2TACNA10 Aula Prtica Cultura de microrganismos necessidades nutritivas. Meios de cultura: composio, preparao, armazenamento, utilizao. Tcnicas de sementeira.

. TEXTO DE APOIO: Meios de cultura: composio, preparao e uso. Preparao de alguns meios de cultura. MEIOS DE CULTURA INTRODUO O estudo microscpico das caractersticas morfolgicas (dimenso, forma e tipo de associao) e das caractersticas de colorao , geralmente, insuficiente para a obteno de uma identificao satisfatria do agente patognico. Assim, para conhecer as propriedades, fisiolgicas e bioqumicas necessrio cultivar as clulas microbianas no laboratrio. A cultura de microrganismos consiste no crescimento de populaes microbianas em meios de cultura laboratoriais. Uma cultura que tem apenas um tipo de microrganismo conhecida por cultura pura, uma cultura que tem mais do que um tipo de microrganismo uma cultura mista. A cultura de microrganismos consiste num passo rotineiro do exame microbiolgico, sendo feito simultaneamente com o exame microscpico ou imediatamente depois. Com a cultura de microrganismos pretende-se: Aumentar a quantidade de microrganismos, que por vezes, ocorrem em nmero reduzido na amostra, para facilitar posteriormente a identificao. Procurar isolar os tipos de microrganismos existentes numa populao microbiana mista. Diferenciar entre grupos de microrganismos atravs da aparncia macroscpica das colnias e das reaces bioqumicas com o meio. Caracterizar e identificar os microrganismos atravs das caractersticas das suas colnias, em um ou mais meios de cultura, e pelas suas capacidades de produzirem alteraes qumicas em diferentes meios de cultura. Quantificar microrganismos. Analisar substncias de ocorrncia natural.

CARACTERSTICAS GERAIS DOS MEIOS DE CULTURA Para a cultura de microrganismos necessrio existirem meios de cultura apropriados que simulem ou at melhorem as condies naturais do ambiente em que se desenvolvem. Um meio de cultura um substrato nutritivo capaz de permitir a nutrio e o crescimento dos microrganismos (bactrias, fungos, algas, parasitas) fora do seu

ambiente biolgico natural, ou seja, uma preparao de nutrientes utilizada para o crescimento de microrganismos em laboratrio. A sobrevivncia e o crescimento dos microrganismos depende de um adequado suprimento de nutrientes e de um ambiente fsico favorvel. No entanto, h uma grande diversidade de necessidades nutricionais e ambientais entre os microrganismos e por isso que s compreendendo as suas necessidades que se consegue ter sucesso na cultura de microrganismos no laboratrio. Composio dos meios de cultura Os meios de cultura devem conter os nutrientes em quantidades e propores correctas para a manuteno e multiplicao dos microrganismos. A maior parte dos microrganismos utiliza substncias de baixo peso molecular que so, frequentemente, derivadas da degradao enzimtica de nutrientes complexos. Por isso, os nutrientes indispensveis ao organismo em causa devem estar sob forma assimilvel. As necessidades nutricionais dos microrganismos so satisfeitas no laboratrio atravs da variedade de meios de cultura existentes. Os microrganismos tm necessidades nutricionais variveis de acordo com a espcie, no entanto, h determinadas substncias cuja necessidade comum a todos. Constituintes essenciais ou bsicos gua A gua um componente importante e sempre presente em altas quantidades. Todas as clulas requerem gua no meio para que os nutrientes de baixo peso molecular possam atravessar a membrana celular. A gua utilizada nos meios de cultura deve ser destilada, pois a gua de consumo contm minerais que podem reagir com os constituintes do meio formando precipitados, alm de substncias antispticas (ex. cloro) que podem interferir com o crescimento microbiano. Fonte de energia As atividades metablicas das clulas s podem ocorrer se houver energia disponvel na clula. Os microrganismos podem ser divididos em duas categorias de acordo com a sua fonte de energia: - fototrficos: usam a energia radiante como nica fonte de energia, atravs da fotossntese. - quimiotrficos: dependem da oxidao de compostos qumicos como fonte de energia. Alguns microrganismos usam molculas orgnicas (como a glicose), enquanto outros usam compostos inorgnicos (como o H2S e o NaNO2). Fonte de carbono O carbono um elemento essencial necessrio ao crescimento microbiano. Entre os microrganismos h duas categorias de acordo com as suas necessidades nutricionais: - autotrficos: usam carbono inorgnico na forma de dixido de carbono como nica ou principal fonte de carbono. Estes microrganismos podem ser cultivados num meio de cultura s com compostos inorgnicos, pois no necessitam de compostos orgnicos e podem ser inibidos por eles. - heterotrficos: usam compostos orgnicos como principal fonte de carbono. Estes microrganismos no podem ser cultivados num meio s com compostos inorgnicos, pois eles necessitam de nutrientes orgnicos, principalmente glicose.

