PRCTICA 2. PROPIEDADES DE AMINOCIDOS Y PROTEINAS.

INTRODUCCION A. AMINOACIDOS. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA. Los -aminocidos son las unidades estructurales de las protenas. Se caracterizan por la presencia sobre el mismo carbono (C ) de un grupo bsico (amino, NH2 o NH3+) y un grupo cido (carboxilo, COOH o COO-), adems de una cadena lateral de naturaleza qumica muy diversa entre los 20 aminocidos proteinognicos. La cromatografa se define como la separacin de una mezcla de dos o ms compuestos por distribucin entre dos fases inmiscibles: una fase mvil, que transporta las sustancias que se separan y que progresa en relacin con la otra, denominada fase estacionaria. La fase mvil puede ser un lquido o un gas y la estacionaria puede ser un slido o un lquido. Estas tcnicas tambin permiten identificar un compuesto comparando su comportamiento cromatogrfico con el de sustancias conocidas empleadas como patrn. En la cromatografa en capa fina (TLC, por Thin Layer Chromatography), la fase estacionaria es una fina capa de material poroso e hidroflico (gel de slice, almina, etc.) extendida sobre un soporte plano inerte (vidrio o aluminio), y la fase mvil es una mezcla de disolventes en diferentes proporciones, que migra por la fase estacionaria por capilaridad. La fase mvil, en su movimiento, arrastra en mayor o menor medida a los componentes de la mezcla. Durante la cromatografa, un determinado soluto interacta con las dos fases y experimenta una serie de procesos (solubilizacin en cada fase, adsorcin en fase slida, arrastre por la fase mvil, etc.) que condicionan su reparto entre ellas. En el equilibrio, la relacin entre las concentraciones del soluto de ambas fases es constante. Este parmetro se denomina coeficiente de reparto y depende de la naturaleza del compuesto y la de las fases, as como de las condiciones en las cuales se corre la muestra (temperatura, vapor de saturacin, etc). La separacin de los componentes de una mezcla se considera buena si todos presentan coeficientes de reparto diferentes. El coeficiente de reparto es poco empleado en la prctica. En su lugar, e ntimamente relacionado con l, se emplea el denominado Rf, caracterstico de cada sustancia y definido como la relacin entre la distancia que recorre dicha sustancia y la que recorre la fase mvil. Los componentes de la mezcla ms insolubles en el

disolvente empleado tendrn un Rf prximo a cero, mientras que el de los ms solubles se acercar a uno. La cromatografa en capa fina se puede emplear para separar distintos grupos de biomolculas, tales como aminocidos, fosfolpidos, azcares, etc, y en cada caso cambiara la fase mvil empleada y los reactivos reveladores. En esta prctica, separaremos aminocidos y revelaremos la placa con ninhidrina, que al reaccionar con el grupo amino de los aminocidos produce un color prpura (en algunos casos puede ser rosa o rojizo), y con el grupo imino o amino secundario (iminocidos) da un color amarillo. B. PROTENAS Las protenas son las biomolculas ms abundantes de la materia viva. Estn formadas por -aminocidos unidos por enlaces peptdicos, lo que origina cadenas lineales. Las protenas conjugadas contienen otros componentes de distinta naturaleza (no peptdica), que se denominan grupos prostticos. Las propiedades fisico-qumicas de las protenas pueden ser muy diferentes: as, protenas estructurales como la queratina del pelo se parecen poco a la hemoglobina o a la hormona insulina. Para que las protenas cumplan su funcin biolgica tienen que adoptar una estructura espacial determinada, denominada nativa. La mayora de las protenas globulares son solubles en disoluciones acuosas y a pH prximos a la neutralidad mantienen su estructura nativa intacta. La alteracin de esta estructura tridimensional conlleva la prdida de su actividad biolgica, proceso que se denomina desnaturalizacin: las propiedades fisicoqumicas cambian drsticamente y, en el caso de las protenas globulares solubles, generalmente se produce una insolubilizacin o precipitacin. Agentes desnaturalizantes tpicos son el calor, valores extremos de pH, disolventes orgnicos, metales pesados (Pb +2, Hg+2, Ag+), agentes caotrpicos y detergentes inicos. La presencia protenas en una disolucin puede ponerse de manifiesto por gran nmero de ensayos, basados en la formacin de un compuesto coloreado entre la protena y un reactivo especfico. Dentro de un rango de concentraciones adecuado, la intensidad del color desarrollado es proporcional a la concentracin de protena, por lo que se puede cuantificar y correlacionar con la cantidad de protena presente en la muestra. Los distintos mtodos colorimtricos presentan diferencias de sensibilidad, especificidad y variables como la dificultad o el precio del ensayo que es importante valorar a la hora de elegir el ms idneo para cada caso. Entre los mtodos ms utilizados para protenas destacan:

