UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE MXICO. FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES IZTACALA.

CARRERA DE MEDICO CIRUJANO

SISTEMA LINFOHEMATICO ALUMNA: Salinas Hernndez Karla Guadalupe. GRUPO: 1333

CASO CLINICO 4: LINFOMA DE HODGKIN

SEMESTRE: 2012-1

Universidad Nacional Autnoma de Mxico. Facultad de Estudios Superiores Iztacala. Carrera de Mdico Cirujano. Sistema Linfohemtico Material para el Alumno CASO CLNICO 4

Hombre de 35 aos con linfadenopata y fiebre Masculino de 35 aos de edad, casado, heterosexual no promiscuo que inici 6 meses antes con fiebre intermitente de 38.5C, diaforesis nocturna y prdida de peso. Posteriormente le aparecieron 3 ndulos en cuello del lado derecho, cansancio, disnea de grandes esfuerzos y dolor abdominal difuso. A la exploracin se encontr palidez de tegumentos, presencia de 3 ganglios en cuello, de 0.5 cm de dimetro, hepato y esplenomegalia. Laboratorio: Hb 9 gr/dL, eritrocitos 2.5 millones/mm3, leucocitos 8,500 cel/ mm3, linfocitos 1800 cel/ mm3, neutrfilos 6200 cel/ mm3, plaquetas 155,000/mm3, linfocitos CD4+ 850/ mm3, CD8+ 350 mm3/, ELISA para VIH positivo, western blot negativo a protenas de VIH. PPD negativo Pistas/hechos/datos orientadores. Masculino 35 aos Casado Heterosexual No promiscuo Fiebre intermitente de 6 meses de evolucin ( 38.5 C) Diaforesis nocturna Perdida de peso 3 nodulos en cuello del lado derecho Cansancio Disnea de grandes esfuerzos Dolor abdominal difuso Ef. Palidez de tegumentos 3 ganglios en cuello (0.5 cm de dimetro) Hepatomegalia Esplenomegalia Laboratorio: Hb 9 gr/dL, Eritrocitos 2.5 millones/mm3,

Leucocitos 8,500 cel/ mm3, Linfocitos 1800 cel/ mm3, Neutrfilos 6200 cel/ mm3, Plaquetas 155,000/mm3, Linfocitos CD4+ 850/ mm3, CD8+ 350 mm3/, ELISA para VIH positivo, Wester blot negativo a protenas de VIH. PPD negativo

Planteamiento del problema Masculino de 35 aos con hepato-esplenomegalia y ELISA para VIH positivo. Hiptesis/Explicaciones/Diagnsticos presuncionales. Al principio se poda suponer que se trataba de un paciente con infeccin por VIH dado que toda la sintomatologa nos puede guiar a ese Dx., pero al analizar las pruebas del laboratorio y descubrir que la prueba de Western blot que se utilizo para comprobar VIH resulto negativa, podemos proponer un Dx de linfoma de Hodgkin pues el paciente presenta varios signos y sntomas relacionados con esta patologa, dado que existe la presencia de tres ndulos en cuello aunado a una hepato-esplenomegalia, y recordando que la prueba de ELISA para VIH puede dar falsos positivos debido a linfoma de Hodgkin. Recordemos que el linfoma de Hodgkin es un tipo de cncer del tejido linftico que comienza en ganglio linftico y afecta tambin a bazo, hgado y medula sea. reas/Objetivos de aprendizaje Linfoma de Hodgkin Hepatomegalia Esplenomegalia ELISA para VIH Western blot LINFOMA DE HODGKIN. El linfoma Hodgkin (LH) se diferencia de la mayora de las neoplasias malignas en su especial composicin celular de forma que en la masa tumoral las clulas neoplsicas son minoritarias, estando el componente mayoritario constituido por clulas inflamatorias. Las clulas de Hodgkin y de Reed-Sternberg (HRS) y sus variantes constituyen menos del 1% de la celularidad total y el componente no neoplsico esta constituido por linfocitos, histiocitos, eosinfilos y plasmticas. La presencia de este componente sugiere que en esta neoplasia la reaccin inmunolgica especfica es una parte importante de la enfermedad. El hecho de que las clulas linfoides atpicas que proliferan en el LH sean minoritarias, es la causa de que dichas clulas hayan sido muy difciles de clasificar. Desde el punto de vista clnico el LH se manifiesta por el aumento del tamao de un ganglio linftico o grupo de ellos. La historia natural de la

enfermedad (no tratada) lleva a la diseminacin a grupos ganglionares vecinos, con afectacin de hgado, bazo y mdula sea. Tanto las caractersticas clnicas como la respuesta al tratamiento de este tipo de linfoma, son diferentes a la de los procesos linfoproliferativos malignos denominados LNH. Los distintos tipos de LH se diferencian en la morfologa de las clulas RS, en la composicin del infiltrado reactivo y en sus caractersticas epidemiolgicas, clnicas y en la historia natural de la enfermedad. Hay cinco subtipos de LH que se denominan: esclerosis nodular (EN), celularidad mixta (CM), LH rico en linfocitos (LHRL), deplecin linfocitaria (DL) y linfoma Hodgkin predominio linfocitico (LHPL). La diferencia ms importante entre las antiguas clasificaciones del LH y la ms recientemente propuesta por la OMS, es que en sta se reconocen dos formas diferentes de LH : el LH clsico y el LH predominio linfoctico nodular (LHPLN) conocido tambin como paragranuloma nodular. El LH clsico engloba a los tipos EN, CM, LHRL y DL. El predominio de linfocitos en el componente no neoplsico no es suficiente para clasificar un caso como LHPLN. Existen casos con morfologa e inmunofenotipo de LH clsico que contienen un predominio de linfocitos T en el infiltrado acompaante. Estos casos en la actualidad son clasificados como LH clsico rico en linfocitos. LINFOMA HODGKIN CLSICO a) Caractersticas clnicas y morfolgicas El linfoma Hodgkin clsico incluye la esclerosis nodular, la celularidad mixta, la enfermedad de Hodgkin clsica rica en linfocitos y la deplecin linfocitaria. La EN es el subtipo ms frecuente de LH (60-80% de los casos). Incide en adolescentes y adultos jvenes aunque puede aparecer a cualquier edad. La afectacin mediastnica y supradiafragmtica son las localizaciones ms frecuentes. En la esclerosis nodular se observa un patrn parcialmente nodular debido a la presencia de bandas fibrosas junto a reas difusas. La clula caracterstica es la variante lacunar de la clula RS. Estas clulas tienen un ncleo multilobulado, con nucleolos pequeos y abundante citoplasma plido que se retrae en el tejido fijado en formol y produce un espacio vaco una laguna. Las clulas lacunares suelen ser abundantes, se observan tambin clulas RS, pero stas suelen ser escasas. El componente no neoplsico contiene linfocitos mayoritariamente de estirpe T, histiocitos, plasmticas, eosinfilos y neutrfilos es frecuente la presencia de necrosis siendo ms numerosas las clulas neoplsicas alrededor de los focos necrticos. Una variante de EN es la forma sincitial de la EN. Se caracteriza porque de forma focal, se observan grandes agregados de clulas lacunares. No parece que el pronstico de esta variante sea diferente al de la forma tpica, aunque hay trabajos que apoyan que estos tipos de EN ricos en clulas neoplsicas y con deplecin del componente no neoplsico, se asocian a masas mediastnicas grandes y estadios avanzados. La EN se ha graduado (grado I y grado II) basndose en el nmero y atipia de las clulas neoplsicas en los ndulos. Los grados II se superponen a la EN sincitial y a las variantes depleccionadas de linfocitos (5-7). No parece que la EN tipo II tenga relacin con la supervivencia global, pero s parece que se asocia con la supervivencia en los pacientes que recaen, lo que sugiere que estas formas se podran beneficiar de tratamientos ms agresivos. La celularidad mixta constituye el 15-30% de los casos de LH, aparece a cualquier edad. La afectacin del mediastino es poco frecuente y sin embargo la afectacin del bazo y de

