Produccin de Proteasas y Bacteriocinas por la Cepa Mexicana Bacillus subtilis No.

21 Contra Hongos y Bacterias Patgenas en Alimentos Mara del Rosario Razo Belmn, Jos Eleazar Barboza Corona, Rubn Salcedo Hernndez, Manuel Vzquez Arista, Ma. Guadalupe L. Basurto Cadena. Departamento de Alimentos, Instituto de Ciencias Agrcolas, Universidad de Guanajuato. Km 9 Carretera Irapuato-Silao, Exhacienda El Copal S/N Irapuato, Gto. mbasurto@dulcinea.ugto.mx. RESUMEN En estudios previos se comprob la actividad antagnica, in Vitro y en invernadero, que presenta una cepa mexicana de Bacillus subtilis No. 21, aislada de cultivos de fresa de la regin de Irapuato contra los hongos fitopatgenos Fusarium verticillioides y Rhizoctonia solani. Por tal motivo, se decidi evaluar algunos de los posibles mecanismos de accin de esta bacteria. En este trabajo se detect la produccin de proteasas y bacteriocinas, las cuales pudieran estar involucradas en el mecanismo antagnico de la bacteria B. subtilis No. 21.

ABSTRACT Previous studies, in vitro and greenhouse, it was proved that the antagonistic activity of a Mexican Bacillus subtilis strain 21, isolated from strawberry fields in Irapuato, against its pathogenic fungi Fusarium verticillioides and Rhizoctonia Solani, Hence, it was decided evaluate some possible action mechanisms of this bacteria. In this work proteases and bacteriocinas production were detected, which could be involved in the antagonistic mechanism of Bacillus subtilis strain 21.

INTRODUCCION Uno de los aspectos que ms afectan la produccin de los cultivos a nivel mundial lo es sin dudas la presencia cada vez ms creciente de enfermedades causadas por hongos, bacterias y virus, esto trae como consecuencia la merma mundial de los cultivos. Este aumento en las prdidas de cultivos y el nmero de enfermedades presentes en stos, hace notable la disminucin de la efectividad de los productos qumicos, lo que con frecuencia da lugar a problemas econmicos para los agricultores. Actualmente se est desarrollando la base cientfica de la lucha biolgica y como principal componente de esta se encuentra el control biolgico el cual abarca desde la represin o control de insectos hasta las enfermedades causadas por hongos bacterias y virus. Para su

control se han utilizado microorganismos los cuales ejercen una actividad antagnica contra dichas enfermedades, entre estos se encuentran hongos como Beauveria, Metarhizium y Paecilomyces y bacterias como Bacillus thuringiensis y Bacillus subtilis. (Antela, 2004). Uno de los principales problemas que limita la productividad de los cultivos es el uso constante de fungicidas, los cuales son nocivos para la salud y el medio ambiente (EPA,1999). Estudios realizados en los ltimos aos sugieren que el mtodo para combatir plagas y enfermedades en productos hortcola es el control biolgico, el cual puede ser incorporado a un plan de manejo integral con el uso adecuado de rizobacterias antagonistas contra hongos fitopatgenos (Fernndez, 1999), tal es el caso de la cepa de Bacillus subtilis No. 21, aislada de cultivos de fresa de la regin de Irapuato, la cual demostr, a nivel de invernadero, ser antagnica contra hongos de Fusarium verticillioides y Rhizoctonia solani (Torres - Basurto, 2000). El objetivo de este trabajo fue estudiar dos de los posibles mecanismos por los cuales la bacteria B. subtilis No.21 ejerce su antagonismo contra los microorganismos probados. Se observo la presencia de altos niveles de proteasas y una posible actividad (baja) de bacteriocina.

