PMI-2201 INTRODUO AOS MTODOS CROMATOGRFICOS

INTRODUO
O termo cromatografia atribudo ao botnico russo Mikhael Semenovich Tswett que, no incio do sculo empregou a tcnica para a separao de pigmentos presentes em folhas de plantas, atravs da passagem de extratos de folhas, arrastados por ter de petrleo, atravs de leitos de carbonato de clcio finamente dividido. As espcies separadas (clorofilas e xantofilas) apareciam nos leitos como bandas coloridas, e por isso Tswett chamou o mtodo de cromatografia, do grego chroma (cor) e graphein (escrever). A definio de cromatografia dada pela IUPAC em 1993 a seguinte : cromatografia o mtodo fsico de separao no qual os componentes a serem separados se distribuem entre duas fases, uma das quais estacionria, enquanto a outra se movimenta numa direo definida. A mistura que contm os componentes a serem separados dissolvida na fase mvel. Durante a passagem da fase mvel atravs da fase estacionria, alguns componentes so fortemente retidos pela fase estacionria e por isso se movem lentamente com o fluxo da fase mvel; enquanto isso, outros componentes interagem fracamente com a fase estacionria, sendo transportados mais facilmente pela fase mvel. Devido a essas diferenas em mobilidade, os componentes da mistura podem ser separados e analisados de forma qualitativa e/ou quantitativa, pela prpria tcnica de cromatografia ou em conjunto com outras tcnicas experimentais, tais como a espectrofotometria ou a espectrometria de massas. Existem vrias formas de realizar uma separao por meio de um processo cromatogrfico. Diversas combinaes so possveis : a fase estacionria pode ser um slido, um lquido imiscvel fase mvel ou um gel, fixado numa superfcie plana ou dentro de uma coluna; a fase mvel pode ser um lquido, um gs, ou um fludo supercrtico (um vapor pressurizado, em temperatura acima de sua temperatura crtica, que possui a vantagem de ter menor viscosidade que o lquido, mas mantendo as propriedades de interao com os solutos). Detalhes sobre algumas dessas formas so disponveis nas referncias apresentadas ao final do texto, ficando este texto restrito apenas apresentao de aspectos mais gerais da tcnica. Dentre os mtodos modernos de anlise qumica, a cromatografia um dos mais empregados, encontrando aplicaes nos mais variados ramos da pesquisa cientfica e tecnolgica, devido capacidade que possui de separar espcies qumicas, de forma seletiva e especfica.

CLASSIFICAO DOS MTODOS CROMATOGRFICOS

Os mtodos cromatogrficos podem ser classificados de duas formas. A primeira, mais simples, baseada na forma pela qual as duas fases so colocadas em contato. Segundo esse critrio, os mtodos poderiam ser classificados em duas categorias : cromatografia em coluna, na qual a fase estacionria mantida dentro de um tubo, em geral bastante estreito, dentro do qual a fase mvel forada por efeito de presso ou pela efeito da gravidade; cromatografia planar, na qual a fase estacionria suportada numa superfcie plana ou nos interstcios de um papel. A fase mvel se move atravs da fase estacionria por efeito da capilaridade ou da gravidade. Outro critrio de classificao, mais fundamental, baseado nos tipos de fases estacionrias e mveis, e nos mecanismos envolvidos nas transferncias de solutos entre as fases. A fase estacionria pode ser slida ou lquida. No caso de fase estacionria lquida, o lquido pode simplesmente estar espalhado sobre um suporte slido ou ento estar imobilizado sobre este. Neste ltimo caso, a fase lquida pode ser chamada de fase ligada. A fase mvel pode ser lquida, gasosa ou um fludo supercrtico. Os mecanismos que podem estar envolvidos em processos cromatogrficos so mencionados na Figura 1, a seguir.

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Adsoro : processo baseado em interaes eletrostticas, dipolares (Van de Waals, por exemplo) ou pontes de hidrognio, que ocorrem entre grupos ativos presentes na superfcie da fase estacionria slida e a fase mvel. Em processos cromatogrficos, a adsoro sempre reversvel (a dessoro do soluto implica na volta deste fase mvel). Partio : quando a fase estacionria um lquido, espalhado na superfcie de um suporte slido e inerte ou nas paredes de um tubo, o processo interfacial, ocorrendo por absoro, ou partio, que se baseia nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionria.

Troca Inica : a fase estacionria constituda de uma matriz onde so adicionados grupos funcionais ionizveis (catinicos ou aninicos). A fase mvel , geralmente, uma soluo inica com propriedades tamponantes, escolhidas de forma a ser compatvel com o tipo de trocador usado.

Bioafinidade : utiliza grupos funcionais, ligados quimicamente matriz estacionria, que possuam especificidade biolgica. Esses grupos retiram da fase mvel somente as suas espcies complementares, deixando passar todas as outras espcies. Excluso : baseia-se em um processo puramente mecnico. A fase estacionria uma matriz de composio inerte, com textura (superfcie e distribuio de tamanhos de poros) controlada. Os componentes presentes na fase mvel podem ser separados porque os menores so capazes de penetrar facilmente em todos os poros da fase estacionria, equilibrando-se com a fase mvel que tambm entra nos poros, enquanto as maiores so excludas, acompanhando a fase mvel que fica fora dos poros. As molculas com tamanho intermedirio entre esses dois extremos migram com velocidades variveis, sendo que possuem penetrao seletiva nos poros, entrando em alguns, mas no em todos. Figura 1 Representao esquemtica dos mecanismos que podem estar envolvidos em processos cromatogrficos Processos cromatogrficos que utilizam fases estacionrias lquidas quimicamente ligadas a um suporte slido tambm podem apresentar um mecanismo de separao que um compromisso entre adsoro (sobre stios ativos do suporte slido) e partio (que ocorre na fase lquida quimicamente ligada). A contribuio relativa de cada mecanismo depende da quantidade relativa de cada tipo de grupo funcional existente. Uma classificao dos mtodos cromatogrficos, retirada de Collins et al. (1990), apresentada na Tabela I

