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Universidad Católica de la Santísima Concepción

Facultad de Medicina / Escuela de Medicina


Bioquímica

PRACTICO Nº02
Propiedades de
las Proteínas
INTEGRANTES / Pilar L. Navarrete Briones
Yael R. Oñate Antilao
María J. Pérez Fernández
Carlos Pino Contreras
CARRERA / Medicina
SECCIÓN / Nº2
DOCENTES / Dr. Reginaldo Del Pozo,Ph. D.
BQ Javier Grandón
BQ Mirna Muñoz, M.Sc
QA German Rotter
FECHA / Jueves 26 de Abril de 2007

Introducción//
En este práctico Nº2 de Bioquímica para
Medicina, una vez más nos acercaremos al mundo de
las Biomoléculas más abundantes del organismo: Las
Proteínas.

Los temas que en esta ocasión nos


convocan abarcan 3 aspectos: en 1º lugar La detección
de aminoácidos: ya sabemos que tan solo 20
aminoácidos componen el alfabeto a partir del cual se
forma la gran variedad de proteínas existentes, existen
muchos métodos bioquímicas que nos permiten
identificar y su presencia en una muestra, dentro estos
destacan la formación de complejos cromóforos por interacción del aminoácido y un reactivo
especifico, en esta ocasión trabajaremos con la Ninhidrina, agente que al entrar en contacto con
aminoácidos libres da lugar a un complejo visible de color azul-violáceo. En 2º lugar
trabajaremos con la Desnaturalización de las proteínas, sabemos que la funcionalidad de una
proteína depende de la integridad de su estructura, no solo 1º, sino que también 2º,3º y
4º(según corresponda), en este práctico utilizaremos diferentes agentes reconocidos por ejercer
efecto denaturante (perdida de estructura 2º y 3º) en proteínas fenómenos que detectaremos a
través de la observación de perdida de solubilidad en las proteínas desnaturadas y para
terminar nos acercaremos al tema de los puntos isoeléctricos proteicos , es decir conocer el
valor del Ph en el cual la proteína adquiere una carga neta cero; cuando ciertas proteínas
alcanzan este status se producen fenómenos como la precipitación, usando este conocimiento
seremos capaces de determinar empíricamente el Punto Isoeléctrico de la proteína de la
Leche :Caseína.

Objetivos //

Identificación de amino ácido a través de la reacción de ninhidrina y su


diferenciación con las proteínas.
Reconocimiento de proteínas por reacciones de precipitación, por
desnaturalización por calor y por acido tricloroacético.
Determinación del punto isoeléctrico de la caseína, a través de insolubilidad.
Conocer algunas de las propiedad de la caseína.
Materiales//

 Solución acido acético 1M.  Mechero


 Caseína en acetato 0,1M.  Pinza

 TCA 10%  16 tubos de ensayo


 Muestra proteica (solución de  Pipetas de 2, 5 y 10ml.
aminoácidos neutra,
ninhidrina y caseína.  Propipetas

 Gradilla  Micropipetas 200-1000µl


100-1000µl
 Vaso 250ml.
 Puntas para micropipetas
Método//

Procedimiento actividad practica nº 1:

a) Agregar en 3 tubos de ensayo 0,5 ml de Solución alcohólica de


ninhidrina al 0,1% y luego agregar:
Tubo 1: 2,5 ml de solución neutra de aminoácidos 0,1 M
Tubo 2: 2,5 ml de solución neutra de caseína.
Tubo 3: 2,5 ml de agua destilada

b) Agitar las soluciones realizadas en el vórtex, de manera que las muestras


queden homogéneas.

c) Calentar todos los tubos a baño María


hirviente por 2 minutos

d) Dejar enfriar las muestras y observar resultados obtenidos

Procedimiento actividad práctica nº2

a)Agregar en 4 tubos de ensayo lo siguiente:


