de herpesvirus, poliovirus, echovirus o coxsackievirus de un paciente con una enfermedad no diagnosticada no prueba que el virus sea la causa de un cuadro clnico especifico se deben establecer patrones epidemiolgico y clnico consistentes. Muchos virus son ms fciles de aislar durante los primeros das de la enfermedad. Las muestras que se emplean en los intentos de aislamiento de virus se presentan en el cuadro 47-5. Una correlacin entre el aislamiento de virus y la presencia de anticuerpos ayuda a establecer diagnostico. Las muestras pueden refrigerarse hasta por 24 horas antes de efectuar el cultivo de virus, con excepcin del virus de respiratorio sincitial y algunos otros. De otra manera, el material debe congelarse (de preferencia a -60oC o mas frio) si hay un retardo en enviar la muestra al laboratorio. Las muestras que no deben congelarse incluyen: 1)la sangre completa extrada para la determinacin de anticuerpos, de la cual debe de separase el suero antes de congelarla; y 2)tejido para cultivo de rgano o clulas que deben de mantenerse a 4 oC y enviar al laboratorio con prontitud.

Los virus se presentan en enfermedades respiratorias en las secreciones farngeas o nasales. Los virus se pueden demostrar en lquido y en los raspados de las bases de las vesculas. En infecciones oculares, el virus es detectable en frotis o raspado conjuntival y en las lagrimas. Las encefalitis suelen diagnosticarse con mayor facilidad a travs de los medios serolgicos, los arbovirus y los herpesvirus no se recuperan comnmente del lquido cefalorraqudeo, pero el tejido cerebral del paciente con encefalitis viral puede producir el virus causante. En las enfermedades vinculadas con enterovirus, como la enfermedad del sistema nervioso central , la pericarditis aguda o la miocarditis, se pueden aislar virus de las heces, del frotis farngeo o del lquido cefalorraqudeo. Las pruebas directas con anticuerpos fluorescentes son tan sensibles como el cultivo para detectar las infecciones de vas respiratorias como virus sincitial, virus de la influenza A y , virus de la parainfluenza y adenovirus. Estas pruebas proporcionaran respuestas en unas cuantas horas despus de recolectar la muestra, en comparacin en das para el cultivo de virus, por esta razn se han convertido en las pruebas preferidas para el diagnostico etiolgico de las infecciones virales del aparato respiratorio.

Examen directo de material clnico: microscopia y tinciones

Las enfermedades virales para las cuales el examen microscpico directo de las improntas o frotis ha mostrado utilidad incluyen la rabia, la infeccin por herpes simple y la infeccin por varicela zoster. La tincin de los antgenos virales como inmunofluorescencia en un frotis de cerebro y en impresiones corneales de animal rabioso y de humanos es el mtodo preferido para el diagnostico de rutina de la rabia.

Cultivo de Virus
A. Preparacin del Inoculo Los materiales lquidos libres de bacterias como el liquido cefalorraqudeo, la sangre completa el plasma o la capa sobrenadante de leucocitos pueden inocularse directamente en cultivo de clulas o despus de diluirse con solucin amortiguadora de fosfato (PH 7.6). La inoculacin de huevos embrionarios o de animales para el aislamiento del virus generalmente se efecta solo en laboratorios especializados. El tejido se lava en medio de cultivo o de agua estril, se corta en pedazos pequeos con tijeras y se muele para hacer una pasta homognea se aade diluyente en cantidades suficientes para hacer una concentracin de 10 a 20% (peso/volumen). En suspensin puede centrifugarse a velocidad baja (no>2000 rpm) durante 10 minutos para sedimentar los residuos celulares insolubles. Se puede inocula el liquido sobrenadante; si hay bacterias, se eliminan segn se estudia ms adelante. Los residuos tambin pueden ser tripsinados, y la suspensin de clulas resultante puede ser: 1) inoculada sobre una monocapa de clulas de un cultivo de tejido existente, o 2) cocultivarse con otra suspensin de clulas conocidas libres del virus. Si el material sometido a prueba contiene bacterias (exudado farngeo, heces, orina, tejido infectado, o insectos), estas deben inactivarse o retirarse antes de la inoculacin. 1.- Bactericidas:

