1

APOSTILA CURSO DE MICOLOGIA MDICA

1.- Introduo Identificao dos fungos Generalidades Os fungos so organismos eucariticos, desprovidos de clorofila e de celulose, uni ou pluricelulares sem a capacidade de formar tecido, imveis na sua maioria. Cada clula pode gerar, por si s, um novo organismo da mesma espcie. So considerados os principais biodegradradores de matria orgnica de nosso planeta. As clulas fngicas apresentam morfologia varivel, mostrando grande diferena em tamanho, estrutura e atividade metablica, formando diferentes tipos de colnias quando cultivados em meios apropriados, estruturas de frutificao complexas e/ou elaborados mecanismos de propagao e disperso.

REINO EUMYCOTA
(De Hoog et al 2000)
Divises

Zygomycota

Chytridiomycota

Ascomycota

Basidiomycota

REINO PROTOZOA: Rhinosporidium seeberi REINO CHROMISTA: Pythium insidiosum

Os fungos so organismos distintos das bactrias em tamanho, estrutura celular e composio qumica. Os fungos so eucariontes isto possuem ncleos envolvidos por membrana prpria, heterotrficos, com nutrio de absoro, uni ou pluricelulares, com parede formada de polissacardeo incluindo glucanas, mananas, quitina bem como glicoprotenas, sem celulose. A composio desses compostos varivel e depende da posio sistemtica dos fungos, ergosterol o principal componente da membrana fngica. A clula fngica constituda pelos componentes encontrados em outros organismos eucariticos. As organelas citoplasmticas e incluses so: mitocndrias, vacolos, vesculas, retculo endoplasmtico, microtbulos, ribossomos e cristais de glicognio. Os tpicos aparelhos de Golgi iro estar sempre presentes. Quase todos os fungos so aerbios e todos necessitam matria elaborada para sua alimentao (heterotrficos). Os fungos no ingerem seu alimento, mas possuem nutrio de absoro e parasitam seres vivos ou atacando matria morta como saprbios, parasitas, simbiontes ou patgenos. Os fungos se desenvolvem em meios de cultivos especiais, formam colnias que so classificadas em dois tipos principais, leveduriformes e filamentosas, que se diferenciam pela macromorfologia e micromorfologia. As colnias de leveduras so, em geral, de consistncia cremosa de cor branca a creme, brilhantes ou opacas podendo apresentar s vezes colorao escura ou alaranjada. As leveduras produzem clulas simples, arredondadas, ovais ou alongadas que se reproduzem quase sempre por brotamento, geralmente na posio polar chamadas de blastocondio. Algumas leveduras podem produzir, brotos simultaneamente em vrios pontos. Os brotamentos ou clulas filhas so liberados da clula me, formando clulas independentes ou continuar unidos formando clulas alongadas chamadas de pseudohifas que se diferenciam das hifas verdadeiras por apresentarem constrio nos septos. Alm dos blastocondios as leveduras podem apresentar artrocondios, pseudohifas e clamidocondios tpicos. As colnias de fungos filamentosos podem ser granulares, cotonosas, aveludadas, pulverulentas, membranosas. O seu talo consiste de hifas que podem ser contnuas ou

interrompidas em intervalos irregulares por septos (septada) que dividem as hifas em clulas. Um conjunto de hifas forma o miclio que pode ser vegetativo ou reprodutivo. O miclio vegetativo penetra no meio de cultivo, para absorver substncias nutritivas para o fungo. O miclio vegetativo o que fica na parte superior do meio e produz as estruturas de reproduo tpicas para cada grupo de fungos. Os fungos sexuados se reproduzem por esporos que podem ser formados internamente (ascoporas) ou externamente (basidiosporas). Os fungos sexuados tambm se reproduzem assexuadamente. Na reproduo assexuada, as estruturas de reproduo tomam nomes variados de acordo com o grupo a que pertencem os fungos. Condios so estruturas assexuadas de reproduo encontradas entre os fungos filamentosos. Podem apresentar tamanhos, formao, cores e septos diferentes (macrocondios, microcondios, amerocondios, didimocondios, fragmocondios, dictiocondios, etc.). As hifas que sustentam os condios so denominadas de conidiforos e as clulas que do origem aos condios conidiognicas. Os condios podem ser claros ou hialinos hialocondios ou pigmentados e escuros - feocondios. Entre os fungos de hifas no septadas, as hifas areas produzem esporos assexuados (esporangiosporos) dentro de estruturas chamadas esporngios. As hifas que sustentam os esporngios so conhecidas como esporangiforos. Columela uma invaginao estril do esporangiforo na rea frtil do esporngio.

2.- Coleta de Material Biolgico A coleta de material biolgico a primeira etapa no processo de identificao dos fungos. Quando realizada incorretamente, dificulta a observao, isolamento e identificao do agente causal da doena. O primeiro passo consiste em obter os dados do paciente: nome, idade, RG, procedncia, endereo, telefone para contato, entre outros; dados epidemiolgicos: profisso, contato com animais, doena associada, estado imunolgico, etc; informaes clnicas: local anatmico acometido, aspecto da leso, suspeita clnica, antibioticoterapia prvia, evoluo e dados do mdico responsvel. O procedimento de coleta varia segundo a regio acometida, suspeita clnica e tipo de material biolgico. A quantidade de amostra coletada deve ser suficiente para permitir o procedimento de identificao laboratorial do fungo: como exame microscpico direto e cultivos em vrios meios, com eventuais repeties desses exames para confirmao dos achados laboratoriais. Procedimento da coleta Para efeitos prticos, a coleta de material biolgico, depende da localizao e do tipo da micose. Amostras de micoses superficiais e cutneas Tambm denominadas dermatomicoses acometem: pele, plo, unhas, provocando algumas delas alteraes somente de importncia esttica. A.- Amostras de pele. A prvia desinfeco da leso com algodo embebido em lcool 70% diminui a biota bacteriana, aumentando a sensibilidade do exame micolgico.

Raspar a leso com bisturi, cureta esterilizada ou com lminas de vidro previamente flambadas. Nas leses sugestivas de dermatofitose, a coleta deve ser feita nas bordas da leso, j que este o sitio ativo da infeco. Quando o raspado da leso no pode ser realizado, pode-se optar por mtodos tais como o de Porto (s para pitirase versicolor) que consiste em utilizar uma fita adesiva transparente (Durex) que pressionada sobre a leso, removida e fixada sobre uma lmina ou a utilizao de um tapetinho estril de aproximadamente 4 cm que e pressionado sobre a leso, embrulhado e transportado ao laboratrio (Mariat & Tapia, 1966). As desvantagens so a falta do cultivo ao empregar a tcnica de Porto e do exame direto, quando se usa o tapetinho. B.- Amostras de unha. A leso pode-se localizar na regio subungueal distal, proximal ou lmina superficial da unha. A tomada amostra depender do tipo de leso. Deve-se remover a presena de esmalte antes da coleta. Na onicomicose superficial branca, raspa-se as reas esbranquiadas da parte superficial com o auxilio de bisturi estril. No acometimento sub-ungueal, deve-se raspar profundamente a rea infectada desde a poro distal proximal. Os primeiros detritos coletados da poro distal devero ser eliminados j que so ricos em contaminantes. As escamas obtidas da poro profunda da leso podero ser usadas para o exame micolgico. Quando as unhas so distrficas, pode-se auxiliar a coleta com tesouras limpas e desinfetadas. C.- Amostras de cabelo e plo. Nos casos de piedras cortam-se com tesoura os cabelos ou plos apresentando ndulos fngicos (observados com auxilio de lupa). Nas tinhas do couro cabeludo e da barba, as amostras podem incluir escamas da pele e os plos ou cabelos alterados. Os cabelos opacos e engrossados so facilmente arrancados, a partir das bordas das placas alopcicas com ajuda de uma pina limpa e flambada.