MATERIALES Y METODOS Cultivo de Bacillus subtilis No 21. La cepa, conservada en el cepario del Instituto de Ciencias Agrcolas se creci como colonias aisladas en Agar Nutitivo estandar (BD Bioxon). Una colonia se pic en 3 mL de caldo nutrido (BD Bioxon) y se dej crecer toda la noche, de este preinculo se transfirieron 0.5 mL en 100 mL de Caldo nutritivo y se cultiv en los tiempos indicados (ver resultados). Las clulas se centrifugaron y el sobrenadante se utiliz como medio condicionado. Determinacin de proteasas. Se aadieron 100 L de medio condicionado en pozos horadados en un medio caseoltico, se dejaron 24 h en refrigeracin para la difusin de las proteasas en el medio y se incubaron a 28 C por otras 24 h. Posteriormente se midi el rea de hidrlisis en las diferentes muestras usando el halo transparente delimitado por un crculo blanquecino formado alrededor de los pozos. Una unidad de proteasa (U) fue definida como el equivalente a 1mm de rea de hidrlisis. Cuantificacin de proteasas por el mtodo de Kunitz. Se prepar una mezcla de 0.5 mL de enzima + 1 mL de sustrato de casena en regulador con glicina, se incub a 37 C durante
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30 min. Una vez terminada la incubacin se agregaron 3.5 mL de cido tricloroactico 4% para detener la reaccin, se agit durante unos segundos para mezclar y se tom una muestra de 1 mL la cual se deposit en un microtubo y posteriormente se centrifugo durante 10 min a 10,000 rpm. Una vez terminada la centrifugacin se recuper el sobrenadante para medir la absorbencia a 280 nm una unidad fue definida como A280nm*Dilucin*160.566/volumen/30 min. (Rojas I., 1994). Mtodo de difusin de pozos para la determinacin de bacteriocinas. Para la evaluacin de bacteriocinas se inocularon previamente las cepas de diferentes bacterias patgenas y Bacillus cereus en 15 mL de Caldo de Soya Tripticasena (CST), se incubaran a 37 C y 28 C respectivamente con una agitacin de 200 rpm durante 24 h. Despus de la incubacin se ajusto la concentracin de clulas a una absorbencia a 2.0 nm y posteriormente se mezclaron 105 L de B. cereus + 15 ml de agar para pozos. Se realiz la misma mezcla para cada una de las 12 especies patgenas que se utilizaron, la mezcla se vaci en cajas de Petri y se dej solidificar, una vez solidificado el medio se hicieron pozos de 8 mm y se dejaron secar a 37 C durante 2 h. Despus se agregaron 100 L de la bacteriocina (medio condicionado) y se incubaron a 4 C durante 24 horas para la absorcin de la bacteriocina, luego se incub a B. cereus a 28C y las cepas patgenas a 37C durante 24 h. Si la prueba es positiva se observaran halos de inhibicin y se medir el dimetro del halo para determinar as la actividad de bacteriocinas. Mtodo de fluorescencia para determinacin de bacteriocinas. Se prepar un preinocul de B. cereus, el cual const de 10 mL de Caldo de Soya Tripticasena (CST)+ 2 asadas de la colonia y se incubara a 28 C durante 24 h. Despus se efectu una siembra de 5 L de preinocul +45 mL de CST y se incubara a 28 C a 200 rpm durante 2 h, posteriormente se tomarn 35 mL de la muestra y se centrifugaron a 0 C durante 5 10 min a 4000 rpm. El sobrenadante se tir y se resuspendi la pastilla en buffer de fosfatos hasta ajustar las clulas a una absorbencia de 0.887 nm. Se prepar un blanco agregando 50 L buffer de fosfatos + 20 L clulas normales + 930 L (Berberina + buffer de fosfatos) y un control agregando 45 L buffer de fosfatos + 5 L muestra +20 L clulas normales + 930 L (Berberina + buffer de fosfatos). La preparacin de las muestras se realizaron agregando 50 L muestra + 20 L clulas normales + 930 L (Berberina + buffer de fosfatos), se agitaron unos segundos en el vortex y se realiz la medicin en el fluormetro Hoefer DynA Quant 200 a una longitud de onda de 360 nm de excitacin y 460 de emisin (Fuente Salcido, 2007).

RESULTADOS Determinacin de proteasas. Los resultados obtenidos mostraron la presencia de proteasas. En la Tabla 1, se muestran los resultados del dimetro que presentaron los halos de hidrlisis al colocar la cepa de Bacillus subtilis No. 21, en dos diferentes medios. Las Figuras 2 y 3 muestran el ensayo de proteasas a 24, 48 y 72 h en medio de caldo nutritivo. Las Figuras 4 y 5 muestran el ensayo de proteasas a las 24, 48 y 72 h en medio de quitina coloidal. En estas figuras se puede observar que las muestras colocadas en caldo nutritivo tuvieron mayor actividad de proteasas que las muestras colocadas en quitina coloidal.

Medio de Cultivo Tiempo Caldo Nutritivo 24 48 72 1.3823 2.8589 2.7568 Quitina Coloidal 0.3534 0.7461 1.1545

Tabla 1. Determinacin de proteasas (U) producidas por B. subtilis No. 21 al cultivarlos en diferentes medios de cultivo

24

48

72

Fig. 1. Ensayo de proteasas a las 24, y 48 h en caldo nutritivo

Fig. 2. Ensayo de proteasas a las 72 h en caldo nutritivo

24

48

72

Fig. 3. Ensayo de proteasas a las 24, y 48 h producidas por clulas crecidas en quitina coloidal

Fig. 4. Ensayo de proteasas a las 72 h producidas por clulas crecidas en quitina coloidal

Cuantificacin de proteasas por el mtodo de Kunitz. Los resultados obtenidos de la cuantificacin de proteasas para B. subtilis No. 21 se muestra en la Figura 5, donde se realizaron muestreos cada 2 h durante 74 h.