Fonte de hidrognio e de oxignio As necessidades de hidrognio e de oxignio so, geralmente, satisfeitas ao mesmo tempo que as de carbono, uma vez que esses elementos fazem parte de muitos compostos, usados como fonte de carbono e de energia. Fonte de azoto O azoto tambm um elemento essencial para a sntese de muitas macromolculas celulares particularmente protenas e cidos nucleicos. Alguns microrganismos utilizam o azoto atmosfrico (N2), outros contam com compostos inorgnicos como a amnia e os sais de nitrato, enquanto outros necessitam de compostos orgnicos que contm azoto como os aminocidos. Uma das principais fontes de azoto de origem comercial so as peptonas. Estas so obtidas a partir da hidrlise cida, alcalina ou enzimtica de matrias proteicas de origem animal ou vegetal e incluem aminocidos, peptdeos e polipeptdeos. As peptonas so hidrossolveis e no coagulveis pelo calor o que permite que os meios de cultura sejam esterilizados no autoclave. Fonte de enxofre e de fsforo O enxofre faz parte de alguns aminocidos e por isso um componente das protenas. As suas fontes incluem compostos orgnicos como os aminocidos sulfurados, compostos inorgnicos como os sulfatos, e ainda o enxofre elementar. O fsforo necessrio para a formao dos cidos nucleicos e para a sntese dos compostos orgnicos de alta energia - adenosina trifosfato (ATP). O fsforo fornecido na forma de sais de fosfato para ser usado por todas as clulas microbianas. Elementos metlicos A maior parte das clulas necessita de alguns ies metlicos como clcio, potssio, magnsio, ferro, mangansio, zinco, cobre, molibdnio, nquel, cobalto e sdio para as suas vrias atividades celulares. Estes ies so necessrios em quantidades nfimas (micronutrientes), sendo usados como cofatores e activadores de enzimas. Fatores de Crescimento: So substncias essenciais para o metabolismo bacteriano, pois so componentes celulares ou precursores desses componentes que no podem ser sintetizados pelos microrganismos (aminocidos, purinas, pirimidinas e vitaminas). Os microrganismos que no conseguem sintetizar esses componentes dentro da clula necessitam de uma fonte externa. As vitaminas so substncias orgnicas que contribuem para o crescimento celular e so essenciais, em pequenas concentraes, para as atividades celulares. So tambm fontes de coenzimas que so necessrias para a formao de sistemas enzimticos activos. So fatores de crescimento o sangue (fatores x e v e soro), aminocidos, extrato de leveduras, lquido asctico, etc. A ao de algumas destas substncias reside na sua capacidade de adsorver substncias txicas do meio exterior. Substncias Inibidoras:

Incluem corantes, antibacterianos, sais biliares, NaCl, alterao do pH, etc. Indicadores de pH: Indicam se o microrganismo ou no capaz de utilizar o substrato alterando o pH e originando mudanas de cor do meio de cultura. Substncias solidificantes (inertes): So aquelas que conferem consistncia ao meio. Utilizam-se o agar ou gelose, a gelatina e o gel de slica. Condies de incubao dos meios de cultura Para que haja crescimento microbiano necessrio que um meio de cultura fornea nutrientes, mas tambm preciso que fornea um ambiente fsico adequado a cada microrganismo. A temperatura, o pH e a atmosfera gasosa so trs dos mais importantes fatores fsicos que influenciam o crescimento e sobrevivncia dos microrganismos. Temperatura O crescimento microbiano depende directamente de como a temperatura afecta as membranas, os ribossomas e outros componentes e as enzimas celulares. Com o aumento da temperatura, a actividade enzimtica aumenta at ao ponto em que ocorre desnaturao irreversvel da estrutura proteica das enzimas. Geralmente, temperaturas da ordem dos 70 C destroem a maioria das enzimas essenciais e causam morte celular. Por outro lado, medida que a temperatura baixa ocorre inactivao das enzimas e o metabolismo celular diminui gradualmente levando consequentemente inibio do crescimento celular (aos 0 C as reaces bioqumicas cessam na maior parte das clulas). Cada microrganismo requer um intervalo de temperatura limitado de acordo com a sensibilidade dos seus sistemas enzimticos ao calor. Assim, para cada espcie temos a considerar: - Temperatura mnima de crescimento: a temperatura mais baixa qual o crescimento ainda ocorre. Abaixo desta temperatura a actividade enzimtica inibida e as clulas ficam metabolicamente inactivas de modo que o crescimento pra. - Temperatura mxima de crescimento: a temperatura mais alta qual o crescimento ainda ocorre. Acima desta temperatura a maior parte das enzimas destruda e o organismo morre. - Temperatura ptima de crescimento: a temperatura qual a taxa de reproduo mxima, o microrganismo cresce mais rapidamente; no entanto, no necessariamente a temperatura ptima ou ideal para as outras atividades enzimticas da clula. A temperatura ptima para uma espcie microbiana no fica no meio do intervalo de temperatura, mais prxima do limite superior. A temperatura ptima de um