Os plos, escamas de pele ou de unhas, podem ser colhidos e transportados entre duas lminas de vidro limpas, secas e flambadas, embrulhadas em papel, ou em placas esterilizadas, sempre com a identificao da amostra. D.- Amostras oculares. Material de conjuntiva colhida da mucosa, desde a poro proximal em direo a borda, com "swab" estril, embebido em soluo salina. O "swab" pode ser colocado num tubo estril, contendo meio semi-slido de transporte ou 0,5ml de soluo salina. Material ocular (crnea) colhido s por oftalmologistas, raspando as reas necrticas, ulceradas e supurativas da leso com esptula esterilizada. Esta amostra ser processada em lmina (exame microscpico direto) e semeada imediatamente nos meios de cultivo apropriados ou tubo estril contendo soluo salina. E.- Amostras ticas. Geralmente o material biolgico obtido a partir do conduto auditivo externo, com swab esterilizado umedecido previamente em soluo salina. E.- Mucosas. i- Mucosa oral. As amostras devem ser obtidas por raspado da superfcie epitelial acometida, empregando esptula ou bisturi rombo esterilizado. Na candidase oral em que se verificam placas esbranquiadas, o material pode ser colhido com swab estril, ou ala de platina, colocar em tubo esterilizado contendo soluo salina. ii- Mucosa nasal. O material nasal pode ser colhido com esptula, bisturi, ala ou swab. Nos casos de suspeita de aspergilose, feohifomicose, zigomicose ou rinosporidiose, recomenda-se coleta do material com procedimento cirrgico, como bipsia, etc.

iii- Mucosa vaginal. As amostras de fluxo vaginal se tomam sem asseio prvio da paciente, com swab, colocar em um tubo com soluo salina esterilizada. iv- Mucosa genital Masculina. A amostra pode ser colhida com swab da rea da glande que apresenta pontos esbranquiados ou pseudomembranas, ou do prepcio em onde podem ser encontradas, vesculas. v- Mucosa perianal. Pode apresentar leses esbranquiadas ou ulceradas de aspecto granulomatosos. As amostras so obtidas por raspado com bisturi rombo estril ou swab Micoses subcutanas A.- Leses sugestivas de Esporotricose. No caso de abscessos fechados a obteno de material purulento feita por puno, com seringa esterilizada ou por drenagem com prvia limpeza da zona implicada. Quando o abscesso drena espontaneamente, o material purulento deve ser colhido com esptula, ala ou swab e transferido a um tubo estril de tampa de rosca, com soluo salina. B.- Leses sugestivas de Micetoma. O material compreende pus que deve conter gros que podem ser visveis a olho nu. Quando difcil a coleta da amostra, recomenda-se colocar gaze sobre a superfcie lesada por 18 a 24 h o que permitir recuperar os gros para o estudo micolgico completo. C.- Leses sugestivas de Cromoblastomicose. Na superfcie cutnea lesada, observam-se geralmente pontos negros devido eliminao trans-epitelial do fungo. O material biolgico deve ser coletado a partir dos pontos enegrecidos da leso. Escamas e crostas com auxilio de bisturi e agulhas estreis, bipsias podem tambm ser obtidas.

D.- Leses sugestivas de Lobomicose ( Doena de Jorge Lobo). A amostra compreende material biolgico coletado por biopsia ou secreo das leses ulceradas colhidas com esptula, bisturi rombo, ala ou swab e transferido a um tubo estril contendo soluo salina. O exame microscpico direto e/ou anatomopatolgico confirmam o diagnstico de lobomicose. Cultura no obtida, at o presente. E.- Leses sugestivas de Rinospordiose O material biolgico deve ser colhido da superfcie de crescimento polipide. Exame microscpico direto e cortes de tecido corados confirmam o diagnstico. F.- Feohifomicose subcutnea Colher o material dos abscessos subcutneos por puno ou bipsia. Fazer exame microscpico direto, cultura e cortes sem colorao. G.- Zigomicose subcutnea Colher uma pequena poro do material por bipsia. Fazer preparaes, exame microscpico direto com KOH, antomo patolgico e cultura.

Amostras de micoses sistmicas A.- Trato respiratrio. i- Escarro. Amostras de escarro so coletadas aps prvia lavagem bucal preferentemente em jejum. O material dever conter escarro profundo, livre de saliva e ser colhido em frasco estril de boca larga. No caso dos pacientes que no expectoram facilmente, podem ser usadas nebulizao, com soluo salina hipertnica.

10

ii- Lavado brnquico. Procedimento realizado pelo mdico com broncoscpio. O material clnico colocado em frasco estril e enviado ao laboratrio. Aproximadamente 1 ml de escarro ou lavado brnquico, levado a um tubo cnico de centrifuga contendo 250 ul aproximadamente de KOH 20% mais tinta, sendo incubada por 12 h a 37C. O material biolgico centrifugado a 2500 rpm durante 10 minutos. A preparao microscpica realizada a partir do sedimento. B.- Bipsia. Devem ser obtidas amostras representativas da patologia suspeita. O material deve ser dividido em dois frascos estreis diferentes, um contendo formol ao 0.4% e outro contendo soluo salina, destinados ao exame histopatolgico e micolgico, respectivamente. C.- Medula ssea. um procedimento mdico que exige rigorosa assepsia. Podem ser obtidas 2-3 ml do material com seringa com heparina, que deve ser transportado imediatamente ao laboratrio micolgico.

D.- Lquido cefalorraqudiano (LCR) Para o estudo micolgico devem ser colhidos 5 a 10 ml de LCR, obtido por puno lombar, em condies de rigorosa assepsia. O LCR normalmente, livre de microrganismos. Qualquer agente observado deve ser considerado como um patgeno potencial. E.- Sangue Realizar assepsia do sitio escolhido para puncionar com lcool 70 % esperar 5 segundos e aplicar soluo de Iodo-povidine a 10%, coletar de 8 a 10 ml de sangue venoso (adultos) e de 1 a 3 ml (crianas), para cada frasco coletado. Terminada a puno retirar a

11

agulha trocando-a por uma nova, inocular o sangue no frasco enviando de imediato ao laboratrio. Nmero e intervalo das amostras: -Suspeita de septicemia: colher duas amostras de sangue de diferentes locais com intervalo de uma hora. -Febre de origem desconhecida: colher duas amostras com intervalo de uma hora. Se forem negativos, aps 24 a 36 h, colher as outras duas amostras com intervalo de 1 hora. F.-Urina A assepsia com gua e sabo da regio genital deve ser rigorosa pudendo aps lavar com povidine, enxugar com gua estril e secar com gaze estril. (sexo masculino retrair o prepcio e lavar a zona do glande e meato urinrio) Coletar 10 ml de urina do segundo jato urinrio (sexo feminino afastando os grandes lbios) em frasco esterilizado. Crianas: Fazer assepsia rigorosa dos genitais e regio perianal com gua e sabo, colocar o coletor urinrio adequado segundo sexo, uma vez obtida a amostra mandar o coletor fechado ao laboratrio. (o coletor dever ser trocado a cada 30-40 minutos caso a criana no tenha urinado) Paciente com sonda vesical de permanncia: Desprezar a urina remanescente na sonda vesical permitindo a descida desta para a bolsa coletora, pinar a sonda vesical 20 cm de distal a proximal logo que a urina fresca se acumule. Prvia assepsia com lcool 70 %, coletar 10 ml da amostra puncionando no lugar do dispositivo para coleta de urina, e depositar em tubo esterilizado adequadamente fechado e transportar ao laboratrio. (no caso da sonda urinria no apresentar dispositivo para coleta de urina recomendvel desligar a sonda vesical do sistema de drenagem e obter amostra de urina mediante gota a gota diretamente no frasco estril. Todo o procedimento dever ser realizado respeitando as normas de assepsia).

