TCVN TIEU CHUAN QUOC GIA TCVN 9745-1:2013 ISO 14502-1:2005 Xuat ban lan 1 CHE — XAC BINH CAC CHAT DAC TRU'NG CUA CHE XANH VA CHE DEN — PHAN 1: HAM LUONG POLYPHENOL TONG SO TRONG CHE - PHONG PHAP DO MAU DUNG THUOC THU FOLIN-CIOCALTEU Determination of substances characteristic of green and black tea — Part 1: content of total polyphenols in tea — Colorimetric method using Folin-Ciocalteu reagent HA NOI - 2013Loi noi dau TCVN 9745-1:2013 hoan toan twong duong véi ISO 14602-1:2005 va Binh chinh ky thuat 1:2008; TCVN 9745-1:2013 do Ban ky thuat tiéu chudn quéc gia TCVNITC/F20 Ché va san phdm ché bién soan, Téng cuc Tiéu chudn Do lung Chat lugng tham dinh, 86 Khoa hoc va Céng nghé cong bé: Bo TCVN 9745 (ISO 14502), Ché — Xéc dinh cdc chét dc trung cia ché xanh va ché den gdm céc phan sau day: TCVN 9745-1:2013 (ISO 14502-1:2005), Phan 1: Ham luong polyphenol téng sé trong ché - Phuong phap do mau ding thuéc thir Folin-Ciocatteu; TCVN 9745-2:2013 (ISO 14502-2:2005), Phan 2: Ham lugng catechin trong ché xanh — Phuong phap sac ky léng hiéu nang cao.TIEU CHUAN QUOC GIA TCVN 9745-1:2013 ——— ee Ché — Xac dinh cac chat dac trung cla ché xanh va ché den — Phan 1: Ham lwong polyphenol téng s6 trong ché —- Phuong phap do mau dung thuéc tht Folin-Ciocalteu Determination of substances characteristic of green and black tea — Part 1: Content of total polyphenols in tea - Colorimetric method using Folin-Ciocalteu reagent 1 Pham vi ap dung Tiéu chuan nay quy dinh phuong phap xac dinh ham lugng polyphenol ting sé trong ché va che hoa tan bing phép phan tich do mau dung thude thi Folin-Ciocalteu“’. Tiéu chudin nay dp dung cho ca san phdm ché xanh va ché den. 2 Tai liéu vién dan Cac tai ligu vién dan sau rat can thiét cho viéc 4p dung tigu chudn nay. Béi voi cdc tai ligu vién dan ghi nim cong bé thi 4p dung phién ban dugc néu. Déi véi cdc tai ligu vién d&n khong ghi nam cOng bé thi 4p dung phién ban mdi nhat, bao gém ca cae sira déi, bé sung (néu cé). TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987), Nude ding dé phédn tich trong phéng thi nghiém — Yéu cau ky thuat va phuong phép thir TCVN 9738 (ISO 1572), Ché — Chudn bi mau nghién va xac dinh ham rong chat kho TCVN 9741 (ISO 7513), Che héa tan dang ran - Xac dinh do ém (hao hut khdi trong & 103 °C) 3 Nguyén tac Polyphenol tv’ phn mau thir cla la ché da nghién min duge chiét bang metanol 70 % & 70 °C. Ché hoa tan duge héa trong nude néng dure bé sung 10 % (thé tich) axetonitril dé dn dinh dich chiét. Cac aTCVN 9745-1:2013 polyphenol trong dich chiét dugc xac dinh bang do mau, ding thuéc thir Folin-Ciocalteu. Thuée thir nay chia chat oxi hoa la axit phospho-vonframic, trong qué trinn khir, cdc nhém hydroxy phenol dé bi oxi héa, chat oxi héa nay sinh ra