FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS ESCUELA DE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

CURSO: BIOTECNOLIGIA DE LOS P.A.I.

TEMA:

DETERMINACIN

DE

LOS

PARMETROS

CINTICOS DE UNA ENZIMA

INTEGRANTES:

MEDINA GARCIA, SANDRA ANNA LUCY MINCHOLA GUTIERREZ, ROSMER EDGAR VILLANUEVA CHUNQUE, YONEL GABRIEL

CICLO: IX

TRUJILLO PER 2011

DETERMINACIN DE LOS PARMETROS CINTICOS DE UNA ENZIMA

I. INTRODUCCIN En los diversos compartimientos celulares transcurre un gran nmero de reacciones qumicas que proporcionan a la clula energa y los componentes necesarios para su mantenimiento. Las reacciones qumicas en los sistemas biolgicos slo ocurren en presencia de catalizadores, que son protenas especficas denominadas enzimas. La presencia de una enzima se detecta por las reacciones especficas que cataliza. Toda reaccin enzimtica puede esquematizarse como sigue:

La velocidad de una reaccin catalizada por un enzima depende de 1. la concentracin de molculas de sustrato [S] 2. la temperatura 3. la presencia de inhibidores 4. pH del medio, que afecta a la conformacin (estructura espacial) de la molcula enzimtica

II.

OBJETIVOS Conocer los parmetros de la actividad enzimtica Observar el comportamiento de una reaccin enzimtica en un extracto crudo vegetal. Determinar la Vm y Km de la enzima extrada de papaya

III. MARCO TEORICO Modelo de Lineweaber-Burk La ecuacin Michaelis-Menten puede transformarse algebraicamente en otras formas que son mas tiles para la expresin de los datos experimentales. Una de las transformaciones se obtiene tomando los dobles reciprocos de ambos miembros de la ecuacin de MichaelisMenten

Ecuacin de Lineweaber-Burk

Determinacin de las constantes de Lineweaber-Burk La representacin grafica de este modelo permite identificar la Km y Vmax; el punto de corte ciob el eje de ordenadasd es equivalente a la inversa de Vmax, y el de abscisas es el valor de -1/Km. Tal representacin doble-recioprica tiene la ventaja de que permite una determinacin mucho mas exacta del valor Vmax ya que las representacin sencilla de Vo frente a la concentracin del sustrato en la curva de Michaelis Menten solo se obtiene por su valor aproximado puesto que es un valor limite a una concentracin del sustrato infinita.

Figura 1. Representacion de la doble reciproca de la velocidad de reaccion

Modelo de Eadie-Hofsteen Ota aplicacin til de la ecuacin de Michaelis-Menten se obtiene multiplicando ambos miembros de la ecuacin Lineweaber-Burl por V y reordenndola se obtiene la ecuacin de Eadie-Hofsteen

Ecuacin de Eadie-Hofsteen Determinacin de constantes de Eadie-Hofsteen La representacin de Vo frente a Vo/[S] se conoce como la representacin de EadieHofsteen. Donde Vo representa la velocidad de la reaccin, Km es la constante de Michaelis- Menten.

Figura 2. Representacin grafica de la velocidad de reaccin y constantes de Vmax y Km de Eadie-Hofsteen. Este diagrama permite visualizar rpidamente los parmetros cinticos importantes como Km y Vmax a la vez que esta menos afectada por el margen de error que el diagrama de Lineweaver-Burke, debido a que asigna el mismo peso a todos los puntos para cualquier rango de concentracin del sustrato o de la velocidad de reaccin.

IV. RESULTADOS 1. DETERMINACIN DE LA CURVA DE CALIBRACIN Tabla N01: Valores de absorbancia y concentracin de almidn Componentes Sustrato de almidn Agua deshidratada HCl 0.1 N Solucin Yodada Absorbancia mg de Almidn Tubos 3 1.5 1.5 2.5 0.1 0.884 0.6

B 0 3 2.5 0.1 0 0

1 0.5 2.5 2.5 0.1 0.295 0.2

2 1 2 2.5 0.1 0.621 0.4

4 2 1 2.5 0.1 1.067 0.8

5 2.5 0.5 2.5 0.1 1.484 1

Curva de Calibracion
1.6 1.4 1.2 1 ABS 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0.2 0.4 0.6 0.8 mg/ml Almidon 1 1.2 y = 1.4434x R = 0.9919