Tubo 1: 0,5 ml de muestra proteica
Tubo 2: 0,5 ml de agua destilada
Tubo 3: 0,5 ml de muestra proteica + 0,5 ml de
TCA 10%
Tubo 4: 0,5 ml de agua destilada + 0,5 ml de TCA
10%

b) Agitar las soluciones realizadas en el vórtex, de manera que las muestras queden
homogéneas.

c) Calentar los tubos a baño María hirviente por 3 minutos


d) Dejar enfriar las muestras y observar resultados obtenidos

Procedimiento actividad práctica nº3

a) Rotular los tubos de ensayo del 1 al 9, para así agregar al tubo nº1 de
ensayo 3,2 ml de ácido acético 1M + 6,8 ml de agua destilada y
luego mezclar en el vortex

b) Agregar 5 ml de agua destilada a 8


tubos de ensayo
(tubos del 2 al 9)

c) Sacar 5 ml de la solución del tubo 1 y agregárselo al tubo 2, mezclando en el


vortex; luego sacar 5 ml del tubo 2, agregarlos al tubo 3 y mezclar nuevamente en
el vortex, luego repetir este paso con todos los demás tubos, realizando así una
disolución seriada

5ml
5 ml

d) Al finalizar con las diluciones, eliminar 5 ml del último tubo (nº9).


Después de de esto, adicionar a cada tubo 1 ml de solución de caseína
en acetato de sodio 0,1M mezclando inmediatamente en el vortex.
Observar y Anotar el efecto inmediato y a los 15 minutos más tarde.

Resultados//

1º Experimento: Identificación de Aminoácidos por Reacción de Ninhidrina y su


diferenciación con las proteínas:

Principio involucrado: Formación específica de un Complejo Cromóforo, por reacción de


desaminación oxidativa (preferentemente aminos primarios) entre Ninhidrina y Aminoácidos
libres.

Mecanismo: (REDOX) Ninhidrina produce al


oxidación del aminoácido con la
consiguiente liberación de NH3, CO2 y un
Aldehído con un carbono menos que el
aminoácido original, el NH3 reacciona con 2
moléculas de Ninhidrina formando un complejo de color azul violáceo llamado Púrpura de
Ruhemann

Ninhidrina: (2,2-dihidroxi-1,3-indanodiona),
Característica especial: FOTOSENSIBLE
Resumen de reacción
Componentes Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
Sol. Neutra aminoácidos 2.5 ml - -
So. Neutra caseína - 2.5 ml -
Agua destilada - - 2.5 ml
Sol. Alcohólica ninhidrina 0.5 ml 0.5 ml 0.5 ml
Resultados Violeta intenso Casi nula (*) Sin reacción

En el tubo 2, la reacción con ninhidrina es poca, ya que la caseína posee muy pocos
grupos aminos libres para que reaccionen (esto por ser una proteína entera). En este caso, el
resultado fue una opalescencia amarilla bastante poco perceptible, considerándose en términos
prácticos como nula con respecto a nuestro resultado esperado y observado en el tubo 1,
donde la reacción fue fácilmente observable e identificable como un violeta intenso, dando
positiva la reacción de la ninhidrina con los grupos aminos de los aminoácidos libres.

2. Reconocimiento de proteínas por reacciones de precipitación por desnaturalización


por calor y por ácido tricloroacético.

Componentes Tubo1 Tubo2 Tubo3 Tubo4


Muestra 0.5 ml - 0.5 ml -
proteica
Agua destilada - 0.5 ml - 0.5 ml
TCA 10% - - 0.5 ml 0.5 ml
Resultados No hay No hay Se forma un No hay
reacción (*) reacción precipitado reacción
blanco

En el tubo 1 es posible evidenciar un leve precipitado, bastante poco perceptible a


simple vista, y siendo posible su identificación (de manera sencilla) a través de un fondo oscuro
de contraste. Sin embargo, con el resultado no sólo el esperado, sino que logrado, que fue el
del tubo 3, se da a entender cuál es el tipo de resultado esperable, y por tal, es que
descartamos la reacción del tubo 1 como válida debido a su poca reacción.

