Université de Tunis El Manar

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique 2ème Année de mastère de recherche en nutrition
Ecole Supérieure des Sciences et Techniques de la Santé de Tunis

Les étapes du clonage

moléculaire
03-11-2021

Elaboré par: Dr. Asma TAJOURI, PhD Année universitaire: 2021-2022

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 Evaluation des pré-acquis:

• Définir le clonage moléculaire.

• Enumérer les outils nécessaires au clonage moléculaire.

 Elaboration d’une stratégie de
clonage
• Choisir les vecteurs de clonage appropriés en fonction du
Etape 1 type et de la taille de l’insert (bouts collants-cohésifs) .

• Choisir la cellule hôte appropriée en fonction du vecteur.

Etape 2

• Choisir les enzymes de restriction appropriées en fonction

Etape 3 des sites de restriction du vecteur.
Comment cloner un gène particulier dans un vecteur
plasmidique?
Les étapes de clonage d’un gène dans un vecteur plasmidique

Clonage de gènes
Etapes Le clonage de gènes permet d’obtenir de nombreuses copies du même gène afin de pouvoir

travailler dessus.

1- Incorporer le gène intéressant dans un plasmide en utilisant des enzymes de restriction. Le

plasmide doit contenir en plus un gène de résistance à un antibiotique.

2- Infecter des bactéries avec ce plasmide.

3- Les bactéries se multiplient en très grande quantité, toutes identiques, formant des clones.

4- Criblage des bactéries ayant intégré le gène intéressant sur un milieu contenant l’antibiotique.

5- Amplification des plasmides dans une culture puis purification de leur ADN.

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1- Préparation de l’ADN à cloner = Insert

• Amplification de l’insert par PCR.

• Contrôle sur gel d’agarose (respecter le pourcentage d’agarose en

fonction de la taille de l’insert).
2- Clonage des produits de PCR dans le vecteur TOPO

- Clonage des produits de PCR dans le vecteur pCR™ TOPO

(Invitrogen):

 Produits de PCR à bouts francs (taq Phusion)  kit Zero Blunt®

TOPO® PCR Cloning (Invitrogen)  clonage dans un vecteur
plasmidique pCR™ blunt-II TOPO entre les sites de restriction
d’EcoRI.

 Produits de PCR à bouts cohésifs (Gotaq)  kit TOPO TA®

Cloning (Invitrogen)  clonage dans un vecteur plasmidique
pCR®2.1-TOPO® entre les sites de restriction d’EcoRI.
 3- Transformation des bactéries compétentes par choc
thermique

Incubation des bactéries compétentes Choc thermique pendant 30 sec à 42°C. Incubation des bactéries transformées dans la glace
avec le plasmide dans la glace pendant 30 pendant 2 min.
min.

SOC

Ajout du milieu soc aux bactéries transformées et Etalement des produits de transformation Incubation des boites de pétri à 37°C ON.
incubation à 37°C pendant 1h sous agitation (800 rpm). sur des boites de pétri suppl d’ATB.
4- Identification des clones positifs

- Culture de 10 clones bactériens, choisis aléatoirement, dans du milieu LB+ATB pour la

miniprép  shaker 37°C 220 rpm O/N.

- Extraction plasmidique (miniprép) (QIAprep Spin Miniprep kit Qiagen).

- Identification des clones positifs qui ont intégré le fragment d’intérêt par une digestion
enzymatique par EcoRI:

MT C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10

- Séquençage des clones positifs.

5- Clonage de l’insert dans le plasmide d’expression
Digestion
avec des
enzymes de
restriction Plasmide pCR-TOPO renfermant l’insert
Plasmide d’expression

Gène de Insert
résistance à
l’ATB
Insert

+ ADN ligase

Vecteur
linéarisé

Plasmide recombiné modifié

6- Transformation des bactéries compétentes.

7- Identification des clones positifs.

8- Séquençage.
9- Amplification du plasmide recombinant et extraction
de l’ADN plasmidique
Une fois le clone d’intérêt est identifié et confirmé par séquençage  Amplification:

 Culture du clone dans 10 ml de milieu LB supplémenté d’ATB à 37°C dans un shaker

220rpm (le matin en arrivant).

 Le soir avant de rentrer, ajouter ces 10 ml de culture bactérienne à 250 ml de milieu LB

+ ATB  culture à 37°C ON dans un shaker 220rpm.

 Le lendemain, maxiprép: extraction de l’ADN plasmidique (kit Qiagen).

 Séquençage.
Exemple 1: Clonage d’un gène dans le plasmide pBR322

et phosphorylé
Exemple 1: Clonage d’un gène dans le plasmide pBR322
Une 1ère sélection: Etalement des produits de transformation sur une boite de pétri Amp+

- Bactéries non transformées: Amp S et Tet S

- Bactéries transformées par:
3 populations de bactéries - Un plasmide intact non recombinant : AmpR et Tet R
- Un plasmide recombinant: AmpR et Tet S

Une 2ème sélection: Etalement des produits de transformation sur une boite de pétri Amp+
et Tet+
Exemple 2: Clonage d’un gène dans le vecteur pUC19

Ce plasmide comporte :

• Un gène de résistance à l’Amp.

• Le gène lacZ (fragment de l’opéron lactose et qui code pour la β-galactosidase) contenant
des sites polylinker.

La particularité de ce vecteur : il possède « un système de sélection enzymatique »

appartenant à l’opéron lactose au lieu d’utiliser un second ATB.
Exemple 2: Clonage d’un gène dans le vecteur pUC19

• Intégration d’un fragment d’ADN d’intérêt au niveau de la région MCS de pUC19:

interruption et donc l’inactivation du gène lacZ  β –galactosidase inactive  les cellules

hôtes ayant intégré un plasmide recombinant perdent l’activité de la β-galactosidase.

• Intégration d’un plasmide intact non recombinant:

β-galactosidase active la sélection des bactéries ayant intégré un plasmide recombinant

est réalisée par « un test colorimétrique » ou « test bleu/blanc »
Principe:
- Cultiver les bactéries dans un milieu contenant un inducteur l’IPTG pour métaboliser le
substrat X-Galactose = X-gal qui est un β –galactoside dont la couleur passe de l’incolore au
bleu quand il est clivé par la β -galactosidase mais au lieu de libérer du galactose et du
glucose comme dans le cas de l’hydrolyse du lactose, il libère du galactose et une substance X
(5-bromo-4-chloro-3-hydroxyindole) qui est colorée en bleu.
En culture et en présence d’IPTG + X-gal  les bactéries AmpR qui se développent sur
l’agar et qui sont transformées par les plasmides recombinants: colonies blanchâtres car
elles ont perdu la capacité de clivage du X-gal par la β -galactosidase.
les bactéries AmpR et transformées par des plasmides non recombinants: colonies bleues.
Principe du clonage d’un gène dans le vecteur pUC19
Les applications du clonage moléculaire

• Produire en grandes quantités des protéines spécifiques.

• Etudier la régulation de l’expression d’un gène.

• Etude fonctionnelle d’une nouvelle mutation identifiée au niveau d’un certain

gène.