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Tabela I - Classificao dos mtodos cromatogrficos, retirada de Collins et al. (1990)

TCNICA Fase Mvel Fase Estacionria Tipo de Cromatografia lquida CP PLANAR Lquida slido CCD ligada CCD lquida CGL Gasosa slido CGS ligada CGFL Fluido Supercrtico slido CSS ligada CSFL lquida CLL CLS slido CE CLFL EM COLUNA Lquida ligada CTI CB

Sigla em Portugus CP CCD CCD CGL CGS CGFL CSS

Nome da Tcnica cromatografia em papel cromatografia em camada delgada cromatografia em camada delgada cromatografia gs-lquido cromatografia gs-slido cromatografia gs-fase ligada cromatografia supercrtica com fase estacionria slida

Sigla em Portugus CSFL CLL CLS CE CLFL CTI CB

Nome da Tcnica cromatografia supercrtica com fase ligada cromatografia lquido-lquido cromatografia lquido-slido cromatografia por excluso cromatografia lquida com fase ligada cromatografia por troca inica cromatografia por bioafinidade

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PRINCPIOS BSICOS DA CROMATOGRAFIA

No ser possvel tratarmos de todos os mtodos cromatogrficos ao longo deste texto. Assim sendo, trataremos apenas de mtodos de cromatografia em colunas. Normalmente, esse mtodo procede com um fluxo contnuo da fase mvel, que permanece at que todos os componentes da mistura em anlise tenham sado da coluna e tenham sido detectados. A Figura 2 mostra esquematicamente como duas substncias A e B podem ser separadas numa coluna por eluio. A eluio envolve o transporte das espcies atravs da coluna pela adio contnua de fase mvel fresca (tambm chamada de gs ou lquido de arraste). No instante inicial da anlise ( t = t0 ), uma pequena quantidade da amostra, que pode inclusive estar diluda na fase mvel, introduzida na coluna, em geral atravs de uma seringa manual ou de uma sistema de injeo automtico, no menor intervalo de tempo possvel. Conforme so transportados pela fase mvel, que entra de forma contnua na coluna, os componentes A e B da mistura vo se distribuindo ao longo das duas fases, e comea a se acentuar a separao entre os componentes ao longo das fases estacionria e mvel. Com o correr do tempo que implica na adio de maiores quantidades de fase mvel fresca o componente que interage mais fracamente com a fase estacionria vai sendo preferencialmente arrastado pela fase mvel. Isso ocorre porque a velocidade de arraste de um componente ao longo da coluna depende da frao de tempo que esse componente passa em cada fase : um componente que interage fracamente com a fase fixa, passa pouco tempo ligado ela, permanecendo a maior parte do tempo na fase mvel. Idealmente, as diferenas entre velocidades de arraste leva separao dos componentes da mistura em anlise em bandas ou zonas da coluna. Com a continuao da passagem de fase mvel, as diferentes bandas vo se movendo ao longo da coluna, at atingir o seu final, onde so coletadas e/ou detectadas. Se um detetor que responde presena dos compostos da mistura colocado no final da coluna e o seu sinal ao longo do tempo registrado em funo do tempo (ou em funo de uma outra varivel significativa, como por exemplo o volume de fase mvel adicionado), uma curva apresentando uma srie de pico, chamada cromatograma, obtida. Uma curva desse tipo mostrada na parte inferior da Figura 2. A curva pode ser utilizada tanto para obteno de dados qualitativos e quantitativos : a posio dos picos ao longo do eixo do tempo pode servir para identificao qualitativa dos compostos da amostra, enquanto que as reas sob os picos fornecem informaes a respeito das quantidades relativas de cada um dos componentes da mistura. A Figura 3 mostra os dados que podem ser obtidos a partir de um cromatograma e seus respectivos smbolos.

Figura 2 (a) Representao esquemtica mostrando a separao de uma mistura de componentes A e B atravs de uma coluna cromatogrfica, por eluio. (b) Curva do sinal de sada do detetor (cromatograma).

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FATORES ENVOLVIDOS NOS PROCESSOS CROMATOGRFICOS TERMOS DE RETENO

Coeficiente de Distribuio ( K ) A eficincia da separao que pode ser conseguida numa coluna cromatogrfica depende das velocidades com a quais as diversas espcies atravessam a coluna (em outras palavras, a velocidade com que cada espcie eluda). Essas velocidades so determinadas pelas magnitudes das constantes de equilbrio das reaes que regem as distribuies das diversas espcies entre a fase mvel e a fase estacionria. Frequentemente, o tipo de equilbrio envolvido em cromatografia pode ser descrito por equaes simples, descrevendo o fenmeno de transferncia de um soluto entre a fase mvel e a fase estacionria. Poderamos escrever, para um composto A, a seguinte reao: A fase mvel

A fase estacionria

A constante de equilbrio K para essa reao chamada de coeficiente de distribuio ou coeficiente de partio, e pode ser definido como K = ( C E / CM ) (1) onde CE e CM representam as concentraes molares do composto A nas fase estacionria e mvel, respectivamente.