mau xanh cé d6 hép thy cure dai & bude séng 765 nm. Phan ing nay lado sy nhiéu hep chat polyphenol va mac du cé thé co dép Ung khac nhau voi cac hop chat don Ié, thi viéc Ilva h thanh mau xanh cla vonfarm va molypden. Cac thudc thiv Folin-Ciocalteu phan ung voi chon axit gallic lam chat chudn hiéu chuan cling gidp ich cho viée thu dug di liéu polyphenol tng sé. 4 Thuéc th Chi sir dung cae thudc thir dat chat lvong phan tich, tri khi c6 quy dinh kha. 4.1 Nuéec, phi hop véi loai 1 cla TCVN 4851:1989 (ISO 3696:1987). 4.2 Axetonitril, 43. Metanol. 4.4 Hén hop chiét metanolinude, 70 % metanol (thé tich) Cho 700 mi metano! (4.3) vao binh dinh mire mét vach 1 t Pha long 68n vach bang nude (4.1) va trén. 4.5 Thuéc th Folin-Ciocalteu, dé duyc pha ché co ban san Nén kiém tra dé tuyén tinh hiéu chudn bang axit gallic dé x4c dinh sy phi hgp cia thud thi duge cung cap. 4.6 Thuéc tht Folin-Ciocalteu lodng, 10 % (thé tich) Dung pipet chuy&n 20 mi thude thi? Folin-Ciocalteu (4.5) véo binh dinh mize m@t vach 200 ml. Pha loaing dén vach bang nude va trén. Chun bi dung dich thuée thi trong ngay st dung. Dé tranh nhiém ban thuée thi Folin-Ciocalteu dam dc, loai 66 thuéc th da chuan bj nhung chua sir dung, 4.7. Dung dich natri cacbonat, 7,5 % (khéi lvong). Can (37,50 + 0,01) g natri cacbonat khan (Na,CO,) cho vao binh dinh mirc mét vach 500 ml. Them nuée 4m dil dén niva binh. Lac 48 héa tan natri cacbonat, 48 ngudi dén nhiét a6 phong, pha loang bang nude dén vach va tron. CHU THICH Dung dich nay ban dén 1 thang & nhigt do phéng, 48 Dung h chudin géc axit gallic, tvong dvong voi axit gallic khan néng 46 khong 1 000 ug/ml.TCVN 9745-1:2013 Can (0,110 + 0,001) g axit gallic ngém mét phan tir nude (M = 188,14) cho vao binh dinh mirc mot vach 100 ml. Héa tan trong nude, pha long dén vach va tron. Chuan bi dung dich chudn méi trong ngay stv dung. CHU THICH Axi galic ngam m@t phdn ty nude tét hon & dang Khan, vi co d6 hoa tan cao hon, da kh G&c tinh htm va ob s8n loai d8 durge ching nhgn, vi dy ACS, bibu thi cho eéc héa chAt dap imag cdc yeu chu ky thudt ca HOi hda hoe MY dua ra, Néu chua biét 6@ dm thi cd x4¢ din 46 &m (hao hyt khbi lxong & 103 °C) tren mgt phan mau chudn, Sau 46, ¢6 thé tinh ning €6 ca dung dich chun go theo axit galic khan, 4.9 Dung dich chuan axit gallic: tw A dén E Dung pipet chuyén cac thé tich dung dich chuan géc axit gallic (4.8) trong Bang 1 vao binh dink mac mét vach 100 mi. Pha loang dén vach bang nue va lic. Chuan bi dung dich chudn pha loang nay trong ngay sir dung. Bang 1 - Dung dich chuan axit gallic pha loang f + Dung dich chuan axit gallic ‘Thé tich cua dung dich géc_~=—- Néng 46 danh dinh cua chat | | axit gallic chudn pha loang mi ugh | A 4.0 10 _| 8 20 20 | I c 3.0 i 30 | | D 40 