Universidad de Guanajuato Divisin de Ciencias Naturales y Exactas, Laboratorio de Microbiologa

Preparacin de medios de cultivo y esterilizacin

Dr. Juan Carlos Torres Guzmn, Dra. Gloria Anglica Gonzlez Hernndez Carlos Ernesto Reynoso Rojas, Luis Crdova Bahena Objetivo. El alumno aprender a distinguir al microscopio estereoscpico la morfologa tpica de las colonias; y al microscopio ptico, la morfologa de las clulas de distintos tipos de microorganismos como bacterias (cocos y bacilos) y hongos levaduriformes y miceliales. Marco terico. Un medio de cultivo es una solucin que cuenta con los nutrientes necesarios para recuperar, multiplicar, aislar e identificar los microorganismos (bajo condiciones favorables de temperatura y pH), as como efectuar pruebas de susceptibilidad. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados, al prepararse podemos encontrarlos en estado slido, semislido y lquido. El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en algunos casos, son ajenos por completo al propio medio. 1- Disponibilidad de nutrientes adecuados Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que se aade a muchos medios, sustancias como suero, sangre, lquido asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de naturaleza vitamnica. Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos microorganismos. 2- Consistencia adecuada del medio Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que obtendramos medios en estado semislido o slido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio. 3- Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases. Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones. 4- Condiciones adecuadas de humedad Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos y evitar as que se deseque el medio. 5- Luz ambiental La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes como sera el caso de los microorganismos fotosintticos. 6- pH La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el crecimiento bacteriano pueden sin embargo

Universidad de Guanajuato Divisin de Ciencias Naturales y Exactas, Laboratorio de Microbiologa

inhibirlo o incluso alterar sus procesos metablicos normales. 7- Temperatura Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a temperaturas entre 15 y 43 C. Otros como los psicrfilos crecen a 0 C y los temfilos a 80 C o incluso a temperaturas superiores (hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37 C, y los saproftos tienen rangos ms amplios. 8- Esterilidad del medio Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presin como agente esterilizante). En general, los medios se clasifican en dos tipos: Medios complejos.- Son aquellos que contienen todos los ingredientes necesarios para el crecimiento del microorganismo en cuestin aunque, de manera particular, en estos medios no se conocen todos sus componentes, ni las cantidades exactas de los mismos. Para su preparacin frecuentemente se utilizan peptonas, compuestas por hidrolizados enzimticos de protena animal y/o extractos de levadura. Aunque estos compuestos contienen trazas de carbohidratos, en general, es necesario suplementarlos con algn azcar, usualmente glucosa, durante su preparacin. Medios definidos.- Son aquellos que contienen de manera definida los nutrientes requeridos para la propagacin del microorganismo en cuestin. Por ejemplo, un medio definido para el crecimiento de Escherichia coli puede contener NH4Cl, MgSO4, KH2PO4, NaH2PO4 y glucosa. Elementos Resultados 1.- Preparacin de medios de cultivo Cada equipo prepar un medio de cultivo diferente. En este caso se prepar el medio de cultivo dextrosa saboraoud (MDS), usando para el crecimiento de hongos filamentosos. Se debieron mezclar los componentes propuestos en el manual, pero al no haber algunos componentes para la mezcla en el laboratorio se nos proporciono el medio en polvo, y se peso directamente a la proporcin que dice el manual [a]. Se esterilizaron tanto el medio, como el tubo cnico para la muestra problema, para que estos estuvieran inertes. esenciales tales como hierro, manganeso y cobre se encuentran como contaminantes de estas sales. La esterilizacin es el proceso de eliminacin de toda forma de vida, incluidas las esporas. Es un trmino absoluto que implica prdida de la viabilidad o eliminacin de todos los microorganismos contenidos en un objeto o sustancia, acondicionado de tal modo que impida su posterior contaminacin.

Desarrollo experimental El desarrollo lo llevamos a cabo de acuerdo del: Manual de Microbiologa Conocimiento y manejo de microorganismos. Prcticas de laboratorio. Universidad de Guanajuato, Facultad de Qumica, Juan Carlos Torres Guzmn Gloria Anglica Gonzlez Hernndez Guadalupe Araceli Lpez Andrade, Primera edicin, Pgs. 6, 7 y 8.