a) Antibiticos: se emplean comnmente en combinacin con la centrifugacin diferencial. b) ter: se puede aadir ter en concentraciones de 10 a 15% si no es daino para el virus en cuestin (por ejemplo enterovirus, vacuna). 2.- Mtodos mecnicos: a) Filtros: las membranas filtro tipo miliporo de acetato de celulosa o un material inerte similar a las preferidas. b) Centrifugacin diferencial: este es un mtodo conveniente para eliminar muchas bacterias de preparaciones de virus pequeos fuertemente contaminadas. Las bacterias se sedimentan a velocidades bajas que no sedimentan los virus y luego por centrifugacin a velocidad alta se sedimentan los virus. El sedimento que contiene los virus se resuspende despus en un pequeo volumen. B. Cultivo en cultivo de clulas Las tcnicas para cultivo de clulas son las ms ampliamente utilizadas para el aislamiento de los virus en las muestras clnicas. Cuando los virus se multiplican en cultivos de clulas producen efectos biolgicos (por ejemplo, cambios citopticos, interferencia viral, produccin de una hemaglutinina) que permite la identificacin del agente. Los cultivos en tubo de ensayo se preparan al aadir las clulas suspendidas en 1 a 2 ml de lquido nutriente que contiene solucin balanceada de sales y varios factores de crecimiento (generalmente suero, glucosa, aminocidos y vitaminas). Las clulas de naturaleza fibroblstica o epitelial se unen a la pared del tubo de ensayo y crecen all, donde pueden examinarse con ayuda de un microscopio de poco aumento. Con muchos virus el crecimiento del agente tiene lugar simultneamente con la degeneracin de estas clulas (figura 47-1). Algunos virus producen un efecto citoptico caracterstica comnmente denominado CPE, en cultivo de clulas, el cual hace posible un diagnostico de presuncin rpido cuando se conoce el sndrome clnico. Por ejemplo, el virus respiratorio sincitial produce de manera caracterstica clulas gigantes multinucleadas, en tanto que los adenovirus producen formaciones similares a racimos de uvas de clulas redondas grandes; los rinovirus producen reas focales de formas redondeadas y dendrticas, el virus del herpes simple produce clulas difusas uniformemente esfricas. Algunos virus (por ejemplo el virus de la rubola) no producen cambios citopticos directos, pero no pueden detectarse por su interferencia con el efecto citoptico de un segundo virus inductor (interferencia viral). El virus de la influenza y algunos paramixovirus pueden detectarse en 24 a 48 horas si se aaden eritrocitos a los cultivos infectados. Los virus que maduran en la membrana celular producen una hemaglutinina que permite al eritrocito absorberse en la superficie de la clula (hemadsorcin). La identidad de un aislado del virus se establece con antisuero de tipo especifico, que inhibe el desarrollo del virus o reacciona con antgenos virales. En el cultivo se pueden desarrollar algunos virus, pero es un proceso muy lento y arduo. Se emplean pruebas alternas en vez del cultivo para diagnosticar esta clase de infecciones.

C. Cultivo en frasco cpsula Este mtodo permite la deteccin rpida de virus en muestras clnicas. Se ha adaptado por varios virus, incluso citomegalovirus y virus de la varicela zoster. Por ejemplo, el CMV en 18 a 24 horas en comparacin con 2 a 4 semanas en el cultivo clsico de clulas; la sensibilidad de los cultivos en frasco cpsula y en cultivo clsico de clulas para CMV son comparables. Monocapas de la lnea celular apropiada (por ejemplo clulas MRC-5 para CMV) crecen en monocapas sobre cubreobjetos en frascos capsulas de 15 x 45 mm. Despus de la inoculacin con la muestra, los frascos se centrifugan a 700 x g durante 40 minutos a temperatura ambiente. Los frascos se incuban a 37 oC durante 16 a 24 horas, se fijan, y reaccionan con un anticuerpo monoclonal especfico para la protena nuclear CMV

presente muy al principio en el cultivo; varios de estos anticuerpos estn disponibles en el comercio. Mtodos de tincin directa o indirecta con anticuerpos y microscopia de fluorescencia se emplean para determinar la positividad del cultivo en el frasco cpsula. Los frascos control positivo y negativo se incluyen en cada prueba que se corren. Los aislados no se obtienen mediante la tcnica del frasco cpsula. Si se requieren aislados para realizar pruebas de susceptibilidad a los antivirales se deben emplear la tcnica clsica en cultivo de clulas.

