NNT/NL : 0000AIXM0000/000ED000

THÈSE DE DOCTORAT
Soutenue à Aix-Marseille Université
le 17 décembre 2020 par

Hana DOUAFER
Développement et évaluation d’une forme pharmaceutique
antibiotique pour inhalation vis-à-vis des bactéries
pulmonaires résistantes de Pseudomonas aeruginosa

Discipline Composition du jury

BIOLOGIE SANTE Pr. William Couet Rapporteur
Université de Poitiers
Spécialité
Dr. Catherine Llanes Rapporteuse
MICROBIOLOGIE
Université de Franche-Comté
École doctorale Pr. Laurent Papazian Examinateur
ED62- Ecole doctorale des sciences de la Aix-Marseille Université
vie et de la santé Dr Jean Michel Brunel Directeur de thèse
Aix-Marseille Université
Laboratoire/Partenaires de recherche
Dr Véronique Andrieu Co-directrice de thèse
- UMR-MD1 membranes et cibles Aix-Marseille Université
thérapeutiques
- Laboratoire de bio-ingénierie
pharmaceutique, service de pharmacie
galénique, biopharmacie et
Affidavit

Je soussigné, Hana Douafer, déclare par la présente que le travail présenté dans ce manuscrit est
mon propre travail, réalisé sous la direction scientifique de Jean Michel Brunel et Véronique Andrieu,
dans le respect des principes d’honnêteté, d'intégrité et de responsabilité inhérents à la mission de
recherche. Les travaux de recherche et la rédaction de ce manuscrit ont été réalisés dans le respect à
la fois de la charte nationale de déontologie des métiers de la recherche et de la charte d’Aix-
Marseille Université relative à la lutte contre le plagiat.

Ce travail n'a pas été précédemment soumis en France ou à l'étranger dans une version identique ou
similaire à un organisme examinateur.

Fait à Marseille, le 24 octobre 2020

Cette œuvre est mise à disposition selon les termes de la Licence Creative Commons
Attribution - Pas d'Utilisation Commerciale - Pas de Modification 4.0 International.
 REMERCIEMENTS

Ce travail de thèse s’est trouvé au cœur d’une collaboration entre l’école doctorale science de la vie et
de la santé ED62 et le Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Algérien
et a été réalisé au sein du laboratoire : UMR-MD1 Membranes et cibles thérapeutiques ainsi que le
Laboratoire de bio-ingénierie pharmaceutique, service de pharmacie galénique, biopharmacie et
cosmétologie de la faculté de pharmacie, Université d’Aix-Marseille, France.
Ce travail n’aurait pas pu se faire sans l’aide et le soutien de nombreuses personnes. Je ne peux
commencer la présentation de ces travaux sans les remercier.
Je souhaite tout d’abord remercier de tout mon cœur mon directeur de thèse le Dr Jean Michel
BRUNEL de m’avoir encadré, d’avoir dirigé cette thèse, ainsi que de m’avoir accordé sa confiance
durant les années passées sous sa supervision. Ses compétences, sa modestie, sa rigueur scientifique et
sa disponibilité permanente n’ont cessé de me motiver dans l’accomplissement de ce travail. Je lui
exprime toute ma reconnaissance pour m’avoir toujours soutenu et encouragé dans toutes mes
démarches. C'est un honneur pour moi d’avoir travaillé avec lui, je lui suis infiniment reconnaissante.
Merci pour avoir fait de mes difficultés les tiennes. Merci de ne pas avoir accepté que je fasse une
thèse sur articles, et voilà je te l’avoue : TU AVAIS RAISON.
Je souhaite aussi manifester mes remerciements à ma co-directrice de thèse la Dr Véronique
ANDRIEU pour ses conseils avisés et ses remarques constructives. Ses qualités pédagogiques
remarquables ont contribué à l’avancement de mon travail. Elle a toujours su m’apporter de précieux
conseils et des solutions concrètes à mes diverses interrogations et questions.
Je tiens à remercier le Dr Jean Michel BOLLA, et à lui exprimer toute ma reconnaissance pour m'avoir
accueillie tout au long de mon travail dans son laboratoire « Membranes et cibles thérapeutiques » et
pour m’avoir permis de profiter d’excellentes conditions de travail. Je le remercie pour son soutien, sa
bienveillance et ses conseils.
Je tiens à manifester ma profonde gratitude au Pr Philippe PICCERELLE, directeur du laboratoire
de bio-ingénierie pharmaceutique qui m’a accueillie dans son laboratoire et a mis à ma disposition
tout le matériel nécessaire pour l’accomplissement des tests de caractérisation aérodynamiques des
solutions et des poudres pour inhalation, je le remercie pour sa gentillesse inestimable et son soutien.

iii
J’adresse également mes vifs remerciements au Dr Catherine Llanes et Pr William Couet, qui m’ont
fait l’honneur de rapporter ma thèse et pour l'intérêt qu'ils ont porté à ces travaux et au Pr Laurent
Papazian pour avoir accepté de faire partie du jury et d’examiner ce travail.
J’adresse mes profonds remerciements au Ministère Algérien de l’Enseignement Supérieur et de la
Recherche Scientifique de m’avoir accordé les financements nécessaires pour réaliser cette thèse.
Je tiens à remercier également le Dr Emmanuel WAFO de m’avoir fourni toute l’aide et les facilités
nécessaires pour effectuer les différents dosages analytiques dans les meilleures conditions. Qu’il soit
assuré de ma profonde gratitude.
Mes Vifs remerciements s’adressent au Pr Michelle SERGENT, de m’avoir accordé de son temps
dans l’élaboration, l’explication et l’interprétation des résultats du plan d’expériences.
Je remercie également le Pr. Jean-Marie Pagès pour ses remarques et ses conseils scientifiques précieux
durant les réunions d’équipe. Je ne peux qu'admirer ses compétences.
Par ailleurs, je tiens également à adresser mes sincères remerciements aux personnes non encore citées
dont les professeurs, les permanents, les anciens et futurs docteurs ainsi que les stagiaires, en
particulier Sophie, Aurélie, Johane, Mrunal, Julia, Jack, Thomas, René, Amane, Martial, Faustine
et Samy qui ont contribué à créer une atmosphère de travail agréable et conviviale, une ambiance si
merveilleuse… jamais oubliable, en leur souhaitant tout le succès … tout le bonheur.
Comment ne pas remercier mes très chers parents à qui revient tout le mérite pour leurs sacrifices et
leurs encouragements, l’ensemble de mes proches et de ma famille en particulier mes chères copines
Azza, Faiza, Fella, Marwa et Nada pour tous les instants inoubliables que j’ai passés avec elles.

Quoi que je fasse ou que je dise, je ne saurai point vous remercier comme il se doit.