12

G.- Fezes. Aproximadamente 20g de fezes recm emitidas devem ser coletadas em frasco esterilizado e enviadas rapidamente ao laboratrio. Para cultivo de vigilncia, utiliza-se swab anal. H.- Outros lquidos corporais. Todos os lquidos corpreos so obtidos por aspiraes percutnea ou drenagem, empregando procedimentos invasivos praticados pelo mdico. Deve ser coletado tanto lquido quanto seja possvel 2 a 10 ml ou mais, pois as concentraes dos microrganismos podem ser muito baixas e coletadas em recipientes com tampa rosca contendo heparina 1:1000. Todas as amostras de material clnico devem ser colhidas adequadamente, em condies ideais e transportadas rapidamente ao laboratrio, com a solicitao do tipo de exame, suspeita clnica, dados clnicos e epidemiolgicos do paciente, para processamento micolgico imediato. 3.- Exame Microscpico Direto e Cultura O exame microscpico direto de material clnico um dos procedimentos mais simples e teis para o diagnstico laboratorial de infeces fngicas. Vrios clarificadores podem ser usados, sendo KOH a 10 ou 20% o mais empregado. A observao de elementos fngicos em escamas de pele, plos ou unhas pode proporcionar uma clara indicao do tipo de micoses envolvida: dermatofitose, candidase ou pitirase versicolor. O exame microscpico direto de fluidos, bipsia ou outro material clnico pode tambm estabelecer o diagnstico de uma micose sistmica, orientando a etiologia da infeco como paracoccidioidomicose, histoplasmose, zigomicose, hialohifomicose, feohifomicose entre outras.

13

Tcnica: Colocar parte do material biolgico a ser estudado sobre lmina limpa, adicionar uma a duas gotas de KOH a 20%, cobrir com lamnula e flambar ligeiramente. As lminas previamente marcadas sero colocadas em cmara mida, overnight a 4 C e posteriormente se realizar a segunda observao microscpica. Nunca se deve pressionar a lamnula com os dedos, uma vez que os cidos graxos naturais da pele dificultam a observao. Quando a amostra muito espessa aconselhvel pressionar a lamnula com uma pina ou outro objeto. O fungo pode ser ento liberado do material biolgico, o que permite sua visualizao. A adio de tinta Parker (Quink) azul permanente ou tinta Scheaffer 22 ao KOH, permite melhor visualizao e contraste dos fungos em especial das clulas de Malassezia furfur que se tingem mais intensamente do que outras estruturas fngicas. Outras substncias tais como goma de Berlesse, DMSO e Chloroblack E podem ser empregadas na visualizao do fungo a partir do material biolgico. Para verificao da presena de cpsula, devem-se fazer preparaes do material clnico com tinta da China, diluda 1:1 em gua destilada ou salina esterilizada.

Cultura dos Fungos: Os fungos preferencialmente se desenvolvem temperatura de 25C, sendo seu crescimento mais lento que o das bactrias. Por isto h necessidade de acrescentar inibidores bacterianos aos meios de cultura ao trabalhar com material biolgico contaminado. Entre os antibiticos cloranfenicol 50 a 300 mg/l empregado para inibir o desenvolvimento de bactrias. Para inibir o crescimento de determinados fungos contaminantes do ar que tm desenvolvimento rpido deve-se usar cicloheximida. Fungos filamentosos crescem melhor entre 24 e 28C e os leveduriformes entre 24 e 37C, em pH de 6,6 a 7,2. Existe um grupo de fungos que apresenta dimorfismo trmico: uma fase saproftica ou filamentosa temperatura (24-28C) e uma fase parasitria ou leveduriforme a 37C. So os fungos dimrficos: S. schenckii, H. capsulatum, P. brasiliensis, B. dermatitidis. C. possadasii, Penicillium marneffei.

14

Tcnica: A semeadura est na dependncia do tipo de amostra e da suspeita clnica. Plos, escamas de pele ou de unhas, sero semeadas em 6 a 8 picadas com ala em L sobre gar inclinado em tubo. Fluidos biolgicos como LCR, lavado brnquico, etc., sero centrifugados a 3000 rpm. por 5 minutos e semeados com pipeta Pasteur estril ou pipeta graduada sobre gar inclinado. Material de biopsia deve ser fragmentado e semeado fazendo picadas na superfcie do gar. Amostras de hemoculturas sero semeadas acrescentando 0,5 ml do caldo na superfcie do meio. A adequada coleta e transporte de material biolgico so essenciais para se obter o diagnstico micolgico preciso.

15

LISTA DE MATERIAL BIOLGICO, EXAMENS MICROSCPICOS DIRETOS E MEIOS DE CULTURA PARA O DIAGNSTICO LABORATORIAL DAS MICOSES Micoses Pitiriase Versicolor Tinha negra Amostra clnica Escamas de Pele Agentes etiolgicos Clulas leveduriformes esfricas gar bile de boi Malassezia furfur ovaladas com ou sem brotamento adicionado de azeite de e filamentos curtos septados. oliva Sabouraud-dextrose Hortae werneckii gar**; Lactrimel gar** Sabouraud-dextrose Piedraia hortae gar**. Sabouraud-dextrose Trichosporon spp gar**; Lactrimel gar** Exame Microscpico Direto Meio de Cultura Te tempo de incubao 37C durante 7 dias 25C durante 20 dias 25C durante 30 dias. 25C durante 7 dias

Hifas escuras septadas, irregulares. Piedra negra Cabelo Ndulos marron - escuros, formados por artrocondios escuros; ascos com 2 a 8 ascosporos tpicos Piedra branca Plos regio Ndulos claros, formados por genitais, axilares, artroconids claros e blastocon. etc. Dermatofitose Cabelo com raz Artrocondios refringentes do couro ectothrix, endothrix ou cabeludo ectoendothrix. Parasitismo fvico Dermatofitose da pele. Escamas e plos Hifas septadas, ramificadas.

Escamas de Pele

Sabouraud-dextrose Microsporum spp, 25C durante gar**; Lactrimel Trichophyton spp. 15 a 30 dias gar**. Mycosel 25C durante 15 a 30 dias 25C durante 15 a 30 dias

Sabouraud-dextrose Epidermophyton gar*; Lactrimel gar**. spp, Microsporum Mycosel spp, Trichophyton spp. Onicomicose Escamas lmina Hifas septadas com artrocondios Sabouraud-dextrose Trichophyton spp. borda livre interna da unha retangulares ou esfricos. gar*; Lactrimel gar**. espessa. (raramente lmina Mycosel externa)

16

Onicomicose borda Escamas lmina livre fina e de borda interna da unha e periungueal do arco (candidase) periungueal Cromomicose Crostas, secreo ou pus.