Idealmente, o coeficiente de distribuio K constante ao longo de uma larga gama de concentraes, e processos cromatogrficos baseados nessa hiptese so chamados de processos cromatogrficos lineares. Toda a discusso que ser feita ao longo deste texto ser limitada a esses processos. Tempo de Reteno ( tR ) e tempo de reteno corrigido ( tR ) O tempo de reteno o tempo gasto por um componente desde a sua injeo na coluna at a sua deteco na sada do sistema. O tempo de reteno engloba todo o tempo que um componente fica no sistema cromatogrfico, seja diludo na fase mvel, seja retido na fase estacionria. A Figura 3 ilustra um cromatograma tpico, com a presena de um trs componentes. O tempo indicado em primeiro lugar no cromatograma indica o tempo gasto pelas molculas da fase mvel para atravessar a coluna e atingir o detetor: esse tempo chamado de tempo morto (dead time, tM ), e normalmente determinado por algum composto ou impureza presente na mistura em anlise que no retido pela fase estacionria. Quando tal composto no existe na mistura, conveniente adicion-lo, uma vez que muito importante saber-se quanto tempo leva a fase mvel sem nenhum composto diludo para atravessar toda a coluna. No caso de cromatografia gasosa, esse tempo tambm pode ser determinado por alguma perturbao de presso no sistema no momento da injeo, que aparece no cromatograma como uma perturbao na linha de base, de forma similar ao pico indicado na figura. Para a determinao dos tempos de reteno corrigidos (tR) necessrio conhecer o tempo morto, uma vez que a correo feita simplesmente descontando o seu valor do valor do tempo de reteno. Relao entre Tempo de Reteno e Coeficiente de Distribuio As velocidades lineares de um soluto ( v ) e das molculas da fase mvel ( u ) podem ser dadas, respectivamente, por : v = ( L / tR ) (2) u = ( L / tM ) (3) onde L o comprimento da coluna cromatogrfica.

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Assumindo que um soluto se move ao longo da coluna cromatogrfica com a mesma velocidade da fase mvel quando nela est dissolvido, e que ele se encontra praticamente parado quando est retido na fase estacionria, poderamos expressar a sua velocidade linear na coluna por v = u x (frao do tempo que o soluto permanece na fase mvel). Essa frao, no entanto, pode ser igualada ao nmero de moles de soluto na fase mvel dividido pelo nmero total de moles do soluto que foi injetado na coluna. Dessa forma : (4) v = u x [ ( CM VM ) / ( CM VM + CE VE ) ] = u x { [ ( 1 / [ 1 + ( CE VE / CM VM ) ] } VM e VE so os volumes ocupados na coluna, respectivamente, pelas fases mvel e estacionria

onde

Substituindo a equao (1) na equao (4), chegamos a : v = u x { [ ( 1 / [ 1 + ( K VE / V M ) ] } (5)

Figura 3 Um cromatograma tpico de uma mistura de trs componentes, indicando os dados que podem ser obtidos e seus smbolos.

Substituindo as equaes (2) e (3) na equao (5), e chamando o termo ( K VE / VM ) de fator de capacidade k, chegamos a : ( L / tR ) = ( L / tM ) x [ 1 / ( 1 + k ) ] que, rearranjada, define a relao entre os tempos de reteno e o coeficiente de distribuio: k = ( K VE / VM ) = (tR tM) / tM (7) Para cada soluto, pode-se escrever a equao (7), e os valores obtidos sero especficos para cada par (soluto - fase mvel).
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FATORES ENVOLVIDOS NOS PROCESSOS CROMATOGRFICOS TERMOS DE SEPARAO

Os termos que acabaram de ser calculados, chamados termos de reteno, so caractersticos de cada soluto. Quando esto envolvidos mais um tipo de componente na amostra a ser analisada, tambm podem ser calculados os chamados termos de separao. Fator de Separao e Reteno Relativa O fator de separao ( ) calculado pela razo entre os coeficientes de distribuio (K) de dois compostos que resultem em picos adjacentes no cromatograma, e pode ser relacionado tambm com os fatores de capacidade (k) e tempos de reteno : = KB / KA = kB / kA = = (tRB tM) / (tRA tM) (8)

Um outro termo, a reteno relativa ( r L,p ) , envolve a razo de tempos de reteno do componente e de um padro, respectivamente. A reteno relativa usada para identificao de substncias e pode ser calculada para quaisquer picos no cromatograma, livre da restrio de serem adjacentes. Resoluo Uma outra medida quantitativa de separao de dois componentes consecutivos num cromatograma a resoluo ( RS ), usada em cromatografia em coluna, e calculada a partir da distncia que separa os mximos dos picos divididos pela mdia das larguras de suas respectivas bases, conforme apresentado na Figura 4. A resoluo de uma coluna uma medida quantitativa de sua habilidade em separar dois solutos, e definida por : RS = ( tRB tRA ) / [ ( WA / 2 ) + ( WB / 2 ) ] = 2 ( tRB tRA ) / ( WA + WB ) (9)

Figura 4 Separaes em trs resolues diferentes

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EFICINCIA DE UMA COLUNA CROMATOGRFICA

Mtodos para a estimativa da eficincia de uma coluna Dois termos, que esto relacionados entre si, so comumente usados para uma estimativa quantitativa da eficincia de uma coluna cromatogrfica : so eles o nmero de pratos tericos N e a altura equivalente a um prato H, que se relacionam pela equao (10) a seguir : N=L/H onde L o comprimento da zona preenchida pela fase estacionria na coluna cromatogrfica. (10)

Um prato terico pode ser considerado uma etapa de equilbrio no processo de distribuio de um componente dado entre as duas fases (mvel e estacionria), de forma anloga ao prato terico de uma coluna de destilao. Quanto maior o nmero de pratos, mais etapas de equilbrio existiriam e, dessa forma, melhor seria a separao entre compostos no processo cromatogrfico. Duas equaes podem ser utilizadas para estimar N, e nenhuma delas ter seu desenvolvimento detalhado neste texto (maiores informaes podem ser obtidas nas referncias mencionadas na literatura comentada). Ambas utilizam informaes retiradas do cromatograma experimental, que podem ser vistas nas Figuras 3 e 4 : a primeira equao (11), utiliza o tempo de reteno tR e a largura na base W; a segunda equao (12), considerada por alguns autores como mais confivel que a anterior, utiliza no mais a largura do pico na sua base, mas na sua meia altura, Wh. N = 16 ( tR / W ) 2 (11) N = 5,545 ( tR / Wh) 2 (12)