determinado microrganismo est correlacionada com a temperatura do seu habitat normal. Os microrganismos podem ser classificados em trs grandes grupos atendendo s suas exigncias de temperatura: Psicrfilos Crescem abaixo dos 20 C, sendo a sua temperatura ptima de 15 C ou mais baixa. Uma das caractersticas deste grupo o facto de crescerem entre os 0 e os 10 C, o que permite, por exemplo, que possam crescer em alimentos armazenados no frigorfico. Alguns crescem a temperaturas inferiores a 0 C e por isso em alimentos congelados. Mesfilos Crescem entre os 20 e os 45 C. Tm capacidade para crescer temperatura do corpo humano (37 C) e assim neste grupo inclui-se a grande maioria dos microrganismos patognicos. Termfilos Crescem a temperaturas superiores a 45 C, sendo o ptimo entre os 50 e os 60 C. Algumas bactrias so capazes de sobreviver fervura, mesmo que no sejam capazes de crescer (termodricos). Muitos dos formadores de esporos suportam a ebulio durante 15 minutos devido aos seus resistentes endsporos. pH O crescimento e sobrevivncia dos microrganismos muito influenciado pelo pH do meio ambiente e cada espcie tem a capacidade de crescer dentro de um intervalo (mnimo, ptimo e mximo) especfico de pH. O pH ptimo para o crescimento microbiano, para o qual mxima a multiplicao, aproximadamente no meio do intervalo de pH onde o crescimento ocorre. O aumento ou diminuio do pH leva a uma diminuio da taxa de reaces qumicas devido destruio das enzimas celulares e por conseguinte afecta a taxa de crescimento e finalmente a sobrevivncia do microrganismo. Diferentes espcies de microrganismos tm diferentes tolerncias de pH e estes pH especficos reflectem a adaptao do organismo ao seu ambiente natural. No entanto, h determinadas espcies que esto adaptadas para crescer a vrios valores da escala de pH. Os microrganismos acidfilos crescem a baixos valores de pH (1-5,5), os alcalfilos desenvolvem-se a valores elevados de pH (8,5-11,5) e os neutrfilos preferem pH 5,5-8. Pode-se considerar que para a maioria das bactrias o pH mnimo para o crescimento 4 e o mximo 9, sendo o ptimo entre 6 e 8 (neutrfilos). Os fungos preferem ambientes ligeiramente cidos, sendo o seu pH ptimo entre 4 e 6. Os meios de cultura esto ajustados para um pH volta de 7, pois este o valor geralmente mais vantajoso para o crescimento da maioria das bactrias. preciso ter em conta que as atividades metablicas dos microrganismos levam produo de compostos cidos (a partir da degradao dos hidratos de carbono) ou bsicos (a partir da degradao proteica) que causam alteraes no pH do meio que podem inibir o crescimento dos microrganismos. Para evitar grandes variaes de pH necessrio adicionar tampes aos meios de cultura (adio de concentraes equimolares de sais de

cidos fracos e sais de bases fracas). Muitos meios contm aminocidos, peptonas e protenas que devido s suas propriedades anfotricas, funcionam como tampes naturais. Atmosfera gasosa Os microrganismos apresentam uma grande diversidade em relao sua capacidade de usar o oxignio livre para a respirao celular. Estas variaes nas necessidades de oxignio reflectem as diferenas nos sistemas enzimticos bioxidativos presentes nas vrias espcies. Na maior parte das clulas o oxignio atmosfrico necessrio para o processo bioxidativo da respirao, no entanto h clulas que no tem o sistema enzimtico para a respirao em presena do oxignio e por conseguinte necessitam de usar uma forma anaerbia de respirao ou fermentao. Assim, os microrganismos so classificados em grupos fisiolgicos atendendo ao seu comportamento em relao ao oxignio: Aerbios estritos (ex. Mycobacterium, Legionella, fungos filamentosos) So os que necessitam da presena de oxignio para crescer e podem faz-lo numa atmosfera com 21 % de oxignio (ao ar). Esto dependentes da respirao aerbia, utilizando o oxignio como aceitador final de electres. Microaerfilos (ex. Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni) Necessitam de oxignio como os aerbios, mas s conseguem crescer com concentraes de oxignio menores do que as que existem na atmosfera (< 21%); crescem melhor com concentraes de oxignio entre 1 e 15%. Anaerbios estritos (ex. Clostridium botulinum) So aqueles que podem ser intoxicados pelo oxignio, que no crescem na atmosfera e no usam o oxignio. Obtm energia por processos que no envolvem a utilizao de oxignio (usam processos fermentativos ou respirao anaerbia). Nestes organismos a presena de oxignio atmosfrico leva formao de metabolitos txicos como o perxido de hidrognio e o radical superxido (O2-), visto que no possuem as enzimas dismutase do superxido (converte o io superxido em perxido de hidrognio) e catlase e/ou peroxidases (convertem o perxido de hidrognio em gua e oxignio). Por conseguinte pequenas quantidades de oxignio atmosfrico so letais para estes microrganismos. No laboratrio, utilizam-se jarras de anaerobiose em que o oxignio removido retirando-se o ar ou por reao qumica. Anaerbios aerotolerantes (ex. bactrias lcticas) So aqueles que no beneficiam do oxignio, pois so organismos que utilizam, exclusivamente, processos metablicos anaerbios (fermentao). Crescem igualmente bem na presena de oxignio, pois produzem catlase e/ou superxido dismutase (ao contrrio dos anaerbios). Aerbios ou anaerbios facultativos (ex. Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae): So aqueles que crescem em presena ou em ausncia de oxignio. No entanto, crescem melhor em presena do que em ausncia de oxignio, no sendo dependentes