40 E 50 | 50 5 Thiét bi, dung cy Sir dung cc thiét bj, dung cy ca phéng thr nghiém théng thong va cu thé cac thiét bi, dung cu sau day’ 5.1 Can phan tich, c6 thé can chinh xae dén + 0,001 g. 5.2 Ndi cach thiiy, c6 kha nang duy tri duge @ 70°C +1 °C. 5.3. B6 phan phii, jung cho hén hop chiét metanol/nuec (4.4), va cai dat & mic 5,0 mi. 5.4 May ly tam, c6 lc ly tam tuong déi (R.C.F.) 2 000 (dién hinh 3 500 r/min). 5.5 May do quang phé, cai dat & bude séng 765 nm va cé thé phu hop voi cac cuvet co chiéu dai duéng quang 10 mm, tét nhat ld ding cuvet déng chay ty é6ng. 5.6 Pipet, thiy tinh hodc ty déng, c6 cdc dung tich bao triim dai thé tich dung cho chat chudn va cc dich pha loang ctia dich chiét mau. 5.7 Binh dinh mirc mét vach, cac dung tich 100 mi, 200 ml, 500 ml va 1.TCVN 9745-1:2013 5.8 May trn Vortex, tron higu qua trong qué trinh chiét. 5.9 Ong chiét, bing thidy tinh, dung tich 10 ml, duge day kin va cé thé chiu dug khi ly tm. 5.10 Ong chia dé, bang thijy tinh, dung tich 10 mi, chia dO 0,1 ml, Do phép phan tich nhay véi cac tap chat hu co dang vi lvgng nén can thu hién quy trinh lam sach bé sung déi voi tat cd cae éng chiét (5.9) va éng chia dO (5.10), riva bang axit nitric khodng 15 % (thé tich), sau d6 trang ky bang nude va lam khd trong th say & 100 °C. Trong phép phan tich do mau cudi cling, nén sir dung dng bang chat déo ding mot lan thay cho viée dling éng chia dé vi khong can phai lam sach bé sung. 6 Léymau gwi dén phong thy nghiém phai 4 mau dai dién. Mau khéng bi hu héng hoac bién dai trong suét qué trinh van chuyan hoac bao quan. Viéc lay mau khong quy dinh trong tiéu chudn nay. Nén lay mau theo: — TCVN 5609 (ISO 1839) déi voi ché, va — TCVN 9743 (ISO 7516) déi véi ché ha tan. 7 Chuan bi mau thy ‘Dé dam bao 49 déng nhat, nghién mau ché theo TCVN 9738 (ISO 1572) va bao quan céc mau trong cc vat chia kin trénh anh sang. D6i voi ché héa tan, chi yéu cdu nghién déi voi cdc mau 6 cdu tric dang hat thé. 8 Cach tién hanh 8.1 Yéu cdu chung Néu c6 yéu cau kiém tra gidi han lap lai (10.2) thi tién hanh hai phép xac dinh don Ié theo 8.2 dén 8.6 dudi céc diéu kién lap lai. 8.2 Xac dinh ham lwgng chat khd Tinh ham lugng chat khé ti’ 46 Am xéc dinh duge (hao hut khéi lugng & 103 °C) trén phan mau thir (Biku 7) theo: — TCVN 9738 (ISO 1572) déi voi ché, hoac — TCVN 9741 (ISO 7513) déi voi che héa tan.TCVN 9745-1:2013 8.3 Phan mau thir 8.3.4 Ché héa tan Can (0,500 + 0,001) g mau thiy (Bigu 7) cho vao binh dinh mirc mét vach 50 mi. 8.3.2 Che Cn (0,200 + 0,001) g mau thir (Biéu 7) cho vao 6ng chiét (5.9). 8.4 Chiét cdc polyphenol 8.4.1 Ché haa tan 8.4.1.1 Cho khodng 25 ml nude néng (nhiét dé tdi da 60 °C) vdo ché hda tan dyng trong binh dinh mire (8.3.1). Tron déu dé hoa tan mau va dé ngudi dén nhiét do phéng. 