Clulas leveduriformes e/ou Sabouraud-dextrose Candida albicans, 25C durante 7 pseudohifas gar**; Lactrimel Candida spp. a 15 dias gar** Estruturas globosas de cor marrom, de parede grossa, septada em dois planos (corpos esclerticos) ou talo moriforme. Leveduras alongadas como charuto, o observadas raramente. Grnulos parasitrios formados por aglomerao de hifas claras ou escuras Sabouraud-dextrose Phialophora gar**; Lactrimel Cladosporium gar** Rhinocladiella Fonsecaea spp. Sabouraud-dextrose gar**; Lactrimel gar**. Sabouraud-dextrose gar**; Lactrimel gar**. spp, 25C durante spp, 20 dias spp.

Esporotricose Eumicetoma

Secreo ou pus Secreo ou pus

Rinosporidiose Lobomicose

Descarga nasal ou tecido do plipo Material de leso queloides e tumores Secreo ou pus

Feohifomicose

Zigomicose

Ndulos

Esfrulas at 350 paredes espessas em diversos graus de maturao Clulas leveduriformes Glenosporella loboi, tamanho uniforme 9-10 um. Loboa loboi, P. loboi Uma ponte tubular une uma clula a outra Hifas escuras septadas, Sabouraud-dextrose Phialophora spp, 25C durante elementos leveduriformes, gar**; Lactrimel Cladosporium spp., 20 dias sem corpos esclerticos gar** Fonsecaea spp., Wangiella spp. Hifas largas no septadas Sabouraud-dextrose Conidiobolus

25C e 37 C durante 20 dias Madurella spp (gros 25C durante escuros), 20 dias Pseudallescheria boydii (gros claros), Acremonium spp, P. romeroi Rhinosporidium seeberi Sporothrix schenckii

17

subcutnea Paracoccidioido micose

subcutneos Escarro, pus, raspado de mucosa, etc.

com reao (corte)

Histoplasmose

Escarro, raspado das leses.

Criptococose

L.C.R., escarro, pus, etc

coronatus, Basidiobolus haptosporus Clulas esfricas de tamanho Sabouraud-dextrose Paracoccidioides varivel de membranas gar*; Lactrimel brasiliensis duplas com um ou muitos gar** brotamentos, clulas esfericas isoladas, clulas caten., Clulas caliciformes. Clulas leveduriformes Sabourad-dextrose Histoplasma pequenas 2-3 m, esfricas gar*;Lactrimel capsulatum ou ovaladas no interior de gar, macrfagos ou mononucleares (colorao com Giemsa). Clulas leveduriformes Sabouraud-dextrose Cryptococcus esfricas com cpsula grande gar*; Lactrimel neoformans (em observao com tinta da gar**. China)

eosinoflica gar*;

25C e 37C durante 30 dias

25C e 37C durante 30 dias

37C durante 15 dias

Candidase

Raspado mucosa, Clulas leveduriformes ou Sabouraud-dextrose biopsia, escarro, pseudohifas gar*; Lactrimel etc. gar**. Otomicose Pseudomembran Filamentos com ou sem Sabouraud-dextrose a com pontos de cabeas aspergilares ou gar**; Lactrimel cores ou massa clulas leveduriformes e gar**. em migalha de pseudohifas po * Meio adicionado de Cicloheximida e cloranfenicol.; ** Meio adicionado de cloranfenicol

Candida albicans, 37C durante Candida spp. 15 dias Aspergillus niger, A. 25C durante Fumigatus, Aspergillus 15 dias spp, Candida albicans, etc..

18

Micologia mdica, micoses e seus agentes Em micologia mdica, as micoses so divididas para seu estudo em:

MICOSES SUPERFICIAIS:
PITIRIASES VERSICOLOR TINHA NEGRA PIEDRA NEGRA PIEDRA BRANCA

MICOSES CUTNEAS: DERMATOFITOSE S CANDIDIASES

MICOSES SUBCUTNEAS: ESPOROTRICOSE CROMOBLASTOMICOSE MICETOMAS RINOSPORIDIOSE ENTOMOFTOROMICOSE MICOSE DO JORGE LOBO

MICOSES SISTMICAS: PARACOCCIDIOIDOMICOSE BLASTOMICOSE HISTOPLASMOSE COCCIDIOIDOMICOSE

MICOSES OPORTUNSTICAS: ZIGOMICOSES HIALOHIFOMICOSE FEOHIFOMICOSE CANDIDIASE CRIPTOCOCOSE ASPERGILOSE PNEUMOCISTOSE LEVEDUROSES

Micoses superficiais Os agentes de micoses superficiais, formam um grupo heterogneo de fungos que no sensibilizam o indivduo, no provocam reaes alrgicas a distancia como os agentes de micoses cutneas. Malassezia furfur, Hortae werneckii, Trichosporon spp., Piedraia hortae so os fungos envolvidos nessas micoses.

19

Malassezia furfur - Agente da pitriase versicolor, afeco cutnea assintomtica que se caracteriza por placas descamativas de diferentes cores: castanho-avermelhadas, marrons ou brancas. O papel do fungo em doenas de natureza seborreica como psorase, dermatite seborreica, foliculite discutvel. M. furfur tem sido isolada tambm de infeces sistmicas, principalmente em neonatos. Hortae werneckii - agente da tinha negra, leso que se caracteriza pela formao de mancha pouca descamativas de colorao castanha a preta, principalmente nas palmas das mos. Essas leses vo aumentando de tamanho, durante meses ou anos. Trichosporon spp - causa piedra branca, que consiste em ndulos castanho-claros e macios em torno de plos da regio genital, axilar e do couro cabeludo. Os ndulos so menos aderentes que os da piedra negra. Nos pacientes com imunodeficincia, pode ocorrer invaso do sangue, dos rins, dos pulmes e da pele. Piedraia hortae - produz piedra negra, que consiste em ndulos duros, pretos e firmes em torno dos cabelos. Micoses cutneas Agrupam as dermatofitoses e as candidase cutneas. Os agentes das micoses cutneas atacam a epidermes e as camadas mais profundas da crnea, chegando a produzir granulomas, se localizando na pele, plos, unhas e mucosas. Os dermatfitos so fungos relacionados entre si que invadem a queratina morta. Pertencem aos gneros Microsporum, Epidermophyton e Trichophyton. As espcies geoflicas vivem principalmente no solo; as zooflicas, em animais; as antropoflicas, nos seres humanos. Esses fungos infectam locais especficos do corpo, que servem de base para o diagnstico clnico. A localizao da dermatofitose pode ajudar na identificao preliminar do fungo.