do oxignio atmosfrico. Usam preferencialmente o oxignio para a respirao aerbia, mas num meio pobre em oxignio utilizam processos bioenergticos como a fermentao ou a respirao celular anaerbia, utilizando compostos como nitratos ou sulfatos como aceitadores finais de electres. Procedimentos para determinar as necessidades de oxignio: As necessidades de oxignio podem ser determinadas inoculando-se o microrganismo em questo num tubo de ensaio contendo o meio slido fundido, agitando-se o tubo para dispersar os microrganismos atravs do meio e por fim deixando solidificar o meio para assegurar que as clulas fiquem dispersas. Aps incubao, o microrganismo vai crescer na parte do meio que contm a concentrao apropriada de oxignio, mostrando quais as suas necessidades: aerbios estritos: apresentam crescimento superfcie. anaerbios estritos: o crescimento limitado ao fundo do tubo. anaerbios facultativos: apresentam crescimento atravs de todo o meio, mas predominando na parte superior do tubo. anaerbios aerotolerantes: apresentam crescimento uniforme atravs de todo o tubo. microaerfilos: crescem numa zona ligeiramente abaixo da superfcie. CLASSIFICAO DOS MEIOS DE CULTURA Composio Qumica Quimicamente definidos ou sintticos So constitudos por quantidades conhecidas de substncias orgnicas e/ou inorgnicas quimicamente puras e bem definidas, ou seja, a sua composio qumica conhecida. Estes meios so, geralmente, usados na cultura de microrganismos autotrficos, como as algas, ou de microrganismos heterotrficos pouco exigentes. Podem ser usados para determinar as necessidades nutricionais precisas de um microrganismo. Adicionando ou retirando um constituinte a este tipo de meios permite verificar se esse constituinte essencial ou no para o crescimento de um determinado microrganismo. Quimicamente complexos ou artificiais Resultam da adio de substncias naturais de composio qumica mal definida a um meio sinttico, ou seja, a composio qumica exata no se conhece. So usados para simular e at melhorar o ambiente natural dos microrganismos a ser estudados. So usados por rotina na cultura de microrganismos So compostos por um nmero limitado de substncias complexas, extratos de plantas ou animais, cujas composies qumicas exatas no so conhecidas: extrato de carne, peptonas (protenas parcialmente degradadas por enzimas como os hidrolisados de casena do leite e os hidrolisados de protenas de soja), extrato de leveduras, sangue, soro, leite, extrato de solo, etc. Todos estes produtos adicionados ao meio de cultura estimulam a crescimento da maior parte dos microrganismos heterotrficos.

Estado Fsico Lquidos ou caldos So aqueles que no tm agente solidificante. No permitem distinguir os diferentes tipos de microrganismos pelo aspecto morfolgico porque no h formao de colnias organizadas. So usados para o estudo da morfologia bacteriana, para aumentar o nmero de microrganismos e para vrias provas bioqumicas (ex. provas fermentativas). Slidos Obtm-se a partir dos meios de cultura lquidos aps adio de uma substncia solidificante em determinada quantidade. Os meios slidos tm a vantagem de apresentar uma superfcie endurecida onde os microrganismos podem crescer, formando colnias. Cada colnia um aglomerado de clulas visvel macroscopicamente que teve origem a partir da multiplicao de uma s clula e que representa o crescimento de uma s estirpe de microrganismos. Estes meios permitem observar a morfologia das colnias, isolar culturas puras, conservar e armazenar estirpes bacterianas e observar reaces bioqumicas especficas. Um meio completamente slido requer uma concentrao de agar entre 1,5 e 2%, enquanto para se obter um meio semi-slido so necessrias concentraes entre 0,2 e 0,5%. Semi-slidos Obtm-se tambm a partir de meios de cultura lquidos aps adio de um agente solidificante em menor proporo que nos meios slidos. Estes meios de cultura so usados no estudo da mobilidade activa dos microrganismos. Podem tambm ser usados em estudos fermentativos e na promoo de crescimento anaerbio. Agentes solidificantes Agar ou Gelose: o agente solidificante mais utilizado pelos microbiologistas. um polissacardeo complexo rico em galactose, mas sem valor nutricional, extrado de algas marinhas. No um nutriente para a maior parte dos microrganismos e no metabolizado durante o crescimento microbiano. um excelente agente solidificante, pois liquefaz-se a cerca de 100 C (o ponto de liquefao aos 96 C) mantendo-se nesse estado fundido at aos 42 C quando passa a gel slido. Assim, os microrganismos, principalmente os patognicos, podem ser cultivados a 37 C ou a temperaturas ligeiramente mais altas sem o meio de cultura se liquefazer durante a incubao. Por outro lado, como a maior parte dos microrganismos no morre a 45 C, podem ser adicionados ao meio fundido antes deste ser colocado em tubos ou placas de Petri para solidificar. Alm de ser possvel adicionar aos meios fundidos certas substncias termolbeis previamente esterilizadas por filtrao.