Merci !

iv
 Dédicaces

Avec mes sentiments de gratitudes les plus profonds, je dédie ce modeste travail :
A l’âme de mon grand-père paternel regretté, dont je n’ai pu jusqu'à présent oublier son
amour et son soutien ; J’espère que, du monde qui est sien maintenant, il apprécie cet humble
geste comme preuve de reconnaissance de la part de sa petite fille qui a toujours prié pour le
salut de son âme.
A l’âme de mon grand-père maternel regretté ;
Puisse dieu le tout puissant, les avoir en sa sainte miséricorde !
A celui qui a toujours garni mes chemins avec force et lumière… mon très cher père, son
affection me couvre, sa bienveillance me guide et son soutien a toujours été ma source de
force pour affronter les différents obstacles ;
A la plus belle perle du monde, la plus forte des mamans… ma tendre mère qui m’a toujours
soutenu et encouragé dans mes choix ;
Aucun hommage ne pourrait être à la hauteur de vos sacrifices, de l’amour et de l’affection
dont vous n’avez jamais cessé de m’entourer tout au long de ma vie, j’espère que vous
trouvez dans ce travail un vrai témoignage de mon profond amour et éternelle
reconnaissance ;
A mes petits anges : mon neveu Youcef, mes cousins Baraa, Raghed et Chahd
A mes étoiles qui éclairent ma vie : ma sœur Imane et mon frère Mohamed ;
A mes grands-mères nous demandons à Dieu de les réserver une longue vie
A tous les membres de ma famille, mes tantes, mes cousines, mes oncles, mes amies, mes
voisins et tous ceux qui m’ont prodigué des encouragements et se sont donné la peine de me
soutenir durant ces années d’étude
A l'ensemble des professeurs qui m'ont instruite et m’ont accompagnée durant mes études.
A tous ceux qui me sont chers ;
A tous ceux dont l’oubli du nom n’est pas celui du cœur

Douafer Hana
v
 Sommaire :
SOMMAIRE : ................................................................................................................................................... VI
RÉSUMÉ .......................................................................................................................................................... IX
SUMMARY ....................................................................................................................................................... X
LISTE DES ABRÉVIATIONS ................................................................................................................................ XI
LISTE DES FIGURES ........................................................................................................................................ XIII
LISTE DES TABLEAUX ..................................................................................................................................... XVI
LISTE DES SCHÉMAS .....................................................................................................................................XVII
INTRODUCTION GÉNÉRALE .............................................................................................................................. 1
CHAPITRE 1 : .................................................................................................................................................... 5
LES ADJUVANTS AUX ANTIBIOTIQUES : UNE STRATEGIE PROMETTEUSE POUR RESTAURER L’EFFICACITE DES
ANTIBIOTIQUES CLASSIQUES ............................................................................................................................ 5
(SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE) ........................................................................................................................ 5
I. INTRODUCTION : ................................................................................................................................................... 6
II. RESISTANCE AUX ANTIBIOTIQUES : ........................................................................................................................... 8
II.1. Modification de la cible ........................................................................................................................... 8
II.2. Pompes d’efflux : ..................................................................................................................................... 8
II.3. Inactivation de l’antibiotique : ................................................................................................................ 9
III. RESISTANCE PAR MUTATIONS : ............................................................................................................................ 12
IV. ADJUVANTS AUX ANTIBIOTIQUES : ........................................................................................................................ 13
IV.1. Inhibiteurs des bêta-lactamases : ........................................................................................................ 15
IV.1.1. Inhibiteurs irréversibles : ............................................................................................................................... 15
IV.1.2. Inhibiteurs réversibles : ................................................................................................................................. 18
IV.2. Inhibiteurs des pompes d’efflux : ......................................................................................................... 21
IV.3. Perméabilisants membranaires : ......................................................................................................... 26
V. CONCLUSION .................................................................................................................................................... 35
CHAPITRE 2 : .................................................................................................................................................. 36
NOUVEAUX ADJUVANTS POLYAMINES POUR RESTAURER LA SENSIBILITE DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA
AUX TETRACYCLINES ...................................................................................................................................... 36
(RESULTATS EXPERIMENTAUX) ...................................................................................................................... 36
I. INTRODUCTION : ................................................................................................................................................. 37
II. POLYAMINES : ORIGINES, ROLE ET POTENTIEL THERAPEUTIQUE .................................................................................... 38
II.1. Géraniol et dérivés polyaminoisoprényles ............................................................................................ 40
II.2. Squalamine ............................................................................................................................................ 41
II.3. Ianthelliformisamines ............................................................................................................................ 42
II.4. Motuporamines ..................................................................................................................................... 42
II.5. Halocyamines ........................................................................................................................................ 45
II.6. Dérivés indoliques ................................................................................................................................. 46
II.7. Dérivé polyaminoisoprényle NV716 ...................................................................................................... 48
III. SYNTHESE DES DERIVES POLYAMINOISOPRENYLES .................................................................................................... 49
IV. ACTIVITE ANTIBACTERIENNE DES DERIVES POLYAMINOISOPRENYLES ............................................................................. 50
IV.1. Détermination des Concentrations Minimales Inhibitrices CMIs ........................................................ 51
IV.2. Evaluation de l’activité antibactérienne des dérivés polyaminoisopréniques seuls et en combinaison
avec les différentes cyclines ......................................................................................................................... 52