8.4.1.2. Thém 5,0 ml axetonitril (4.2). Pha loaing dén vach bang nue va tron. 8.4.2 Che 8.4.2.1 Cho hén hop chiét metanolinuéc (4.4) dung trong bo phan phdi (5.3) vao ndi cach thy dat 6 70 °C va 48 trong it nhat 30 min dé cho hén hop chiét cAn bang. 8.4.2.2 Cho éng chiét chiva mau (8.3.2) vao ndi céch thiy dat 70 °C. Phan phéi 5,0 ml hn hop chiét néng metanol/nuse tir 8.4.2.1 vao dng chiét, day nap va tron trén may trn vortex (5.8). 8.4.2.3. Tiép tuc dun néng éng chiét 10 min trong néi cach thuy, tron trén may tron vortex sau 5 min dén 10 min, ‘Didu quan trong la tron déu ky cac mau dé dam bao chiét hét. 8.4.2.4 Lay dng chiét ra khdi ndi cach thily va dé ngudi dén nhiét d phong. Mé nap va dat dng vao may ly tam (5.4) & téc d@ 3 500 r/min trong 10 min. 8.4.2.5 Gan can than dich ndi phia trén vao éng chia d (5.10). 8.4.2.6 Lap lai cc bude chiét 8.4.2.2 dén 8.4.2.5. Phdi tron cdc dich chiét, thém hdn hop chiét ngudi metanol/ nuéc (4.4) dén 10 mi va tron. 8.4.2.7 Dich chiét tir 8.4.2.6 c6 thé bén it nhat trong 24 h néu duge bao quan & 4 C. Bé cho dich chiét dat dén nhiét 46 phéng truéc khi tién hanh phép phan tich. Néu chi mét lvgng nhé mau dang hat c6 thé bi {Ang xuéng trong qua trinh bao quan thi khéng can phdi tai huyén pho.TCVN 9745-1:2013 8.5 Dich pha loang Dung pipet chuyén 1,0 ml dich chiét mau (dich chiét ché hda tan tir 8.4.1.2 hodc dich chiét ché tir 8.4.2.6) vao binh dinh mic mét vach 100 mi. Pha loading dén vach bang nude va tron. 86 Xéc dinh 8.6.1 Dung pipet thuc hién hai lan, méi lan chuyén 1,0 mi dung dich chuan axit gallic A, B, C, D va E (4.9) vao cae éng chat déo hoac cac dng chia do (6.10) riéng ré. CHU THIGH Dung dich nay tuong Ung vOi khoding 10 pg, 20 ug, 30 yg, 40 ug va 0 Ug axit galic Khan 8.6.2 Ding pipet thyc hién hai lan, mai lan chuyén 1,0 ml nuée vao cdc éng chia dé (5.10). Day la mu trang thuée thir. 8.6.3 Dung pipet thuc hién hai lan, méi lan chuy€n 1,0 mi dich chiét mu pha lodng (8.5) vao cac éng chia 46 ring ré. 8.6.4 Dung pipet thém 5,0 ml thuéc thir Folin-Ciocalteu (4.6) vao tung éng va tron. 8.6.5 Sau khi bd sung thudc thir Folin-Ciocalteu loang trong vang 3 min dén 8 min, ding pipet lay 4,0 ml dung dich natri cacbonat (4.7) vao méi éng. Day nap va tron. 8.6.6 Dé yén binh & nhiét 6 phdng trong 60 min, sau 6 do mat d6 quang trong cuvet co chiéu dai dung quang 10 mm so véi nuéc trén may do quang phd (6.5) dat 6 buée séng 765 nm. 8.6.7 Mau trang thudc thi (8.6.2) phai ¢6 mat d6 quang < 0,010. Cac gia tri mau tréng cao hon cho thdy co su nhiém tle nude, thudc thir hodc dung cu thiy tinh. Diéu quan trong niva la mat d6 quang cia mau phai nam trong dai hiéu chuan. Néu mat d6 quang cia mau cao hon mat dé quang cla 50 pg dung dich chuan axit galic E thi kp lai phép phan tich do mau bing cach tng d6 pha long (8.5). 