Manipular correctamente muestras biolgicas para que no sean derramadas o para que no sean eyectadas sobre el manipulador.

TITULO DEL PRCTICO INTRODUCCION (OBJETIVOS) Para analizar cierto elemento en el laboratorio debe ser posible su extraccin y separacin de cualquier entorno que pudiera rodearlo o contenerlo. Con este fin han sido desarrolladas variadas tcnicas de separacin entre las cuales se encuentran aquellas que son de inters en el curso de qumica biolgica: electroforesis, centrifugacin y cromatografa en columnas. Estas son bien llamadas tcnicas separativas. Luego de la obtencin del elemento de inters, se puede cuantificar su presencia en el medio. Para ello se debe recurrir a los mtodos de anlisis, que pueden ser culitativos o cuantitativos. Entre estos ltimos se encuentra la espectrofotometra que es la otra tcnica observada en el laboratorio. METODOS SEPARATIVOS - CROMATOGRAFIA EN COLUMNAS: En la cromatografa existe una fase fija (matriz) y otra mvil (generalmente un solvente) . de intercambio ionico: en la matriz se coloca iones cargados opuestamente al elemento que se quiere separar del resto de la muestra. Se hace pasar la muestra por la columna y el elemento deseado quedar retenido por fuerzas electrostticas al ion proporcionado en la matriz . por afinidad: en la matriz se coloca un elemento que tenga gran afinidad por el elemento que se desea separar. Al correr la muestra, el elemento quedara retenido por su afin en la matriz. Ejemplo: sustratoenzima, antgeno-anticuerpo.

. por filtracin: la fase fija ser un gel con un tamao de poro acorde al tamao del elemento que se quiere separar y al de las dems partculas que acompaan al mismo. Las partculas mas pequeas que caben en el poro pequeo del gel tardaran mas tiempo en llegar al fondo, mientras que las partculas mas grandes sern eluidas y llegaran rpidamente al fondo de la columna.

- ELECTROFORESIS Mtodo basado en la migracin de partculas cargadas desde el catodo al anodo de una cuba debido a la aplicacin de un campo elctrico. La velocidad con que migren las partculas estar afectada por el tamao de las partculas. El mtodo que se observo en el laboratorio se conoce como SDS PAGE: electroforesis con gel de poliacrilamida, y dodecilsulfato sdico, que sirve para desnaturalizar las protenas y cargarlas negativamente. el gel se forma al mezclar los monmeros de acrilamida, un catalizador, un buffer, entre dos placas de vidrio con forma rectangular que sirven de separadores para dar el espesor de la lamina de gel. Antes de que se forme el pelcula de gel se introduce el peine para formar las pequeas cavidades (Wells o calles) donde se van a introducir las muestras de protenas junto con el SDS, buffer, mercaptoetanol, colorante para poder ver las muestras, tambin hay un espesante que puede ser sacarosa o glicerol. En realidad, Se arman dos geles en la misma placa, uno a continuacin del otro: el segundo se conoce como de stacking o apilamiento, que tiene otro pH, poro mas grande, y no es resolutivo.Con el gel formado los vidrios se mantienen juntos por la gran superficie de adherencia. Se coloca el gel en la cuba de electroforesis. los bornes estan conectados mediante un hilo de platino que hace de electrodo entre las hemi cubas; luego el conector es el gel. se hace uso de una fuente

de energa cuyo objetivo es rectificar la corriente alterna de la red domiciliaria en corriente continua.

La migracin se produce porque las protenas estan cargadas negativamente debido al dodecilsulfato sdico (SDS) y se encuentran en un campo elctrico. Luego de sembrar se coloca la tapa conectora para cerrar el circuito y correr la muestra. Luego de que termine la corrida, se desmolda el gel y se le coloca un colorante (Komazi blue) para teir todo;luego se debe decolorar para obtener los patrones de protenas teidos de azul. Para determinar la concentracin se realiza mediante colorimetra (se realiza una reaccin que da un color y que luego se mide con un espectrofotmetro).

- CENTRIFUGA Este mtodo hace uso de un equipo en cuyo rotor se colocan los tubos con muestra, al cual se le aplica cierta velocidad angular (rpm), con el objetivo de separar los elementos constituyentes de la muestra segn sus masas y tamaos (densidades) Se pueden diferenciar dos tipos de centrifugaciones: .diferenciales :se hacen sucesivos ensayos modificando velocidades angulares y tiempos); .por gradiente :se utiliza un gradiente de densidades,(puede ser de sacarosa. los elementos de la muestra descendern hasta encontrar la densidad del gradiente igual a la suya. Luego puede quedar definido un gradiente continuo o discontinuo .