Gelatina: obtida a partir de cartilagens de mamferos. Tem como inconvenientes principais estar liquefeita s temperaturas usadas, geralmente, para incubar os microrganismos patognicos para o Homem ( 37 C), pois s solidifica aos 22 C, e poder ser digerida por ao dos microrganismos. Atualmente, est em desuso, sendo s utilizada para estudar microrganismos que actuem sobre ela, ou seja, que possuam a enzima gelatinase (prova da hidrlise da gelatina). Slica gel: uma substncia inorgnica inerte e inatacvel por enzimas microbianas. Devido aos seus custos s usada em trabalhos de grande rigor cientfico. Objetivos Funcionais Simples ou bsicos So os meios que apenas possuem os nutrientes bsicos ou essenciais, por isso s crescem microrganismos pouco exigentes que tenham grande capacidade de sntese. Como so meios pobres em nutrientes so insuficientes para suportar o crescimento de microrganismos mais exigentes. Exemplos: gua Peptonada: contm gua, peptonas e cloreto de sdio. Ricos ou enriquecidos A partir dos meios bsicos, por adio de outros nutrientes, produzem-se todo o tipo de meios complexos e ricos. Estes meios so usados para a cultura de microrganismos exigentes que tm necessidades nutricionais altamente elaboradas e especficas. Estes microrganismos no crescem ou crescem com dificuldade em meios bsicos e por isso requerem a adio de fatores de crescimento (so substncias essenciais para o seu metabolismo, mas que eles no so capazes de sintetizar). Nestes meios pode haver tambm capacidade de adsoro de substncias txicas. Estes meios permitem o crescimento generalizado de todos os microrganismos da amostra. Assim, utilizam-se quando se quer quantificar os microrganismos de uma amostra ou se pretende fazer crescer todos os microrganismos que existam num produto que em princpio deveria estar estril (ex. sangue), j que qualquer crescimento sinal de patogenicidade. Um meio rico contm uma grande variedade de substncias orgnicas como: extrato de carne, extrato de levedura, sangue, soro, lquido asctico, infuso de corao e crebro, etc.

Exemplos: Agar Sangue: composto por 5 a 10% de sangue desfibrinado, animal ou humano, o que vai enriquecer o meio em nutrientes. O sangue s adicionado ao meio liquefeito quando a temperatura se encontra entre 45-48 C, para que os glbulos vermelhos fiquem intactos. Agar Chocolate: tambm composto por sangue, mas este adicionado ao meio quando a sua temperatura de 80 C. utilizado para o crescimento de microrganismos exigentes como os do gnero Neisseria. Brain-Heart infusion: um meio muito rico que contm infuso de crebro e corao de vitela. utilizado para microrganismos exigentes como os do gnero Streptococcus e Neisseria. Seletivos (slidos) ou de enriquecimento (lquidos) Alm dos nutrientes necessrios para o crescimento de todos os microrganismos, estes meios especficos contm um ou mais compostos qumicos que so essenciais devido sua especificidade funcional. Estes meios so usados para isolar grupos especficos de microrganismos, pois seleccionam um determinado microrganismo de um produto polimicrobiano (expectorao, fezes, saliva, etc.). No entanto, preciso ter em conta que no h meios de cultura 100% seletivos, podendo crescer eventualmente outros microrganismos. So meios que permitem o crescimento de um tipo de microrganismos em detrimento de outro ou de outros, pois so formulados para suprimir o crescimento dos microrganismos que no interessam ao fim em vista, permitindo o crescimento dos microrganismos que se desejam isolar. Assim, o favorecimento de um tipo de microrganismo pode dever-se a uma ao inibidora sobre os restantes (condiciona o crescimento de uns) ou ao estimuladora do microrganismo pretendido (mais raro) ou ambas, ou seja, inibe o crescimento de um tipo de microrganismos enquanto aumenta o crescimento de outro. Os meios lquidos com inibidores do crescimento microbiano no permitem uma seleo to precisa como nos meios slidos, h um enriquecimento do contedo microbiano do meio. Estes caldos estimulam o crescimento de um microrganismo especfico, que se torna assim a espcie dominante porque se sobrepe aos seus competidores. Permitem aumentar a concentrao de microrganismos que esto em minoria no ambiente. Os agentes de seleo podem ser produtos qumicos, corantes (eosina, verde de malaquita, azul de metileno, violeta cristal, verde brilhante, etc.), antimicrobianos, sais minerais (tetrationato de sdio, nitrato de potssio, telurito de potssio, cloreto de sdio, etc.), sais biliares, asparagina (promove o crescimento), etc. Exemplos: Agar Sabouraud: favorece o crescimento dos fungos, pois tem um pH baixo (5,6) e uma alta concentrao de glicose, alm disso o crescimento bacteriano est inibido devido presena de um antibacteriano no meio.

Meio de Lwenstein-Jensen e Meio de Middlebrook: so meios com glicerol e verde de malaquita (corante) que inibem outras bactrias permitindo isolar o Mycobacterium tuberculosis. O primeiro meio contm asparagina que um favorecedor do crescimento desta espcie bacteriana. Caldo Verde Brilhante: condiciona o crescimento de cocos Gram positivo e favorece o crescimento de bacilos Gram negativo, principalmente da famlia Enterobacteriaceae devido presena de sais biliares e do corante verde brilhante. Caldo de Tetrationato e Caldo de Selenito: o tetrationato e o selenito de sdio so substncias inibidoras de bactrias intestinais e de muitos cocos Gram positivo. Estes meios so utilizados no isolamento de Salmonella e de Shigella a partir de produtos (gua, alimentos, fezes, urina, etc.) onde a concentrao destes patognicos baixa em relao ao resto da populao normal. Diferenciais Estes meios permitem separar grupos de microrganismos atravs da sua aparncia no meio (caractersticas morfolgicas ou bioqumicas). Tm incorporado substncias qumicas (indicadores) que, aps a inoculao e a incubao, assinalam alteraes caractersticas na aparncia do crescimento microbiano (colnias) e/ou no meio que rodeia as colnias (geralmente por mudana de cor do meio onde existe a colnia) o que permite a sua diferenciao e identificao. Do informao acerca do comportamento e do metabolismo dos microrganismos, permitindo a visualizao de atividades metablicas. Um meio com um hidrato de carbono e um indicador de pH permite detectar se o acar foi ou no metabolizado, pois este quando fermentado origina como produtos terminais cidos orgnicos que fazem diminuir o pH e por isso mudam a cor do meio assinalando as caractersticas fermentativas do microrganismo em estudo.