9 Tinh két qua 9.1. Tinh khéi Ivong cua axit gallic khan, m, trong 1,0 ml dich long cua dung dich chun A, B, C, D va E (4.9) tir 8.6.1, chinh xac dén 0,1 yg, ding céng thie: XVXWoy un X10000 700x100 Trong dé Mo la khéi lugng ctia axit gallic ngam mot phan tie nudc, dug dung dé chudn bj dung dich chudn géc (4.8), tinh bang gam (g); 10v TCVN 9745-1:2013 Ja thé tich cia dung dich chudn géc axit gallic, doe ding dé chudn bj cdc dung dich chuan A, B, C, D va E (4.9), tinh bang mililit (ml); Wovens la ham long chat khé cia axit galllic, tinh bang phan tram khdi lvgng (%). 9.2 Dyng duéng chuan tuyén tinh phi hgp nhat tir khdi lvong cila axit gallic khan trong cac chat chudn A,B.C,D va E (4.9), nhu da tinh trong 9.1, dua vao mat 66 quang cla dung dich chuan axit gallic sau khi tri di mat 40 quang cla mau trang thuéc they Thu ldy gia tri d6 déc cla duong chuan va gid tri giao diém. Duong chuan axit gallic dién hinh dug néu trong Phy luc A. Phai thu duoc hiéu chudn tuyén tinh. Tinh gia tri dd déc cua dudng chudn, chinh x4c dén 0,000 1 4é dung cho cac phép tinh tiép theo. Higu chuan tuyén tinh cing phai cé gia tri giao diém gan voi gid tri ban dau. Cac gia tri giao diém trén mat d6 quang cua truc y > + 0,04 phai duoc kiém tra danh gia. Vi dy, kiém tra 46 4m cua axit gallic, viéc chun bj chat chun hoac hiéu chuan pipet. Ham lung polyphenol téng s6, wr, tinh bang phdn tram khdi long mau khd, duge tinh bang oéng thie: Trong 6 Dao sem Sonus Mase Vinbw Wortumds (oe )xV,,, xdx100 = XMyy,, X10 000XWoy4 wy; la mat d6 quang thu duge déi voi dung dich mau thu; 1a mat d6 quang tai diém duong chudn tuyén tinh phi hop nhat cat voi truc y; 1a 66 déc thu dugc tiv higu chudn tuyén tinh phu hop nhat: la khdi long ca phan mdu thd, tinh bang gam (g); la thé tich cla dich chiét mdu (50 mi déi voi ché héa tan va 10 ml déi vdi che), tinh bang milllit (ml); la h€ sé pha long duoc ding trvec Khi x4c dinh phép do mau (dién hinh tir 4,0 ml dén 100 mi, vi vay hé s6 pha loang la 100); la ham lwgng chat khd cla mau thir, xac dinh duge theo 8.2, tinh bang phan tram khdi lvong (%). 1TCVN 9745-1:2013 10 Bd chum 10.1 Phép thi? lién phong thir nghiém Chi tiét v8 phép thi? lién phong thir nghiém dé xc dinh d6 chum cia phwong phdp duge néu trong Phy luc B. Cac gid tri thu duc tl phép thir lién phéng thir nghiém nay cé thé khéng ap dung cho cac dai ndng 46 va cdc ch&t nén khdc véi cdc gid tri d& néu. 10.2 86 lap lai Chénh lech tuyét déi gida cdc két qua cla hai phép thy déc lép, don Ié thu duge, khi sir dung cung phuong phép, tién han trén cing vét ligu thi giéng hét nhau, trong cing mot phéng thir nghiém, do mét ngudi thyc hién, si dung cing thiét bi, trong mét khong thoi gian ngéin, khéng duge qua 5 % trudng hop vuot qué gia tri gi6i han lap lai, r, néu trong Bang B.1. 