vi
 IV.3. Etude de la perméabilisation de la membrane externe ....................................................................... 56
IV.4. Effet des différents dérivés sur la perméabilité membranaire ............................................................ 59
IV.5. Effet sur la viabilité bactérienne .......................................................................................................... 61
V. CONCLUSION .................................................................................................................................................... 62
CHAPITRE 3 : .................................................................................................................................................. 64
AVANTAGES ET LIMITATIONS DE L'ADMINISTRATION DES ANTIBIOTIQUES PAR VOIE PULMONAIRE POUR LA
PRISE EN CHARGE DES MALADIES RESPIRATOIRES INFECTIEUSES................................................................... 64
(SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE) ...................................................................................................................... 64
I. INTRODUCTION................................................................................................................................................... 65
II. ANATOMIE ....................................................................................................................................................... 65
III. TRAITEMENTS PULMONAIRES CIBLES ..................................................................................................................... 67
IV. VOIE D'ADMINISTRATION PULMONAIRE ................................................................................................................. 69
IV.1. Aérosolthérapie.................................................................................................................................... 70
IV.2. Biopharmaceutiques inhalés ................................................................................................................ 72
IV.3. Mécanismes d'élimination des particules d'aérosol après inhalation ................................................. 74
IV.3.1. Clearance Mucociliaire (CMC) ........................................................................................................................ 75
IV.3.2. Dégagement mécanique ................................................................................................................................ 75
IV.3.3. Macrophages Alvéolaires (MA) ...................................................................................................................... 75
IV.3.4. Dégradation enzymatique ............................................................................................................................. 76
IV.4. Mécanismes et facteurs influençant le site de dépôt des particules inhalées..................................... 76
IV.4.1. Impaction inertielle ........................................................................................................................................ 78
IV.4.2. Sédimentation ................................................................................................................................................ 78
IV.4.3. Diffusion......................................................................................................................................................... 79
V. DISPOSITIFS D’INHALATION .................................................................................................................................. 80
V.1. Nébuliseurs : ......................................................................................................................................... 81
1. Les nébuliseurs à jet ......................................................................................................................................... 81
2. Les nébuliseurs ultrasoniques .......................................................................................................................... 82
V.2. Inhalateurs-doseurs pressurisés (pMDIs) .............................................................................................. 84
V.3. Inhalateurs de poudre sèche (IPS) ........................................................................................................ 86
1. Les IPSs passifs : ............................................................................................................................................... 87
2. Les IPSs actifs : ................................................................................................................................................. 87
V.3.1. Ingénierie des particules pour inhalation ........................................................................................................ 91
V.4. Inhalateurs à brume douce (Soft Mist Inhalers) SMIs ........................................................................... 92
VI. ANTIBIOTIQUES INHALES .................................................................................................................................... 93
VII. CONCLUSION .................................................................................................................................................. 99
CHAPITRE 4 : ................................................................................................................................................ 102
CARACTERISATION AERODYNAMIQUE D’UNE SOLUTION POUR NEBULISATION DE LA COMBINAISON
NV716/DOXYCYCLINE ................................................................................................................................... 102
(RESULTATS EXPERIMENTAUX) .................................................................................................................... 102
I. INTRODUCTION................................................................................................................................................. 103
II. ÉVALUATION AERODYNAMIQUE DES PARTICULES FINES : L’IMPACTEUR DE NOUVELLE GENERATION NGI ........................... 104
III. ANALYSE DES DONNEES .................................................................................................................................... 107
IV. EVALUATION DE L’EFFICACITE DE LA COMBINAISON DOXYCYCLINE/NV716 VIS-A-VIS DES SOUCHES CLINIQUES DE P.
AERUGINOSA ....................................................................................................................................................... 108
V. CARACTERISATION AERODYNAMIQUE DES AEROSOLS DE LA DOXYCYCLINE ET DU NV716 SEPAREMENT PUIS EN COMBINAISON109
VI. DETERMINATION DE L'INFLUENCE DES CONCENTRATIONS DES SUBSTANCES ACTIVES ET DE LA DUREE DE NEBULISATION SUR LES
PROPRIETES AERODYNAMIQUES .............................................................................................................................. 113
VII. INFLUENCE DU DISPOSITIF DE NEBULISATION SUR LES PROPRIETES DE L’AEROSOL DE LA COMBINAISON DOXYCYCLINE/NV716
........................................................................................................................................................................ 115
VIII. CONCLUSION ............................................................................................................................................... 121
CHAPITRE 5 : ................................................................................................................................................ 122
vii
FAISABILITE D'UNE POUDRE SECHE INHALEE A PARTIR DE LA COMBINAISON DOXYCYCLINE/NV716 SELON LA
METHODOLOGIE DES PLANS D’EXPERIENCES ............................................................................................... 122
(RESULTATS EXPERIMENTAUX) .................................................................................................................... 122
I. INTRODUCTION................................................................................................................................................. 123
II. METHODOLOGIE DES PLANS D’EXPERIENCES .......................................................................................................... 124
II.1. Terminologie ....................................................................................................................................... 125
II.2. Espace expérimental ........................................................................................................................... 126
III. ELABORATION DES PLANS D’EXPERIENCES UTILISES DANS L’ETUDE ............................................................................. 127
III.1. Détermination du meilleur lactose constitué de particules de grande taille ..................................... 127
III.2. Détermination des facteurs influençants les propriétés aérodynamiques de la combinaison
doxycycline/NV716 .................................................................................................................................... 128
IV. RESULTATS ET DISCUSSION ................................................................................................................................ 130
IV.1. Influence de différents facteurs sur les propriétés aérodynamiques de la poudre de la combinaison
doxycycline/NV716 .................................................................................................................................... 136
IV.1.1. Influence du taux de remplissage sur l'aérosolisation de la poudre du mélange Doxycycline/NV716 ........ 139
IV.1.2. Influence du taux de principes actifs ........................................................................................................... 139
IV.1.3. Influence de l'excipient support .................................................................................................................. 140
IV.1.4. Influence de l'ordre d'introduction des différents principes actifs .............................................................. 140
IV.2. Mélange optimal ................................................................................................................................ 142
V. CONCLUSION :................................................................................................................................................. 143
CHAPITRE 6 .................................................................................................................................................. 144
LES HANAMINES ........................................................................................................................................... 144
(RESULTATS EXPERIMENTAUX) .................................................................................................................... 144
I. INTRODUCTION................................................................................................................................................. 145
II. SYNTHESE DES DERIVES HANAMINES : .................................................................................................................. 145
III. ÉTUDE DE L’ACTIVITE ANTIBACTERIENNE ET DE LA CAPACITE DES HANAMINES A POTENTIALISER L’ACTIVITE DES ANTIBIOTIQUES
........................................................................................................................................................................ 147
III.1. Détermination de la nature de l’interaction ...................................................................................... 149
IV. ETUDE DU MECANISME D’ACTION ANTIBACTERIEN DES HANAMINES HD3 ET HD13 ..................................................... 151
IV.1. Évaluation de l’effet membranotrope des Hanamines HD3 et HD13 ................................................ 152
IV.1.1. Perméabilisation de la membrane externe : étude de l’hydrolyse de la nitrocéfine ................................... 152
IV.1.2. Perturbation de l’intégrité membranaire : étude de la libération d’ATP ..................................................... 153
IV.1.3. Dépolarisation membranaire : mesure de la libération du DiSC3(5) ........................................................... 155
IV.2. Action des composés HD3 et HD13 sur la performance des pompes d’efflux d’E. aerogenes EA289 157
V. CONCLUSION .................................................................................................................................................. 161
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES .................................................................................................. 162
MATERIELS ET METHODES ........................................................................................................................... 166
DONNES SUPPLEMENTAIRES ........................................................................................................................ 185
BIBLIOGRAPHIE ............................................................................................................................................ 191

viii
 RÉSUMÉ

Plusieurs approches ont été envisagées pour lutter contre la propagation des souches
bactériennes résistantes en constante expansion. L’une des plus prometteuses consiste en la
combinaison d’antibiotiques avec d’autres entités chimiques non antimicrobiennes « les
adjuvants » tels que les dérivés de type polyaminoisoprényle en offrant un meilleur accès
interne aux antibiotiques administrés conjointement et/ou en inhibant leur expulsion.
L’évaluation in vitro de leurs activités potentialisatrices de l’action de la doxycycline vis-à-vis
de la bactérie P. aeruginosa nous a permis d’identifier le meilleur dérivé (le composé NV716).
L’étude de son mécanisme d’action a permis de conclure que le NV716 perturbe l’intégrité de
la membrane bactérienne externe de manière dose-dépendante.
Une solution pour inhalation à base de leur combinaison (NV716/doxycycline) a été développée
et évaluée selon les recommandations de la pharmacopée (EP, USP) en utilisant le Next
Generation Impactor, un appareil qui permet la mesure de la taille des particules inhalées. Le
diamètre aérodynamique des gouttelettes (MMAD = 3,4-4,4 μm) a été démontré conforme aux
normes recommandées pour les aérosols thérapeutiques (<5 μm), avec une Fraction de
Particules Fines élevée (FPF > 50%) requise pour maintenir leurs concentrations à un niveau
supérieur à leurs Concentrations Minimales Inhibitrices (CMI) au site d'infection. Une étude
supplémentaire a ensuite été menée sur l'administration pulmonaire de cette même combinaison
(NV716/doxycycline) sous forme d’une poudre, nous avons ainsi pu identifier les facteurs
influençant le comportement aérodynamique de notre poudre combinée pour inhalation et la
meilleure formulation a été obtenue en regroupant les facteurs optimaux sans utiliser un panel
d'excipients qui peuvent affecter négativement les voies respiratoires déjà affaiblies par une
infection à P. aeruginosa.
Finalement, une autre classe de molécules chimiosensibilisantes agissant en synergie avec la
doxycycline et l’érythromycine a été développé. Les différentes méthodes biophysiques
utilisées ont démontré la capacité des meilleurs composés à agir sur l’intégrité physique des
membranes bactériennes et sur les performances d'efflux des pompes de type AcrAB-TolC.

Mots clés : résistance bactérienne, adjuvants aux antibiotiques, dérivés polyaminés,

aérosolthérapie, Pseudomonas aeruginosa.

ix
 SUMMARY

Several approaches have been considered to fight the spread of ever-expanding resistant
bacterial strains and one of the most promising is the combination of antibiotics with non-
antimicrobial chemical entities namely adjuvants such as polyaminoisoprenyl derivatives by
offering them a better internal access and/or inhibiting their expulsion. Evaluation of their
potentiating activities with respect to the action of doxycycline against P. aeruginosa allowed
us to identify the best derivative (compound NV716). The study of its mechanism of action led
to the conclusion that this latter disrupts the integrity of the external bacterial membrane in a
dose-dependent manner.
An inhalation solution based on the NV716/doxycycline combination was developed and
evaluated using a Next Generation Impactor, a device used to measure the size of inhaled
particles. The aerodynamic droplet diameter (MMAD = 3.4-4.4 μm) meets the recommended
standards for therapeutic aerosols (<5 μm) and a high Fine Particle Fraction (FPF > 50%)
required to maintain their concentrations above their Minimum Inhibitory Concentrations
(MICs) at the site of infection.
An additional study was then performed for pulmonary administration of the same combination
as a powder. We were able to identify the factors influencing the aerodynamic behavior of our
combination and the best formulation by combining some optimal factors without using a panel
of excipients that can negatively affect the airways.
Finally, another class of chemosensitizing molecules acting synergistically with doxycycline
and erythromycin has been developed. The various biophysical methods used have
demonstrated the ability of the best compounds to act on the physical integrity of bacterial
membranes and on the efflux performance of AcrAB-TolC type pumps.