A estimativa de H pode ser feita substituindo-se o valor de N calculado na equao (10), uma vez que o comprimento L normalmente conhecido. Se no clculo, no lugar do tempo de reteno tR for usado o tempo de reteno corrigido tR, o nmero de pratos chamado de nmero de pratos efetivo. O nmero de pratos tericos e a altura equivalente a um prato so largamente empregados na literatura e por fabricantes de equipamentos para avaliar o desempenho de colunas. No entanto, para que esses nmeros tenham algum significado na comparao de duas colunas, fundamental que eles tenham sido determinados nas colunas em comparao nas mesmas condies de ensaio e, principalmente, que tenham sido determinados para o mesmo componente. No entanto, apesar de serem frequentemente utilizados, deve-se atentar para o fato de que o uso desses dois termos pode induzir a um erro: de fato, numa coluna cromatogrfica, jamais so atingidas condies de equilbrio, uma vez que durante a operao uma das fases est em movimentao constante. Efeito da vazo da fase mvel na eficincia de uma coluna A eficincia na separao que pode ser alcanada numa coluna depende, dentre outros fatores, do tempo mdio de contato entre as fases mvel e estacionria. Esse tempo, por sua vez, depende da vazo da fase mvel e do dimetro da coluna (que, juntos, determinam a velocidade de escoamento da fase mvel ao longo da coluna). Ora, a vazo da fase mvel um parmetro facilmente ajustvel, e por isso torna-se interessante observar como varia a eficincia de uma coluna com essa vazo. Esse estudo feito normalmente atravs da determinao de H ( com o uso das equaes (10) a (12) ) para diversos valores de vazo ou de velocidade de escoamento. Dados tpicos de estudos desse tipo so apresentados nos grficos da Figura 5. Ambos apresentam mnimos para H, que correspondem a valores mximos de eficincia, para baixos valores de vazo ou velocidade de escoamento da fase mvel. Como podemos ver na figura, os valores de mnimos para cromatografia lquida e gasosa so bem diferentes, sendo que a velocidade correspondente a um valor de H mnimo para cromatografia em fase lquida significativamente menor do que no caso da cromatografia gasosa. No entanto, essa vantagem da cromatografia lquida acaba no se tornando uma vantagem prtica porque raramente vivel o emprego
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de colunas muito longas em cromatografia lquida (o mais comum terem entre 25 cm e 1m), devido queda de presso ao longo da coluna com o escoamento do lquido (a chamada perda de carga). J no caso da cromatografia gasosa, muito comum serem utilizadas colunas de 50m ou mais de comprimento. Dessa forma, o nmero total de pratos tericos e, consequentemente, a eficincia frequentemente maior em cromatografia gasosa que em cromatografia lquida.

OTIMIZAO DO DESEMPENHO DE UMA COLUNA

A estratgia a ser empregada para se conseguir realizar com sucesso a identificao de compostos presentes numa mistura por meio de uma separao cromatogrfica pode ser exemplificada pelas seguintes etapas : (a) Seleo do mtodo cromatogrfico a ser empregado.

Figura 5 Efeito da velocidade de escoamento da fase mvel na altura de um prato terico para cromatografia lquida e gasosa. (b) Seleo do mtodo cromatogrfico a ser empregado. (c) Seleo ou preparao da coluna adequada ao mtodo e mistura a ser separada (determinao do dimetro da coluna e escolha da fase estacionria). (d) Seleo das condies operacionais para um teste preliminar (escolha da fase mvel, da sua vazo, da temperatura, etc...). (e) Realizao de um teste preliminar. (f) Avaliao do teste preliminar e estudo das mudanas a serem feitas (caso necessrias) para se atingir a resoluo desejada com um tempo de ensaio mnimo. (g) Estabelecimento das novas condies de ensaio (se necessrias) para a obteno da resoluo desejada no tempo de ensaio desejado. (h) Se no forem atingidos os objetivos, avaliar a possibilidade de trocar a tcnica escolhida inicialmente, ou ento de empregar condies especiais de anlise. Vamos a seguir desenvolver uma srie de equaes que sero extremamente teis como guias para escolha de condies operacionais que podem permitir que sejam atingidos os principais objetivos de uma anlise por cromatografia : uma separao clara de compostos, com um ensaio que dure o mnimo de tempo possvel. Efeito dos fatores de capacidade (k) e de seletividade () na resoluo Quando dois compostos se movem atravs de uma coluna de forma muito semelhante, no cromatograma eles podero ser representados por picos muito prximos, podendo inclusive se confundir, como j foi visto na Figura 4. Uma coluna eficiente aquela capaz de separar esses compostos, ou seja, aquela capaz de resolver esses picos. Vamos agora apresentar as equaes que relacionam a resoluo com as constantes de equilbrio das reaes que regem as distribuies das espcies entre a fase mvel e a fase estacionria, representadas pelos fatores de capacidade e seletividade.
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Para o desenvolvimento dessas equaes, assumimos que estamos lidando com compostos A e B que apresentam tempos de reteno to prximos que podemos assumir que WA = WB W. A equao (9) torna-se ento : RS = 2 ( tRB tRA ) / ( 2W ) = ( tRB tRA ) / W (13)

Da equao (11) podemos tirar uma relao entre W, tR e N. Se aplicarmos essa relao para o composto B, e a substituirmos na equao (13), chegamos equao (14), que pode ser rearranjada em termos dos fatores de capacidade ( usando a equao (7) ), resultando na equao (15) : RS = [ ( tRB tRA ) / tRB ] x ( N / 4 ) RS = [ ( kA kB ) / ( 1 + kB )] x ( N / 4 ) (14) (15)