20

AGENTE Microsporum Epidermophyton T.mentagrophytes T.rubrum T. verrucosum T.tonsurans T.shoenleinii T.violaceum

PELE + + + + + + + +

UNHAS +(raro) + + + + + +

PLO INVASO ECTTRICA + + + (raro) + -

PLO INVASO ENDTRICA + + +

Microsporum canis - causa dermatofitose do corpo e do couro cabeludo, geralmente encontrado em crianas adquirido de animais infectados como ces e gatos. Microsporum gypseum - causa dermatofitose inflamatria do corpo ou do couro cabeludo, contrado por contato com solo contaminado. Epidermophyton floccosum - dermatofitose epidmica (p de atleta) em locais de veraneio, bem como dematofitose inguinal. Trichophyton rubrum - dermatofitose do corpo, dos ps, da virilha e das unhas. Em paciente imunodeprimidos, pode causar ndulos ou abscessos subcutneos. Trichophyton mentagrophytes - dermatofitose inflamatria nos ps, no corpo, nas unhas, na barba e no couro cabeludo. causa comum de p de atleta, apresenta as variedades granular e cotonosa. Trichophyton tonsurans - causa tinha do couro cabeludo, tinha capilar com pontos pretos e s vezes dermatofitose do corpo, dos ps e das unhas. Trichophyton verrucosum - dermatofitose do couro cabeludo, da barba ou do corpo, geralmente adquirida por contato com o gado infectado.

21

Trichophyton shoenleinii: dermatofitose do couro cabeludo chamado FAVO (tinha favosa) com alopcia definitiva, raramente, dermatofitose do corpo ou das unhas. Candidases So causadas primordialmente por C. albicans, embora outras espcies de Candida estejam se tornando cada vez mais importantes como agentes etiolgicos. A C. albicans existe como normal no trato gastrointestinal, na rea vulvovaginal, na pele e fezes. Em casos de comprometimento imunolgico e conseqente queda da resistncia causados por AIDS, neoplasias, lpus eritematoso, tuberculose ou terapias com esterides ou agentes citotxicos, as leveduras podem proliferar e causar auto-infeces. As candidases atingem principalmente as mucosas, exemplo candidase oral. broncopulmonar, vulvovaginal; candidase mucocutnea crnica, cutnea, ungueal, etc. so algumas das manifestaes que podem ocorrer. Micoses subcutneas Os agentes de micoses subcutneas, tem habitat no solo. Podem ocorrer micoses subcutneas quando h traumatismo por espinhos ou outro tipo de vegetao ou materiais contaminados por fungos. Os organismos alojam-se na pele e passam a produzir infeco localizada na pele e no tecido subcutneo e s vezes nos linfonodos da regio. Raramente a infeco se se dissemina. As leses subcutneas caracterizam-se pela cronicidade de reas duras, nodulosas, crostosas e ulceradas. Que no cicatrizam e periodicamente produzem exsudao. Os membros inferiores, sobretudo os ps, so muitas vezes comprometidos, visto que seu contato com espinhos e outros vegetais mais freqente. Esporotricose Esta infeco decorre de ferimentos cutneos provocados por materiais contaminados, como espinhos de flores, gravetos, madeira, etc. Produz leses ulcerativas subcutneas, nos membros, que podem avanar ao longo dos vasos linfticos. A esporotricose pulmonar est sendo observada com mais freqncia, deve ser distinguida da tuberculose, coccidioidomicose, histoplasmose e sarcoidose. O agente etiolgico Sporothrix schenckii, fungo dimrfico.

22

Cromoblastomicose As leses produzidas evoluem com grande lentido torna-se, vo-se formando muitas protuberncias sobrepostas, o que cria a aparncia de couve-flor. Geralmente, a erupo seca, mas pode ulcerar-se. Na suas camadas mais profundas, encontram-se corpos esclerticos. Os principais agentes envolvidos: F. pedrosoi, F. compacta, P. verrucosa, C. carrionii, Rhinocadiella aquaspersa. Micetomas O micetoma geralmente se restringe aos ps, mas pode ser visto em outras regies como mos e ndegas. Os ndulos, que periodicamente exsudam um lquido oleoso contem gros que podem ser brancos, amarelos, vermelhos ou pretos. Aos poucos as leses comprometem toda a perna. A infeco causada pelos fungos superiores (micetoma eumictico) produz leses fistulosas, com pouca dor ou destruio ssea, enquanto a causada por bactrias fungiformes (micetoma actinomictico) apresenta leses tumorosas cnicas semelhantes s erupes de acne, com grande exsudao e comprometimento sseo com dor. Principais agentes de micetoma eumictico: Scedosporium apiospermum, Acremonium falciforme, Acremonium recifei, Exophiala jeanselmei, Madurella mycetomatis, Madurella grisea. Principais agentes de micetoma actinomictico: Nocardia asteroides, Nocardia brasiliensis, Nocardia otitidiscavarium, Actinomadura madurae, Actinomadura pelletierii, Streptomyces somaliensis, Actinomyces israelii e Actinomyces bovis. Rinosporidiose doena que se caracteriza pela formao de granuloma vegetante, poliposo, com sede predominantemente nasal ou ocular. (conjuntiva palpebral, conjuntiva bulbar e saco lacrimal). J foram verificados casos de localizao vaginal, retal e peniana, assim como no conduto auditivo externo. Agente etiolgico Rhinosporidium seeberi que no tem sido cultivado. Entomoftoromicose ou zigomicose subcutnea Granuloma eosinofilico causados por zigomicetos que invadem primariamente a gordura do tecido celular subcutneo.

23

comum em crianas, traduzindo-se pelo aparecimento de um ndulo subcutneo que aumenta em volume, provocando intumescimento extensivo, progressivo e lento. Geralmente o paciente no apresenta imunodepresso Agentes envolvidos pertencentes aos gneros Conidiobolus e Basidiobolus. Doena de Jorge Lobo dermatose que provoca leses tipo quelides com ausncia de comprometimento visceral, ausncia de adenopatia satlite, longa evoluo do processo. Nem sempre as leses cutneas assumem aspecto puramente queloidiano ao lado e leses papulosas, nodulares, verrucosas, e tuberosas podem ocorrer. Agente etiolgico, Lacazia loboi (Loboa loboi) ainda no cultivado.

Micoses sistmicas Os fungos que causam micoses sistmicas vivem em forma saprbia no solo. Alguns animais de vida silvestre so reservatrios importantes. Os indivduos podem desenvolver a doena principalmente por inalao de propgulos. Todos os agentes de micoses profundas apresentam dimorfismo trmico. Na natureza e nos cultivos a 25C, formam colnias filamentosas com reproduo assexuada. Nos tecidos e cultivos a 37C eles apresentam sua forma leveduriforme. Estes fungos so taxonomicamente heterogneos: Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis, Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis. Histoplasma capsulatum agente de infeco relacionada a indivduos que visitam grutas ou lugares com morcegos. 90-95% dos casos so assintomticos ou subclnicos e os sintomas respiratrios gripais se resolvem espontaneamente. Esporadicamente algum paciente pode apresentar uma forma pulmonar aguda da doena, com suores noturnos, tosse, febre e emagrecimento. fulminante em pacientes com imunodeficincia. Paracococcidioides brasiliensis a infeco geralmente se caracteriza por leses pulmonares semelhantes s da tuberculose e de outras micoses. Leses nas mucosas nasais, oral, pele e outros rgos podem ocorrer.