los ganglios abdominales es ms comn. En el LH celularidad mixta el infiltrado es difuso, las clulas neoplsicas son del tipo RS clsico. Estas clulas son bi o multinucleadas con nuclolos grandes, eosinfilos que semejan inclusiones virales. El infiltrado contiene linfocitos T, histiocitos, eosinfilos, neutrfilos y plasmticas. Tanto la EN como la CM pueden afectar focalmente a las reas interfoliculares de los ganglios linfticos y se pueden acompaar de hiperplasia folicular con cambios involutivos que simulan enfermedad de Castleman. En el LH rico en linfocitos las clulas neoplsicas son de tipo clsico o lacunar y el componente no neoplsico est constuido mayoritariamente por linfocitos. Un porcentaje pequeo de estos casos puede tener un patrn de crecimiento vagamente nodular, con centros germinales en los ndulos y clulas neoplsicas en el manto de los folculos y en las reas nter foliculares. Estos casos, deben diferenciarse del LHPLN para lo cual es necesario el estudio ionmunofenotpico. Este tipo constituye aproximadamente el 6% de los casos de LH con una mayor incidencia en varones de edad media . El LH tipo deplecin linfocitaria es la forma menos frecuente de LH, siendo una enfermedad de ancianos y pacientes VIH seropositivos. Se presenta con linfadenopata abdominal, hepatoesplenomegalia y afectacin de la mdula sea. Tiene patrn difuso y las clulas neoplsicas son numerosas y de aspecto sarcomatoso siendo el infiltrado no neoplsico muy escaso. b) Caractersticas inmunofenotpicas Las clulas neoplsicas del LH clsico en la mayora de los casos expresan CD15+, CD30+, siendo negativas para CD45. La frecuencia con la que se detecta la expresin de CD15 es diferente en las distintas series probablemente debido a variaciones tcnicas. Solo en un pequeo nmero de casos se detecta en las clulas HRS expresin dbil de diferentes antgenos de linaje B como CD20 y CD79a (13-15). Otro antgeno asociado a linaje B que se expresa en el 90% de los casos es PAX-5. Otros de los hallazgos inmunofenotpicos caractersticos de LH clsico es la ausencia de expresin de los factores de transcripcin OCT-2 y BOB-1. El diagnostico de LH se realiza mediante el estudio morfolgico rutinario siendo los estudios inmunofenotpicos en los casos tpicos no absolutamente necesario aunque forma parte de la prctica diagnstica habitual. La ausencia de expresin conjunta de CD30 y CD15 o la expresin de CD20 intensa en las clulas neoplsicas obliga a reconsiderar el diagnstico debindose descartar un LHPLN o un linfoma B de clulas grandes tipo rico en clulas T. La expresin genuina de antgenos de estirpe T en la HRS es absolutamente inusual. Cuando se detecta es necesario un estudio molecular del gen TCR para descartar un linfoma T. Entre el 40-% y el 50% de los casos expresan la protena latente de membrana (LMP-1) codificada por el VEB (fig. 4). c) Origen de las clulas HRS En los estudios moleculares convencionales (Southern blot o PCR) de los genes de las inmunoglobulinas y del receptor T, en la mayora de los casos de LH clsico no se detectan reordenamientos clonales (16-20), y solo cuando se han aplicado tcnicas de micromanipulacion y se ha estudiado ADN extrado de las clulas neoplsicas aisladas mediante dicha tcnica, se han demostrado reordenamientos monoclonales de los genes de las inmunognlobulinas (20,21). Este hallazgo prueba el origen B y el carcter

maligno (clonal) de las clulas HRS. Adems, se han detectado mutaciones somticas en los genes de las inmunoglobulinas reordenados , lo que implica que las clulas HRS se originan de clulas B centrogerminales o postcentrogerminales ya que las mutaciones se introducen en los genes de las inmunoglobulinas durante el paso de la clula B por el centro germinal. Pero sorpresivamente las clulas HRS, a pesar de tener los genes de las inmunoglobulinas hipermutados, no expresan inmunoglobulina de superficie (22). Para que una clula B escape a la apoptosis en el centro germinal debe tener hipermutacin somtica que produzca una inmunoglobulina de superficie de alta afinidad. Pero a diferencia de las clulas normales del centro germinal, las clulas HRS no expresan inmunoglobulina de superficie y por lo tanto no pueden ser seleccionadas. Esto sugiere que sus precursoras deben ser clulas del centro germinal preapoptticas que por mecanismos desconocidos han adquirido ventajas que las capacitan para escapar a la muerte por apoptosis. Parece que hay diferentes factores implicados en el hecho de que las clulas HRS no expresen inmunoglobulinas de superficie; as en un grupo de casos se detectan mutaciones destructivas en los genes de las inmunoglobulinas reordenados, que producen reordenamientos no funcionales y que hacen que dichos genes no se expresen- Tambin se ha reportado la falta de expresin de los factores de transcripcin de los genes de las inmunoglobulinas BOB-1, OCT-2, y PU1. La deficiencia de estos factores podra silenciar la expresin de inmunoglobulina en clulas HRS aunque tengan reordenamientos funcionales de dicho gen. Dichos hallazgos sugieren que las clulas HRS aunque derivan del centro germinal son en realidad clulas B defectivas debido a alteraciones en los mecanismos trasncripcionales. d) Biologa molecular de las clulas HRS Las alteraciones moleculares por los que las clulas HRS escapan a la apoptosis no son bien conocidas. Las clulas B del centro germinal que no tiene mutaciones favorables son eliminadas mediante un mecanismo de apoptosis mediada por Fas y la clulas del centro germinal que expresan inmunoglobulinas de alta afinidad escapan a la apoptosis sobreexpresando el gen antiapopttico c-FLIP (28-30). As mientras que Fas media la apoptosis, c-Flip es un factor que protege a las clulas B del centro germinal frente a la misma. Recientemente se ha descrito que las clulas HRS expresan constitutivamente el gen antiapopttico c-FLIP (31). La alta concentracin de c- FLIP en las clulas HRS podra explicar la resistencia de estas clulas a la apoptosis mediada por Fas. Otro mecanismo que se ha sugerido podra favorecer la resistencia a la apoptosis de la clulas HRS es la expresin de antgenos no linaje especficos (CD15, CD30) y la falta de expresin de antgenos especficos de linaje B, hechos ambos que favoreceran el que las HRS no fueran reconocidas en el centro germinal. Estudios recientes han demostrado actividad constitutiva de NF en las clulas HRS. NF es un factor de trascripcin nuclear B B que activa la expresin de genes propoliferativos y antiapoptticos. La expresin constitutiva de NFB dotara a las clulas HRS de capacidad para crecer independientemente de las seales reguladoras, pudiendo ser ste el evento transformante principal para el desarrollo de esta neoplasia. En algunos casos de LH el mecanismo por el cual las clulas neoplsicas expresan constitutivamente este factor de trascripcin parece estar relacionados con mutaciones en el gen, que codifica la molcula que en su forma salvaje (no mutada) retiene a

