Hibridación de ácidos nucleicos

Desnaturalización y renaturalización del ADN por la temperatura

Agentes desnaturantes:
- Temperatura
- Moléculas polares (con grupos
amino y carbonilo que compitan por la
formación de puentes hidrógeno)

- Condiciones alcalinas
Alteración
Alteración de
de las
las propiedades
propiedades físicas
físicas del
del ADN
ADN por
por desnaturalización
desnaturalización
Estructura
Estructura de
de los
los ácidos
ácidos nucleicos
nucleicos yy su
su absorción
absorción óptica
óptica
 Curvas de Desnaturación

-Las curvas de desnaturación son específicas para cada molécula de ADN y dependen de la
composición nucleotídica
-La curva sigmoidal muestra que las interacciones que mantiene la doble hélice son cooperativas (la
separación en un punto estimula la separación consecutiva de otros puntos en la molécula)
-De esta curva se obtiene la Tm (temperatura media de fusión)
-La Tm muestra una correlación lineal con el contenido de G+C
Curvas de Desnaturación
 Aplicación
Aplicación de
de la
la hidridación
hidridación de
de ácidos
ácidos nucleicos
nucleicos
en
en el
el análisis
análisis molecular
molecular
- Formación de híbridos de DNA:DNA o DNA:RNA durante un proceso de renaturación
- El apareamiento de los híbridos dependerá de la complementariedad de bases y de las
condiciones químicas y térmicas del proceso de renaturación

Astringencia o rigor (Stringency): grado de especificidad en el apareamiento de los híbridos.

Experimentalmente se regula cambiando la temperatura, tiempo, longitud y composición de las
cadenas a hibridar y ambiente químico (pH, cationes (Na+), moléculas polares(formamida))
 Ensayos de hidridación

- Slot blot y dot blot

Hibridación en fase sólida - Hibridación Southern
- Hidridación Northern

Hidridación en fase líquida

Hibridación in situ
 Dot blot y Slot blot

Permite analizar ácidos nucleicos sin purificar (x ej: provenientes de muestras

biológicas: sangre, heces, esputo)
 Southern blot

La técnica de Northern blot es idéntica en procedimiento pero se utiliza para analizar

muestras de RNA (aplicado al estudio de la expresión de genes).
Métodos paralelos de análisis molecular
 Marcaje de sondas
1) Marcaje por síntesis con DNA polimerasa
Traslado de la mella: Nick translation
 Marcaje de sondas

2) Marcaje terminal
Marcaje con polinucleótido quinasa
 Tipos de marca:
1) Directa: Fluorocromo

Radiactiva (32P)

2) Indirecta:

Grupo indicador
2) Marca Indirecta:
Resumen de marcadores y métodos para su detección
 Micromatrices
Micromatrices de
de ADN:
ADN: DNA
DNA microarrays
microarrays

Técnica revolucionaria que permite monitorear la expresión de múltiples

genes en forma simultánea

Permite estudiar los genes que están activos en tejidos particulares

 POLIMORFISMOS

Variaciones en la secuencia del genoma. Pueden ser producidas por:

- Recombinación no homóloga (duplicación de genes)
Ej: isoformas de la fosfatasa alcalina
- Transposición y retrotransposición
Ej. Secuencias LINE y SINE, secuencias Alu.

Polimorfismo en regiones génicas (génico)

- Polimorfismo del grupo sanguíneo ABO
- Polimorfismo de la galactosemia
- Polimorfismo del CFTR

Polimorfismo en regiones no génicas (genético)

Utilizado para la identificación de individuos (huella dactilar de ADN)
-DNA mini-satélite
Repeticiones de 10 a 65 pb, ricas en C+G agrupadas en tandem formando bloques grandes de cientos y
miles de repeticiones repartidos en todo el genoma
Ej: GGGCAGGANG (N=cualquier nucleótido), secuencias de DNA minisatélite hipervariable de elevado
polimorfismo
-DNA microsatélite
Repeticiones de unidades menores a 7 pb, agrupadas en tandem hasta 50 repeticiones
Ej: secuencias teloméricas
 FRLP
Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restricción
(restriction fragment length polymorphism)

Cada muestra genera diferentes fragmentos de longitud diferente en función de los sitios de restricción presentes
Se utiliza una sonda que hibrida en una posición cercana al sitio polimórfico y se analizan los resultados por Southern

Ejemplo: La secuencia de corte de la enzima de restricción está ausente en un alelo

 FRLP en el diagnóstico de la anemia falciforme
Anemia falciforme: enfermedad hereditaria por presencia de HbS, generando un deficiente transporte de O2
La β-globina situada en el cromosoma 11 presenta una mutación de cambio de sentido.

La mutación genera la ausencia del sitio de corte para la enzima de restricción Mst II
FRLP en el diagnóstico de la anemia falciforme
Estas
Estas determinaciones
determinaciones
pueden
pueden ser
ser aplicadas
aplicadas
como
como diagnóstico
diagnóstico
prenatal
prenatal
 Polimorfismo en el número de repeticiones en tandem: VNTR
(variable number of tandem repeats)

La sonda hibrida con la secuencia repetida y permite la identificación del grado de repetición del
polimosfismo (una carácterística única para cada individuo (salvo en gemelos unicigóticos))
Obtención de una huella
dactilar de ADN empleando
una sonda VNTR
← Sonda

El intrón 1 del gen de la mioglobina

posee 4 secuencias repetidas
formando un loci de VNTR (VNTR1)

El esquema muestra el resultado del

Southern blot al utilizar la sonda de
33 pb descrita, para analizar a tres
diferentes individuos
El polimorfismo VNTR utilizado en criminalística
Aplicaciones de los polimorfismos: FRLP y VNTR

-Diagnóstico de paternidad biológica

-Seguimiento de árboles genealógicos
-Identificación de sospechosos en procedimientos penales
-Identificación post-mórtem de individuos (casos judiciales y catástrofes)
-Diagnóstico de patologías hereditarias
-Compatibilidad de transplantes
-Análisis de la inestabilidad genética de cierto tumores
 Hidridación in situ

Tisular
Aplicada a cortes de tejidos o células intactas
fijados con formalina e incluidos en parafina
La sondas utilizada tiene una marca radiactiva o
fluorescente (FISH) y son analizada por el
examen de una película fotográfica
(autorradiografía) o en un microscopio de
fluorescencia respectivamente. Detección del mRNA para el gen tailless en un
embrión de Drosophila.
FISH: hibridación in situ fluorescente
(fluorescent in situ hybriditation).
Permite estudiar cambios en la expresión génica
analizando el mRNA (por ej: durante el
desarrollo)
Es utilizada para detectar virus patógenos en
células infectadas.
Es utilizada en investigación para la detección
de la expresión específica de genes en algunas
patologías.
Hidridación in situ

Cromosómica
Se realiza en cromosomas metafásicos fijados,
tratados con proteasa y desnaturalizados por
calor y álcali.
La sonda utilizada generalmente está asociada
a una marca fluorescente (FISH) y analizada en
un microscopio de fluorescencia.
Coloreado de cromosomas mediante FISH

El coloreado de cromosomas permite identificar la

localización de secuencias específicas en cada uno de
los cromosomas utilizando sondas especificas para
cada uno de ellos marcadas con diferentes
fluorocromos
Permite la detección de cromosomopatias aneuploidías
(monosomías, trisomías) o variaciones estructurales
(deleciones, inversiones).
Permite observar cambios grandes de reorganización
cromosómica (por ej. en células cancerosas).

FISH para la detección del gen de una proteína muscular

(Lichter el al., Science 247, 1990, 64).