DETECCIN DEL ANTGENO La deteccin de antgenos virales se usa de manera extensa en virologa. hay equipos comerciales para detectar muchos virus, inclyendo herpes simple I y II, influenza A y B, virus sincitial respiratorio, adenovirus, virus de paraimfluenza, rotavirus y citomegalovirus. Tambin se emplean varios tipos de pruebas: inmunoensayo enzimtico, anticuerpo fluorescente directo, anticuerpo fluorescente indirecto, aglutinacin de ltex, etc. Las ventajas de estos procedimientos son que permiten la deteccin directa de virus que no crecen con facilidad en cultivos de clulas o que se desarrollan de manera muy lenta. En general, las pruebas de deteccin de antgeno para virus son menos sensibles que los mtodos de cultivo viral y amplificacin de cido nucleico. Amplificacin y deteccin de cido nucleico Existe una amplia variedad de pruebas comerciales para detectar cido nucleico viral o para amplificarlo y detectarlo. Estos procedimientos se estn convirtiendo en los estndares para la virologa diagnstica, sustituyendo las tcnicas tradicionales de cultivo de virus y deteccin de antgeno. Los otros mtodos son PCR, PCR para transcriptasa reversa y otros mtodos patentados. Los procedimientos permiten la deteccin de virus, as como la cuantificacin de los virus (p.ej., VIH-1, citomegalovirus, virus Epstein-Barr). Los datos de pruebas cuantitativas se emplean para guiar la terapia antiviral en enfermedades virales mltiples. Hibridacin de cidos nucleicos La hibridacin de acidos nucleicos para detectar virus es muy sensible y especfica. La muestra se coloca sobre una membrana de nitrocelulosa y el cido nucleico viral presente en la muestra se le une; a continuacin se desnaturaliza con un lcali in situ, se hibrida con un fragmento de acido nucleico viral marcado, y se detectan los productos hibridados. Para los rotavirus, que contienen RNA de doble cadena, el mtodo de hibridacin en punto es incluso ms sensible que el EIA. MEDICIN DE LA RESPUETSA INMUNE PARA LA INFECCIN POR VIRUS Tpicamente, una infeccin por virus induce respuesta inmunitaria dirigida contra uno o mas de los antgenos virales. Generalmente se desarrollan respuestas inmunitarias celular y humoral, y se puede emplear la medicin de cualquiera de ella para diagnosticar una infeccin viral. La inmunidad celular se puede evaluar por la hipersensibilidad drmica, la transformacin de los linfocitos y las pruebas de citotoxicidad. La repuesta inmunitaria humoral tiene mayor importancia diagnstica. Los anticuerpos de tipo IgM aparecen inicialmente y van seguidos de los anticuerpos IgG. Los anticuerpos IgM desaparecen en algunas semanas, en tanto que los anticuerpos IgG persisten durante muchos aos. El establecimiento del diagnostico de una infeccin viral se logra serolgicamente al demostrar el aumento en el ttulo de los anticuerpos al virus o los anticuerpos antivirales del tipo IgM. Los mtodos que se emplean son prueba de neutralizacin(Nt), Prueba de fijacin del complemento (FC), prueba de inhibicin de hemaglutinacin(HI) y prueba de inmunofluorescencia (IF), hemaglutinacin pasiva e inmunodifusin.

Cuando estn disponibles, las pruebas de hipersensibilidad drmica para medir la respuesta inmunes celulares ofrecen ciertas ventajas en la determinacin fcil y rpida antes de la exposicin a agentes infecciosos. INMUNOMICROSCOPIA ELECTRNICA Los virus no detectables por tcnicas convencionales pueden observarse mediante inmunomicroscopia electrnica (IEM). Los complejos antgeno- anticuerpo o los agregados formados entre las partculas virales en suspensin son causados por la presencia de anticuerpos en el antisuero aadido y se detectan ms fcilmente y con mayor precisin que las partculas virales individuales. Se emplean la IEM para detectar los virus que causan enteritis y diarrea; estos virus en general no pueden cultivarse en cultivo standard para virus. El rotavirus se detecta mediante EIA.

