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fvrier 2009

Evaluer la capacit antioxydante par des tests in vitro


Il existe diffrentes mthodes pour dterminer le potentiel antioxydant de produits alimentaires, actifs, ingrdients, . Le laboratoire AGROBIO-Rennes peut proposer 3 types danalyse : le test TEAC / ABTS.+ Decolorization Assay, le test DPPH, le test ORAC. Les antioxydants peuvent rduire les radicaux primaire par 2 mcanismes : par transfert dlectron singulet ou par transfert datome dhydrogne. Les mthodes ABTS.+ Decolorization Assay (ou TEAC) et DPPH jouent sur le transfert llectron singulet, alors que la mthode ORAC joue sur le transfert dun atome dhydrogne. Les mthodes ABTS et DPPH sont couramment utiliss pour analyser les extraits de plantes et de fruits. Ce sont des mthodes anciennes qui une fois standardises permettent des comparaisons de rsultats. La mthode ORAC est plus rcente et est applicable sur quasiment toutes les matrices (extraits vgtaux, aliments, plasma sanguin, ) aussi bien sur des composs hydrophiles que lipophiles. Le test ORAC propose une mesure standardise largement accepte. Le test TEAC : Trolox Equivalent Antioxydant Capacity ou test ABTS.+ Decolorization Assay. Ce test est bas sur la capacit dun antioxydant stabiliser le radical cationique ABTS.+ de coloration bleu-verte en le transformant en ABTS+ incolore, par pigeage dun proton par lantioxydant. Une comparaison est faite avec la capacit du Trolox (analogue structural hydrosoluble de la vitamine E) capturer ABTS.+. La dcroissance de labsorbance cause par lantioxydant reflte la capacit de capture du radical libre. La capacit antioxydante, exprime en quivalent Trolox (TEAC), correspond donc la concentration de Trolox ayant la mme activit que la substance tester une concentration. Le rsultat est donn en M ou mM dquivalent Trolox par g de produit ou par ml sil sagit dun liquide. La mthode a t standardise dans notre laboratoire, avec un temps fixe dincubation qui peut dans certains cas, engendrer une sous estimation de la valeur obtenue. On parle alors de capacit antioxydante relative. Dans ce cas, on peut envisager de laisser se drouler la raction jusquau bout et recalculer la valeur TEAC. Le test DPPH : La mthode est base sur la dgradation du radical DPPH.. Un antioxydant aura la capacit de donner un lectron singulet au radical synthtique DPPH. de coloration violette pour le stabiliser en DPPH de coloration jaune-verte. La mesure de la dcroissance de coloration violette au cours du temps permet de dterminer la EC50, temps au bout duquel 50% de coloration est perdue. Gnralement interprte sur la base de la quantit dun antioxydant ncessaire pour faire diminuer de 50% la quantit initiale de DPPH (EC50), (des comparaisons de EC50 sont ralises), le rsultat est dpendant de la concentration en DPPH initiale. En ajoutant une rfrence connue, on pourrait standardiser la mthode, en ramenant par exemple les rsultats un quivalent Trolox. Cette mthode est beaucoup utilise pour tudier des extraits vgtaux et alimentaires pour mesurer la capacit antioxydante totale. Le test ORAC : Oxygen radical absorbance capacity. La mthode est base sur la dcroissance de la fluorescence de la fluorescine en prsence d'un oxydant chimique lAAPH (un radical peroxyl libre stable). Le produit tester peut tre capable de protger la fluorescine et rduire la vitesse de dgradation de la fluorescence. Il possde alors un pouvoir antioxydant. La mthode est ralise en microplaque dans lesquelles nous mesurons en parallle, le dclin de la fluorescine au cours du temps en prsence de concentrations croissantes de Trolox (une molcule de rfrence, analogue structural hydrosoluble de la vitamine E), et des chantillons tester diffrentes concentrations. Le but est dobtenir une rponse comparable celle de la gamme. On peut ainsi aprs traitement des donnes, calculer l'quivalent Trolox. La mthode faisant intervenir une cintique, la mesure de la capacit se fait par lintermdiaire du calcul des aires sous la courbe. Cest la seule mthode qui combine la fois le pourcentage dinhibition de la raction doxydation et la longueur dans le temps de cette inhibition en une seule mesure. Elle donne une mesure globale de la capacit antioxydante. Lavantage majeur du test ORAC est de proposer une mesure standardise et largement accepte.

Cahier de paillasse du laboratoire

Remarque : - Il existe souvent des diffrences de valeurs entre les mthodes du fait que les sources de radicaux libres soient diffrentes, et que les antioxydants rpondent diffremment aux mthodes de mesure. - Selon les matrices testes, lune ou lautre mthode est applicable. Par exemple pour des extraits vgtaux, les 3 tests sont applicables. En revanche, pour du plasma sanguin, la mthode ORAC semble plus indique du fait que les radicaux peroxyl utiliss dans le test ORAC sont les plus couramment rencontrs dans le corps humain. La valeur en est de fait plus significative. Vous pouvez retrouver nos fiches et d'autres exemples d'applications sur notre site internet : www.labo-nutrinov.com

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