3. Determinación del punto isoeléctrico (pI) de la caseína.

En las reacciones de los tubos de ensayo, tanto en los tubos 1, 2, 8 y 9 no se


evidenciaron precipitados. Tanto en los tubos 3 y 6 se observaron opalescencia, lo que indicaba
su poco precipitado al aun estar suficientemente esparcidos en el medio para producir tal
opalescencia, mientras que en los tubos 4 y 5 se pudo observar, de mejor manera, un
precipitado blanco. Esto se explica pues, el punto isoeléctrico de la caseína es de pH 4.6-4.7,
estando dentro de nuestro rango de pH experimental de pH 4.4 – 4.7
Componente Tubo1 Tubo2 Tubo3 Tubo4 Tubo5 Tubo6 Tubo7 Tubo8 Tubo9
s
pH de cada 3.5 3.8 4.1 4.4 4.7 5.0 5.3 5.6 5.9
tubo
Agua 6.8 5 5 5 5 5 5 5 5
destilada (ml)
Ácido acético 3.2 - - - - - - - -
1M (ml)
Vol. Solución 5 5 5 5 5 5 5 5 5
a agregar al 5 ml
tubo siguiente
(ml)
Resultados o o (+) + + + + + o o
inmediatos
Resultados a o o (+) + x x + (x) + o o
los 15
minutos

Símbolos: o = no cambia + = opalescencia x = precipitado

En las reacciones de los tubos de ensayo, tanto en los tubos 1, 2, 8 y 9 no se


evidenciaron precipitados. Tanto en los tubos 3 y 6 se observaron opalescencia, lo que indicaba
su poco precipitado al aun estar suficientemente esparcidos en el medio para producir tal
opalescencia, mientras que en los tubos 4 y 5 se pudo observar, de mejor manera, un
precipitado blanco. Esto se explica pues, el punto isoeléctrico de la caseína es de pH 4.6-4.7,
estando dentro de nuestro rango de pH experimental de pH 4.4 – 4.7

Discusión//

Experimento n°1:

El único problema que se nos presentó, se refiere al resultado del tubo 2


(Ninhidrina + Caseína), si bien sabíamos que esa reacción es especifica para aminoácidos
libres, nosotros esperábamos que se formara un complejo coloreado pero en menor cantidad
por interacción de la Ninhidrina con los grupos Amino libre de las cadenas laterales de la
Caseína, la experimentación mostró lo contrario, lo que reafirma el carácter específico de la
reacción para reconocimiento solo de aminoácidos libres.

Experimento n°2:

La desnaturalización por TCA y calor (por hervido de


agua) sobre BSA sería observable sólo a través de al formación
de un precipitado señal de pérdida de solubilidad de la proteína
por alteración de la estructura 2° y 3°. Los resultados no se adecuaron a lo esperado, la T° no
ejerció efecto Denaturante en BSA; la explicación más probable se refiere a la estructura
característica de la proteína y a que el tiempo y la T° aplicada no fueron adecuados para lograr
el efecto esperado, ya que este debe ser aplicado por mucho tiempo para conseguir tal efecto.

Experimento n°3:

El punto isoeléctrico de una proteína corresponde al


pH en el cual, al ser sometida a un campo eléctrico, no migra
hacia ningún electrodo. Esto ocurre por que los grupos
ionizables que posee se encuentran en un estado de
ionización en el cual la suma de sus cargas equivale a cero.
Es decir, la proteína posee carga neta neutra.
La caseína es una fosfoproteína presente en la leche.
Más que una sola proteína, con este nombre se designa un
grupo de proteínas, la α-caseína, la β-caseína, la ℘-caseína
y la caseína D. Por poseer grupos fosfato, tiene carácter
ácido, por lo que su punto isoeléctrico esta bajo pH 7.
Las cadenas laterales de los residuos aminoacídicos de las proteínas estabilizan
mediante interacciones iónicas, puentes de hidrógeno, entre otros enlaces débiles, su
estructura tridimensional. El pH determina la carga de estos grupos, al igual que las
interacciones entre moléculas proteicas y el agua (solvatación). Por lo tanto, en ciertos casos,
como el de la caseína, al hallarse en su punto isoeléctrico, la proteína no pude formar puentes
de hidrógeno con las moléculas de agua, disminuyendo su solubilidad y tiende a formar
precipitados. Por ende la caseína en una solución de pH equivalente a su PI, va a
precipitar, y de acuerdo al grado de turbidez de la solución, se puede determinar este
punto experimentalmente.
Este principio fue el utilizado en esta experiencia, mediante la cual logramos observar
que los tubos nº4 (pH4,4) y nº5 (pH4.7) presentaban precipitación. Por esto podemos decir
que el PI de la caseína se encuentra entre estos valores de pH. Luego de una pequeña
investigación, pudimos averiguar los puntos isoeléctricos de cada tipo de caseína, los cuales
son (pH):
• α-caseína4.6
• β-caseína5
• ℘-caseína5.8 – 6
Dado lo anterior, podemos decir que la solución con la que trabajamos era de α- caseína.
Conclusión //

La reacción de desaminación oxidativa y formación de complejo coloreado entre la


ninhidrina y los grupo amino de los aminoácidos nos permite su eficaz detección. La reacción es
negativa para proteínas, ya que la poca cantidad de grupos amino libres es escasa y el
complejo no se alcanza a ver a simple vista. El calor acelera la formación del complejo
coloreado por la reacción entre la Ninhidrina y los aminoácidos libres.

Las proteínas son susceptibles a la acción de agentes denaturantes, como el calor o un


ácido fuerte, por la desestabilización de las interacciones entre las cadenas laterales de sus
residuos aminoácidos. Sin embargo, condiciones como el tiempo de exposición al agente,
temperatura, grado de acidez, entre otras variables, deben ser controladas para lograr tal
objetivo. Además de esto cabe considerar que las proteínas difieren entre sí respecto de las
condiciones que provocarán su desnaturalización, ya que poseen diversas composiciones y
proporciones de aminoácidos (por lo tanto reaccionan de distinta forma a cambios del medio,
pH por ejemplo). En el caso de la BSA, empleada en el experimento nº2, su alta masa relativa
(75000) probablemente hubiese requerido más tiempo del empleado (3 minutos) en la
aplicación de calor para tener resultados más notorios.

Proteínas como la caseína (fosfoproteína) poseen la particularidad de precipitar al


encontrarse en un medio con su pH isoeléctrico. Esto se da debido a la disminución de
interacciones entre sus residuos aminoacídicos entre sí, y con sus grupos fosfato, lo que
produce desestabilización de uniones como puentes hidrógeno, puentes salinos, etc. Como
consecuencia de esto las moléculas proteicas tienden a aglomerarse formando precipitados.
Mediante la observación de soluciones de caseína con valores predeterminados de pH,
pudimos observar la formación de precipitados y determinar el punto isoeléctrico de esta
molécula.

Bibliografía//

LEHNINGER, Albert L. y otros; “Principios de Bioquímica”; Barcelona, 1995; Editorial Omega,


S.A.

STRYER, Lubert y otros; “Bioquímica”; Barcelona, 2002; Editorial Reverté, S.A.;


GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS, Carrera de Medicina 2007 Universidad Católica de la
Santísima Concepción. Dr. Reginaldo del Pozo, Ph.D.; BQ Javier Grandón, BQ Mirna Muñoz,
M.Sc.; QA German Rotter.

http://es.wikipedia.org/wiki/Case%C3%ADna