Figura N01: Curva de calibracin del almidn

2. DETERMINACIN DE LOS PARMETROS DE MICHAELIS MENTEN (Km y Vmx) Muestra: Papaya Tabla N02: Valores de Absorbancia, almidn residual y velocidad. TUBO Blanco * Problema1 Problema2 Problema3 Problema4 Problema5 ABS 0 0.073 0.143 0.144 0.316 0.574 C 0 0.073 0.143 0.144 0.316 0.574 mg de Almidn 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Almidn Almidn residual hidrolizado 0 0 0.05057503 0.14942497 0.09907164 0.09976445 0.21892753 0.39767216 0.30092836 0.50023555 0.58107247 0.60232784

Tabla N03: Valores de velocidad y de cantidad de sustrato inicial, residual e hidrolizado TUBO Blanco * Problema1 Problema2 Problema3 Problema4 Problema5 ABS 0 0.073 0.143 0.144 0.316 0.574 C 0 0.073 0.143 0.144 0.316 0.574 mg de Almidn 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Almidn Almidn USC USC residual hidrolizado (0.1ml) (100ml) 0 0 0.05057503 0.14942497 0.00747125 7.47124844 0.09907164 0.09976445 0.21892753 0.39767216 0.30092836 0.50023555 0.58107247 0.60232784 0.01504642 0.02501178 0.02905362 0.03011639 15.0464182 25.0117777 29.0536234 30.1163919

2.1)

REPRESENTACIN DE MICHAELIS MENTEN

0.045 0.04 0.035 0.03 0.025 V 0.02 0.015 0.01 0.005

Vm=0.0416

Vmax/2=0.0208
y = -0.0237x2 + 0.0653x R = 0.9838

Km=0.36
0 0 0.2 0.4 0.6 S 0.8 1 1.2

Figura N02: Diagrama de velocidad de reaccin y constante de Michaelis-Menten

Tabla N04: Valores de los parmetros de Michaelis Menten y valor de R2 Vmax Vmax/2 Km R2 0.0416 0.0208 0.36 0.9838

2.2)

REPRESENTACIN DE LINEWEAVER BURK

Tabla N05: Valores de cantidad de sustrato, velocidad y de sus respectivas inversas PAPAYA Veloc. (mg./min) 0 0.009961665 0.020061891 0.033349037 0.038738165 0.040155189

[S]inicial (mg./ml.) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

1/S 5 2.5 1.666666667 1.25 1

1/V 100.3848294 49.84575007 29.98587336 25.81433613 24.90338164

Representacin de Lineweaver - Burk

120 100 1/V 80 60 40 20 0 0 2 1/S 4 6 y = 20.051x R = 0.9912

Figura N03: representacin de Lineweaver Burk

Tabla N06: Valores de Vmx, Km y R2 1/V=(Km/Vmx)x(1/S)+(1/Vmx) y = 19.614x + 1.4007 19.614 14.0029985 Km/Vmx Km 1.4007 0.71392875 1/Vmx Vmx 2 0.9919 R

2.3)

REPRESENTACIN DE EADIE HOFSTEE

V/S = Vmx/Km - (1/Km)*V

Tabla N07: Valores de cantidad de sustrato, velocidad y de velocidad/sustrato PAPAYA Veloc (mg./min) 0 0.009961665 0.020061891 0.033349037 0.038738165 0.040155189

[S]inicial (mg./ml.) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

V/S 0.04980832 0.05015473 0.05558173 0.04842271 0.04015519

V 0.009961665 0.020061891 0.033349037 0.038738165 0.040155189

Representacin de Eadie - Hofstee

0.06 0.05 0.04 V/S 0.03 0.02 0.01 0 0 0.01 0.02 V 0.03 0.04 0.05 Series1 y = -0.15x + 0.0531 R = 0.1235

Figura N04: Representacin de de Eadie Hofstee

Tabla N08: Valores de Vmx, Km y R2 V/S= Vmx/Km - (1/Km)*V y = -0.15x + 0.0531 0.0531 Vmx/Km 0.15 1/Km 0.354 Vmx 6.666666667 Km 2 0.1235 R

2.4)

REPRESENTACIN DE LANGMUIR

S/V = Km/Vmx + S*(1/Vmx)

Tabla N09: Valores de cantidad de sustrato, velocidad y de sustrato/velocidad PAPAYA Veloc (mg./min) 0 0.009961665 0.020061891 0.033349037 0.038738165 0.040155189

[S]inicial (mg./ml.) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1

S/V 20.07696588 19.93830003 17.99152402 20.6514689 24.90338164

S 0.2 0.4 0.6 0.8 1

Representacin de Langmuir
30 25 20 S/V 15 10 5 0 0 0.2 0.4 0.6 S 0.8 1 1.2 y = 5.183x + 17.603 R = 0.4137