TIPOS DE CENTRIFUGAS .Centrifuga de mesa, comn: tiene un rotor. Llegan hasta 3500-5000 rpm. . Ultracentrifugas: hasta 30000rpm. Tienen refrigeracin; a la cmara se le hace vacio para reducir al mximo la friccion con el aire, lo cual aumentara mucho la temperatura de la centrifuga. Tienen rotores intercambiables. Los rotores se mantienen en heladeras para que la centrifuga no tenga que hacer el trabajo de enfriarlo, ya que las muestras biolgicas deben estar en frio para no degradarse. El rotor tiene alveolos donde se colocan tubo que generalmente son de policarbonato o polivinilo. La tapa de la centrifuga se traba por seguridad. . Preparativas: se utilizan antes de utilizar la ultracentifuga. Se hace para ahorrarle trabajo a la otra que es mucho mas cara. La idea es que para separar las organelas de una celula, se puede usar una preparativa para sedimentar las partes mas pesadas de la celula como la fraccin nuclear, y utilizar una ultra para llegar a mayores velocidades que son las optimas para sedimentar las fracciones mas livianas como las membranas (plasmtica); velocidades de alrededor de 50000g-100000g, o mas (velocidades de giro:70000rpm). En el laboratorio se utilizan centrifugas que llegan hasta 120000g, que sirve a los fines de separar organelas. TIPOS DE ROTORES - Basculantes: los tubos se mueven y quedan horizontales; la fuerza centrifuga relativa actuaa normal a la superficie del liquido que se centrifuga las partculas que estan mas cercanas a la superficie del liquido van a tardar mucho mas en sedimentar que las que estn en el fondo, por ende las que lleguen antes al fondo van a experimentar grandes fuerzas de centrifugacin durante gran parte de la corrida, pudiendo daarse.

en la practica no se utilizan tanto; son mas lentos para sedimentar, - De angulo fijo: desde muy vertical hasta muy horizontal, pero siempre se mantiene constante. Las partculas viajan juntas por la pared del tubo por accin de la fuerza centrifuga hasta llegar al fondo. Es menos daina la fuerza sobre las partculas. son mas baratos, mas practicos de usar y mas rapidos. Para una centrifugacin por gradiente se tarda menos el ensayo. .

METODOS DE ANALISIS CUANTITATIVOS . Espectrofotometro: equipo que mide la absorbancia (transmitancia) de una muestra determinada, haciendo uso de luz monocromtica. Luego se puede determinar concentracin de cierto analito en la muestra.

- Recomendaciones para manejar herramientas. - Resultados - Calcular errores: tericamente no superar 0,01%-0,05%; en la practica 0,1%. Mayor a 0,5% mandar a calibrar el equipo. - Conclusion: integracin sobre los resultados. Colocar cualquier artilugio que se haya utilizado durante el practico y que no aparezca en la gua como tal. Tomando como referencia el hecho de que el error porcentual no puede ser mayor a 0,5%, se debera mandar a calibrar las micropipetas debido a que casi todos los errores porcentuales superan el 0,5%. En realidad prefiero pensar que el equipo fue mal manipulado por nosotros los alumnos. Esto fundado en que el ensayo 1 fue realizado por dos alumnos diferentes, lo cual introduce mayor error a la

medicin. Tambien se podra sumar el hecho de que no siempre se tom el primer dato lanzado por la balanza luego de estabilizarse sino que se espero a que se estabilizara definitivamente, cuando en realidad variaba constantemente. Esto fue corregido en el siguiente ensayo. La manipulacin incorrecta de la micropipeta tambin influenci el error. Por ejemplo al momento de tomar la muestra se puede haber descendido al segundo tope del vstago de la micropipieta y haber tomado mayor volumen del estipulado.

Se explico el correcto uso de las micropipetas, asi como la forma de tomar y depositar muestras con las mismas. Lo primero que se debe tener en cuenta es el volumen de muestra que se quiere recoger; luego se selecciona una micropipeta adecuada observando su graduacin y un tip acorde. Se debe tener especial cuidado en observar bien el visor al momento de graduar la micropipeta, ya que no siempre esta bien proporcionda su graduacin y se puede romper involuntariamente. Luego para tomar una muestra se debe hacer descender el vstago de la micropipeta hasta el primer descenso que permite. La muestra se debe tomar lo mas superficial posible teniendo en cuenta el tipo de muestra (por ejemplo, si presenta espuma). Para descargar la muestra, se debe colocar la punta del cartucho sobre la pared del recipiente para evitar salpicaduras. Se desciende el vstago de la micropipeta hasta su primer tope, y hasta el segundo para descargar cualquier resto que quedase dentro del tip. Los tips para las micropipetas se identifican mediante colores: 1-10 ul, 1-20ul blanco; 2-40, 2-50 ul amarillo; 10-100, 20-200 amarillo, 10-1000 azul.

La actividad realizada consisti en tomar con la micropipeta determinado volumen de agua destilada de un vaso de precipitado y pesarlo en la balanza analtica. Luego se debera determinar si existe un error entre el peso definido por la balanza y el volumen adquirido con la micropipeta.