24

Blastomyces dermatitidis O microrganismo ao ser inalado, produz infeco respiratria crnica e branda, que piora gradualmente, ao longo de semanas ou meses. Escarro torna-se purulento, sanguinolento. A fase respiratria da doena tem semelhanas com tuberculose, coccidioidomicose, paracoccidioidomicose e histoplasmose. Pode provocar leses subcutneas, sseas, etc. Coccidioides immitis Por inalao dos condios aps 14 dias, 60% dos pacientes apresentam infeco respiratria assintomtica. O restante 40% apresenta sintomas da doena respiratria gripal leve ou raramente grave. Complicaes pulmonares, na forma de cavidades ou de pneumonia ocorrem em 5%. Pode ocorrer disseminao por via hematognica dos pulmes para os ossos, as articulaes, a pele, os tecidos subcutneos, etc. Micoses oportunsticas A maioria dos fungos que produzem micoses oportunsticas so saprfitos do meio ambiente, de crescimento rpido, normalmente inalado. Esses organismos geralmente no so patognicos, mais atuam como patgenos oportunistas. O indivduo que apresenta algum tipo de depresso imunitria em decorrncia de doena ou em especial, do uso de medicamentos imunossupressores, antibioticoterapia por longo tempo, pode ser alvo de infeces oportunsticas. Zigomicose infeco fngica aguda causada por fungos da diviso Zigomycota, os esporos desses fungos podem infectar os seios paranasais e a rea peri-orbital. A infeco rapidamente se dissemina para os vasos sanguneos vizinhos, causando necrose e trombose, vascular (CID). A partir da se difunde para o encfalo e para as meninges, produzindo meningoencefalte, rapidamente fatal. Essa doena pode se disseminar para os pulmes e para o tubo digestivo. Principais agentes envolvidos: Absidia sp., Apophysomyces sp., Mucor sp., Rhizopus sp., Saksenaea sp., Cunninghamella sp..

25

Feohifomicoses Infeces causadas por fungos demceos que apresentam hifas escuras nos tecidos. O nmero de agentes envolvidas , em geral, muito grande e tende a aumentar. Alternaria spp. produz quadros como ceratomicose, infeces cutneas, osteomielite, doenas pulmonares e infeco do septo nasal. Bipolaris spp. causam ceratomicose e sinusite fngica, abscessos subcutneos, meningite, alergias e peritonite. Cladosporium spp., Epicoccum spp. e Nigrospora spp. causa ceratomicose e alergias. Curvularia spp. causam ceratomicoses, micetoma, endocardite, infeco pulmonar, alergias e infeco do septo nasal. Exserohilum spp. sinusite fngica, embolia artica, lcera de crnea e meningite. Hialohifomicoses Infeco causada por fungos hialinos (hifas hialinas) Acremonium sp. - pode causar ceratomicose, leses do palato duro, meningite, artrite e doenas sistmicas. Aspergillus sp. - o Aspergillus fumigatus o patgeno oportunista mais comum do gnero. Aspergilose disseminada, doenas pulmonares, broncopneumonia alrgica, ceratomicose, otomicose e infeco dos seios paranasais. Fusarium spp. - causa mais comum de ceratomicoses, onicomicoses, otomicoses, lceras varicosas, micetoma, osteomielite. Tem sido identificado tambm em leses sistmicas em transplantados de medula ssea.

26

Paecilomyces spp. implicados em casos de peniciliose, endoftalmite, endocardite, derrame pleural e leses cutneas. Penicillium spp. causam ceratomicose, peniciliose, otomicose, onicomicose e, raramente, infeces profundas. Penicillium marnefei produz uma forma disseminada de peniciliose, o nico agente dimrfico do grupo. Scopulariopsis sp. ceratomicose, otomicose e onicomicose. Criptococose Em geral produz infeces pulmonares brandas muitas vezes subclnicas. Em pacientes sintomticos manifesta-se como tosse e febre, radiografias demonstra ndulos isolados ou mltiplos nos campos pulmonares mdio e inferior que podem calcificar. Muitos pacientes apresentam infiltrados densos pulmonares. Na disseminao ocorre infeco hepato-esplnica, osteomelite, comprometimento subcutneo e ndulos cutneos semelhantes ao molusco contagioso. A meningites a forma grave da doena foi atinge grande parte de indivduos com AIDS. Agente etiolgico: Cryptococcus neoformans var neoformans, Cryptococcus neoformans var gattii, com os sorotipos A, B, C, D. Candidse, Trichosporonose e Malasseziose descritos anteriormente. Leveduroses por: Geotrichum candidum Produz infeces orais com placas brancas semelhantes s de candidase, ao passo que a forma intestinal da doena provoca colite e fezes sanguinolentas. As manifestaes bronquiais so as mais comuns; tosse crnica e o escarro mucide e sanguinolento que provocam lembra tuberculose. J foram documentadas infeces vaginais. Toluropsis glabrata patgeno oportunista que geralmente provoca doenas em pacientes debilitados. Os pulmes e os rins so os rgos mais afetados, embora esse fungo

27

possa disseminar-se para o restante do corpo atravs do sangue, causando fungemia e choque sptico. Pneumocystis carinii Pneumocystis se adere s clulas epiteliais e penetram ao citoplasma, aumentando a permeabilidade capilar do alvolo, produzido danos na membrana basal do alvolo formando exudado alveolar eosinoflico. O agente no tem sido cultivado.

4.- Identificao dos Fungos PRINCIPAIS CARACTERISTICAS MACROMORFOLOGICAS DOS FUNGOS 4.a- Identificao dos Fungos

28

Os

caracteres

macromorfolgicos

da

colnia

fngica

podem

variar

consideravelmente entre um meio de cultivo e outro, dependendo da constituio nutricional ou devido a diferentes tempos e temperaturas de incubao. Conseqentemente fundamental em que meio e condies foi incubado o agente. A anlise macroscpica dos cultivos visa caracterizar. 1- Textura: serosa, cremosa, mucide, membranosa, pulverulenta, granular, camura, cotonosa. 2- Topografia: plana, convexa, umbilicada, pregueada, cerebriforme. 3- Aspecto: brilhante, opaco, seco, mido. 4- Superfcie: lisa, fissurada, rugosa. 5- Bordas: regulares, irregulares, radiadas. 6- Cor da colnia: branco, preto, verde, vermelho, etc. 7- Pigmento: presena ou ausncia, cor do pigmento, difuso ou restrito colnia. 8- Tempo de crescimento. 9- Dimetro da colnia. Tcnica de esgaramento: Utilizada para identificao micromorfolgica de fungos filamentosos. Com ala de platina em L, retirar um fragmento da colnia, colocar em lmina com una gota de lactofenol azul de algodo e com auxilio de agulhas esgarar bem. Cobrir com lamnula, comprimir levemente e observar ao microscpio com aumento 10X ou 40X.

Cultivo em lmina. Nesta tcnica as estruturas permanecem devem permanecer ntegras e o meio utilizado pode ser Sabouraud dextrose gar, batata gar, lactrimel gar ou V8. Esterilizar placas de Petri com uma lmina no interior, papel de filtro e lamnula. Colocar o meio de gar em placa. Deixar solidificar.

29

Lamnula

Com a ala em L, destacar pores bem pequenas da colnia do bolor, crescida no gar e colocar nos quatro lados do pedao de gar. Cobrir com lamnula esterilizada, pressionando levemente.

Lmina suporte Umedecer com 4 ml de gua esterilizada

gar batata Lmina para microcultivo

Colocar um pouco de gua destilada esterilizada no fundo da placa esterilizada, repor a gua esterilizada, sempre que necessrio. Deixar por 10-15 dias, dependendo da velocidade de crescimento do fungo.