A equao (15) ainda pode ser rearranjada de modo a que se possa exprimir a resoluo em termos do fator de seletividade , se usarmos a equao (8) : RS = ( N / 4 ) x [ ( 1 ) / ] x [ ( kB / ( 1 + kB )] (16) Tambm interessante obter uma equao que relacione o nmero de pratos tericos necessrio para se conseguir uma determinada resoluo. Isso pode simplesmente ser feito atravs de um rearranjo da equao (16), resultando : N = 16 RS [ / ( 1 ) ]2 x [ ( 1 + kB ) / kB ]2 Efeito da resoluo no tempo de reteno Um dos objetivos de uma anlise cromatogrfica conseguir uma separao clara dos compostos da mistura analisada (ou seja, uma boa resoluo) no mnimo de tempo possvel (ou seja, com tempos de reteno os menores possveis). interessante, portanto, chegar a uma equao que relacione o tempo de reteno e a resoluo, de forma a podermos avaliar quais os efeitos das variaes de condies de operao em ambos. O tempo de durao de uma anlise dado pela tempo de reteno do componente que se move mais lentamente ao longo da coluna. Chamando esse componente de B, podemos escrever a sua velocidade linear atravs da equao (2). Combinando essa equao com as equaes (5) e (10), podemos chegar expresso : tRB = [ N H ( 1 + kB ) ] / u (18) A equao (18) pode ser combinada com a equao (17), resultando na equao a seguir, que relaciona o tempo de reteno com a resoluo : tRB = ( 16 RS2 H / u ) x [ / ( 1 ) ]2 x [ ( 1 + kB )3 / ( kB )2 ] Otimizao do Desempenho Consideraes Gerais As equaes (16) e (19) podem servir de guias para a escolha das condies operacionais que devem ser empregadas para que os objetivos de uma boa anlise sejam atingidos : uma separao ntida com o mnimo de tempo de anlise. As duas equaes so compostas por trs termos: (a) o primeiro termo relacionado com efeitos cinticos que podem levar ao alargamento dos picos no cromatograma ( N ou H/u ); (b) o segundo termo est relacionado com a termodinmica dos constituintes a serem separados, e um termo de seletividade que s depende das propriedades dos compostos analisados; (c) o terceiro termo tambm est relacionado com a termodinmica dos constituintes, e um termo de seletividade que depende das propriedades tanto dos compostos analisados quanto da coluna. Na busca pelas condies operacionais otimizadas, deve-se sempre ter em mente que alguns parmetros fundamentais ( , k e N ou H ) podem ser ajustados de forma mais ou menos independente. Essa ser a discusso feita a seguir, e o efeito das alteraes desses parmetros na resoluo exemplificado na Figura 6.
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Otimizao do Desempenho Variao em N ou em H Uma forma evidente de aumentar a resoluo de uma coluna aumentar o nmero de pratos tericos. Se isso for feito simplesmente pelo aumento do comprimento da coluna, normalmente o tempo de ensaio aumenta muito. , portanto, muito mais interessante tentar alterar condies de operao que levem a uma diminuio da altura equivalente a um prato : H pode ser alterado atravs de mudanas na vazo da fase mvel, no tamanho de partculas da fase estacionria (que leva a mudanas nas caractersticas de escoamento da fase mvel), na viscosidade da fase mvel (e, portanto, por alteraes na temperatura de operao, que afetam a viscosidade) e na espessura de filme de lquido recobrindo a superfcie da fase estacionria (caso a fase estacionria seja constituda por esse conjunto fase slida-lquido adsorvido). O efeito do aumento de N na melhoria da resoluo, quando feito de forma adequada (que mantm ou altera muito pouco o tempo de reteno), pode ser visto na Figura 6.

Figura 6 Efeito de mudanas em , k e N na resoluo de dois picos adjacentes

Otimizao do Desempenho Variao no fator de capacidade (k) Frequentemente a separao pode ser bastante melhorada atravs da manipulao do fator de capacidade. Um aumento no fator de capacidade geralmente melhora a resoluo, porm com aumento do tempo de anlise. A Figura 7 apresenta dois grficos mostrando as variaes da resoluo e do tempo de anlise com o fator de capacidade, utilizando as equaes (16) e (19) modificadas, apresentadas abaixo, com todos os termos que no contm kB englobados nos termos Q e Q, assumidos como se mantendo aproximadamente constantes. Pela observao da figura fica claro que valores de kB maiores de 10 devem ser evitados, uma vez que levam a ganhos muito pequenos em resoluo com grandes aumentos de tempo de anlise, o mesmo ocorrendo para valores de k muito pequenos, uma vez que a resoluo nesses casos cai muito. O mnimo na curva do tempo ocorre para um valor de kB da ordem de 2. Dessa forma, valores adequados de kB, que proporcionam boa resoluo com tempos de anlise curtos se situam na faixa de 1-5. De qualquer modo, melhorias na resoluo com frequncia acarretam um pouco de aumento no tempo de anlise, como pode ser visto na Figura 6.

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RS = Q x [ ( kB / ( 1 + kB )] (16)

tRB = Qx [ ( 1 + kB )3 / ( kB )2 ] (19)

Figura 7 Efeito do fator de capacidade kB na resoluo e no tempo de reteno. assumido que Q e Q permanecem aproximadamente constantes com as variaes em kB. As equaes so dadas acima. Normalmente, a maneira mais fcil de melhorar a resoluo atravs da otimizao do valor de k . Para fases mveis gasosas, k geralmente alterado atravs do aumento da temperatura. Para fases mveis lquidas, a mudana na composio do solvente frequentemente permite manipular k de forma a conseguir melhores separaes. Um exemplo desse procedimento pode ser visto na Figura 8.