10.3 Dé tai lap Chénh léch tuyét d4i gidra cdc két qua cia hai két qua thir don Ié thu duge, khi sir dung cing phuong phap, tién hanh trén cing vat ligu thir giéng hét nhau, trong cac phdng thr nghiém khac nhau, do nhirng nguéi khac nhau thyc hién, sir dung cdc thiét bi khdc nhau, khong duos qua § % trong hyp vuot qua gié tri gidi han tai lp, R, néu trong Bang B.1. 11 Bao cao thir nghiém Bao céo thir nghiém phai néu ré: moi théng tin can thiét 48 nhan biét day au v8 mau the phuong phap ldy mau da sir dung (néu biét); phuong phép thir da siv dung, vién dan tiéu chuan nay; = moi chi tiét thao tac khac véi quy dinh trong tiéu chudn nay hodc tuy chon cling nh cac sy cé bat ky c6 thé anh huéng dén két qua thir nghiém; — két qua thir nghiém thu dugc; — néu kiém tra d@ lap lai thi néu két qua cudi cing thu duge. 12TCVN 9745-1:2013 Phu luc A (Tham khdo) Duong chuan cia axit gallic X Ham lugng eda axit gallic khan. tinh bang microgam trén millt (jig!) Y_ Mat d6 quang. 765 nm y= 0.132¢ + 0.0113 F=0,9985 Gia tri d6 déc cba duéng chudn = 0.0132 Gia te giao diém = 0.0113 Hinh A1- Dung chuan tuyén tinh phi hop nhat déi voi axit gallic 13TCVN 9745-1:2013 Phu luc B (tham khao) Cac két qua cia phép thir lién phong thir nghigm Mot phép thir lién phong thiy nghigm dugc thy hién vao nm 2001, dudi sy bao tre cla TS chive tiéu chudn héa quéc té, cho cdc két qua théng ké [duc danh gid theo TCVN 6910-2 (ISO 5725-2)] néu trong Bang 1. Bang 1 - Dir ligu vé a8 chum Nhan biét mau Chéxanh =| = Ché den Ché den | A | B Cc 'Sé6 lwong céc phéng thir nghiém tham gia 23 | 23 23 'S6 lugng cdc két qua thi nghiém duge chép nhan 20 | 20 20 t | Ham long polyphenol ting s6 trung binh, tinh | | | theo nam hrgng chat kno, % 2438 18.81 13.95 6 léch chudn lap lai, 5, 0,332 | 0,218 0,214 He s6 bién thién lap fal, % 1.36 | 4.16 183 | Gio nan tap lal, 2.8 s) 093 st 0,60 | 86 léch chudn t8i 8p, Sa | 4,129 1,186 1,029 | He 86 bién thign tai lap, % 464 | 6.31 7,38 3,32 288 Gi6i han tai lap, R(=2,8 Sa) 3.16 14(1 (2) (3 (4) TCVN 9745-1:2013 Thy muc tai ligu tham khao TCVN 5609:2007 (ISO 1839:1980), Ché - Léy mau TCVN 9743:2013 (ISO 7516:1984), Ché hoa tan dang ran - Lay mau TCVN 6910-2:2010 (ISO 5725-2:1994), 86 chinh xéc (06 dung va d6 chum) cua phyong phdp do va két qua do — Phan 2: Phuong phap co’ ban xc dinh d6 lap va 46 tai lap cua phuong phép do tiéu chudn SINGLETON, V.L., ORTHOFER, R. and LAMUELA-RAVENTOS, R.M. Analysis of total phenolics and other oxidation substrates and antioxidants by means of Folin-Ciocaiteu reagent. In: Methods in Enzymology. Oxidants and Antioxidants, Part A, Lester Packer, ed. (1999) 299, pp. 152-178 15