500

400

UP/mL/min.

300

200

100 0 10 20 30 40 50 60 70 80

tiempo (h)

Fig. 5. Curva de Produccin de proteasas

Determinacin de Actividad de Bacteriocinas por el mtodo de difusin en pozos. Los resultados obtenidos de est prueba en la cual se midi la efectividad de las bacteriocinas producidas por la cepa de B. subtilis No. 21 contra las 12 especies de bacterias patgenas utilizadas las cuales afectan a productos alimenticios se muestran en la tabla 2.

Medio de Cultivo Nombre Bacteria Streptococcus pyogenes Bacillus cereus 183 Enterobacter cloacae ATCC13047 Staphylococcus aureus ATCC 25923 Staphylococcus xylosus ATCC700404 Pseudomona aeruginosa ATCC27853 Escherichia coli Listeria inocua Proteus vulgaris ATCC13315 Salmonella sp. Shigella flexneri Streptococcus pneumoniae 25.13 275.68 25.13 275.68 0 0 0 0 0 0 0 0 19.44 35.34 25.13 21.99 0 0 0 0 0 0 0 0 Caldo Nutritivo Quitina Coloidal

Tabla 2. Determinacin de actividad de Bacteriocinas producidas por B. subtilis No. 21 al enfrentarlo contra diferentes bacterias patgenas

Mtodo de fluorescencia para determinacin de bacteriocinas. Las mediciones obtenidos en est prueba se graficaron y se ajustaron a una curva sigmoidal la cual se muestra en la Figura 6. Se observ un mximo de actividad de bacteriocinas despus de las 60 horas de cultivo, de acuerdo con el ajuste el mximo se alcanza despus de las 50 horas.

180 160 140

fluorescencia (UR)

120 100 80 60 40 20 0 10 20 30 40 50 60 70 80

tiempo (h)

Fig. 6. Curva de actividad de bacteriocinas

DISCUSIN Los resultados obtenidos sugieren que la cepa mexicana de Bacillus subtilis No. 21 analizada en este trabajo puede ejercer una actividad antagnica contra diversas cepas de hongos fitopatgenos como son Fusarium verticillioides y Rhizoctonia solani mediante la liberacin de proteasas donde su mayor produccin se present entre las 18 y 24 h, de acuerdo a la Figura 5. Adems de producir proteasas, B. subtilis No. 21 produce tambin bacteriocinas, las cuales segn los resultados obtenidos pueden inhibir el crecimiento de algunas bacterias patgenas para el ser humano y las cuales pueden ser encontradas en los alimentos. Dichas bacteriocinas alcanza su mayor actividad a despus 60 h de cultivo, la cual es de 160 UR. En posteriores trabajos se realizar estudios adicionales para la determinacin cuantitativa de proteasas mediante zimogramas, adems de realizar pruebas para determinar que otros compuestos pueden ser producidos por dicha cepa bacteriana. El ensayo de fluorescencia est diseado especficamente para la deteccin rpida de bacteriocinas (Fuente Salcido, et. al., 2007), en nuestro caso pudimos detectar actividad con dicho ensayo, sin embargo nos falta una prueba adicional para demostrar que la actividad medida efectivamente es una bacteriocina: la prueba de que la actividad mostrada es debida a una molcula de naturaleza protica, actualmente estamos trabajando en ese tema.

BIBLIOGRAFIA Antela- Arrasta., O., 2004. Control biolgico como estrategia en el manejo integrado de plagas. EPA., 1999 Environmental Protection Agency and pesticides. Fernndez, G.J., 1999. Agroecologa Americana. En Enciclopedia Prctica de la Agricultura y Ganadera: 11-18. Grupo Editorial Ocano. Barcelona, Espaa. Fuente Salcido N., Salcedo Hernandez R., Alans Guzmn M., K. Bideshi D., Barboza Corona J., 2007. A new rapid fluorogenic method for measuring bacteriocin actiity., Journal of Microbiological Methods. Torres G.L.I., Basurto C.M.G. 2000. Control Biolgico De Hongos Fitopatgenos De La Raz y Corona De Fresa Con Cepas Antagnicas De Bacillus subtilis. Tesis de Licenciatura. ICA. U. de Guanajuato. Irapuato, Gto. Mxico. Rojas I. 1994. Produccin de proteasas por Bacillus thuringensis crecido en medios a base de materiales protein-quitinosos. Posible uso de estas enzimas en la obtencin de hidrolizados de carne y harinas de pescado. Tesis de Maestra. Instituto Tecnolgico de Veracruz. Veracruz, Veracruz, Mxico.