NFB en el citoplasma. Otra posible va de activacin constitutiva de NFB en el LH podra estar asociada con la amplificacin del locus NFB/REL (35). e) Patognesis Diferentes estudios epidemiolgicos llevaron a sospechar que en el desarrollo del LH podra estar implicado algn agente infeccioso. El patrn de incidencia bimodal sugiri que la posibilidad de desarrollar la enfermedad aumentaba al retrasarse el contacto con el agente infeccioso. Este paralelismo entre la epidemiologa del LH y la poliomielitis apuntaba la posibilidad de que el agente infeccioso fuera un virus. Estudios serolgicos en pacientes con LH demostraron niveles elevados de anticuerpos frente al virus Epstein-Barr (VEB) especialmente anti-EBNA-2. Se observ tambin, que el haber padecido mononucleosis infecciosa incrementaba el riesgo de desarrollar LH hasta tres veces. Estos hallazgos hicieron que las sospechas se centrasen en el VEB como el agente etiolgico. En 1987 Weiss y Col. (37) detectan ADN del VEB en muestras de LH. En 1989 Weiss y col. (38) mediante tcnicas de hibridacin in situ (HIS) demostraron ADN del VEB en las clulas HRS y en 1993 Armstrong y col. (39) utilizando una tcnica de HIS para la deteccin de EBERs demostraron que aproximadamente en el 50% de los casos de LH clsico, la mayora de la clulas diagnsticas expresaban estos RNAs (fig. 5) que el VEB codifica en un gran nmero de copias en las clulas infectadas de forma latente. Trabajos posteriores demostraron que el VEB persista en las clulas neoplsicas en las mltiples recadas y en las diferentes localizaciones. En este 50% de casos las HRS expresan las protenas codificadas por los genes LMP-1, LMP-2a y EBNA-1, patrn de expresin caracterstico de la infeccin viral latente (latencia de tipo 2). Las LMPs son protenas virales con capacidad transformante. Este hecho soporta que el VEB en el LH no deba ser un mero pasajero, pudiendo ser un factor patognico al menos en ese 50% de casos. La LMP-1 simula un receptor CD40 activado constitutivamente que aumenta la actividad de la familia de los factores de trascripcin NF-kB. La LMP-2 tiene capacidad de bloquear la expresin del receptor de la clula B y por lo tanto acta como un gen antiapopttico (permite que la clula no sea reconocida). Adems LMP-2 tambin activa la familia NF-kB. Mediante la expresin de estas protenas, el VEB permite que las HRS sobrevivan en el centro germinal y favorece la expresin de NFkB que consecutivamente provoca la expresin de genes proproliferativos y antiapoptticos. Podra ser que la imposibilidad de detectar VEB en los casos negativos, se debiera a la integracin de fragmentos de genoma del virus en el genoma de la clula husped, y que su efecto transformante en estos casos fuera del tipo impacto y carrera (hit and run) pero esto no ha podido ser demostrado. Por lo que hay que concluir que en al menos la mitad de los casos de LH clsico el agente primario transformante no se conoce. Se han encontrado mutaciones del gen IkBen un grupo de casos de LH negativos para el VEB. La quinasas I y especialmente la I retienen en el citoplasma a B B NFB, cuando esta quinasas reciben la seal estimuladora se fosforilizan y liberan a NFB que se traslada al ncleo iniciando la trascripcin. Las mutaciones el gen

IkBprovocaran la traslocacin al ncleo de NFkB en ausencia de seales estimuladoras produciendo la sobreexpresin de los genes de proliferacin, de control del ciclo celular y de apoptosis que este factor de trascripcin regula. Las mutaciones en el gen IkBpodran ser un factor transformante central en los casos de LH no asociados al VEB. Trabajos recientes han detectado amplificacin de locus NFkB/REL en un grupo de casos de LH clsico Esta alteracin provoca la desregulacin de NFkB y podra ser un mecanismo de activacin alternativo de NFkB que actuara en el grupo de casos de LH clsico no asociados al VEB y sin mutaciones en el gen IkB. LINFOMA HODGKIN PREDOMINIO LINFOCITICO NODULAR a) Caractersticas clnicas y morfolgicas Aunque el LHPLN se parece a los otros tipos de LH en la especial composicin celular, con una minora de clulas neoplsicas sobre un fondo constituido por clulas inflamatorias benignas, difiere del LH clsico por su morfologa, sus caractersticas inmunofenotpicas y por su manifestaciones clnicas. El LHPLN en la actualidad se define por tener un patrn de crecimiento nodular que ocupa al menos el 30% del ganglio afecto con o sin reas difusas. La variante de clula RS que lo define, se caracteriza por poseer un ncleo vesicular polilobulado con nuclolos pequeos generalmente perifricos sin halo perinucleolar. Esta clulas se denominan clulas L-H o clulas en palomita de maz. El fondo inflamatorio est constituido predominantemente por linfocitos acompaados de acmulos de histiocitos mientras que las plasmticas, los eosinofilos y neutrofilos generalmente no estn presentes en el infiltrado, as como tampoco las clulas HRS de tipo clsico. Ocasionalmente se observa esclerosis similar a la de la EN. El LHPLN constituye el 5% de los casos de LH. Tpicamente afecta a pacientes generalmente varones, entre los 25-45 aos de edad y suele afectar a ganglios perifricos respetando el mediastino. El 80% de los pacientes estn en estadios iniciales en el momento del diagnstico y el 90% de los pacientes hacen remisiones completas despus del tratamiento. Las recadas aparecen con igual frecuencia que en el LH clsico, pero las recadas tardas y mltiples son ms frecuentes que en los otros tipos de LH aunque suelen ser recadas ganglionares aisladas que no se asocian con menor supervivencia. Los pacientes con LHPLN tienen un riesgo mayor de desarrollar LNH que los pacientes con otros tipos de LH. En las diferentes series se describe que entre un 2% y un 2,5% de pacientes con LHPLN desarrollan un LNH de clulas B (52-54). b) Caractersticas inmunofenotpicas El LHPLN se define por el inmunofenotipo. A diferencia de las clulas HRS del LH clsico las clulas L-H expresan CD45 y antgenos de estirpe B de forma que son CD20+, CD79a+. Frecuentemente expresan EMA y son C15- y expresan BCL-6. La expresin dbil de CD30 se observa en un porcentaje pequeo de casos (55). La expresin de OCT-2 y de BOB-1 fuerte en las clulas L-H es til para diferenciar LHPLN de LH clsico. Los ndulos estn constituidos mayoritariamente por linfocitos B con frecuentes clulas T CD57+. Estas clulas tpicamente rodean a las clulas L-H conformando rosetas (56) No se detecta expresin de LMP-1. En los ndulos se observan mallas de clulas dendrticas. Las reas internodulares estn

predominantemente constituidas por clulas T. El estudio inmunohistoqumico ayuda a reconocer el patrn de crecimiento nodular y en particular las tinciones con CD20 y CD21; esta ltima descubre la malla de dendrticas y muestra que los ndulos en el LHPLN son folculos o centros germinales alterados. c) Origen de las clulas L-H En el estudio del ADN extrado de las clulas neoplsicas aisladas se observan reordenamientos monoclonales de los genes de las inmunoglobulinas detectndose hipermutacin somtica en la regin variable del gen de la IgH y tambin signos de mutaciones en proceso on going. Los reordenamientos son funcionales y se detecta ARN m de Ig en las clulas L-H. Estos datos sugieren que las clulas L-H derivan de clulas B del centro germinal y ms concretamente de centroblastos (58). d) Relacin entre los centros germinalesprogresivamente transformados y el LHPLN La LHPLN se ha asociado persistentemente con los centros germinales progresivamente transformados (CGPT). Los CGPT se observan de forma focal en aproximadamente un 20% de casos de LHPLN (59). Los CGPT son grandes folculos que contienen numerosos linfocitos B pequeos del manto. Su semejanza con los ndulos del LHPLN ha hecho que se especule sobre la posibilidad de que el LHPLN derive de los CGPT. La mayora de los pacientes con linfadenitis con CGPT no tienen un riesgo mayor de desarrollar LHPLN (60,61). El diagnstico diferencial entre estas dos entidades se basa en la morfologa. Los CGPT son grandes, bien delimitados, con centros germinales reactivos entre ellos mientras que los ndulos del LHPLN estn pegados unos a otros, son irregulares y borran la arquitectura ganglionar. En los CGPT no se observan clulas L-H aunque algunos de los centroblastos que contienen pueden tener morfologa similar. PRUEBAS Y EXAMENES La enfermedad se puede diagnosticar despus de:

Biopsia del tejido sospechoso, por lo regular una biopsia de ganglios linfticos. Biopsia de mdula sea.