Figura 8 Efeito da variao do solvente em cromatogramas

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Otimizao do Desempenho Variao no fator de seletividade ( ) Quando o valor de prximo de um, a otimizao dos valores de k e um aumento em N no suficiente para se garantir uma separao satisfatria num tempo curto. Nessas circunstncias, deve-se tentar conseguir aumentar mantendo o valor de k dentro da faixa tima de 1-10. Pode-se tentar conseguir isso : (a) atravs de mudanas na composio da fase mvel um exemplo onde essa opo funciona o da separao de anisol (C6H5OCH3) e benzeno (C6H6). Quando a fase mvel uma mistura 50% gua50% metanol, os valores de k so respectivamente 4,5 e 4,7 mas igual a 1,02. Se essa fase mvel for trocada por uma mistura 37% tetra-hidrofurano 63% gua, os valores de k se alteram para 3,9 e 4,7 (ainda dentro da faixa recomendada), mas sobe para 1,20. No primeiro caso h superposio nos picos do anisol e do benzeno, o que no ocorre no segundo caso. (b) mudando o pH da fase mvel muito interessante para separaes envolvendo cidos e/ou bases. (c) mudando a composio da fase estacionria opo normalmente menos conveniente que as anteriores, mas muito eficiente, podendo ser tentada caso o laboratrio possua vrias colunas diferentes disposio para instalao no cromatgrafo. (d) mudando a temperatura da coluna isso funciona bem em cromatografia de troca inica, mas tem pouco efeito no aumento do valor de a para cromatografia lquido-lquido e lquido-slido. (e) partindo para o uso da incorporao de compostos especiais fase estacionria um exemplo bem conhecido o da separao de olefinas com o uso de uma fase estacionria slida inorgnica impregnada com sais de prata, que leva formao de complexos entre ons prata e compostos orgnicos insaturados. A otimizao do valor de , levando a uma melhoria na resoluo, acarreta a alterao no tempo de reteno de um dos dois compostos em anlise, conforme pode ser visto na Figura 6. O Problema Geral da Eluio A Figura 9 mostra um cromatograma hipottico obtido a partir de uma mistura de seis componentes, constituda de trs pares de componentes, que possuem coeficientes de distribuio bastante diferentes entre si. Na curva (a), as condies operacionais foram ajustadas de modo a que os fatores de capacidade para os compostos 1 e 2 ( k1 e k2 ) tenham valores situados na faixa tima, entre 2 e 5. Essas condies operacionais, no entanto, fazem com que os valores de k para os outros componentes sejam muito superiores aos valores timos, o que leva a um tempo de reteno (e, consequentemente, um tempo de anlise) extremamente elevado. Alm disso, os picos correspondentes aos compostos 5 e 6 aparecem de tal forma alargados que pode ser difcil a determinao clara dos valores a eles relacionados (tempos de reteno e larguras na base ou meia altura, por exemplo). A curva (b) mostra o que ocorreria ao cromatograma caso as condies operacionais fossem adaptadas para otimizar a resoluo do par 5-6 e o tempo de ensaio : nesse caso, a resoluo dos outros dois pares seria totalmente inadequada. Na curva (c) observa-se o que aconteceria caso as condies fossem otimizadas para o par 4-5 : embora nesse caso o tempo de anlise fosse mais adequado que no caso (a), a resoluo do primeiro par no seria adequada. Esse fenmeno exemplificado acima extremamente comum, de forma que em condies prticas muito difcil conseguir-se realizar uma separao de uma mistura um pouco mais complexa utilizando as mesmas condies operacionais ao longo de todo o ensaio. O procedimento mais comum o alterar as condies operacionais ao longo da separao, de modo a otimizar a resoluo passo a passo ao longo do ensaio, por exemplo alterando os valores de k continuamente. No caso do exemplo esquematizado na Figura 9, o que poderia ser feito o seguinte : o ensaio seria iniciado nas condies de melhor resoluo para o par de compostos 1-2; imediatamente depois da eluio do composto 2, as condies operacionais seriam alteradas para aquelas timas para o par 3-4, e, aps a sada do composto 4, a separao seria completada nas condies timas para o par 5-6. Tal procedimento operacional, apesar de mais complexo, levaria a uma boa resoluo de todos os compostos da mistura num tempo mnimo.
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A alterao de valores de k se faz normalmente atravs da mudana na composio da fase mvel em cromatografia lquida, e atravs da alterao programada de temperatura em cromatografia gasosa. Um belo exemplo das potencialidades desse ltimo procedimento pode ser visto na Figura 10.

Figura 9 Ilustrao do problema geral da eluio em cromatografia

ANLISE QUANTITATIVA
A cromatografia vem apresentando crescente utilizao como ferramenta analtica devido sua simplicidade, ao custo relativamente baixo, vasta gama de aplicaes possveis e possibilidade de fornecer dados quantitativos confiveis. Este ltimo item discutir justamente alguns aspectos gerais a respeito da obteno de dados quantitativos, que so comuns a todas as variaes dessa tcnica experimental. A anlise quantitativa est baseada na comparao das alturas ou das reas dos picos correspondentes aos compostos presentes nas misturas sob anlise com aqueles obtidos a partir de um ou mais padres. Se as condies operacionais forem bem controladas, esses parmetros (altura e rea dos picos) variam linearmente com a composio.