Exemplos: Meio de Simmons: o citrato neste meio a nica fonte de carbono, assim se houver crescimento microbiano significa que o citrato est a ser metabolizado. Isto origina uma variao de pH (aumento de pH) que detectada pelo azul de bromotimol que passa de verde a azul. Agar Sangue: este meio com glbulos vermelhos intactos fornece informao acerca da capacidade hemoltica dos microrganismos. Distingue as bactrias no hemolticas (gama-hemlise) das bactrias alfa-hemolticas (hemlise parcial) e das bactrias beta-hemolticas (hemlise total). Agar Cled (Cystine Lactose Electrolyte Deficient Media): um meio diferencial, pois como contm lactose e um indicador de pH (azul de bromotimol) permite detectar se o acar foi ou no metabolizado. usado para cocos Gram positivo e para bacilos Gram negativo, e permite travar o crescimento em toalha dos Proteus. Simultaneamente seletivos e diferenciais

Exemplos: Agar MacConkey: um meio seletivo, pois contm sais biliares e o corante violeta de cristal para inibir o crescimento de bactrias Gram positivo permitindo que as Gram negativo cresam. Por outro lado, um meio diferencial, pois como contm lactose e um indicador de pH (vermelho neutro) permite distinguir entre as bactrias Gram negativo que fermentam (ex. E.coli) e as que no fermentam (ex. Salmonella e Shigella) esse hidrato de carbono. As colnias das bactrias fermentadoras de lactose aparecem rosadas enquanto as outras ficam incolores e at transparentes. Agar Manitol Sal: um meio seletivo pois, como tem uma grande concentrao salina (7,5% NaCl) inibe a maior parte dos microrganismos permitindo o crescimento das bactrias da famlia Micrococcaceae (cocos Gram positivo). um meio diferencial, pois tem presente o lcool manitol e um indicador de pH (vermelho de fenol) que passa de vermelho a amarelo se o microrganismo fermentar o manitol. Agar SS: a presena de sais biliares e do corante verde brilhante tornam-o um meio seletivo, pois inibem muitas bactrias Gram positivo. bom para o isolamento de Salmonella e Shigella. um meio diferencial devido presena de lactose e de um indicador de pH (vermelho neutro) que permite distinguir os microrganismos fermentadores da lactose (colnias rosa) dos no fermentadores (colnias da cor do meio). Agar EMB (Eosine Methylene Blue) ou Meio de Levine: um meio seletivo, pois parcialmente inibidor para microrganismos Gram positivo devido ao azul de metileno, e por conseguinte o crescimento dos Gram negativo mais abundante. um meio diferencial, pois a presena de lactose e do corante eosina permite diferenciar as bactrias fermentadoras das no fermentadoras da lactose. Os microrganismos fermentadores da lactose levam baixa de pH, de modo que as colnias aparecem com aspecto verde metalizado. Os que no fermentam a lactose produzem colnias incolores, mas devido sua transparncia aparecem com a cor do meio, ou seja, prpura. Este meio permite identificar os Gram negativo patognicos atravs da caracterizao visual, porque eles raramente fermentam a lactose. Meios de transporte So meios estveis que no permitem que os microrganismos se desenvolvam, mas mantendo a viabilidade de todos os microrganismos da amostra sem alterarem as suas concentraes. So usados para armazenamento temporrio de amostras para serem transportadas para o laboratrio, nas mesmas condies em que se encontravam no momento da colheita. Meios de manuteno Permitem manter as culturas durante algum tempo, pois os microrganismos vo crescendo, mas lentamente.

PREPARAO GERAL DE MEIOS DE CULTURA DESIDRATADOS Os meios de cultura desidratados so produzidos por Laboratrios comerciais, de tal modo que o nome e a composio de cada meio praticamente semelhante para todas as marcas. So fornecidos em p ou em grnulos e a sua preparao faz-se pela simples adio de gua destilada, bidestilada ou desionizada (obtido pela ao de resinas troca-ies) em determinada proporo que se encontra expressa no rtulo da embalagem. Rehidratao Num recipiente de vidro pesa-se cuidadosamente o p relativo ao volume que pretendemos obter, segundo as indicaes do fabricante. Esses componentes do meio vo ser agora dissolvidos em gua destilada, bidestilada ou desionizada, e depois com a ajuda do calor aquece-se at dissoluo completa. Ajuste do pH Nesta fase pode ser ajustado o pH do meio para valores compatveis com as bactrias, ou seja, pH 7, que se encontra definido pelo fabricante para cada meio de cultura. Podem-se adicionar solues tampo (ex. fosfato de sdio ou de potssio) para manter o valor do pH constante. Em provas fermentativas adicionam-se tambm os indicadores de pH (ex. vermelho de fenol), caso no faam j parte da composio do meio. Distribuio Distribui-se o meio de cultura em quantidades apropriadas por recipientes apropriados (tubos de ensaio, frascos ou bales). Esterilizao Embora os meios sejam vendidos esterilizados, na fase de rehidratao deixam de o ser e ento necessrio esteriliz-los de novo para evitar a presena de microrganismos contaminantes e de outras formas de vida. O mtodo de esterilizao utilizado condicionado pela composio do meio de cultura. A esterilizao dos meios de cultura pode ser feita de vrios modos: * Em autoclave (aplicao do calor hmido sob presso): O calor hmido o mtodo mais efectivo para matar os microrganismos pois causa desnaturao e coagulao das protenas vitais como as enzimas, enquanto o calor seco (estufa) causa oxidao dos constituintes orgnicos da clula (isto os microrganismos vo-se queimando lentamente). A desnaturao ocorre com temperaturas inferiores e menor tempo de exposio do que a oxidao (ex. os endsporos de Bacillus anthraccis so destrudos em 2-15 min. pelo calor hmido enquanto com o calor seco demora mais de 180 min. a 140 C para obter o mesmo resultado).