Si los exmenes revelan que usted en realidad tiene linfoma de Hodgkin, se llevarn a cabo exmenes adicionales para ver si el cncer se ha diseminado. Esto se denomina estadificacin, que ayuda a guiar un futuro tratamiento y seguimiento y le da a usted alguna idea de lo qu puede esperar en el futuro. Por lo general, se realizarn los siguientes procedimientos:

Pruebas de qumica sangunea, entre ellas niveles de protenas, pruebas de la funcin heptica, pruebas de la funcin renal y nivel de cido rico. Tomografa computarizada del trax, el abdomen y la pelvis. Hemograma o conteo sanguneo completo (CSC) para ver si hay anemia y conteo de leucocitos.

Tomografa por emisin de positrones (TEP).

En algunos casos, puede ser necesaria una ciruga abdominal para extraer un pedazo del hgado y extirpar el bazo. Sin embargo, dado que las otras pruebas ahora son muy buenas para detectar la diseminacin del linfoma Hodgkin, esta ciruga generalmente es innecesaria. TRATAMIENTO El tratamiento depende principalmente de lo siguiente:

El tipo del linfoma de Hodgkin (la mayora de las personas tiene Hodgkin clsico). El estadio (dnde se encuentra la enfermedad). Si el tumor tiene ms de 4 pulgadas (10 centmetros) de ancho. La edad del paciente y otras cuestiones mdicas. Otros factores, como prdida de peso, sudores fros y fiebre.

Se harn exmenes para ver si el cncer se ha diseminado. Esto se denomina estadificacin, que ayuda a guiar un futuro tratamiento y seguimiento y le da a usted alguna idea de lo qu puede esperar en el futuro. La estadificacin es necesaria para determinar el plan de tratamiento. Los estadios del linfoma de Hodgkin van de I a IV. A mayor nmero del estadio, ms avanzado estar el cncer.

Los estadios I y II (enfermedad limitada) se pueden tratar con radioterapia, quimioterapia o una combinacin de ambas. El estadio III se trata con quimioterapia sola o una combinacin de radioterapia y quimioterapia. El estadio IV (enfermedad avanzada) casi siempre se trata con quimioterapia sola.

Las personas con linfoma de Hodgkin que reaparece despus del tratamiento o no responde a ste pueden recibir quimioterapia en dosis altas seguida de un autotrasplante de mdula sea (usando clulas madre de uno mismo). Los tratamientos adicionales dependen de otros sntomas y pueden incluir:

Transfusin de hemoderivados, como plaquetas o glbulos rojos, para combatir conteos plaquetarios bajos y anemia. Antibiticos para combatir la infeccin, sobre todo si se presenta fiebre.

HEPATOMEGALIA. La hepatomegalia es un signo fsico detectado con relativa frecuencia en la consulta del pediatra que no debe menospreciarse; puesto que, puede ser la manifestacin de una hepatopata o de un trastorno sistmico con expresin heptica. El trmino hepatomegalia se emplea para definir un aumento del tamao del hgado por encima del valor aceptado como normal para la edad. En general, en recin nacidos y lactantes, es considerada patolgica la palpacin del borde inferior heptico ms de 2 cm por debajo del reborde costal en lnea medioclavicular derecha; en nios mayores, el borde inferior

heptico no debe sobrepasar el reborde costal derecho. Algunas situaciones clnicas que pueden condicionar la palpacin de una falsa hepatomegalia son: las anomalas morfolgicas de la caja torcica (el pectus excavatum o el trax estrecho por constitucin astnica) o los procesos respiratorios que cursan con descenso del diafragma como el broncoespasmo o el neumotrax. Una variante normal del lbulo heptico derecho, llamado lbulo de Riedel, puede extenderse por debajo del reborde costal e interpretarse como hepatomegalia; las personas con esta variante estn asintomticas y no presentan signos clnicos ni analticos de hepatopata. ETIOPATOGENIA 1. Inflamacin. Las infecciones, los txicos, las radiaciones, las enfermedades autoinmunes y la hiperplasia de clulas de Kupffer inducen hepatomegalia mediada por mecanismo inflamatorio. 2. Depsito. Las sustancias que pueden depositarse en exceso en el hgado originando hepatomegalia son: el glucgeno, los lpidos, la grasa, metales y protenas anormales. 3. Infiltracin. La infiltracin es el mecanismo de la hepatomegalia en el caso de: tumores, quistes parasitarios y hematopoyesis extramedular. Las clulas tumorales pueden tener su origen en tumores primarios hepticos benignos o malignos o en tumores extrahepticos (metstasis). Las clulas que infiltran el hgado en el caso de hematopoyesis extramedular y en los sndromes hemofagocticos son clulas sanguneas. 4. Congestin vascular. La obstruccin al drenaje venoso entre el hgado y la aurcula derecha origina hepatomegalia. La obstruccin puede localizarse a nivel intraheptico o a nivel extraheptico. 5. Obstruccin biliar. La obstruccin al flujo biliar es el mecanismo de la hepatomegalia en: atresia biliar, quistes de coldoco, colelitiasis y tumores de localizacin heptica, biliar, pancretica y duodenal. a) Pruebas complementarias de primer nivel Las pruebas complementarias que se deben realizar a todos los pacientes en los que se detecta hepatomegalia son: anlisis de sangre y orina y ecografa Doppler abdominal. Analtica de sangre: 1. Hemograma con recuento diferencial y frotis de sangre perifrica (buscando blastos, linfocitos estimulados). Reticulocitos (hemlisis). Velocidad de sedimentacin. 2. Coagulacin: actividad de protrombina, tiempo de cefalina, fibringeno. Plaquetas. 3. Bioqumica: funcin renal (creatinina, urea, iones), gasometra, glucemia, colesterol, LDH (hemlisis), bilirrubina indirecta (hemlisis), funcin heptica (datos de necrosis: ALT, AST; datos de colestasis: GGT, bilirrubina total y fraccionada, fosfatasa alcalina; datos de sntesis: actividad de protrombina, glucemia, colesterol, colinesterasa, protenas totales y albmina), triglicridos, enzimas musculares (CPK, aldolasa).

 Anlisis de orina: sedimento y urocultivo (en recin nacido y lactante). Ecografa Doppler abdominal: es la tcnica de imagen de eleccin en la valoracin inicial de la hepatomegalia. Determina el tamao del hgado, la homogeneidad del parnquima, identifica masas o quistes de tamao igual o superior a 1 cm, clculos y barro biliar. La tcnica Doppler permite valorar la permeabilidad de los vasos, el calibre y flujo portal, la existencia de circulacin colateral. No es una buena prueba para descartar trombosis de las suprahepticas. ESPLENOMEGALIA. La esplenomegalia o hipertrofa de bazo o tambin conocida como lienomegalia es un agrandamiento patolgico del bazo o estructura esplnica ms all de sus dimensiones normales (11cm). Tambin podra considerarse en funcin del peso (el peso normal es de 450-750g, considerndose aumentado si es mayor de 750g.) Generalidades El bazo es un rgano en cuya funcin se integra el sistema linftico y el filtrado de la sangre para mantener los niveles adecuados de glbulos rojos, glbulos blancos y plaquetas. Debido a la gran variedad de funciones que en l radica, el bazo puede verse afectado por diversas dolencias que ponen en compromiso el desempeo del sistema linftico o sanguneo. Entre esas afecciones se encuentran principalmente las infecciones, entre ellas las acaecidas por parsitos, enfermedad en el hgado, y neoplasias malignas. Sntomas Normalmente asintomtico pero puede presentarse:

Imposibilidad de realizar comidas ms copiosas de las habituales. En ocasiones se presentan naseas e incluso vmitos. Molestia en el hipocondrio izquierdo, justo por debajo de la parrilla costal.