Universidad de Guanajuato Divisin de Ciencias Naturales y Exactas, Laboratorio de Microbiologa

Los tubos eppendorff, las puntas para micropipeta se nos proporciono ya esterilizado. Las cajas de petri, son de plstico y previamente esterilizadas por el fabricante, as que no hubo necesidad de esterilizarlas. Tabla 1. Observaciones del control. Control Crecimiento de microorganismos Bacterias Nmero de colonias diferentes Una Descripcin de las colonias observadas Crculos amarillos translcidos --------------------------

Abierto

Cerrado

Ninguno

Ninguna

Tabla 2. Observaciones de distintos medios con agua. Medio Crecimiento de microorganismos Hongos filamentosos Nmero de colonias diferentes Una Descripcin de las colonias observadas Filamentos blancos con algodn como verde en el centro, se form en una esquina de la caja. Crecimiento de algodn con filamentos en el centro de la caja.

LB

YPG

Hongos filamentosos

Una

Tabla 3. Observaciones del crecimiento de la siembra de blgaros en cada medio. Medio Crecimiento de microorganismos Levaduras Nmero de colonias diferentes Una Descripcin de colonias observadas las

MDS

Puntos blancos definidos distribuidos de manera uniforme, se not un aspecto cremoso. Puntos blancos no tan definidos pero de aspecto cremoso, no se distribuyeron tanto. Puntos blancos pequeos cremosos con puntos

YPG

Levaduras

Una

LB

Levaduras y bacterias

Dos

Universidad de Guanajuato Divisin de Ciencias Naturales y Exactas, Laboratorio de Microbiologa

blancos translcidos.

Discusin Se recurri a la bibliografa y se ve el predominio de microorganismos en cada uno de los medios.

Medio de Cultivo LB YPG MDS

Microorganismo que crece Bacterias Hongos Hongos

Cuestionario Investiga por qu la luz Ultravioleta y el calor son capaces de matar a un microorganismo La luz UV es absorbida a una longitud de onda de 240 a 280 nm por cidos nucleicos causando daos genticos alterando las bases. Se utiliza en la preparacin de vacunas. En que consiste el proceso de tindalizacin y en que caso es conveniente aplicarlo como mtodo de esterilizacin Tindalizacin: se somete el producto a calentamientos intermitentes cerca de 56 C y 100C durante 30 minutos, para asegura las formas vegetativas. En los intervalos se mantiene a temperatura ambiente o a 37C, las esporas germinan y las bacterias resultantes se hacen ms sensibles al calentamiento posterior. Investiga para que sirve un medio de enriquecimiento, un medio selectivo y un medio diferencial. Medios enriquecidos: se aade nutrientes a los cultivos donde el microorganismo exige mucho. Medios selectivos: se aade compuestos al agar que permita el crecimiento del microorganismo deseado. Diferenciales: son formulaciones especiales en las que se estudian las peculiaridades fisiolgicas especficas de las bacterias. Bibliografa Histologa Bsica. Texto y Atlas. Junqueria-Caneiro. Masson, Elsevier, 6ta edicin, Pg. 3. Biologa de los Microorganismos. Brock, 10 edicin Prentice Hall Microbiology. Sixth Edition, Prescott, Harley, Klein, Mc Graw Hill http://es.wikipedia.org/wiki/Medio_de_c ultivo.

Tabla 4. Crecimiento de microorganismos en cada medio De acuerdo a esto nuestros resultados tienen sentido y se puede ver que si predomina la tendencia que se marca en la tabla 4 del crecimiento de cada microorganismo en cada medio. Los resultados obtenidos en la prctica fueron los esperados, ya que como se aprecia en las tablas de observaciones la muestra problema tuvo el crecimiento de microorganismos que normalmente crecen (levaduras) excepto en la caja donde tenemos las bacterias, adems debido al buen manejo de las cajas no hubo crecimiento de hongos. En el agua estril, en la caja que se abri pudimos ver el crecimiento de bacterias por medio de la contaminacin lo cual puede ser normal. Conclusiones Se comprendi las diferencias y utilidad de los distintos tipos de medios de cultivo de microorganismos. La esterilizacin del medio fue buena, adems de la manipulacin, ya que al no haber crecido nada despus de haber almacenado el medio MDS se concluye que el manejo fue hecho dentro del rea de esterilidad (20cm alrededor del mechero Mecker). El cultivo de la muestra problema fue satisfactoria, ya que se manipul bien. A pesar de tener una muestras contaminada aprendimos que la manipulacin de las muestras y el material deben de ser lo ms cuidadosamente posible.

Universidad de Guanajuato Divisin de Ciencias Naturales y Exactas, Laboratorio de Microbiologa

Manual de Microbiologa Conocimiento y manejo de microorganismos. Practicas de laboratorio. Universidad de Guanajuato, Facultad de Qumica, TorresGonzlez-Lpez, Primera edicin.