Keywords: bacterial resistance, antibiotic adjuvants, polyamine derivatives, aerosol therapy,

Pseudomonas aeruginosa.

x
 LISTE DES ABRÉVIATIONS

1,2'-diNA : 1,2-dinaphthylamine
ABC : ATP-Binding Cassette
ADJ : Adjuvant
ALIS : Suspension d’Inhalation de Liposome d’Amikacin
AMA : Aspergillomarasmine A
AMP : Adénosine monophosphate
AMPs : Peptides Antimicrobiens Endogènes
ATP : Adénosine Triphosphate
AZLI : Aztréonam Solution pour Inhalation
BLSE : Bêta-Lactamases à Spectre Etendues
BPCO : Bronchopneumopathie Chronique Obstructive
CA-SFM : Comité de l’Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie
CCCP Carbonylcyanure m-chlorophénylhydrazone
CDC: Center for Disease Control
CFC : Chlorofluorocarbone
CFTR : Gène Régulateur de la Conductance Transmembranaire
CMC : Clearance Mucociliaire
CMI : Concentration Minimales Inhibitrice
CMO : Collecteur terminal à Micro-orifices
CSA : Antibiotique Stéroïdiens Cationiques « Céragénine »
CTAB Cétyl de tétrabutylammonium
Dae : Diamètre aérodynamique équivalent
DCE : Diamètre de Coupure Effectif au débit de 60 litres/min
DCE’ : Diamètre de Coupure Effectif au débit d'échantillonnage Q
DD : Dose Délivrée
DE : Dose Emise
Disc3 (5) : Iodure de 3,3'-dipropylthiadicarbocyanine
DMF : Diméthylformamide
EGCG : Épigallocatéchin-3-gallate
EP Pharmacopée Européenne
EPI : Inhibiteurs des Pompes d’Efflux
EUCAST : European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing
FDA : Food and Drug Administration
FIC : Concentration Inhibitrice Fractionnaire
FPD : Dose de Particules Fines
FPF : Fraction de Particules Fines
GC-MS : Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse
GSD : Écart type géométrique
HFA : Hydrofluoroalcanes
HPMC : Hydroxypropylméthylcellulose

xi
HTAP : Hypertension Artérielle Pulmonaire Primitive
IC50 Concentration Inhibitrice médiane
INT : Nitrotétrazolium
IPS : Inhalateur de Poudre Sèche
LPS : Lipopolysaccharide
MA : Macrophages Alvéolaires
MAC : Mycobacterium avium complex
MATE : Multidrug And Toxic-compound Extrusion
MBL : Métallo-Bêta-Lactamases
MDR : Résistance Multiple aux médicaments
MDRAB : Acinetobacter baumannii Multi-Résistant
MFS : Major Facilitator Superfamily
MMAD : Diamètre Aérodynamique Massique Médian
MNT : Mycobactérioses pulmonaires Non-Tuberculeuses
NADH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide réduit
NGI : Impacteur de Nouvelle Génération
ONM : Observatoire National de la Mucoviscidose
PA : Principe Actif
PAβN : Phénylalanine Arginine-β-Naphtylamide
PBP : Protéines de Liaison aux Pénicillines
PEG : Polyéthylène Glycol
Ph. Eur : Pharmacopée Européenne
PLGA : Acide polylactique-co-glycolique
PMB : Polymyxine B
PMBn : Polymyxine B nonapeptide
pMDIs : Inhalateurs-doseurs pressurisés
PVP : Polyvinylpyrrolidone
Q: Débit d'échantillonnage
Q1 1er quartile
Q3 3èm quartile
RND : Resistance-Nodulation-cell Division
SAW : Atomisation par ondes acoustiques de surface
SBL : Sérine- Bêta-Lactamases
SMI : Inhalateurs de brouillard doux
SMR : Small Multidrug Resistance
THF : Tétrahydrofurane
TIP : Tobramycine sous forme de poudre
TIS : Tobramycine Solution pour Inhalation
TPP+ : Tétraphénylphosphonium lipophile
USP Pharmacopée Américaine
VRSA : S. aureus Résistant à la Vancomycine
XDR : Ultra-résistante
XDRAB : Acinetobacter baumannii Extrêmement-Resistant

xii
 LISTE DES FIGURES

Figure 1. Structures chimiques d’antibiotiques représentatifs ............................................................... 6

Figure 2. Mécanismes de résistance des bactéries vis-à-vis des antibiotiques ...................................... 7
Figure 3. Mécanismes d’action des bêta-lactamines, leurs inhibiteurs et leurs adjuvants .................. 11
Figure 4. Structures chimiques des inhibiteurs de β-lactamases (composés 10-11-14-17-18) et des
bêtalactamines (composés 12-13-15-16) .............................................................................................. 16
Figure 5. Structures chimiques des inhibiteurs des β-lactamases (composés 19-25). ......................... 19
Figure 6. Structures chimiques des inhibiteurs des pompes d’efflux (composés 26-32)...................... 23
Figure 7. Structures chimiques de la Ménadione 33, CSA-13 34 et CSA-8 35 ....................................... 27
Figure 8. Structures chimiques des dérivés polyamines (composés 36-46) .......................................... 32
Figure 9. Structures chimiques caractéristiques de polyamines naturelles courantes......................... 38
Figure 10. Structures chimiques du géraniol 47 et du PAβN ............................................................... 40
Figure 11. Structures chimiques des deux meilleurs dérivés polyaminoisoprényles vis-à-vis des
souches MDR d’Enterobacter aerogenes Ea289 et de Salmonella enterica Thyphimurium BN10055 . 41
Figure 12. Structure chimique de la squalamine 38 .............................................................................. 41
Figure 13. Structure chimique de l’ianthelliformisamine A 42 ............................................................. 42
Figure 14. Structure chimique de la motuporamine MOTU-N44 41..................................................... 42
Figure 15. Mécanisme d’action de MOTU-N44 41 sur la membrane bactérienne 156 .......................... 44
Figure 16. Structures chimiques de l'halocyamine A 50 et ses dérivés................................................. 45
Figure 17. Structures chimiques des ianthelliformisamines 44 et 53-54 .............................................. 46
Figure 18. Structures chimiques des dérivés indoliques 55- 57 ............................................................ 48
Figure 19. Structure chimique du dérivé polyaminoisoprényle NV716 58 ........................................... 49
Figure 20. Principe de l’évaluation de la CMI par la méthode de microdilution .................................. 51
Figure 21. Effet dose-dépendant des différents composés 58- 64 testés en combinaison avec la
doxycycline contre P. aeruginosa PA01 ................................................................................................ 53
Figure 22. Restauration de l’efficacité de différentes cyclines vis-à-vis de P. aeruginosa PA01 en
présence des dérivés NV716 58 et 59-63 (10 µM) ................................................................................ 54
Figure 23. Restauration de l'activité des cyclines vis-à-vis de PA01 en présence des dérivés NV716 58
et 60 (utilisés à une concentration de 10 µM). ..................................................................................... 55
Figure 24. Corrélation du facteur de gain observé en fonction de la valeur du Log P de l’antibiotique
tétracycline considéré. ........................................................................................................................... 56
Figure 25. Principe du suivi de la cinétique d’hydrolyse de la nitrocéfine, selon la thèse de Marine
Blanchet166 ............................................................................................................................................. 57
Figure 26. Principe de la réaction d’hydrolyse de la nitrocéfine par une β-lactamase ......................... 57
Figure 27. Structures chimiques de la polymyxine B (PMB) et la polymyxine B nonapeptide (PMBn) 58
Figure 28. Comparaison de la cinétique d'hydrolyse de la nitrocéfine en présence de PMB, PMBn et
des dérivés 58-61 (a) et des dérivés 62-64 (b) utilisés à une concentration de 64 µM. ....................... 59
Figure 29. Comparaison des effets de perméabilisation membranaire des dérivé 58-64 (64µM) avec
ceux de la PMB ...................................................................................................................................... 60
Figure 30. Comparaison des effets de perméabilisation membranaire du dérivé NV716 58 (utilisé à
différentes concentrations) à ceux obtenus avec la PMB..................................................................... 60
Figure 31. Effet bactéricide/ bactériostatique de la doxycycline seule ou en combinaison avec le
composé NV716 58 utilisés à différentes concentrations vis-à-vis de P. aeruginosa PA01 ................. 62
Figure 32. Illustration du système respiratoire 186 ................................................................................ 67
Figure 33. Courbe de distribution massique des particules d’un aérosol ............................................. 72
Figure 34. Les principaux modes de dépôt des particules d'aérosol dans les voies respiratoires ........ 79