a) Ensayo de Biuret: Compuestos con enlaces peptdicos producen un cambio de color del azul al prpura cuando reaccionan con Cu (II) en medio alcalino. El ensayo es bastante especfico para protenas (pocos interferentes) y barato, pero poco sensible: se requieren de 1 a 10 mg de protena. b) Ensayo de Lowry: Es hasta 10 veces ms sensible que el de Biuret, pero ms tedioso de realizar. El principio de la reaccin es similar a aqul: se basa en la reaccin de protenas con el Cu (II) en medio alcalino y en la reaccin de grupos fenlicos (mayoritariamente de tirosina) con un reactivo, denominado de Folin-Ciocalteau, que contiene fosfomolibdato y fosfowolframato. Como inconvenientes destacan su dependencia del contenido en Tyr y Trp de la protena y las interferencias debidas a la eventual presencia de compuestos fenlicos en el medio. c) Ensayo de Bradford: Es un ensayo rpido y sensible para cuantificar protenas (1-20 g), aunque la presencia de detergentes en la muestra puede producir interferencias. El mtodo se basa en el cambio de color que experimenta el colorante azul coomassie en medio cido en presencia de protenas. Las protenas producen el cambio de la coloracin anaranjada del reactivo a una tonalidad azulada. En esta prctica se utilizarn y compararn los ensayos de Biuret y de Bradford. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL A. AMINOACIDOS. CROMATOGRAFA EN CAPA FINA. MATERIAL. Placa fina de celulosa Micropipeta 1-10 l y puntas Cubeta para el revelado Cubeta cromatogrfica Pinzas de madera Lpiz n 2 Regla de 20 cm Secador REACTIVOS. Muestras de aminocidos al 1% Ninhidrina (1mg/ml en acetona) Fase mvil: n-butanol/acetona/actico/agua (35/35/20/10) Importante: Coger la placa por los bordes, sin tocar la superficie, para evitar contaminarla.

1. Colocar 25 ml (aprox.) de fase mvil en la cubeta y cerrarla, para saturar su atmsfera.

La cromatografa se efectuar en esa cubeta cerrada.

2. Trazar con un lpiz, sin apretar demasiado para no daar la placa, una lnea horizontal
a 1,5 cm del borde inferior de la placa. Marcar sobre ella 5 puntos con igual separacin

entre s, y aplicar en cada uno de esos puntos 0,5 l de cada aminocido con la micropipeta. Es importante que las gotas se extiendan lo menos posible, por lo que se debe secar la primera antes de aplicar la segunda, si es necesario utilizando el secador. Anotar las posiciones en que se han colocado los diferentes aminocidos y el problema.

3. Colocar la placa en la cubeta, cuidando de que el nivel de disolvente quede por debajo
de la lnea de aplicacin de las muestras. Cerrar y esperar unos 35-45 minutos. La fase mvil no debe llegar al extremo superior de la placa. En ese tiempo, realizar los otros apartados de la prctica.

45 min

4. Sacar la placa, marcar en un borde el nivel alcanzado por la fase mvil, secarla en la
estufa (si huele algo a disolvente orgnico, eliminar los ltimos residuos con aire caliente del secador) y sumergirla en la cubeta de revelado en la que, previamente, se habr puesto una pequea cantidad del revelador (20-30 ml de ninhidrina). Meter la placa en la estufa unos 3-5 min, a 105C, o hasta la aparicin de manchas.

5. Observar las manchas aparecidas, su forma e intensidad. Calcule en Rf de cada

muestra estndar y determine cul(es) es (son) el (los) desconocido(s) de la muestra problema. Rf = Distancia corrida por la muestra / Distancia recorrida por la fase mvil Distancia recorrida por la fase mvil: _____________

Tubo 1 2 3 4

Aa patrn

Color de la mancha

Distancia recorrida

Rf

PROBLEMA

A0) Cul es el aminocido problema?