A maneira mais prtica de aplicar o calor hmido atravs do autoclave, que consiste num sistema fechado de volume constante em que um aumento de presso permite um aumento de temperatura. O autoclave permite temperaturas altas, um aquecimento mais rpido e uma grande penetrao de calor. neste aparelho que se esterilizam por rotina os meios de cultura, solues e materiais contaminados. Normalmente a esterilizao dos meios de cultura faz-se por exposio ao vapor a 121 C e 15 lbs de presso durante 15 minutos ou mais, dependendo do tipo de material a esterilizar. * Por filtrao: Quando na composio de um meio de cultura entram substncias que no podem sofrer temperaturas elevadas (ex. gelatina) recorre-se filtrao desses elementos termolbeis. Utilizam-se filtros de membrana (de celulose), encontrando-se disponveis uma grande variedade de poros de diferentes dimenses. Geralmente usam-se membranas com poros de 0,2 m de dimetro que no permitem a passagem dos microrganismos, ficando assim o meio esterilizado. A filtrao uma excelente maneira de reduzir a populao microbiana sem ocorrer destruio directa dos microrganismos, pois o filtro simplesmente os remove. Acondicionamento Quando no se pretende usar o meio de cultura de imediato, este deve ser conservado ao abrigo da luz, a uma temperatura entre 0 e 5 C no perodo determinado pelo fabricante, evitando a sua desidratao. Para o utilizar faz-se a redistribuio para recipientes j esterilizados onde se iro posteriormente semear os microrganismos. Os meios slidos para poderem ser redistribudos tem de ser aquecidos at ficarem liquefeitos, transferidos para um banho de gua a 48-50 C para arrefecerem, e finalmente distribudos por recipientes. J no recipiente preciso deixar o meio arrefecer mais para solidificar (Figura 6). Os meios slidos no estado liquefeito podem ser colocados em tubos de ensaio (com tampa para evitar a contaminao e a desidratao do meio de cultura) ou em placas de Petri. Para se obter um tubo em rampa deixa-se arrefecer e solidificar o meio de cultura numa posio inclinada, criando assim uma rampa mais ou menos pronunciada. So usados para manter culturas puras. Por outro lado, deixando arrefecer o meio num tubo na posio vertical temos um tubo em cilindro. Estes tubos so usados, por exemplo, para estudar as necessidades em oxignio dos microrganismos. Os meios em placa de Petri proporcionam grandes reas de superfcie para o isolamento e o estudo dos microrganismos. As placas de Petri so formadas por duas metades, uma base (que contm o meio de cultura) e uma tampa. H placas de Petri de vrios tamanhos sendo as usadas por rotina de aproximadamente 9 cm de dimetro. Os meios lquidos so distribudos em tubos de ensaio, bales ou frascos tambm devidamente rolhados.

CULTURA DE MICRORGANISMOS - SEMEADURAS OBSERVAO E CRTICA DOS RESULTADOS DAS SEMEADURAS CARACTERSTICAS CULTURAIS DOS MICRORGANISMOS Conhecer procedimentos para a cultura de microrganismos. Compreender a importncia das tcnicas asspticas na cultura de microrganismos. Conhecer princpios e procedimentos das diversas tcnicas de sementeira em placa. Executar semeaduras em diferentes meios de cultura em placa para isolamento de colnias a partir de produtos polimicrobianos.

TEXTO DE APOIO: Semear a designao microbiolgica para a introduo, num meio de cultura adequado, de um inculo de origem biolgica ou cultural. Os meios de cultura slidos podem ser distribudos de forma variada de acordo com o que se pretende: em bales tipo Erlermeyer ou outros, tubos em rampa, em cilindro e em placas de Petri. Os meios de cultura lquidos (caldos) so habitualmente distribudos em bales ou tubos. Observao do crescimento bacteriano. Em meios slidos: O crescimento traduz-se pelo aparecimento de colnias, isto , aglomerados de clulas resultantes da multiplicao bacteriana a partir de um nico ancestral. Nessas colnias devem ser averiguadas principalmente quando observadas em placas de Petri: as seguintes caractersticas,

- tamanho ponta de alfinete, pequeno, mdio e grande. - cor/pigmentao diversificadas. - forma - circular, irregular, rizide e em toalha. - textura lisa, rugosa e mucide. - brilho opacas e brilhantes. - elevao - sem relevo (achatadas), com ligeiro relevo, relevo marcado, convexo e mamilonadas. - margens inteiras, lobadas, onduladas, serradas e filamentosas. Em meios lquidos O crescimento nos caldos pode ser apreciado por: - turvao - fina, uniforme, floculenta. - sedimento. - pelcula ou anel (crescimento superfcie)