xiii
Figure 35. Influence de la taille des particules sur leur site de dépôt au niveau pulmonaire .............. 80
Figure 36. Schéma d'un nébuliseur à jet d'air ....................................................................................... 82
Figure 37. Schéma d'un nébuliseur ultrasonique .................................................................................. 82
Figure 38. Représentation schématique d'un nébuliseur à mailles vibrantes ...................................... 83
Figure 39. Schéma des inhalateurs-doseurs pressurisés pMDIs ........................................................... 85
Figure 40. Représentation schématique des types d'inhalateurs à poudre sèche IPSs ........................ 88
Figure 41. Illustration schématique de l’inhalateur Respimat® Soft Mist™ montrant les composants
clés de l’appareil et les détails de l’uniblock 356 .................................................................................... 93
Figure 42. Impacteur de Nouvelle Génération NGI utilisé pour la caractérisation aérodynamique des
aérosols 402........................................................................................................................................... 105
Figure 43. Attachement du nébuliseur à l’impacteur NGI au cours du test d’impaction ................... 106
Figure 44. Pourcentage de souches de P. aeruginosa (a) et facteur de gain (b) lié à la restauration de
l'activité de la doxycycline en présence de l’adjuvant NV716 ............................................................ 108
Figure 45. Distribution massique de chaque composé (Doxycycline et NV716) sur les étages de
l’impacteur NGI résultant de la nébulisation de chaque composé seul ............................................. 111
Figure 46. Caractérisation des gouttelettes (MMAD et GSD) (a) et Fraction des Particules Fines (FPF%)
(b) obtenues par la nébulisation de la combinaison doxycycline/NV716 ........................................... 112
Figure 47. Distribution massique sur les étages de l’impacteur NGI résultant de la nébulisation des
deux composés ensemble (doxycycline/NV716) ................................................................................ 113
Figure 48. Propriétés aérodynamiques de l'aérosol de la combinaison selon différentes
concentrations de doxycycline et du NV716 (a) et différentes durées de nébulisation (b) ............... 114
Figure 49. Caractérisation des gouttelettes (a) et Fraction des Particules Fines (b) de l'aérosol de la
combinaison doxycycline/NV716 généré par différents nébuliseurs ................................................. 118
Figure 50. Distribution de masse de la doxycycline et du NV716 sur les étages du NGI obtenue avec
trois nébuliseurs différents : PARI eFlow® (a), Pari Sprint® (b) et Pari LC Plus® (c) ............................ 119
Figure 51. Comparaison des performances des trois nébuliseurs (PARI LC Plus®, PARI Sprint® et PARI
eFlow®). ............................................................................................................................................... 120
Figure 52. Représentation du domaine de variation avec les niveaux bas et haut d’un facteur (a) ainsi
que du domaine expérimental défini par les domaines des différents facteurs (b).430 ...................... 126
Figure 53. MMADs obtenus pour les particules des deux composés en association avec les deux types
de large lactose (a) ainsi que leur domaine de variation (b)............................................................... 131
Figure 54. Effets d'interaction de premier ordre – MMAD, en fonction du type de lactose (a) et en
fonction du principe actif (b) ............................................................................................................... 132
Figure 55. Fraction de Particules Fines obtenues avec les différents mélanges des deux composés
avec les deux types de large lactose (a), le domaine de variation des FPFs (b).................................. 133
Figure 56. Effets d'interaction de premier ordre – FPF, en fonction du type de lactose (a) et en
fonction du principe actif (b) ............................................................................................................... 133
Figure 57. Doses Emises et Doses Délivrées obtenues à partir des différents mélanges des deux
composés avec le lactose LH206 (a) ou RESPI003 (b) ......................................................................... 134
Figure 58. Profils de dépôt sur les étages du NGI des particules inhalées de la doxycycline (a) ou du
NV716 (b) délivrées séparément ou en tant que combinaison NV716/doxycycline en mélange avec le
lactose LH206 (c) ou RESPI003 (d) ................................................................................................... 135
Figure 59. Propriétés aérodynamiques MMAD (a) et FPF (b) des aérosols impliquant un mélange des
poudres de la doxycycline et du NV716 selon différents facteurs. Box Plots pour les réponses MMAD
(c) et FPF (d) représentent graphiquement leur plage de variation. .................................................. 137
Figure 60. Analyse de l'impact de plusieurs facteurs sur les caractéristiques aérodynamiques : le
MMAD (a, b) et la FPF (c, d) du mélange doxycycline/NV716 testé en inhalation. ............................ 138
Figure 61. Ordre et durée de mélange des deux composés avec le lactose pour obtenir une poudre
pour inhalation. ................................................................................................................................... 140
xiv
Figure 62. Modèles de dépôt sur les étages du NGI du mélange doxycycline /NV716 délivrés selon les
facteurs optimaux ............................................................................................................................... 143
Figure 63. CMIs du composé HD3 et de la doxycycline vis-à-vis de PA01 (a). CMIs (µg/mL) du
composé HD13 et de l’érythromycine vis-à-vis de K. pneumoniae ATCC 51296 et de E. coli ATCC
25922 (b) ............................................................................................................................................. 148
Figure 64. Principe du test d’échiquier permettant la détermination simultanée des CMIs et de la FIC
............................................................................................................................................................. 149
Figure 65. Cinétique d’hydrolyse de la nitrocéfine en présence du HD3 (a) et HD13 (b)................... 152
Figure 66. Principe de l’étude de l’effet d’un composé sur l’intégrité membranaire (libération d’ATP
intracellulaire) des bactéries à Gram-négatif, selon la thèse de Marine Blanchet 166 ........................ 154
Figure 67. Mesure de la libération d’ATP en présence des composés HD3 et HD13 chez PA01(a), K.
pneumoniae ATCC51296 (b) et E. coli ATCC25922 (c) ......................................................................... 155
Figure 68. Principe du test de dépolarisation membranaire (libération du DiSC3(5)) réalisé sur une
bactérie à Gram-négatif, issu de la thèse de Marine. Blanchet 166 ..................................................... 156
Figure 69. Mesure de la fluorescence du DiSC3(5) chez PA01(a), K. pneumoniae ATCC51296 (b) et E.
coli ATCC25922 (c) en présence des composés HD3 et HD13 ............................................................ 157
Figure 70. Principe du test d’efflux en temps réel par l’évaluation de l’efflux du 1,2'-diNA déclenché
par le glucose, selon la thèse de Marine Blanchet166 ........................................................................... 158
Figure 71. Mesure de la capacité des composés HD3 (a) et HD13 (b) à inhiber l’efflux chez EA289 . 159
Figure 72. Mécanisme d’action des deux meilleurs Hanamines (HD3 et HD13) ................................ 160