Causas a) Infecciones:

mononucleosis infecciosa (EBV o CMV) otras infecciones virales infecciones parasitarias (Paludismo...) infecciones bacterianas (Tuberculosis, Brucelosis...) enfermedad por araazo de gato

b) Patologa heptica:

insuficiencia heptica colestasis heptica cirrosis colangitis esclerosante

fibrosis qustica atresia biliar enfermedad de Wilson

c) Procesos tumorales:

linfoma enfermedad de Hodgkin leucemia

d) Anemias hemolticas:

hemoglobinopatas talasemia anemia hemoltica inmunitaria anemia hemoltica por deficiencia G-6-PD anemia hemoltica idioptica autoimnunitaria

e) Otras causas:

sarcoidosis sndrome de Felty crisis esplnica drepanoctica enfermedad de Gaucher

Diagnstico Se establece gracias a:

Inspeccin abdominal Percusin (el timpanismo en hipocondrio izquierdo desaparece) Palpacin. El bazo se palpa en decbito lateral derecho con la pierna izquierda flexionada. Se desplaza con la respiracin y el eje se dirige hacia abajo y adentro. Analtica de sangre como el CSC (conteo sanguneo completo) Exmenes para las causas de sospecha La prueba de eleccin es la Ecografa abdominal. Tambin pueden usarse la TAC o la gammagrafa.

PRUEBA DE ELISA PARA VIH. Es una tcnica de inmunoensayo en la cual un antgeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algn otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antgeno y que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparicin de colorantes permite medir indirectamente mediante espectrofotometra el antgeno en la muestra.

Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular est presente en la muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran nmero de variables, tales como selecin de reactivo, temperatura, medicin de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba. La interaccin antgeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infeccin o una enfermedad autoinmune. Un resultado positivo indica que el anticuerpo est en la sangre e implica que la persona ha contraido una determinada enfermedad. En estos casos de diagnstico de enfermedad es recomendable la eliminacin (mediante centrifugacin) de clulas de la sangre que puedan interferir con el ensayo y pueda ocasionar un resultado falso positivo, careciendo aqul de especificidad. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es verstil, robusto, simple en su realizacin, mediante el uso de la fase slida, una separacin fcil entre la fraccin retenida y la fraccin libre. Adems se han propuesto y desarrollado diferentes mtodos de amplificacin de la seal (luminiscentes, cascadas enzimticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal. Este mtodo ha tenido una enorme aplicacin en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificacin de productos mediante anticuerpos: diagnstico clnico, deteccin viral, clasificacin de anticuerpos en isotipos, bsqueda de anticuerpos monoclonales, etc. Dispositivos empleados en ELISA Se han ensayado numerosas fases slidas, desde los tubos de cristal de los orgenes a las actuales microplacas de 96 pocillos de plstico tratado para aumentar su capacidad de adsorcin (fenmeno de superficie) de molculas y con fondos de pocillo pticamente claros para poder realizar las medidas de densidad ptica en instrumentos especficos, espectrofotmetros de lectura de placas que han recibido el nombre de lectores ELISA. Actualmente se estn desarrollando dispositivos de mayor capacidad, por ejemplo con 384 y 1536 pocillos, adecuados para los sistemas de 'screening' masivo de los sistemas robotizados (HTS, 'High-throughput system') Los lectores ELISA son espectrofotmetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotmetro convencional, con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de filtros que slo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda. Son la que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad ptica de los cromgenos ms comnmente utilizados. Fases de un ensayo ELISA Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:

1. Conjugacion del anticuerpo o del antgeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina...). El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antgeno marcado se emplea en ensayos de competicin de antgeno. Dicha unin anticuerpo-enzima o antgenoenzima ha de producirse durante un determinado periodo de tiempo en aras de producir una solucin coloreada y que pueda ser valorada visualmente o cuantificada por medio de un espectrofotmetro (normalmente a una longitud de onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se de la reaccin, no se evidenciar ningn color, interpretndose este resultado como un falso negativo, disminuyendo la sensibilidad de la tcnica. 2. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unin de anticuerpos o antgenos se realiza con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen gran afinidad por protenas. As, el procedimiento de recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa poco antgeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa demasiado antgeno, el exceso dar lugar a una reaccin falsa negativa. 3. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antgeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antgeno fro frente a una cantidad fija de antgeno marcado. Es el ensayo de competicin del antgeno. 4. Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todos las molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se aade el sustrato enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica (D.O.) mediante espectrofotometra. Tipos de ensayos ELISA Se han desarrollado mltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificacin de un antgeno en solucin, la deteccin de un anticuerpo en una solucin (por ejemplo en el clonaje de anticuerpos monoclonales) o la determinacin de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo. A continuacin se describen los ms comunes.

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antgeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antgeno en la solucin analizada. Es necesario incluir controles negativos que sern muestras del mismo tipo de las analizadas (sangre, orina,...) pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antgeno buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antgeno buscado). ELISA indirecto. Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de deteccin emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antgeno y uno secundario marcado contra el primario. La deteccin tiene mayor sensibilidad

por presentar una amplificacin de seal debida a la unin de dos o ms anticuerpos secundarios por cada primario. Es el ensayo ms popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimtico permite cuantificar una gran cantidad de antgenos. El ELISA indirecto es el mtodo de eleccin para detectar la presencia de anticuerpos sricos contra el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Segn esta tcnica, protenas recombinantes de la envoltura y el ncleo del VIH se absorben como antgenos en fase slida a los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos sricos contra eptopos en estas protenas vricas. En general, el ELISA indirecto permite detectar anticuepos sricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una infeccin.

ELISA sndwich (Ensayo de captura de antgeno y deteccin mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antgeno. Despus de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antgeno, que ser retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Despus de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solucin con un segundo anticuerpo anti-antgeno marcado. As pues cada molcula de antgeno estar unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificacin de seal que permite el segundo anticuerpo.

Quimioluminiscencia Durante determinadas reacciones qumicas, la luz generada por este fenmeno constituye una alternativa conveniente y muy sensible para las mediciones de absorbancia en ELISA. Los tipos de ELISA que recurren a la quimioluminiscencia utilizan un sustrato que genera luz, en lugar del sustrato cromgeno de las reacciones ELISA ordinarias. Tales son los casos de la oxidacin del compuesto luminol por perxido de hidrgeno y la enzima peroxidasa de rbano (HRP), que producen luz. La luz que se genera en dichas reacciones puede detectarse gracias a su capacidad de sensibilizar una pelicula fotogrfica. La medicin cuantitativa de la emisin de luz puede hacerse mediante el uso de un luminmetro. La ventaja de las pruebas de quimioluminiscencia sobre las cromgenas es la mejora de la sensibilidad. En general, el lmite de deteccin puede aumentarse al menos diez veces si se cambia un sustrato cromgeno por uno que emita luz, y ms de doscientas veces cuando se adicionan agentes potenciadores. Marcadores enzimticos ms comnmente utilizados En la tabla siguiente se recogen los marcadores enzimticos ms comnmente empleados en ensayos ELISA, los sustratos que se emplean para su revelado y el modo de prepararlos. Enzima Sustrato Tampn