Series1

Figura N05: representacin de Langmuir

Tabla N10: Valores de Vmx, Km y R2 S/v=(Km/Vmx)+S*(1/Vmx) y = 5.183x + 17.603 17.603 Km/Vmx 5.183 1/Vmx 0.192938453 Vmx 3.396295582 Km 2 0.4137 R

2.5)

REPRESENTACIN LINEAL DIRECTA Tabla N11: Valores de la cantidad de sustrato y velocidad PAPAYA [S]inicial (mg./ml.) 0 -0.2 -0.4 -0.6 -0.8 -1 Veloc. (mg./min) 0 0.0100 0.0201 0.0333 0.0387 0.0402

0.2 0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 V 0.08 0.06 0.04 0.02 0 -1 -0.5 -0.02 0 0.5 1 1.5 S 2 2.5 3 3.5 4

Figura N06: Representacin lineal directa

-De la figura N06, se obtienen los valores de Km y Vmx de la siguiente manera: Km 0.15 0.45 0.7 2 3.15 1.29 Vmax 0.048 0.056 0.072 0.12 0.166 0.0924

Promedio Km=1.29 Vmax=0.0924

Tabla N12: Cuadro comparativo de los resultados finales REPRESENTACIN MICHAELIS MENTEN LINEWEAVER BURK EADIE HOFSTEE LANGMUIR LINEAL DIRECTA Vmx 0.0416 0.71392875 0.354 2.82485876 0.98359688 Km 0.36 14.0029985 6.66666667 3.39629558 6.10649019 R2 0.9838 0.9919 0.1235 0.4137 -

3.

DISCUSIONES

-La cintica de las enzimas se estudia usualmente observando las velocidades de reaccin para evitar as los problemas relacionados con la inhibicin por producto y con cualquier cambio de pH que pueda haber como resultado de la reaccin. Esta metodologa hace uso de mtodos espectrofotomtricos de gran rapidez. (Atkinson, 2002)

-Un inconveniente de la representacin Lineal directa podra dar la dificultad de detectar las desviaciones del comportamiento de michaelis menten. La representacin lineal es un mtodo relativamente insensible a las lecturas errneas individuales que se encuentran lejos de los valores correctos. Este mtodo se recomienda para aquellas enzimas que se conoce que obedecen a una cintica de michaelis menten. (Doran, 1998). -Los valores de los parmetros biotecnicos obtenidos mediante la representacin de langmuir son los ms prximos a los de la regresin lineal, lo que indica la mayor eficacia de esta representacin frente a las otras dos. (Izquierdo, 2004)

-En los mtodos utilizados podemos notar como el Km va tomando valores relativamente bajos dependiendo del mtodo de linealizacion realizado, esto demuestra la alta afinidad de la enzima extrada de la papaya, por su sustrato de almidn. Ya que a una baja concentracin de almidn, se vio solo la mitad de la velocidad mxima de la enzima. (Doran, 1998)

-En el laboratorio trabajamos con un sustrato la cual a una velocidad mxima no puede ser medido con exactitud, a pesar de ello nos sirvi de parmetro la concentracin de sustrato conocida como constante de Michaelis-Menten (Km) a la cual la velocidad de reaccin es la mitad de la velocidad mxima. (Nelson, 2000)

-Valores bajos de la constante Michaelis-Menten (Km) indican que el complejo ES est unido muy fuertemente y raramente se disocia sin que el sustrato reaccione para dar producto. Para nuestro caso el valor de Km fue bajo (0.36), lo que indica que existe una unin muy fuerte del complejo enzima-sustrato (ES) por el sustrato. (Nelson, 2000)

4.

CONCLUSIONES

-Se trabaj con los respectivos parmetros que determinan la velocidad enzimtica aplicando graficas tales como las de cintica enzimtica de Michaelis Menten (Vmax y Km) y se las pudo comparar con los obtenidos por las representaciones Lineweaver Burk, Eadie Hofstee, Langmuir y Lineal Directa

5.

BIBLIOGRAFA

-Atkinson B., REACTORES BIOQUIMICOS, Editorial reverte, 2002. -Izquierdo Felipe y col., PROBLEMAS RESUELTOS DE CINETICA DE LAS REACCIONES QUIMICAS,Ediciones de la universidad de Barcelona, 2004. - DORAN, P. 1998. Principios de Ingeniera de los bioprocesos. Editorial acribia SA. Zaragoza (Espaa). -Nelson, D.L., Cox, M.M. (2000). Lehninger Principles of Biochemistry.(3 Ed.). Worth Publishers. New York