xv
 LISTE DES TABLEAUX

Tableau 1. Concentrations Minimales Inhibitrices CMIs des antibiotiques en présence d'inhibiteurs

des bêta-lactamases .............................................................................................................................. 20
Tableau 2. CMIs des antibiotiques en présence des inhibiteurs 27-31 vis-à-vis des bactéries à Gram-
négatif. .................................................................................................................................................. 25
Tableau 3. CMIs des antibiotiques en présence de la ménadione 31, CSA-13 32, et CSA-8 33 vis-à-vis
des bactéries à Gram-négatif ................................................................................................................ 28
Tableau 4. CMIs des antibiotiques en présence des adjuvants 36-46 vis-à-vis des bactéries à Gram-
négatif ................................................................................................................................................... 34
Tableau 5. Concentrations du dérivé motuporamine MOTU-N44 41 (µM) nécessaires pour restaurer
l’activité de la doxycycline à (2 µg/mL) vis-à-vis des souches à Gram-négatif...................................... 43
Tableau 6. Résumé de l’activité des différents dérivé indolique et leurs concentrations nécessaires
pour restaurer l’activité de la doxycycline à (2 µg/mL) vis-à-vis de P. aeruginosa ATCC27853 ........... 47
Tableau 7. Rendement de la synthèse du composé NV716 58 obtenus avec différents solvants ....... 50
Tableau 8. CMIs de la doxycycline et des dérivés 58-64 vis-à-vis de P. aeruginosa PA01 .................... 52
Tableau 9. Facteurs de gain obtenus pour la combinaison de la doxycycline avec les différents
composés 58- 64 utilisés à différentes concentrations (10 µM)........................................................... 53
Tableau 10. Concentrations des différents composés nécessaires pour rétablir l'activité de la
doxycycline à une concentration de 2 µg/mL vis-à-vis de P. aeruginosa PA01 .................................... 54
Tableau 11. CMIs de la doxycycline en présence ou en absence du composé NV716 58 contre des
souches mutantes de P. aeruginosa ..................................................................................................... 61
Tableau 12. Avantages et limitations des différents antibiotiques commercialisés sous forme
d’aérosol ................................................................................................................................................ 98
Tableau 13. Paramètres aérodynamiques de l'aérosol de chaque composé nébulisé séparément
doxycycline et NV716 : ........................................................................................................................ 110
Tableau 14. Paramètres de nébulisation de l'aérosol de la combinaison (doxycycline/NV716) ........ 111
Tableau 15. Paramètres de nébulisation utilisés pour la caractérisation aérodynamique de l'aérosol
de la combinaison pour différentes concentrations ........................................................................... 113
Tableau 16. Paramètres de nébulisation utilisés pour la caractérisation aérodynamique de l'aérosol
de la combinaison pour différentes durées de nébulisation .............................................................. 114
Tableau 17. Comparaison des paramètres de nébulisation obtenu par trois nébuliseurs différents
(PARI LC Plus®, PARI Sprint and PARI eFlow®)..................................................................................... 117
Tableau 18. Résumé des facteurs et des niveaux de la pré-étude conçue pour choisir la meilleure
taille du large lactose .......................................................................................................................... 127
Tableau 19. Différents mélanges proposés pour la pré-étude permettant de choisir la taille optimale
du large lactose ................................................................................................................................... 128
Tableau 20. Domaine expérimental résumant les différents facteurs étudiés et leurs niveaux ........ 129
Tableau 21. Plan expérimental proposé pour étudier l'influence de plusieurs facteurs sur l'efficacité
d'aérosolisation du mélange de poudre de la doxycycline et du NV716 ............................................ 130
Tableau 22. Paramètres aérodynamiques des aérosols impliquant la doxycycline, le NV716
séparément ou en mélange, en association avec le lactose LH206 ou RESPI003 ............................... 131
Tableau 23. Constituants de la formulation optimale (doxycycline/NV716) et ses caractéristiques
aérodynamiques en inhalation............................................................................................................ 142
Tableau 24. Synthèse et structures chimiques des dérivés HD5-HD17 .............................................. 146

xvi
Tableau 25. CMIs des Hanamines (µM) seules et en combinaison avec la doxycycline (SYN1) ou avec
l’érythromycine (SYN2) utilisées à 2 µg/mL vis-à-vis de PA01, K pneumoniae ATCC51296 et E. coli
ATCC25922 .......................................................................................................................................... 147
Tableau 26. Valeurs des FICs obtenues avec différentes combinaisons de la doxycycline ou
érythromycine) avec les Hanamines HD3 et HD13 vis-à-vis de 3 souches à Gram-négatif ................ 150

LISTE DES SCHÉMAS

Schéma 1. Synthèse du dérivé polyaminofarnésyle NV716 58 ............................................................. 49

Schéma 2.Structures des dérivés polyaminofarnésyles et polyaminogéranyles 59-64 synthétisés ..... 50
Schéma 3. Procédé de synthèse du dérivé HD1.................................................................................. 145
Schéma 4. Structures chimiques des composés HD2, HD3 et HD4 .................................................... 145

xvii
 INTRODUCTION GÉNÉRALE
Les antibiotiques, qu’ils soient bactéricides (qui tuent directement la bactérie) ou
bactériostatiques (qui inhibent la croissance bactérienne) ont été longtemps considérés comme
des produits miraculeux qui ont révolutionné la thérapeutique clinique. Ils ont permis de traiter
les maladies infectieuses, très courantes à l’époque pré-antibiotique et ainsi sauvé la vie des
millions de personnes qui n'auraient peut-être pas survécus sans leur utilisation.1,2 Au fils des
ans, en raison de leur facilité de prise (généralement sous forme de comprimés pour la voie
orale), leurs coûts relativement faibles et leur efficacité dans le traitement des maladies
infectieuses telles que les pneumonies, les otites et les infections cutanées, leur utilisation s’est
ancrée dans notre culture.1 Ils sont également employés à titre prophylactique pour prévenir le
développement des maladies infectieuses ainsi que dans divers consommables tels que le savon,
le dentifrice et même dans la nourriture.1 Ainsi, avec cette utilisation excessive et inappropriée
des antibiotiques les bactéries ont développé leurs propres moyens de défense et sont devenues
de plus en plus résistantes à leur action. Au cours des 20 dernières années, le monde a connu
une fréquence croissante d’émergence et de dissémination des souches résistantes qui sont
devenues une véritable menace de plus en plus préoccupante pour la santé publique.3
Malheureusement, l’âge d’or inauguré par les antibiotiques n’a pas duré longtemps
puisqu’après seulement huit décennies d'utilisation certaines infections bactériennes sont en
train de devenir incurables.2

En contrepartie, le rythme de développement de nouveaux antibiotiques a considérablement

ralenti et les médicaments dont nous disposons actuellement deviennent de plus en plus
inefficaces.1 Selon un rapport publié en 2013 par le CDC (Centers for Disease Control) sur les
menaces de la résistance bactérienne aux antibiotiques : plus de 3 400 décès par an aux Etats
Unis sont causés par des bactérie à Gram-négatif avec plus de 730 000 infections.4 Cet écart
énorme entre les besoins thérapeutiques et le nombre réel des nouveaux médicaments tire la
sonnette d’alarme sur la nécessité à trouver des stratégies innovantes pour combattre
l’émergence des bactéries résistantes, avant de nous retrouver dans une ère où aucun
antibiotique n’est efficace dans le traitement des infections bactériennes.1

En outre, dans le cas des maladies infectieuses respiratoires, il existe un besoin urgent de
développer de nouveaux modes de délivrance des antibiotiques étant donné que l’efficacité d’un
traitement ne dépend pas uniquement du potentiel thérapeutique du principe actif mais

1
 Introduction générale

également de son mode d’administration qui détermine la concentration de l’antibiotique au

niveau du site cible où une concentration optimale est requise afin d’assurer une activité
maximale tout en restant le plus éloigné possible de sa concentration cytotoxique. Ainsi, les
nouveaux systèmes de délivrance d’antibiotiques visent à l’amélioration de l’efficacité
thérapeutique via l’augmentation des concentrations locales en principes actifs, la minimisation
du risque d’émergence des souches résistantes et la prévention de la réinfection.5 Dans ce
contexte, la voie pulmonaire apparait comme un mode précieux d’administration locale des
antibiotiques pour la prise en charge des infections pulmonaires en raison de ses multiples
avantages y compris le ciblage de la zone à traiter, la rapidité d’obtention de l’effet
pharmacologique, la minimisation des doses administrées ainsi que des effets secondaires en
raison de la faible exposition systémique.