HRPO (peroxidasa de rbano) OPD 10 mg/25 mL de tampn citrato sdico 0.15 M pH 5; aadir microL de 30% perxido de hidrgeno 30% TMB 2.5 mg/250 microL de DMSO; hasta 25 ml con tampn citrato sdico 0.1M pH 6; aadir 5 microL de perxido de hidrgeno 30% ABTS 60 mg/100 mL de tampn citrato sdico 0.1 M pH 6; aadir 35 microL de perxido de hidrgeno 30%; parar con fluoruro sdico 1.25%; leer a 405 nm DAB 10 mg/20 mL de tampn Tris 50 mM pH 7.4; filtrar y aadir 20 microL de perxido de hidrgeno 1% CNP 6 mg en 1 mL de metanol; aadir 10 mL de tampn Tris 50 mM pH 7.4; filtrar y aadir 40 microL de perxido de hidrgeno 30% AEC 80 mg en 1 mL de N,N'-dimetilformamida + 200 microL de tampn acetato 0.1 M pH 4.5; filtrar y aadir 50 microL de perxido de hidrgeno 30% ASA 80 mg/100 mL de agua destilada caliente; ajustar a pH 6.0 con 1 mM NaOH y aadir 10 % por volumen de 0.05% perxido de hidrgeno; parar con 25 microL de NaOH 1 M AP (Fosfatasa alcalina) PNPP 5 mg/5 mL de tampn dietanolamina-HCl 0.1 M pH 9.8 +1 mM cloruro de magnesio NAPFB (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Fast Blue BB/ 10 ml de tampn Tris 0.05M pH 9.2 - 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar. NAPR (A) 4 mg de fosfato de naftol en 200 microL de dimetilformamida en un tubo de vidrio, (B) 10 mg de sal Red BB/ 10 ml de tampn Tris 0.05M pH 9.2 2 mM cloruro de magnesio. Mezclar A + B y filtrar. BCIP 1 mg/mL en solucin AMP (2-amino-2-metil-propanol) beta-G ONPG 2.5 mg/ml en tampn fosfato sdico 0.1 MpH 7.0 + 1 mM cloruro de magnesio + 0.1 M beta-mercaptoetanol ureasa BP 8 mg/1.48 ml de 0.01M NaOH; llevarlo a 100 ml con agua desionizada; aadir 100 mg de urea y EDTA a 0.2 mM; ajustar el pH a 4.8 con 1 mM NaOH o HCl; almacenar a 4 C PG IS Aadir a cada placa de ELISA 25 microL de cada uno de los reactivos siguientes en secuencia : (A) 1% (peso/vol) gelatina en 0.1 M tampn fosfayo pH 7.0, (B) 1% (peso/vol) almidn en agua destilada caliente, (C) 3.04 mg/mL de benzil-penicilina en 0.1 M tampn fosfato pH 7.0 (5000 U/mL), (D) 0.01 N ioduro en 0.1 M KI solucin stock (en una botella oscura).

Prueba ELISPOT Una variante de la prueba ELISA, llamada ELISPOT, es capaz de detectar cuantitativamente el nmero de clulas en una poblacin productora de anticuerpos especficos contra un antgeno determinado o un antgeno contra el que se dispone de un anticuerpo especfico. Aqu, las placas se recubren con el antgeno reconocido por el anticuerpo de inters o con el anticuerpo especfico para el antgeno cuya produccin se valora. Seguidamente, se aade a las placas recubiertas una suspensin de la poblacin celular que se investiga e incuba. Las clulas se disponen en la superficie de la placa, y las molculas secretadas reactivas a las molculas de captura son unidas en la cercana de las clulas secretoras, producindose un anillo de complejos antgeno-anticuerpo alrededor de cada clula que sintetiza la molcula de inters. Despus, la placa se lava y un anticuerpo unido a enzima especfico para el antgeno secretado, o para la especie de anticuerpo secretado, se aade y deja que se unan. El posterior revelado del ensayo

mediante adicin de un sustrato cromgeno o emisor de luz adecuado, indica la posicin de cada clula productora de anticuerpo (o de antgeno) como un punto de color o luz. WESTERN BLOT. El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada para detectar protenas especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una membrana adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la protena de inters con anticuerpos especficos contra ella. Finalmente, se detecta la unin antgeno-anticuerpo por actividad enzimtica, fluorescencia... De esta forma se puede estudiar la presencia de la protena en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras protenas. Esta tcnica es hoy en da imprescindible en varios campos de la biologa, como la biologa molecular, la bioqumica, la biotecnologa o la inmunologa. Existe toda una industria especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra decenas de miles de protenas diferentes. El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de Stanford. El nombre (Western, occidental en ingls) le fue dado por W. Neal Burnette , y consiste en un juego de palabras con una tcnica anloga pero que usa DNA, el Southern (sureo) blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor, Edwin Southern. Otras tcnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son el Northern blot (en el que se separa e identifica RNA), el Eastern blot, el Southwestern blot. Antecedentes Antes de la aparicin del Western blot, ya existan diversas tcnicas capaces de detectar un antgeno determinado en una muestra, como la inmunoelectroforesis, la inmunodifusin doble de Ouchterlony, la inmunoprecipitacin... La aparicin del Western no fue posible hasta la aparicin de las membranas. En 1975, Edwin Southern demostr que la nitrocelulosa era capaz de capturar cidos nucleicos separados previamente por electroforesis. De esta forma, se permita el anlisis de una mezcla compleja de molculas de ADN, como un genoma tratado con enzimas de restriccin. Se desarroll as el Southern blot, usando el nombre del descubridor como epnimo; es por ello que tanto esta tcnica como sus derivadas (Western blot, Northern blot...) se escriben con mayscula. Ms tarde, Towbin (1979) y Burnette (1981) demostraron que tambin era capaz de unirse a protenas. Ya en 1986, Millipore desarroll la primera membrana de PVDF diseada para la transferencia de protenas, la membrana de transferencia ImmobilonTM PVDF. Porteriormente fue llamada membrana de transferencia Immobilon-PTM para diferenciarse de otras membranas.

Pasos del Western blot Preparacin de la muestra Las muestras pueden ser tomadas de un tejido entero o de un cultivo celular: Una pequea cantidad del tejido se introduce en un buffer de extraccin. Despus se procede a homogeneizarlos, sea con una licuadora (para grandes volmenes de muestra), con un homogenizador (para muestras pequeas) o por sonicacin. Por ltimo se centrifuga para obtener las protenas en el sobrenadante, la fraccin no precipitada.7 Las clulas pueden lisarse por uno de esos mtodos mecnicos. Tambin pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y solubilicen las protenas. A veces se aaden inhibidores de proteasas y fosfatasas que evitan la digestin por las enzimas celulares de las protenas y de las fosfoprotenas, respectivamente.

Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 C) para evitar la desnaturalizacin proteica. Para separar protenas de compartimentos y orgnulos celulares es preciso combinar tcnicas mecnicas - como filtraciones y centrifugaciones - y bioqumicas. Electroforesis en gel Las protenas de la muestra sern separadas mediante una electroforesis en gel en funcin de uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios: punto isoelctrico, peso molecular y carga elctrica. La naturaleza de la separacin depende del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel. La electroforesis en gel ms frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de poliacrilamida y de tampn con dodecilsulfato (SDS). En esta tcnica las protenas sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la prdida de las estructuras secundaria y terciaria (por ejemplo, reduciendo los puentes disulfuro (S-S) a grupos tiol (SH + SH)) y mantiene los polipptidos en este estado desnaturalizado. De este modo, la estructura tridimensional de las protenas no influye en la electroforesis, y pueden separarse nicamente en funcin del tamao. Transferencia Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos, se las transfiere desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta transferencia puede realizarse por difusin, por vaco o por accin de un campo elctrico (electrotransferencia). Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de unir protenas de forma inespecfica (es decir, se adhieren a todas las protenas con idntica afinidad):

las membranas de nitrocelulosa, aunque no se conoce exactamente la naturaleza de las interacciones membrana - protena, se sabe con cierta seguridad que se trata de interacciones no covalentes de naturaleza hidrfba.

en las membranas de PVDF, la unin est basada en interacciones hidrofbicas y de dipolos entre la membrana y las protenas. Como particularidad, deben ser humedecidas con metanol o etanol antes de exponerlas a tampones acuosos, debido a su alta hidrofobicidad y a la ausencia de surfactantes.