30

Para montar, retirar a lamnula com pina estril. Fixar o fungo na lamnula colocando 1 a 2 gotas de lcool e esperar secar. Montar essa lamnula em uma lmina limpa, com uma gota de lactofenol azul-algodo. A lamnula pode ser vedada com esmalte de unha ou Etellan para conservar por mais tempo. Pode, tambm, ser montada a lmina do microcultivo, retirando-se o pedao de gar, fixando com lcool e colocando uma lamnula limpa, com uma gota de Lactofenol azul-algodo. A classificao e identificao dos fungos esto baseadas principalmente nos caracteres macro e micromorfolgicos, assim como no mtodo de reproduo sexual do organismo isolado. O processo de identificao de leveduras inclui testes bioqumicos, que sero discutidos posteriormente. Observamos atualmente em micologia, a participao crescente das tcnicas de biologia molecular, no auxlio taxonmico. Nosso primeiro grande objetivo diferenciar colnias leveduriformes e filamentosas. 1.- Observe e descreva as principais caractersticas macroscpicas das diversas colnias fngicas a serem analisadas: a) Colnias leveduriformes

b) Colnias filamentosas

Micromorfologia dos fungos de interesse em micologia mdica 4b. Rotina de Identificao de Leveduras

31

l - ISOLAMENTO 1 - Princpio: Freqentemente as leveduras crescem com bactrias em cultura, ou pode haver o desenvolvimento de mais de uma espcie de levedura no mesmo cultivo. Para a correta identificao das leveduras essencial utilizar culturas puras. O primeiro passo portanto, consiste na purificao dos cultivos.

2 - Material utilizado: - gua destilada esterilizado - ala de platina - cultivo de levedura a ser identificada - placas de Sabouraud dextrose gar com cloranfenicol

3 - Tcnica: Preparar uma suspenso da colnia em gua destilada esterilizada de acordo com o no 3 da escala de MacFarland. Com o auxlio de uma ala de platina semear em estrias em placa de Sabouraud dextrose gar com cloranfenicol. Incubar a 37C por 48 horas. A cultura isolada ser utilizada para as provas de identificao. OBS: Quando no houver crescimento ideal nesta temperatura, proceder o isolamento em outra placa e incubar temperatura ambiente.

32

ll - Prova do tubo germinativo 1 - Princpio: Esta uma prova presuntiva para Candida albicans. O tubo germinativo formado dentro de 2 horas por C. albicans, mas outras espcies, como Candida tropicalis podem produzi-lo aps 3 horas. Aproximadamente 95% das amostras de C. albicans so positivas. O tubo germinativo difere da pseudo-hifa por no ser septado, apresentar paredes paralelas e no possuir constrio na sua extremidade abaulada. 2 - Material utilizado: - 0,5 mL de soro humano, de cavalo, de carneiro, etc. - pipetas Pasteur - lminas - lamnulas 3 - Tcnica: Semear cultivo de 24-48 horas, em tubo contendo 0,5 mL de soro. Incubar a 37C durante duas horas. Adicionar uma gota da suspenso com pipeta Pasteur em lmina e cobrir com lamnula. Examinar ao microscpio com objetivas de 10 x e 40x. 4 - Estruturas observadas ao microscpio:

33

lll - Prova do clamidocondio (microcultivo) 1 - Princpio: Observar a existncia ou no de filamentao, a produo de clamidocondios, blastocondios e de artrocondios, assim como a disposio destes elementos no miclio. C. albicans produz clamidocondios arredondados em posio intercalar ou terminal em relao pseudohifa. De modo geral, a maioria das espcies do gnero Candida formam pseudohifas bem desenvolvidas. J as leveduras dos gneros Torulopsis, Rhodotorula e Cryptococcus no produzem pseudohifas. Algumas leveduras ascosporadas apresentam pseudohifas rudimentares ou no as formam. A presena de artrocondios sugestiva de Geotrichum spp. ou Trichosporon spp, este ltimo associado a blastocondios.

2 - Material utilizado: - Cultivos de 24-48 horas - gar fub - Placas de Petri (90x15 mm) - Ala de platina com extremidade retilnea - Lamnulas esterilizadas 3 - Tcnica: Fundir o meio de gar fub e verter sobre placa de Petri. Aps a solidificao, com o auxlio de uma ala de platina, fazer 3 estrias finas, paralelas na superfcie da placa e cobrir com lamnula esterilizada. Incubar a 25C, durante 48-96 horas. Examinar ao microscpio, com objetivas de 10 x e 40x. 4 - Observao ao Microscpio:

34

IV - Prova de assimilao de fontes de C e N (auxanograma) 1- Princpio O teste de assimilao indica a habilidade de uma levedura para utilizar um composto na presena de oxignio. Cada espcie possui seu padro prprio de assimilao. Essas provas so muito sensveis e teis para a identificao das leveduras. Esto condicionados a fatores de permeabilidade, sistemas enzimticos que catalisam a degradao dos hidratos de carbono e ao sistema redutase que intervm na reduo do nitrato.

2- Material utilizado - Cultivo de 24-48 horas - Meio C - Meio N - Placas de Petri 150 x15 mm esterilizadas - Placas de Petri 90 x 15 mm esterilizadas - Fontes de carbono (dextrose, maltose, sacarose, galactose, lactose, trealose, melibiose, L-arabinose, celobiose, xilose, rafinose, dulcitol, ramnose, inulina, inositol) - Fontes de nitrognio (peptona e KNO3)

3- Tcnica Preparar suspenso da levedura ajustando a turbidez de acordo com o padro 5 da escala de MacFarland. Fundir os meios C e N e estabiliz-los em banho Maria a 50C durante a realizao da prova. Para verificar a assimilao de fontes de carbono, misturar 2 mL da suspenso com 40 mL do meio C e verter em placa de Petri de 150 x 15 mm. Para observar a assimilao de fontes de nitrognio, misturar 1 ml da suspenso com 20 ml do meio N, e verter em placa de Petri de 90 x 15 mm. Aps a solidificao dos meios, distribuir equidistantemente as fontes de carbono (meio C) ou nitrognio (meio N) sobre o

35

gar. Incubar a 30C durante 24-48 horas. Realizar leitura e observar surgimento de halo de crescimento na rea correspondente a cada fonte.

4- Leitura Gli Gal Mal Sac Lac Raf Tre Mel Ra Dul Ino Cel Inu Ma Xil KN Pep m n O3

V - Prova de fermentao de Acares (zimograma) 1- Princpio A habilidade de uma levedura para fermentar um determinado acar depender da presena ou ausncia de um sistema de transporte que permitir a absoro do acar a baixas tenses de O2 e da presena de um sistema enzimtico que atuar na degradao glicoltica do acar com a formao de etanol e anidrido carbnico. A fermentao positiva ou negativa de um determinado acar um dado complementar para diferenciar as espcies.

2- Material - Cultivos de 24-48 horas - gua destilada esterilizada (4ml) - Meio de cultivo para a fermentao de acares: dextrose, maltose, sacarose, lactose, galactose, e trealose - Bateria de meios para fermentao (tubos de rosca com tubos de Durhan) - Pipeta automtica calibrada para 200 microlitros

36

3. Tcnica Preparar uma suspenso de leveduras (turbidez de acordo com o padro 5 da escala de MacFarland). Inocular 200l da suspenso em tubos de ensaio contendo os respectivos carboidratos. Incubar a 37C por 24-72 horas. Realizar leitura observando a produo de cido (mudana de cor do meio) e gs (formao de bolha no interior do tubo de Durhan). A observao da prova vlida at 20 dias aps a realizao da mesma.