Fundamentos y Tipos de ELISAs. El ELISA se basa e el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte (inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotmetro o un colormetro. Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuacin: Anticuerpos marcados: ELISA Directo ELISA Indirecto ELISA sndwich Doble (DAS) Heterlogo (HADAS) Antgeno marcado ELISA competitivo

ELISA Directo. Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble (tapizado) de antgenos especficos. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de anticuerpos marcados (conjugados) con una enzima; si los anticuerpos reaccionan con los antgenos, el complejo quedar solubilizado. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Indirecto. Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de estudio. Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados. Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

 Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. Pasos generales de un ELISA. 1. Tapizado del pocillo con el antgeno o anticuerpo. 2. Adicin de la muestra problema con la mezcla de antgenos o anticuerpos. 3. Unin del antgeno o anticuerpo especfico al anticuerpo o antgeno tapizado en el pocillo 4. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de antgeno o anticuerpo no unido 5. Adicin del anticuerpo secundario marcado con la enzima 6. Unin del anticuerpo secundario al antgeno o anticuerpo 7. Lavado del pocillo para eliminar el exceso de enzima no unida 8. Adicin del substrato 9. Unin del substrato a la enzima 10. Desarrollo del color

ELISA Sndwich DAS (Double Antibody Sandwich). Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte) conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos marcados que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Sndwich HADAS. Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adicin de la muestra problema (extracto vegetal, sangre, suero, plasma, etc.), de tal forma que si est presente el agente patgeno de diagnstico (antgeno), reaccionar especficamente con los anticuerpos fijados al soporte. Lavado para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado y los restos de la muestra no fijados. Adicin de anticuerpos especficos del antgeno a detectar (deben tener un eptopo diferente de los anticuerpos con los que se han tapizado el soporte), los cuales reaccionan con los antgenos aadidos con la muestra problema y que se encuentran fijados a los anticuerpos. Lavado para eliminar los anticuerpos que no hayan reaccionado. Adicin de anticuerpos conjugados con una enzima anti-anticuerpos empleados en el paso anterior. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.

 Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado. ELISA Competitivo. Consta de las siguientes etapas: Fijacin al soporte insoluble de anticuerpos especficos del agente patgeno a detectar. Lavado para eliminar los anticuerpos fijados deficientemente o no fijados. Adicin en concentracin conocida de una mezcla de antgenos del anticuerpo utilizado en el paso anterior, marcados con una enzima y antgenos desconocidos objeto de estudio. Paralelamente, aadir nicamente antgenos del anticuerpo usado en el paso anterior, marcados con una enzima. Lavar para eliminar los antgenos que no hayan reaccionado. Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede parar la reaccin si se desea. Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado de ambas pruebas y comparar los resultados. Si las lecturas de ambas pruebas son anlogas, el antgeno a estudio no tienen nada que ver con los anticuerpos empleados para tapizar el soporte. Si hay diferencia en las lecturas de ambos pocillos, el antgeno objeto de estudio, est relacionado serolgicamente con el anticuerpo empleado para tapizar el soporte y la diferencia de densidad ptica, es proporcional a la concentracin del antgeno problema en la muestra. Todos los tipos de ELISAs descritos se pueden resumir en dos grandes grupos: ELISAs para detectar antgenos: ELISAs sndwich. ELISAs para detectar anticuerpos: ELISAs indirectos. La fase slida debe ser de un tipo que permita un fcil manejo (especialmente en los procesos de lavado) y la reproducibilidad de la unin de antgenos o anticuerpos sobre su superficie. Las microplacas de 96 pocillos y un volumen de 350L son especialmente ventajosas para procesar un elevado nmero de muestras y un vez tapizadas, el material inmovilizado permanece reactivo mucho tiempo siempre que se mantenga seco y a baja temperatura. Normalmente se utilizan microplacas de poliestireno de fondo plano que pueden adquirirse estriles y con o sin tapa. Lectura e interpretacin de los resultados. La lectura de los resultados puede ser valorada tanto visual como colorimtricamente. A simple vista, pueden ser ledos ciertos ensayos rutinarios en los que no haga falta una cuantificacin y no se presenten abundantes casos dudosos (el ojo humano no es capaz de discernir una variacin de 0,1 de densidad ptica) ya que dicha lectura visual tendr el inconveniente de la subjetividad y el de diagnosticar equivocadamente los casos lmite. No obstante, evita la adquisicin de aparatos relativamente costosos como son los lectores de microplacas. Una de las grandes ventajas de la tcnica ELISA es la posible automatizacin de la lectura y, por lo tanto, su objetividad. Dicha automatizacin se puede conseguir con un simple colormetro o espectrofotmetro de cubeta o con sofisticados equipos de lectura automtica de microplacas. Los resultados finales de la lectura colorimtrica se reflejan numricamente mediante valores de absorbancia o densidad ptica que se obtendrn a la longitud de onda ms adecuada para la coloracin final alcanzada.