B. PROTENAS MATERIAL. Tubos de ensayo (vidrio y plstico) Micropipetas de 200 l y 1000 l Calefactor Pipetas de 1, 5 y 10 ml REACTIVOS. Disolucin de albmina (10 mg/ml) NaOH 2.5 N Acetona Reactivo de Biuret 1. Precipitacin de protenas. Rotular cinco tubos de ensayo del 1 al 5, y aadir a cada tubo 1 ml de la disolucin de albmina de 10 mg/ml. A continuacin proceder como sigue para constatar el efecto que sobre la solubilidad de la protena tienen los siguientes agentes:

Propipetas Puntas de micropipeta Pinzas de madera

Tampn fosfato 10 mM, pH 7 cido tricloroactico (TCA) 10% Acetato de plomo 0,2 M Reactivo de Bradford

Tubo 1 2 3 4 5

Condicin Calor Medio cido Medio bsico Disolv. orgnico Catin pesado

Tratamiento Calentar a 100 C unos minutos Aadir 1 ml de cido tricloroactico Aadir 1 ml de hidrxido sdico Aadir 2 ml de acetona Aadir 1 ml de acetato de plomo

Observaciones

Mezclar bien los tubos y observar y comentar los cambios producidos.

2. Ensayo del Biuret. Preparar, a partir de la disolucin de albmina original, 10 ml de disolucin 2 mg/ml en albmina. Rotular 4 tubos de vidrio y aadir, en el orden indicado, cada uno de los reactivos que se especifican (en ml):

1 H2O destilada Albmina 2 mg/ml 2 -

2 1.8 0.2

3 1 1

4 2

Reactivo de Biuret
Diferencia de color respecto al control

3 No

Una vez agitados, esperar 10 min y observar resultados apuntado si el color producido permite dar el ensayo como positivo. 3. Ensayo de Bradford. Rotular dos tubos de plstico y aadir los reactivos en el orden que se indica:

1 H2O destilada Albmina 2 mg/ml Reactivo de Bradford Agitar y observar el color de los 2 tubos. 800 l -200 l

2 700 l 100 l 200 l

CUESTIONES (se valorara la brevedad en las respuestas)

A1) Calcule el Rf de los Aminocidos patrones y el problema (tabla) e identificar el/los aminocidos problema.

A2) Qu naturaleza tienen las fases estacionaria y mvil empleadas? Con una fase mvil ms polar, la separacin sera mejor o peor? Por qu? Poner un ejemplo de una fase mvil ms polar que la empleada en la prctica y de otra ms apolar.

A3) Describir la reaccin de ninhidrina con los aminocidos y los colores obtenidos.

A4) Qu aminocido de cada una de las siguientes parejas tendr mayor Rf en el sistema cromatogrfico empleado? Por qu? a) Ala y Lys; b) His y Phe; c) Asp y Leu; d) Gly y Ser. A5) La deteccin precoz de algunas enfermedades congnitas relacionadas con el metabolismo de aminocidos se realiza por esta tcnica, empleando una muestra de sangre. El caso ms importante es la fenilcetonuria. Consultar el problema metablico que origina la enfermedad y describir qu observaramos en la cromatografa de un suero fenilcetonrico con respecto a uno sano.

B1) Cmo operara para transformar la disolucin de albmina 10 mg/ml en otra de concentracin 0.4 mg/ml?

B2) Para desproteinizar un plasma sanguneo qu sera mejor aadirle, cido tricloroactico o hidrxido sdico? Por qu?

B3) En el ensayo del Biuret, qu color presenta la disolucin del tubo 1? Por qu?

B4) Calcular los mg de albmina presentes en los tubos n 2 de los ensayos de Biuret y de Bradford, y justificar, en funcin de los resultados, cul de los dos mtodos es ms sensible para detectar protenas.

B5) Si los valores normales de protena total en suero (adultos) son entre 6,4 y 8,3 g/dl, qu mtodo emplearamos para cuantificar la protena total de un suero problema a partir de 100 l de una muestra diluida 200 veces?

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