Parmi les différentes approches envisagées pour remédier au problème de résistance

bactérienne, la stratégie de co-formulation des antibiotiques avec des adjuvants inhibant la
résistance et renforçant l’activité antibactérienne apparait comme une solution prometteuse
pour préserver l’arsenal d’antibiotiques déjà existant. Les résultats obtenus par des études
précédemment réalisées dans notre laboratoire en utilisant le principe de combinaison des
antibiotiques avec des dérivés polyaminés en vue de potentialiser leurs activités
antibactériennes et restaurer la sensibilité des souches résistantes ont encouragé la poursuite de
recherches dans cette voie.

C’est dans ce cadre d’idées que ce projet de thèse se situe dont l’objectif principal était de
contribuer à la recherche de solutions pour lutter contre la résistance bactérienne aux
antibiotiques et ceci à travers :

➢ Le développement d’une forme pharmaceutique pour inhalation (sous forme d’une

solution ou d’une poudre) pour le traitement des infections respiratoires à Pseudomonas
aeruginosa connue par sa forte capacité à résister aux traitements antibiotiques et
responsable d’infections aiguës et chroniques qui menacent le pronostic vital des
personnes infectées.6-8 Cette forme pharmaceutique est composée d’une combinaison
d’un antibiotique (la doxycycline) avec un adjuvant permettant la potentialisation de
son activité antibactérienne et la restauration de la sensibilité bactérienne.
➢ La caractérisation du profil aérodynamique in vitro des principes actifs et l’évaluation
de la performance de leur combinaison en inhalation dans le but d'assurer leur
délivrance optimale vers le site d'action cible.

2
 Introduction générale

➢ La mise en place d’un protocole de synthèse de nouveaux dérivés polyaminés en vue

de la recherche de nouvelles molécules chimiosensibilisantes des antibiotiques vis-à-
vis des bactéries à Gram-négatif résistantes.
Afin d’aborder l’ensemble de ces objectifs, cette thèse a été divisée en six chapitres :
- Le premier chapitre présente une analyse bibliographique expliquant le concept
d’adjuvants aux antibiotiques ainsi que ses avantages et détaillant les différentes classes
d’adjuvants et les exemples de molécules citées dans la littérature ayant conduit à des
résultats promoteurs en tant que potentialisateurs d’antibiotiques, ce travail a fait l’objet
d’un 1er article de revue (Journal of Medicinal Chemistry).
- Le deuxième chapitre présente les résultats du développement et de l’évaluation du
potentiel antibactérien d’un modèle d’adjuvants aux antibiotiques tétracyclines plus
précisément la doxycycline, basé sur des dérivés polyaminoisoprényles à diversité
structurale. Cette étude a été publiée dans le journal Anti-Infective Agents.
- Le troisième chapitre présente une étude bibliographique exhaustive réalisée sur
l’administration des antibiotiques par voie inhalée, ses avantages et ses limitations et
constitue une partie introductive aux résultats expérimentaux détaillés par la suite. Ce
travail a fait l’objet d’un 2ème article de revue publié dans Journal of Controlled Release.
- Le quatrième chapitre présente les résultats du développement et de la caractérisation
aérodynamique in vitro d’une solution pour inhalation basée sur la combinaison de la
doxycycline avec le meilleur dérivé (le composé NV716) choisi en fonction des résultats
obtenus dans le premier chapitre, ainsi que la prédiction du site de dépôt pulmonaire de
ces deux composés. Les résultats de cette étude ont été publiés dans International
Journal of Pharmaceutics.
- Dans le cinquième chapitre, nous avons décrit la mise en place d’une méthodologie
expérimentale permettant d’évaluer l’adaptabilité de la combinaison précédente
(Doxycycline/NV716) à l’administration par inhalation sous forme d’une poudre et
l’influence de différents facteurs sur le profil aérodynamique et le site de dépôt au
niveau pulmonaire des principes actifs afin de définir la formulation la plus adaptée.
Cette étude d’optimisation a fait l’objet d’un article soumis dans Journal of Controlled
Release.
- Le dernier chapitre présente la synthèse de nouveaux types de dérivés polyaminés,
l’étude de leur activité antibactérienne intrinsèque, de leur capacité à potentialiser les
antibiotiques ainsi que le mode d’action des molécules présentant le meilleur profil
d’activité adjuvante.
3
 Introduction générale

Les résultats les plus significatifs de ce travail ainsi que les éventuelles perspectives seront
résumées dans la conclusion générale. Enfin, dans la partie matériels et méthodes, nous
détaillerons les matériels et les différents protocoles expérimentaux utilisés tout au long de ce
travail de thèse.

4
 Chapitre 1 :

Les adjuvants aux antibiotiques : Une stratégie prometteuse

pour restaurer l’efficacité des antibiotiques classiques

(Synthèse bibliographique)

5
 Chapitre 1

I. Introduction :

Depuis la découverte de la pénicilline en 1940 par Alexander Fleming, les antibiotiques ont
représenté l’une des plus importantes avancées en thérapeutique clinique.9 Cependant, le
développement des mécanismes de résistance aux antibiotiques par les bactéries d’une part, et
la disponibilité d’un nombre restreint de nouveaux antibiotiques d’autre part tendent à limiter
les possibilités de traitement des infections bactériennes (Figure 1).

Figure 1. Structures chimiques d’antibiotiques représentatifs

Ainsi, pour réduire l’émergence de cette résistance, il est capital de comprendre les différentes
stratégies mises en œuvre par les bactéries pour résister à l’action des antibiotiques.10
Pour qu’un antibiotique soit fonctionnel, trois conditions doivent être remplies :

‐ La cible de l’antibiotique doit être présente et intacte dans la cellule bactérienne.

‐ L’antibiotique doit pouvoir atteindre sa cible en quantité suffisante.
‐ L’antibiotique ne doit pas subir une modification le rendant inactif.

6
 Chapitre 1

L’altération d’une de ces conditions entraine une résistance à l’action de l’antibiotique, qui peut
survenir selon différents mécanismes (Figure 2) :

‐ Modification de sa cible par suite d’une mutation.