4- Leitura Acar Gs Dex Malt Sac Lac Galac Treal

37

VI - Produo de Urease 1- Princpio prova complementar de grande utilidade para confirmar a identificao de algumas leveduras. Por exemplo, Cryptococcus spp., Trichosporon spp. e Rhodotorula spp. O dermatfito T. mentagrophytes so urease positivos.

2- Material -Cultivo de 24-48 horas -Meio de uria de Christensen

3- Tcnica Semear cultivos de 24-48 horas na superfcie do meio de uria de Christensen. Incubar temperatura de 30C durante 24-48 horas e observar a viragem do indicador.

4- Leitura Vermelho = positivo Amarelo = negativo

II - Produo de Cpsula 1- Princpio A formao de cpsula observada em espcies de Cryptococcus, embora possa ocorrer em outras espcies de leveduras. A observao de cpsula no exame direto de uma levedura necessita complementao posterior da identificao atravs de outras tcnicas (prova da urease, cultivo em meio niger, auxanograma, etc.).

38

2- Material -Cultivo da levedura-problema -Lmina -Lamnula -gua destilada esterilizada -Tinta da China

3- Tcnica Aps homogeneizar a levedura com uma gota de gua destilada e uma gota de tinta da China sobre uma lmina, sobrepor uma lamnula e observar ao microscpio.

4- Leitura As preparaes positivas iro mostrar a presena de uma rea clara, a cpsula, em torno da clula leveduriforme, sobre um fundo negro. VIII - Produo de pigmento no gar-niger 1- Princpio Quando Cryptococcus neoformans semeado num meio contendo extrato de semente de niger, girassol ou alpiste, as colnias tornam-se negras ou marrons devido a atividade de fenol oxidase da levedura. Colnias de outras leveduras, incluindo outras espcies de Cryptococcus iro manter sua cor original. Esse meio deve ser utilizado na triagem para isolamento de C. neoformans.

2- Material -Meio de gar-niger -Ala de platina -Cultivo da levedura-problema

39

3- Tcnica Semear a levedura-problema em placa contendo meio de gar-niger, pelo mtodo do esgotamento. Observar o crescimento da levedura na placa incubada a 37oC.

4- Leitura A colnia de C. neoformans apresenta colorao marrom ou negra. IX - Produo de ascosporos (Eugenio Reyes Arenas) 1- Princpio Algumas espcies de leveduras formam ascos, que alojam esporos sexuados, as ascosporas. A observao dessas estruturas importante para a identificao da levedura. Para estimular a produo de ascosporas necessrio cultivar o isolado em meios especiais 2- Material -Cultivo da levedura-problema -Placa contendo meio de Gesso, ou V-8. -Ala de platina -Bateria de Ziehl Nielsen -Lmina

3- Tcnica Semear a levedura-problema em meio de apropriado e incubar a 37C ou temperatura ambiente, de acordo com a exigncia do isolado. Aps 5-7 dias, realizar esfregao em lmina, corar pela tcnica de Ziehl Nielsen e observar ao microscpio com objetiva de 100 x.

40

4- Leitura Examinar a forma e tamanho dos ascos e ascosporas e o nmero de ascosporas em cada asco.

Principais estruturas microscpicas dos fungos Hifa: Estruturas tubulares, constitudas de talo filamentoso (Segundo a cor, podem ser classificadas como hialina ou demcea)

Septada; dividida em compartimentos celulares atravs de septos parciais, completos ou perfurados.

Cenoctica; filamento contnuo no sendo aparentemente dividida por septos.

2. Blastocondio: Organismo unicelular globoso, ovide ou elipside denominado levedura. Se origina quando a clula me gera um ou mais indivduos por um processo denominado brotamento ou gemulao. 3. Pseudohifa: Constituda pela sequncia de brotamentos de leveduras sem separao entre as clulas filhas gerando uma estrutura alongada, de paredes no paralelas, sem septo mas com ponto de contrio entre uma clula e outra. Podem existir brotamentos laterais mltiplos que nascem a partir do ponto de contrico, formando assim o pseudomiclio.

41

4. Artrocondios: So elementos retangulares de paredes grossas formados por fragmentao das formas cilndricas dos fungos previa diviso do material gentico.
5. Clamidocondios: Estrutura de resistncia

produzida pelo fungo como resposta frente s condies adversas do meio. Clulas geralmente globosas ou ovides, de volume aumentado, parede dupla e espessa. A localizao no miclio pode ser intercalar, apical ou terminal. Os condeos tambm podem apresentar esta estrutura.

Os fungos tm ciclos de reproduo assexual e sexual, onde os elementos de frutificao podem ter uma disposio interna ou externa. 1. Zygomycota: Esporos sexuados-zigosporas. Esporos endgenos assexuados-

esporangisporos, contidos em esporngios. 3. Ascomycotina: Em algum estgio da vida, produzem esporos endgenos sexuadosascosporos dentro de estruturas em forma de saco denominados ascos. Segundo a morfologia do asco adquire a denominao de peritcio, apotcio ou cleistotcio. 4. Basidiomycotina: Esporos sexuados- basidisporos situados externamente sobre a clula me-baside. 5. Chytridiomycota:

42

Reproduo Assexuada

Disposio Externa Interna

Estruturas Condios, picnidiocondios Esporangisporos Basidisporos Ascos simples, ascostroma, peritcio, cleistotcio, apotcio.

Sexuada

Externa Interna

Observe e descreva os caracteres microscpicos dos seguintes exemplos de reproduo dos fungos.

Reproduo assexuada externa

Reproduo assexuada interna

Reproduo sexuada interna

43

2.- Observe e desenhe as seguintes estruturas microscpicas dos seguintes fungos filamentosos: Trichophyton rubrum T. mentagrophytes T. tonsurans

Microsporum gypseum

Microsporum canis

Epidermophyton floccosum

Aspergillus spp

Penicillium spp

Paecilomyces spp

44

Fusarium spp

Rhizopus spp

Mucor spp

Phialophora spp

Cladosporium spp

Fonsecaea pedrosoi

Alternaria spp

Curvularia spp

Nattrassia mangiferae

45

Sporothrix schenkii 25

Histoplasma capsulatum 25

Paracoccidioides brasiliensis 25

37

37

37

46

6.- Referncias bibliogrficas Arango M.; Castaeda E. Micosis Humanas Procedimentos Diagnsticos Exmenes directos. 1995. Ellis D.H. Clinical Mycology. The human opportunistic Mycoses. P. Fazer Inc. Guillinham Printers Pty. Ltd. Australia 1994. Hoog G.S. et al Atlas of clinical fungi. Contraolbureau oor Schimmelcultures,

Netherlands/Universitat Rovira Virgili , Spain. 2000. Kern M. A. Medical Mycology. A Self-Instructional Text. F. A. Davis Company. Philadelphia, 3 er ed 1988. Lacaz C.Z.; Porto E.; Martin J. C. Micologa Mdica: Fungos, actinomicetos e algas de interese mdico 7 de. So Paulo: Sarvier, 1984. Richardson M.D. & Warnock D.W. Fungal Infection. Diagnosis and managment. Blockwell Scientific publication, london. 1er ed 1993.

47

Autores Agenor Messias Junior Arnaldo Lopes Colombo Eugenio Reyes Arenas Olga Fischman Gompertz Patrcio Godoy Martinez Victor Silva Vargas Colaboradores Cledja Soares deAmorim Edma Helena de Oliveira Fabiane Camargo G. Nunes Leila Paula de Almeida Luis Zaror Cornejo Marly Forjaz Zelinda Maria Nakagawa