Las membranas de nitrocelulosa son ms baratas que las de PVDF, aunque son tambin ms frgiles, tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y no pueden ser sometidas a varias pruebas consecutivas. Tambin pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papel activado. Sin embargo, no son tan usados como los anteriores. Difusin simple En la transferencia por difusin simple se ponen en contacto las superficies del gel electrofortico y de la membrana y, sobre sta, se dispone un taco de papeles de filtro. Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto pesado. Este montaje se coloca sobre un tampn, que ascender por capilaridad hacia el papel de filtro arrastrando consigo las protenas. Al llegar a la membrana, quedarn retenidas en ella. Este protocolo no est muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de protena transferida a la membrana es muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia. Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por una modificacin que permite obtener mltiples transferencias de un mismo gel, permitiendo de esta forma realizar varias pruebas sobre geles virtualmente idnticos. Esta modificacin es viable cuando no es necesaria una transferencia cuantitativa de protena. Transferencia al vaco En esta tcnica, se aade el poder de succin de una bomba conectada a un sistema de secado de planchas de gel, el cual lleva las protenas desde el gel hasta la superficie de la membrana de nitrocelulosa. Este mtodo es vlido tanto para protenas de alto como de bajo peso molecular. Electrotransferencia Este mtodo se basa en una corriente elctrica y un tampn de transferencia para llevar las protenas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los siguientes elementos (del polo negativo o ctodo al positivo o nodo): esponja, varios papeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel, membrana, ms papeles de filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sandwich, se dispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente elctrica, de magnitud acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible,... Las protenas del gel se desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana. Tras la transferencia, se suele proceder a la tincin del gel con Coomassie Brilliant Blue (un colorante de protenas) para comprobar que en efecto una parte importante del material proteico ha pasado a la membrana.

La electrotransferencia es hoy en da la tcnica de transferencia ms usada gracias a la velocidad del proceso y al elevado porcentaje de protena que se transfiere (especialmente en comparacin con las otras tcnicas). Bloqueo Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse protenas de forma inespecfica, es preciso bloquear los lugares de unin que han quedado libres tras la transferencia. En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la deteccin puede unirse a ellos, dificultando la distincin del complejo antgeno-antgeno que se forma con la protena que se busca. En el bloqueo se incuba la membrana con una solucin de protenas, tpicamente de albmina de suero bovino o ASB (ms conocida por sus siglas en ingls, BSA), leche en polvo o casena, con una diminuta fraccin de detergente, como Tween 20 o Tritn X100. Las protenas en solucin se unirn a todos aquellos lugares de unin de la membrana que no estn ya ocupados por las transferidas desde el gel. De este modo, el anticuerpo slo podr unirse a su antgeno especfico, reduciendo as el ruido de fondo y los falsos positivos. Deteccin En la deteccin se comprueba la presencia en la membrana de una determinada protena. Para ello se emplea un anticuerpo especfico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una reaccin colorimtrica (produce color). De esta forma, se hace patente la unin con el antgeno, la protena, as como su localizacin. El proceso tradicionalmente se ha realizado en dos pasos, aunque ahora es posible la deteccin en un nico paso, lo cual es til en ciertos campos. Mtodo en dos pasos Los dos pasos de los que consta este mtodo de deteccin son la unin del anticuerpo primario y la del anticuerpo secundario. Anticuerpo primario El primer paso es permitir la unin de un anticuerpo primario contra la protena buscada. ste se consigue inoculando dicha protena o uno de sus eptopos (regiones capaces de desencadenar la respuesta inmune) a un animal (como un conejo o una cabra) o a un cultivo celular. Adems, como la protena se ha desnaturalizado durante la electroforesis en gel, es preciso que el anticuerpo reconozca especficamente la protena desnaturalizada. La presencia del elemento extrao debera desencadenar una respuesta inmune cuyo resultado incluya la produccin del anticuerpo, primario en este caso, ya que reconoce la protena. As pues, tras el bloqueo se incuba en agitacin moderada la membrana con una disolucin de anticuerpo primario (0,5 - 5 g/ml). La disolucin consiste en un tampn salino, con cloruro de sodio por lo general, con un pH cercano a la neutralidad, una pequea fraccin de detergente y, en ocasiones, protenas disueltas, como ASB o leche

en polvo. La membrana junto con la disolucin pueden ser introducidas en una pequea bolsa de plstico. Esta incubacin puede durar desde 30 minutos a una noche entera. La temperatura a la que puede tener lugar es igualmente variada; en general, las elevadas temperaturas favorecen las uniones ms especficas. Anticuerpo secundario Tras lavar la membrana para eliminar el anticuerpo primario que no se ha unido, se expone al anticuerpo secundario. ste reconoce de forma especfica una regin concreta del anticuerpo primario. Suelen estar marcados para ser detectables (unin a biotina, a una enzima reporter como laa fosfatasa alcalina o la peroxidasa del rbano (HRP), etc.). Varios de estos anticuerpos se unirn a cada anticuerpo primario, amplificando la seal. Los anticuerpos secundarios proceden de animales o de cultivos de hibridomas de origen animal. Por ejemplo, un anticuerpo secundario "anti-ratn" es aquel capaz de reconoces casi todos los anticuerpos primarios obtenidos de ratones. Igualmente hay anticuerpos "anti-cabra", "anti-conejo"... Su uso presenta ciertas ventajas: econmicas, por permitir a un laboratorio compartir una nica fuente de anticuerpos secundarios; y dan resultados mucho ms consistentes. Tambin pueden emplearse protenas no anticuerpos, como las protenas A y G. Radiactividad secundarios que consiste en protenas de unin a anticuerpos marcadas radiactivamente. Esta protena puede ser, por ejemplo, la protena A de Staphylococcus aureus o la protena G14 marcadas con 125I (un istopo radiactivo de yodo). Las protenas mencionadas tienen la capacidad de unirse a anticuerpos de forma inespecfica, por lo que se unirn al primario. Este mtodo apenas se usa actualmente, por ser significativamente ms caro, peligroso y lento que los otros. Sin embargo, presenta ventajas: es muy sensible, da bandas que permiten una precisa cuantificacin; y la imagen autoradiogrfica puede ser reproducida fcilmente y con gran precisin para su publicacin. Anticuerpo unido a una enzima Un mecanismo de deteccin simple y rpido consiste en unir al anticuerpo secundario enzimas que catalicen la transformacin de un sustrato soluble en un producto insoluble. De esta forma, en el posterior anlisis quedar una mancha all donde est la protena de inters. Enzimas como la peroxidasa de rbano (HRP) o una fosfatasa alcalina son vlidas para este mecanismo. Por ejemplo, la peroxidasa puede catalizar la oxidacin del 4-cloronaftol en presencia de un 1% de perxido de hidrgeno. El resultado es que el primero forma una mancha de precipitado oscura. Otras tcnicas, como ELISA o ELISPOT, tambin emplean este mtodo de deteccin. Otro mtodo ms sofisticado consiste en la unin de una enzima que catalice una reaccin quimioluminiscente. Las anteriormente citadas enzimas tambin son vlidas en este caso, aunque cada una usa un agente quimioluminiscente diferente. En el caso de la peroxidasa, cataliza la oxidacin del luminol en presencia de perxido de hidrgeno. La

