XXIII Congreso de ASEM: La investigacin en las enfermedades neuromusculares.

Conferencia Ricardo Pardal

Clulas madre de la cresta neural como alternativa teraputica

Introduccin

Las enfermedades neuromusculares son relativamente frecuentes entre la poblacin y se originan, entre otras causas, por la degeneracin o el dao de clulas nerviosas que participan directa o indirectamente en la inervacin de los msculos. Los sntomas son tpicamente de tipo motor, con descoordinacin de movimientos, rigidez muscular y parlisis total en los peores casos. Estas enfermedades suelen resultar muy deletreas y actualmente no existen tratamientos eficaces que mejoren los sntomas.

La terapia celular consiste en el transplante de clulas en la zona afectada para sustituir a las clulas daadas, o bien para contribuir a su recuperacin. El xito de una terapia de este tipo depende del conocimiento profundo y previo de dos aspectos del problema, por un lado las bases celulares y moleculares de la enfermedad, lo que permitir la bsqueda de las clulas ms adecuadas para su transplante. Y por otro lado tambin es necesario un anlisis exhaustivo de las propiedades de las clulas a transplantar, para evitar efectos indeseables una vez transplantadas. Por todo ello, es absolutamente recomendable y necesaria una investigacin bsica previa que determine la viabilidad del tratamiento, mediante estudios in vitro e in vivo utilizando modelos animales de la enfermedad. No debemos olvidar que se trata de transplantar clulas en un ambiente extrao y nuevo para ellas, lo que podra modificar sus propiedades bsicas. Como ejemplo de efecto secundario indeseable existe la posibilidad de que algunas clulas, sujetas a ambientes y sealizaciones extraas tras el transplante, puedan provocar crecimiento de tipo tumoral. Resulta pues muy recomendable la identificacin, la separacin y el estudio de subpoblaciones de clulas madre que puedan resultar tiles para el transplante y tratamiento de las distintas enfermedades.

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Existen ya algunos estudios de terapia celular aplicada al tratamiento de neuropatas perifricas, como es el uso de clulas de la glia envolvente en la recuperacin de la mielina en los nervios perifricos de modelos animales de neuropata desmielinizante. Tambin se han utilizado mioblastos inyectados directamente en los msculos de modelos animales de neuropatas originadas por degeneracin de las fibras musculares. Sin embargo, el abanico de posibilidades de terapia celular se ha abierto enormemente con la descripcin y el estudio de las clulas madre, unas clulas que permanecen indiferenciadas en los tejidos precisamente para contribuir a su mantenimiento y reparacin.

Existen dos tipos de clulas madre, las clulas madre embrionarias, que se obtienen del embrin en sus primeros estadios y pueden diferenciarse hacia cualquier tipo celular del organismo, y las clulas madre adultas o especficas de tejido. Estas ltimas tienen menor capacidad proliferativa que las embrionarias y suelen diferenciarse nicamente hacia tipos celulares caractersticos del tejido en el que se encuentran. Sin embargo, el uso de clulas madre embrionarias plantea problemas de tipo legal y tico, adems de problemas de rechazo inmunolgico, mientras que todos estos inconvenientes quedaran solventados al utilizar transplantes autlogos basados en clulas madre adultas.

Con esta presentacin pretendo ilustrar un ejemplo de utilizacin de clulas madre especficas de tejido para el tratamiento de una enfermedad, en nuestro caso la enfermedad de Parkinson, pero que podra ser extrapolable a otros tipos de enfermedades neurodegenerativas.

El Parkinson como modelo de enfermedad neurodegenerativa

La Enfermedad de Parkinson (EP) es una dolencia neurodegenerativa provocada por la muerte selectiva de neuronas dopaminrgicas de la Sustancia Negra (SN). Estas neuronas proyectan sus axones al ncleo estriado para establecer unas sinapsis cuyo neurotransmisor principal es la dopamina. Estas conexiones forman parte de los circuitos de los ganglios basales encargados del control fino de los

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movimientos. La falta de tono dopaminrgico en el estriado, por degeneracin de las neuronas de la SN, genera los sntomas motores de la enfermedad, como el temblor o la rigidez postural.

Recientemente se ha intentado abordar el tratamiento de esta enfermedad mediante terapia celular. La estrategia ms comnmente perseguida ha sido la de transplantar clulas productoras de dopamina en el estriado desnervado, para intentar contrarrestar la falta del neurotransmisor. La procedencia de las clulas ha sido muy diversa dependiendo del laboratorio, pero recientemente se estn probando clulas dopaminrgicas derivadas de la diferenciacin de clulas madre. Por un lado hay grupos trabajando con clulas madre embrionarias, derivando a partir de ellas neuronas dopaminrgicas de tipo mesenceflico, muy similares a las que se pierden por degeneracin en el transcurso de la enfermedad. Por otro hay grupos trabajando con clulas dopaminrgicas adultas obtenidas de distintos lugares como por ejemplo de la retina. Por ltimo hay otros grupos que estn intentando utilizar clulas madre especficas de tejido, obtenidas del individuo adulto, como fuente de las clulas dopaminrgicas a transplantar.