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Figura 10 Exemplo do efeito da temperatura em cromatografia gasosa. (a) anlise isotrmica a 45oC; (b) anlise isotrmica a 145oC; (c) anlise em programao de temperatura, indo de 30oC at 180oC (temperaturas indicadas no eixo em anexo). Anlise baseada na altura dos picos e na rea dos picos A altura de um pico determinada entre o ponto mximo do pico e a sua base, que determinada traando-se uma linha que conecta a linha de base do cromatograma dos dois lados do pico, conforme indicado na Figura 3. Essa medida normalmente pode ser feita com uma boa preciso. Como j foi visto na Figura 9, tanto a altura quanto a largura dos picos (a altura dos picos inversamente proporcional sua largura) podem ser alteradas ao longo do cromatograma em funo das condies operacionais. Dessa forma, medidas quantitativas precisas s podem ser conseguidas se as condies operacionais no levarem a alteraes na forma dos picos dos compostos e dos padres. Para evitar esse problema, pode-se fazer a anlise quantitativa baseada no na altura dos picos, mas na rea dos picos, que independente de efeitos de alargamento como os exemplificados na Figura 9. Dessa forma, as reas so medidas mais confiveis do que as alturas, mas so determinadas com maior dificuldade que as alturas (especialmente se o cromatgrafo for antigo, e no contar com interface adequada com computador, o que ainda ocorre em muitos laboratrios pelo Brasil). Dessa forma, quando no existirem limitaes devidas a alargamento de picos, medidas de altura podem ser usadas para anlise quantitativa.
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Caso o equipamento possua coleta digital de dados e esteja interfaciado a um computador, normalmente a determinao da rea dos picos no apresenta grandes problemas, e esse deve ser o parmetro utilizado para anlise quantitativa. Calibrao e Padres Padres Internos A realizao de anlise quantitativa de forma precisa envolve a preparao de uma srie de soluespadro com concentraes, na medida do possvel, varrendo uma faixa de concentraes na mesma ordem de grandeza das concentraes existentes na amostra a ser analisada. Essas solues-padro so analisadas na mesma coluna que ser utilizada para a anlise das amostras, nas mesmas condies operacionais. As reas dos picos correspondentes a cada concentrao de soluo-padro podem, dessa forma, ser obtidas, e uma curva de calibrao pode ser construda. Essa curva deve ter a forma de uma reta passando pela origem. A maior fonte de erro desse procedimento vem da incerteza no volume injetado na coluna, uma vez que frequentemente volumes muito pequenos (da ordem de L) so utilizados, o que dificulta a reprodutibilidade , mesmo com a utilizao de microseringas muito precisas. Essa situao acentuada quando amostras lquidas devem ser injetadas em sistemas de cromatografia gasosa, precisando ser vaporizados imediatamente aps a injeo : nesses casos, podem ocorrer grandes variaes nos volumes realmente injetados na coluna. Os erros podem ser reduzidos com o uso de vlvulas automticas de injeo, mas dificilmente pode-se alcanar imprecises menores que 1-2%. A forma mais precisa de operao envolve o uso de padres internos, uma vez que as imprecises devidas ao processo de injeo sero, nesse caso, as mesmas tanto para a amostra em anlise quanto para o padro. Nesse procedimento, uma quantidade de uma substncia-padro, determinada com a preciso adequada, injetada juntamente com a amostra a ser analisada, e a relao entre os picos dos componentes da amostra e do padro utilizada como parmetro analtico. Para que esse mtodo funcione bem, necessrio que o pico referente ao padro aparea bem separado de todos os outros picos do cromatograma, ou seja, a sua resoluo deve ser alta (RS >1,25). Com o uso de um padro interno adequado, precises melhores que 1% podem ser obtidas. O mtodo de normalizao de reas Uma outra abordagem que tenta diminuir as incertezas envolvidas o uso desse mtodo. A eluio completa de todos os componentes da amostra necessria, e as reas de todos os picos computada. A seguir, as reas so corrigidas por meio dos fatores de resposta do detetor para cada tipo de componente (esses fatores, ou so fornecidos pelos fabricantes dos cromatgrafos, para cada tipo de detetor, ou ento so determinados em laboratrio), e a concentrao relativa de cada composto determinada pela relao entre a rea de cada pico e a rea total. O exemplo a seguir ilustra a aplicao desse mtodo. Exemplo: Os dados a seguir foram obtidos de um cromatograma de uma mistura de lcoois butlicos (os fatores de correo do detetor foram obtidos a partir de experimentos realizados com quantidades conhecidas dos lcoois puros) lcool n-butlico i-butlico s-butlico t-butlico rea do Pico (cm2) 2,74 7,61 3,19 1,66 Fator de Resposta do Detetor 0,603 0,530 0,667 0,681 rea Normalizada (cm2) 2,74 / 0,603 = 4,54 7,61 / 0,530 = 14,36 3,19 / 0,667 = 4,78 1,66 / 0,681 = 2,44 rea Total = 26,12

Os valores das porcentagens relativas de cada lcool na mistura seriam, portanto : % lcool n-butlico = (4,54 / 26,12) x 100 = % lcool i-butlico = (14,36 / 26,12) x 100 = % lcool s-butlico = (4,78 / 26,12) x 100 = % lcool t-butlico = (2,44 / 26,12) x 100 = 17,4% 55,0% 18,3% 9,3% 100,0%
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DETETORES
Muitos tipos de detetores (mais de uma dezena) existem e so utilizados nas diversas modalidades de cromatografia. Foge ao objetivo deste texto uma descrio dos detetores existentes, e informaes a esse respeito podem ser encontradas nas referncias citadas na literatura comentada. Apenas sero mencionadas a seguir algumas caractersticas do que seria o detetor ideal: (a) Sensibilidade adequada. O que seja isso no pode ser descrito em termos quantitativos, uma vez que o que seria o adequado difere de detetor para detetor. Pode-se dizer apenas que, atualmente, os detetores atuais so capazes de detectar dentro de uma faixa de 10-8 a 10-15 g de composto analisado por segundo. (b) Boa estabilidade e reprodutibilidade. (c) Resposta linear em vrias ordens de grandeza de concentrao de compostos analisados. (d) Temperatura de operao podendo ir desde a temperatura ambiente at pelo menos 400oC (temperaturas elevadas so comuns em comatografia gasosa). (e) Pequeno tempo de resposta, independente da vazo da fase mvel. (f) Fcil de usar e confivel (e, na medida do possvel, prova de falhas, mesmo quando utilizado por iniciantes). (g) Similaridade de resposta a todos os compostos (fator de resposta elevado e constante ao longo de uma faixa elevada de concentraes), ou ento respostas seletivas e previsveis ao longo das diversas classes de compostos analisados. (h) Deteco no destrutiva da amostra. (i) Baixo custo. evidente, e no necessrio enfatizar muito, nenhum detetor apresenta todas essas caractersticas.