Meios de cultura e Tcnicas de Semeadura O estudo de bactrias exige o prvio isolamento e identificao, para tanto, so utilizados diversos meios de cultura diferentes. Meio de cultura uma mistura de nutrientes que possibilitam o crescimento in vitro de microorganismos. A maioria das bactrias cresce em meios de cultura. As excees so as ricketsias, clamdias, Mycobacterium leprae e Treponema, que so parasitos intracelulares obrigatrios. Neste caso, estes microorganismos podem ser cultivados em culturas de clulas e ovos embrionados. Inoculao a contaminao proposital de um meio de cultura, ou seja, a transferncia de um determinado nmero de microorganismos para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam e permitam a sua identificao. A inoculao das bactrias em diferentes meios envolve vrias tcnicas de semeadura. Toda a manipulao realizada em laboratrio (com meios, cultura e material utilizado) requer certos cuidados para evitar a contaminao. Esses procedimentos so denominados tcnicas asspticas. Fundamentao terica Meios de Cultura Os diversos meios de cultura existentes podem ser classificados de diversas formas:

Tcnicas de Semeadura As tcnicas de semeadura so o mtodo pelo qual se transfere inculos bacterianos de um meio de cultura ou material a ser analisado (secrees, urina, sangue) para outro meio de cultura. Para garantir que apenas o microorganismo desejado seja semeado, so utilizadas as tcnicas asspticas: procedimentos que devem ser adotados visando a no contaminao de materiais, meios e culturas. As tcnicas de assepsia incluem: a. Fazer a desinfeco da rea de trabalho e anti-sepsia das mos ANTES e DEPOIS de qualquer trabalho. (1) b. Trabalhar SEMPRE na rea de segurana: uma rea de aproximadamente 10 cm ao redor da chama do bico de Bunsen. (2) c. Esterilizar adequadamente todo material (p.ex.: alas e agulhas bacteriolgicas) ANTES e DEPOIS de seu uso sempre aquecer da base para a ponta, evitando a formao de aerossis. (3) d. Flambar a boca dos frascos e tubos ANTES e DEPOIS das inoculaes, evitando a contaminao da cultura/material a ser analisado e garantindo que somente o microorganismo desejado ser inoculado. (4)

De acordo com as caractersticas fsicas dos meios de origem e destino, alm da finalidade da inoculao, podem-se utilizar diferentes tcnicas de inoculao. A transferncia de inculo de um meio para outro tambm denominada genericamente como repique. A seguir, veremos quais so as tcnicas de inoculao: Semeadura em meios slidos

Semeadura em meios semi-slidos

Semeadura em meios lquidos

Objetivos Aps a realizao da atividade prtica voc ser capaz de: a. Executar e determinar a finalidade das principais tcnicas de semeadura de bactrias em diferentes meios (lquidos, semi-slidos e slidos), tanto em tubos quanto em placas; b. Caracterizar os diferentes meios de cultura e a finalidade de cada um;

c. Identificar e executar as tcnicas de assepsia em laboratrio. Material Para a atividade prtica sero utilizados: - Placa de Petri com Agar - Tubo com Agar inclinado - Placa de Petri estril - Tubo com Agar semi-slido - Cultura bacteriana em caldo e em Agar - Pipetas estreis - Ala e agulha bacteriolgicas Execuo da prtica A partir de cultura em placa: - a partir de um crescimento isolado obtido em placa, pegar uma colnia com auxlio de uma ala bacteriolgica e transferir para o tubo com caldo, atravs do processo de difuso.

A partir de cultura em caldo: - a partir de um crescimento obtido em caldo, realizar as seguintes inoculaes: 1. Com auxlio de uma ala bacteriolgica, transferir o inculo para o tubo com caldo, atravs da tcnica de difuso. 2. Com auxlio de uma ala ou agulha bacteriolgica, transferir o inculo para o tubo com Agar inclinado, atravs da tcnica de estria (sinuosa ou reta). 3. Com auxlio de uma ala bacteriolgica, transferir o inculo para a placa com Agar, atravs da tcnica de esgotamento em estrias (3 ou 4 estrias). 4. Com auxlio de uma agulha bacteriolgica, transferir o inculo para o tubo com Agar semi-slido, atravs da tcnica de picada central.

A partir da amostra de gua: - com o auxlio de uma pipeta estril, transferir 1 ml da amostra de gua para uma placa estril e adicionar o meio fundido, realizando a tcnica do pour plate.

Aps a execuo de todas as inoculaes, incubar os meios a 37C por 24 horas. Observar e interpretar o crescimento nos meios, destacando aquele empregado no isolamento de colnias (esgotamento em estrias). Exerccios de fixao 1. Qual a diferena entre os meios de enriquecimento e seletivo? 2. Qual a finalidade da tcnica do spread plate ou tcnica do espalhamento? 3. Por que no devemos cruzar as estrias na tcnica do esgotamento em estrias?

4. Por que devem ser realizadas as tcnicas asspticas? 5. Por que utilizamos diferentes meios durante a anlise de um determinado material? 6. Para uma cultura que esteja guardada h muito tempo (sob refrigerao), qual o tipo de meio devemos utilizar para retornar a utiliz-la numa atividade prtica? 7. Para determinar a presena de um microorganismo especfico num material que esteja muito contaminado, quais os tipos de meios que devemos utilizar?