El cuerpo carotdeo como alternativa teraputica

En nuestro grupo existe una amplia experiencia en el estudio de un pequeo rgano llamado cuerpo carotdeo. Este tejido posee las clulas ms dopaminrgicas del organismo, las clulas glmicas. Estas clulas son quimiorreceptores capaces de detectar cambios en las variables fisicoqumicas de la sangre como el pH, la presin parcial de CO2 y sobre todo la presin parcial de oxgeno. Las clulas glmicas son las encargadas de informar al cerebro del descenso en los niveles sanguneos de oxgeno, lo que permite desencadenar respuestas compensatorias como la hiperventilacin. El carcter tan dopaminrgico de las clulas glmicas nos indujo a pensar en la posibilidad de utilizar estas clulas para su transplante en el estriado de modelos animales de Parkinson. En una primera fase se llevaron a cabo experimentos en modelos de Parkinson con ratas y ratones, donde los resultados de recuperacin de las funciones motoras fueron bastante satisfactorios. A continuacin, y en

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colaboracin con la Universidad de Navarra, se llevaron a cabo transplantes en modelos de Parkinson en primates, con resultados tambin positivos. Por ltimo hemos comenzado desde hace unos aos a colaborar con neurlogos del Hospital Virgen de las Nieves de Granada para llevar a cabo algunos autotransplantes con pacientes humanos. Aunque las mejoras en la sintomatologa tras los transplantes no han sido espectaculares, s que el estudio nos ha permitido trazar algunas correlaciones interesantes como las existentes entre la edad del paciente o el grado de avance de la enfermedad, con el porcentaje de mejora motora.

Nuestros estudios de terapia celular con clulas glmicas, tanto en modelos animales como los ensayos clnicos con pacientes, nos han permitido dilucidar algo mejor el mecanismo por el que estas clulas consiguen su efecto beneficioso sobre el circuito afectado. Parece ser que ms que la sntesis de dopamina, lo verdaderamente importante es que estas clulas tambin producen de forma abundante factores trficos del tipo del GDNF. Estos factores consiguen la supervivencia y recuperacin de las pocas neuronas que quedan en las zonas afectadas de la SN. El efecto beneficioso es por tanto en su mayor parte trfico, ms que de sustitucin de la funcin dopaminrgica. Este hallazgo nos permite elucubrar sobre la posibilidad de utilizar el transplante de clulas glmicas de forma ms general para el tratamiento de otras enfermedades tambin causadas por muerte neuronal.

Uno de los problemas que creemos est impidiendo unos resultados ms esperanzadores con esta tcnica, es el tamao reducido del cuerpo carotdeo y la escasez de tejido glmico del que disponemos para su transplante. La alternativa en la que nos embarcamos fue la bsqueda de clulas madre especficas de tejido glmico que nos permitieran expandir la poblacin de clulas glmicas en cultivo previamente a su utilizacin para los transplantes.

Clulas madre neurales especficas de tejido glmico

El cuerpo carotdeo es un tejido paraneural derivado de la cresta neural, como el resto del sistema nervioso perifrico. El parnquima glmico consta de dos clulas

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principales, ambas de origen neuroectodrmico, las clulas glmicas o tipo I, positivas para la tirosina hidroxilasa (TH), y las clulas sustentaculares o tipo II. Estas ltimas comparten caractersticas con las clulas gliales del sistema nervioso como por ejemplo la expresin del marcador glial GFAP. Se cree que las clulas tipo II tienen la funcin de asistir y mantener a las clulas tipo I, del mismo modo que hacen las clulas gliales con las neuronas en el sistema nervioso.

La capacidad regenerativa del cuerpo carotdeo est muy bien descrita pues es un rgano que se hipertrofia en situaciones de hipoxia crnica. Nosotros mismos hemos descrito que animales sometidos a hipoxia moderada pero durante largos perodos de tiempo, activan el rgano de forma que las clulas proliferan para aumentar la poblacin de clulas glmicas disponibles. Administrando un compuesto que marque clulas proliferativas como el BrdU, hemos demostrado que al cabo de una semana en hipoxia crnica comienzan a aparecer clulas TH+ y BrdU+, es decir correspondientes a nuevas clulas glmicas. Este fenmeno marcadamente sugiere la existencia de una subpoblacin de clulas progenitoras en el cuerpo carotdeo capaces de diferenciarse hacia clulas glmicas cuando es necesario.

En nuestro laboratorio llevamos a cabo preparaciones de clula nica de cuerpo carotdeo, para poder sembrar las clulas en cultivos que permitan la proliferacin de clulas madre de tipo neural. El crecimiento tpico de las clulas madre especficas de tejido neural es en forma de neuroesferas o colonias esfricas de miles de clulas que crecen en flotacin en el medio rico en factores trficos. En nuestro caso el 1% de las clulas de cuerpo carotdeo sembradas dan lugar a un crecimiento en forma de neuroesferas. Estas clulas madre tienen una capacidad limitada de autorrenovacin y se diferencian in vitro hacia clulas glmicas. Las neuroesferas inmediatamente comienzan a tener glomrulos que surgen del cuerpo principal, y que por inmunocitoqumica hemos demostrado que estn formados por clulas glmicas TH positivas tpicas. Tambin hemos llevado a cabo experimentos de electrofisiologa con las clulas glmicas aparecidas a partir de las neuroesferas, para demostrar que sus respuestas fisiolgicas a estmulos tpicos como la hipoxia o la

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hipoglucemia son perfectamente equiparables a lo ya descrito por nuestro grupo en estudios previos de este rgano.

Podemos concluir por tanto que el cuerpo carotdeo consta de una subpoblacin de clulas madre neurales que contribuye al mantenimiento del tejido glmico, y que es susceptible de ser utilizada para la expansin del rgano en cultivo previo a su uso para terapia celular. Queda por identificar exactamente el tipo celular in vivo correspondiente a esta subpoblacin de clulas progenitoras neurales, lo que permitira un estudio ms detallado de su naturaleza y un mejor control de su biologa. Tambin hemos comenzado ya a transplantar estas clulas glmicas derivadas de clulas madre, para conocer las implicaciones que pueda tener la tcnica en el tratamiento de las distintas enfermedades neurodegenerativas.

Dr. Ricardo Pardal Contratado Ramn y Cajal Lab. de Investigaciones Biomdicas Univ. de Sevilla y Hospital U. V. del Roco Sevilla