BIBLIOGRAFIA COMENTADA
Os seguintes livros foram utilizados na elaborao deste texto, e podem ser tomados como sendo um conjunto bsico de referncias sobre o tema, que possui uma grande variedade de livros e peridicos em vista da grande gama de aplicaes e da variedade de modalidades analticas. Skoog, D.A.; Leary, J.J. Principles of Instrumental Analyseis. 4a ed. Saunders College Publishing. Philadelphia. 1992. caps. 24-25. Livro muito interessante, contm os fundamentos de muitas tcnicas analticas. O presente texto apresenta fundamentalmente a estrutura do captulo 24. Uma boa referncia para quem deseja ter uma viso geral das tcnicas de anlise instrumental mais utilizadas atualmente. Apesar de ter sido editado h quase dez anos, ainda muito atual. Collins, C.H.; Braga, G.L.; Bonato, P.S. (coord.) Introduo a Mtodos Cromatogrficos. 4a ed. Campinas. Editora da UNICAMP. 1990. Livro interessante, contm os fundamentos de muitas modalidades da cromatografia. Uma boa referncia para quem j quer comear a se aprofundar na tcnica, e com a vantagem de ser em portugus.. Apesar de ter sido editado h dez anos, ainda atual, porm menos detalhado que a prxima referncia. Existe em bibliotecas da Poli e na do Instituto de Qumica. Braithwaite, A. ; Smith, F.J. Chromatographic Methods. 5a ed. Chapman & Hall. Londres. 1996. Este livro para quem j quer comear a se aprofundar nos mtodos cromatogrficos. Apresenta diversas das modalidades da cromatografia de forma bastante acessvel, com um detalhamento suficiente para aqueles que necessitam utilizar a tcnica. Recente e mais acessvel que a prxima referncia. Existe na biblioteca do Instituto de Qumica.
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Snyder, L.R.; Kirkland, J.J. Introduction to Modern Liquid Chromatography. 2a ed. Wiley. Nova York. 1979. Este livro para quem vai se aprofundar em cromatografia lquida. Apresenta fundamentos que so aplicveis em diversas das modalidades da cromatografia, com um detalhamento maior do que o das referncias anteriores. No fundo, apresenta os conceitos fundamentais, de uma forma mais detalhada, e por isso bastante til, apesar dos seus mais de vinte anos. Existe na biblioteca do Instituto de Qumica. Para os interessados, existe um nmero muito grande de referncias, tanto na forma de livros, quanto na de peridicos, a respeito do tema. Os interessados podem conseguir facilmente informaes a respeito consultando o Dedalus, a partir do SIBI/USP, http://www.usp.br/sibi/. Quem no souber nem o que Dedalus, nem o que SIBI, pergunte a uma bibliotecria de qualquer biblioteca da Poli, e ela certamente vai explicar como funciona.

EXERCCIOS
1. Calcule o nmero de pratos tericos e o nmero efetivo de pratos de uma coluna para um composto que apresente um tempo de reteno (tR) de 3,64 min e uma largura de pico (W) igual a 0,33min. O tempo morto (tM) igual a 0,21 min. 2. Usando os dados apresentados na tabela abaixo (tempos de reteno corrigidos, tR), calcule os valores do fator de separao ( ) de cada composto em relao ao alfenol. Interprete esses resultados (em outras palavras : o que representa ser menor que 1, igual a 1 ou maior que 1?). Sabendo que o tempo morto igual a 43 s, calcule os valores do fator de capacidade k para todos os compostos. Composto amobarbital pentobarbital fenobarbital alfenol metaqualona tR (min) 3,53 4,17 5,11 6,31 10,74

3. Calcule H e N para uma coluna de 25 cm de comprimento na qual um composto orgnico apresentou um tempo d reteno de 9,59 min e uma largura de pico de 1,20 min. 4. Dois compostos A e B foram analisados na mesma coluna mas em condies operacionais diferentes. Os tempo de reteno e larguras de pico observadas para as trs condies so dadas na tabela abaixo. Pergunta-se: (a) as resolues nas trs condies; (b) qual seria a condio operacional mais interessante? Justifique. (c) que mudanas devem ter sido feitas da condio 1 para a condio 2, sabendo que a anlise de cromatografia lquida? E se a anlise tivesse sido feita em cromatografia gasosa, quais teriam sido as mudanas? Condio Operacional 1 Composto A Composto B tR = 17,50 min tR = 19,55 min W = 130 s W = 182 s Condio Operacional 1 Composto A Composto B tR = 5,73 min tR = 6,36 min W = 0,56 min W = 0,71 min Condio Operacional 1 Composto A Composto B tR = 10,52 min tR = 11,36 min W = 0,38 min W = 0,48 min

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5. As reas relativas dos picos dos cinco compostos apresentados na Figura 8, e os respectivos fatores de resposta do detetor, so dadas abaixo. Calcule a porcentagem relativa de cada composto na mistura. Composto 1 2 3 4 5 rea relativa dos Picos 27,6 32,4 47,1 40,6 27,3 Fator de Resposta do Detetor 0,70 0,72 0,75 0,73 0,78

6. Determine as larguras de dois picos, um com tempo de reteno igual a 6,00 min e outro com tempo de reteno igual a 3,64 min, sendo que o valor do nmero de pratos tericos (o mesmo usado para os dois picos) igual a 1600. Explique a razo pela qual os valores de largura de picos so diferentes. coerente usar no clculo o mesmo valor de N para os dois compostos? 7. Os dados a seguir foram obtidos em uma cromatografia gs-lquido realizada numa coluna de 24,7cm de comprimento. Composto A B C tempo de reteno tR, min 5,4 13,3 14,1 largura da base W, min 0,41 1,07 1,16

Sabendo-se que nas condies de operao utilizadas o tempo morto igual a 3,1 min, pede-se: (a) o nmero mdio de pratos efetivos e o desvio padro desse valor mdio; (b) o valor da altura mdia de prato; (c) o fator de capacidade para cada um dos trs compostos; (d) a resoluo para os pares A/B, A/C e B/C; (e) o fator de separao para os pares A/B, A/C e B/C; (f) considerando o par B/C, qual seria o comprimento de coluna necessrio para ser atingida uma resoluo igual ao dobro da calculada em (d), considerando-se a altura mdia de prato aquela calculada em (b); (g) considerando o par B/C, qual seria o tempo de ensaio necessrio para ser atingida uma resoluo igual ao dobro da calculada em (d), sendo mantidas as mesmas condies de vazo de fase mvel.

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