fosfatasa alcalina cataliza la defosforilacin del adamantil-1-2-dioxetano fosfato, reaccin que genera luz. Si se coloca una pelcula fotogrfica sobre la membrana, la exposicin a la luz que se desprende en la reaccin permite detectar la actividad enzimtica. Marcaje fluorescente Otro mtodo basado en el mismo principio emplea anticuerpos unidos a fluorocromos del infrarrojo cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) - furanona (MDPF) o el rojo Nilo. Estos compuestos emiten una cantidad de luz constante (estado esttico) cuando se excitan de manera constante, permitiendo una deteccin muy precisa y una cuantificacin del antgeno ms exacta que la de la quimioluminiscencia, que se realiza durante un estado dinmico. El rojo Nilo no es puede usarse para teir bandas en membranas de PVDF; sin embargo es posible realizar la tincin en el gel SDS - PAGE y luego transferirlo a la membrana de PVDF. Esto ltimo presenta una ventaja, y es que no es necesario realizar una tincin del gel para comprobar la transferencia proteica. Sistema avidina/estreptavidina Otra opcin es emplear un anticuerpo primario unido covelentemente a molculas de biotina. Despus la deteccin se llevar a cabo con una protena de unin a la misma, como la estreptavidina o la avidina. Deteccin con oro Otra tcnica, conocida como Golden blot, consiste en la deteccin de los anticuerpos primarios con protena A unida a partculas de oro. El resultado es una membrana con manchas rojas, causadas por el oro, all donde est la protena. La sensibilidad del mtodo puede incrementarse con una tincin fotoqumica de plata: el oro cataliza la reduccin de los iones plata a plata metlica en presencia de otro agente reductor, como la hidroquinona; la plata forma de este modo unas manchas visibles bajo microscopio ptico. Se consigue as una sensibilidad comparable a la de las tcnicas radiactivas. Mtodo en un paso Histricamente la deteccin se ha realizado en dos pasos por la relativa facilidad que supone producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto ofrece a investigadores y empresas enormes ventajas en lo que a flexibilidad se refiere, y aade un efecto amplificador al proceso. Sin embargo, debido a la llegada de los anlisis de protenas de alto rendimiento y los menores lmites de deteccin ha crecido el inters por desarrollar sistemas de deteccin en un solo paso que aumentaran la rapidez del proceso al tiempo que reducen los consumibles. Esto requiere un anticuerpo que reconozca al mismo tiempo la protena de inters y una "etiqueta" detectable. Se incuba de manera similar al anticuerpo primario del proceso en dos pasos, y, tras una serie de lavados, ya se puede detectar directamente.

Anlisis Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la deteccin de aquellas que s se han unido a la protena de inters. Deteccin colorimtrica La deteccin colorimtrica depende de la incubacin del Western blot con un sustrato que reacciona gracias a la enzima reporter (una peroxidasa, por ejemplo) unida al anticuerpo secundario. Pasa as de ser un compuesto soluble a una forma insoluble de otro color que precipita cerca de la enzima tiendo as la membrana. Se procede despus a un lavado en el que se elimina el tinte soluble. La cuantificacin proteica se evala por densitometra (cuan intensa es la mancha) o por espectrometra. Deteccin quimioluminiscente La deteccin quimioluminiscente requieren la incubacin de la membrana con un sustrato, que emitir luminiscencia al ser expuesto al reporter que trae unido el anticuerpo secundario. La luz emitida es captada por una pelcula fotogrfica o, ms recientemente, por cmaras CCD, que toman una imagen digital del Western blot. Se analiza la imagen por densitometra para evaluar la cantidad relativa de mancha y cuantifica el resultado en trminos de densidad ptica. Actualmente hay programas que permiten realizar anlisis ms profundos si se aplican ciertos estndares, como la obtencin del peso molecular. Deteccin radiactiva Los marcadores radiactivos no requieren sustratos enzimticos; en su lugar se coloca una pelcula fotogrfica contra el Western blot y la actividad radiactiva del marcador provoca la aparicin en ella de regiones oscuras. stas se correspondern con las bandas de las protenas de inters. Su alto precio y su riesgo para la salud y la seguridad han provocado su desuso en los ltimos tiempos. Deteccin fluorescente En la deteccin con marcadores fluorescentes se procede a la excitacin lumnica de stos que les provoca una excitacin. sta es detectable por un fotosensor, como una cmara CCD equipado con los filtros de emisin apropiados. Se consigue as una imagen digital del Western blot que puede ser analizado para obtener el peso molecular o la cuantificacin proteica. La fluorescencia es considerada uno de los mtodos de anlisis ms sensibles. Exploraciones secundarias Una caracterstica de las membranas de PVDF, de la que carecen las de nitrocelulosa, es su capacidad de quitar los anticuerpos y volver a explorar la membrana con otros anticuerpos. Aunque hay protocolos que permiten hacer lo mismo en membranas de nitrocelulosa, la robustez de las de PVDF facilita la eliminacin de los anticuerpos, permitiendo ms reusos antes de que el ruido de fondo es tan grande que impide continuar con los experimentos. Otra diferencia es que, a diferencia de la nitrocelulosa,

el PVDF debe ser empapado en etanol, isopropanol o metanol al 95% antes de ser usado. Adems, las membranas de PVDF tienden a ser ms delgadas y ms resistentes a los daos durante su uso. Aplicaciones Investigacin Actualmente, el Western blot es una de las tcnicas ms usadas en el estudio de la biologa molecular. Diagnstico Prueba de VIH: se buscan, mediante Western blot, los anticuerpos anti-VIH en una muestra de suero humano. Se transfieren a una membrana las protenas de clulas que, se sabe, estn infectadas por el VIH. Entonces, se incuba el suero que hay que probar con esta membrana. Este paso es equivalente a la incubacin con el anticuerpo primario; si hay anticuerpos anti-VIH en el suero, sern estos los que realizen el papel de anticuerpo primario. Se lava, para eliminar los anticuerpos no unidos, y la membrana se vuelve a incubar con un anticuerpo secundario anti-humano unido a una enzima-seal. La aparicin de bandas indica la presencia de protenas contra las cuales el suero del paciente contiene anticuerpos, es decir, el paciente es seropositivo. Se emplea como prueba definitiva de la encefalopata espongiforme bovina, comnmente llamada "enfermedad de las vacas locas". Algunas clases de la prueba para la enfermedad de Lyme usan el Western blot. En veterinaria, ocasionalmente se emplea el Western blot para confirmar la presencia del FIV en gatos. BIBLIOGRAFIA. 1. LINFOMA DE HODGKIN. Carmen Bellas Menndez; Revista espaola de patologa Vol. 37, n. 2, ao 2004. 2. ENFERMEDAD DE HODGKIN: NUEVOS CONCEPTOS CLNICO-PATOLGICOS. Dr. Jos Ren Mesa Cuervo, Dr. Edgardo Espinosa Martnez, Dr. Carlos Hernndez Padrn, Dr. Rafael Losada Buchilln, Dra. Alel Plasencia Ternbln y Dr. Porfirio Hernndez Ramrez. Instituto de Hematologa e Inmunologa. 3. HEPATOMEGALIA. Universidad Autnoma de Guadalajara. 4. ESPLENOMEGALIA Universidad Autnoma de Guadalajara. 5. PRUEBAS PARA EL DIAGNOSTICO DE VIH, Instituto de Hematologa e Inmunologa.