Aplicaciones del ELISA. Patologa Animal Enfermedades producidas por parsitos Babesias y tripanosomas Toxocara canis Toxoplasmosis Triquinosis Enfermedades producidas por Micoplasmas Enfermedades producidas por bacterias Mycobacterium tuberculosis Brucelas Enterotoxinas Vibrio cholerae Estreptococos Salmonelas Enfermedades producidas por virus Enfermedad de Aujeszky Enfermedad de Newcstle Fiebre aftosa Leucemia felina Peste porcina africana Peste porcina clsica Rinotraqueitis infecciosa Rotavirus Artritis vrica Otras aplicaciones Hormonas Gonadotropina corinica Progesterona Testosterona Hormonas tiroideas Cuantificacin de inmunoglobulinas IgG IgE IgA Inmunopatologa Anticuerpos anti-DNA Factor reumatoide Inmunocomplejos circulantes

Patologa Vegetal Enfermedades producidas virus En frutales PPV CLSV TRSV En ctricos CTV En patata PLRV PVY PVX PVA TRV En cereales En guisante En lpulo En soja En ornamentales En plantas hortcolas Enfermedades producidas bacterias Enfermedades producidas Micoplasmas Enfermedades producidas hongos

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WESTERN BLOT El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada para detectar protenas especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la protena de inters con anticuerpos especficos contra ella. Finalmente, se detecta la unin antgeno-anticuerpo por actividad enzimtica, fluorescencia. De esta forma se puede estudiar la presencia de

la protena en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras protenas. Esta tcnica es hoy en da imprescindible en varios campos de la biologa, como la biologa molecular, la bioqumica, la biotecnologa o la inmunologa. Existe toda una industria especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de miles de protenas diferentes. LECTURA DE RESULTADOS

1. Negativo:
Significa que no se detectan anticuerpos especficos para la enfermedad estudiada y que el ELISA previo que dio positivo fue un falso positivo. Sin embargo, no descarta la posibilidad de una infeccin que se encuentre en perodo de ventana.

2. Positivo:
Significa que los anticuerpos encontrados son especficos para la enfermedad estudiada y confirma la infeccin por este virus 3. Indeterminado:

Es un resultado inconcluyente, pues aun cuando presenta alguna reactividad, sta no cumple con los criterios de interpretacin para considerarlo positivo; este tipo de resultado se puede presentar algunas veces en la etapa inicial de la infeccin y en otros casos por factores inherentes a la muestra y no relacionados con la enfermedad estudiada; requiere seguimiento y asesora pues an no se puede precisar o descartar la presencia del virus.

APLICACIONES Investigacin Actualmente, el Western blot es una de las tcnicas ms usadas en el estudio de la biologa molecular. Diagnstico

Prueba de VIH: se buscan, mediante Western blot, los anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Se transfieren a una membrana las protenas de clulas que, se sabe, estn infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hay que probar con esta membrana. Este paso es equivalente a la incubacin con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero, sern estos los que realizen el papel de anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a

incubar con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima-seal. La aparicin de bandas indica la presencia de protenas contra las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo. Se emplea como prueba definitiva de la encefalopata espongiforme bovina, comnmente llamada "enfermedad de las vacas locas". Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot. En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la presencia del FIV en gatos.