‐ Diminution de la perméabilité de la membrane bactérienne à l’antibiotique, qui
représente la cause la plus fréquente de la résistance intrinsèque.
‐ Réduction de l’entrée de l’antibiotique dans la bactérie ou augmentation de son efflux,
pour l’empêcher d’atteindre sa cible en quantité suffisante.
‐ Les processus de désactivation de l’antibiotique comme l’hydrolyse enzymatique ou
toute autre modification chimique qui réduit l’affinité de l’antibiotique avec sa cible ou
la rend nulle.1-3

A
Impermeabilité
membranaire

Antibiotique
B
Surexpression des
Chromosome pompes d’efflux

Plasmide

Pompe d’efflux C
Modification
La cible d’antibiotique de la cible

B-Lactamase

D
Inactivation
de l’antibiotique

Figure 2. Mécanismes de résistance des bactéries vis-à-vis des antibiotiques

A) Réduction de la perméabilité membranaire empêchant l'entrée de l'antibiotique. B) Surexpression

des pompes d’efflux qui expulsent l’antibiotique vers l’extérieur de la bactérie. C) Modification de
la cible de l’antibiotique la rendant méconnaissable. D) Inactivation enzymatique de l’antibiotique
engendrant la perte de son activité.

7
 Chapitre 1

Dans ce chapitre nous examinerons les différents types de mécanisme de résistance connus
et les nouvelles stratégies mises au point pour lutter contre cette résistance bactérienne grâce
au développement d’adjuvants permettant d’améliorer les performances des antibiotiques.

II. Résistance aux antibiotiques :

II.1. Modification de la cible

La modification de la cible moléculaire de l’antibiotique représente l’un des mécanismes de

résistance les plus répandus développés par les bactéries. Cette modification peut ainsi avoir
lieu suite à une mutation ponctuelle dans des gènes sélectionnés provoquant une résistance
rapide vue qu’elle affecte directement la structure de la cible de l’antibiotique chez les
microbes.9 Dans la majorité des cas, ces changements mutationnels auront pour conséquence
une réduction de la sensibilité à l'inhibition tout en conservant les fonctions cellulaires de la
cible. Par contre, certaines modifications de cette dernière sont généralement accompagnées de
changements dans la cellule compensant les caractéristiques de la cible modifiée.9,11
Non seulement une mutation mais également une catalyse enzymatique hautement efficace et
régiosélective (méthyltransférase ) peut être à l’origine de la modification de la cible.9,11 Ainsi,
comme l’interaction de l’antibiotique avec sa cible est complémentaire, la moindre altération
structurale de la cible aura des effets importants sur sa liaison avec les antibiotiques, par
exemple une altération de la sous-unité 30s ou 50s du ribosome par une méthyltransférase
engendre une résistance aux antibiotiques comme les macrolides, les tétracyclines et d'autres
agents de cette catégorie qui ciblent la synthèse protéique.

II.2. Pompes d’efflux :

Un autre mécanisme de résistance est l’expulsion active des antibiotiques vers l’extérieur de la
cellule. Cette résistance est due à des protéines de transport spécifiques nommées les pompes
d’efflux et impliquées dans l'élimination des substances toxiques.12 Ce type de résistance affecte
surtout les antibiotiques (en particulier les macrolides, les tétracyclines et les fluoroquinolones)
qui exercent leur action à l’intérieur de la cellule et inhibent la biosynthèse des protéines et de
l’ADN.11-13 Les pompes d'efflux diffèrent par leur spécificité et leurs mécanismes,11-13 certaines
sont spécifiques n'exportant qu'un seul type de molécule, d’autres sont dites à large spectre et

8
 Chapitre 1

sont capables d’expulser des classes de molécules structurellement distinctes, définissant ainsi
la résistance multiple.11,14-16

Ces pompes sont classées en cinq familles : la famille ATP-Binding Cassette (ABC), la famille
Small Multidrug Resistance (SMR), la famille Major Facilitator Superfamily (MFS), la famille
Multidrug And Toxic-compound Extrusion (MATE) et la famille Resistance-Nodulation-cell
Division (RND).11,14-16 Cette classification tient compte du nombre d’unités qui composent la
pompe (unique ou multiple), la source d’énergie utilisée et le type de substrat exporté.16 Le
phénomène d’efflux d’antibiotique est un mécanisme « actif » qui nécessite de l’énergie pour
le déplacement des composés contre leur gradient de concentration, on note que toutes les
familles des pompes d’efflux utilisent la force protomotrice pour avoir l’énergie nécessaire à
leur fonctionnement, à l’exception de la famille ABC qui utilise l’énergie fournie par
l’hydrolyse de l’ATP.15,17

II.3. Inactivation de l’antibiotique :

Plusieurs stratégies ont été développées par les bactéries pour s’opposer à l’effet des
antibiotiques, l’une d’elles implique la production d’enzymes capables de modifier ou de
dégrader l’architecture de l’antibiotique par le biais de réactions d’hydrolyse, de transferts de
groupes et de mécanismes d’oxydoréduction.11

L’inactivation des antibiotiques par hydrolyse est un mécanisme de défense facilité par la
présence de liaisons chimiques sensibles à l’hydrolyse (par exemple les liaisons esters ou
amides) qui constituent la cible de nombreuses enzymes telles que les estérases et les amidases
excrétées par les bactéries et capables de cliver ces groupes fonctionnels sensibles conduisant
ainsi à l’inactivation de l’antibiotique avant qu’il n’atteigne sa cible.11 Le développement de
tels catalyseurs aussi efficaces témoigne de la puissance des mécanismes de défense des
bactéries vis-à-vis des antibiotiques.18

De nombreuses enzymes ont été rapportées dans la littérature comme capables de modifier ou
de détruire les antibiotiques et les bêta-lactamases représentent les enzymes de résistance les
plus répandues et cliniquement les plus importantes.19
Elles sont responsables du clivage hydrolytique du cycle bêta-lactame, l'élément structural clé
responsable de l'activité de certains antibiotiques, puisqu’il assure l’acylation irréversible des

9
 Chapitre 1

Protéines de Liaison aux Pénicillines (PBPs), qui produisent le peptidoglycane, un biopolymère

essentiel qui assure l'intégrité structurelle de la paroi bactérienne.
Ainsi, les β-lactamases hydrolysent presque toutes les β-lactamines, telles que les
céphalosporines, les pénicillines, les carbapénèmes et les monobactames, et génèrent des
produits à cycle ouvert qui sont microbiologiquement inactifs.11-13 Les gènes codants pour ces
enzymes sont très répandus dans le règne bactérien et sont portés sur des chromosomes ou des
plasmides.19 Les bactéries à Gram-négatif libèrent leurs bêta-lactamases dans le périplasme
pour empêcher l’antibiotique d’atteindre sa cible PBP dans la membrane cytoplasmique,20 alors
que les bactéries à Gram-positif excrètent leurs enzymes au niveau extracellulaire.19 On note
qu’il existe des centaines de bêta-lactamases, ayant toutes la même fonction, la seule différence
résidant dans les séquences d’acides aminés influençant ainsi leur affinité aux différents
substrats. Elles peuvent être classées de deux façons différentes : une classification structurelle
(dite d’Ambler) et une classification fonctionnelle (dite de Bush-Jacoby).19,21

L’utilisation répétée des bêta-lactamines a stimulé la synthèse d’enzymes particulièrement

actives, attaquant et dégradant la plupart des bêta-lactamines et appelées les bêta-lactamases à
spectre étendues « BLSE ».19,21,22 A ce jour, plus de 180 BLSE différentes ont été identifiées
surtout chez Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae et Proteus mirabilis. 23,24
L’absence de fonctions chimiques sensibles à l’hydrolyse dans la structure chimique des
aminosides permet à ces dernières d’échapper à l’action des bêta-lactamases. Cependant, les
bactéries ont développé d’autres classes d’enzymes capables de désactiver ces inhibiteurs de la
synthèse protéique pour empêcher leur liaison à l’ARN du ribosome (Figure 3).

De nombreuses études réalisées sur une variété de micro-organismes ont révélé la présence de
nombreux loci génétiques impliqués dans la résistance aux antibiotiques.11 Les gènes
responsables de résistance sont très variés, d’une part parce qu’il y a plusieurs cibles différentes
de l’antibiotique dans la cellule et d’autre part parce que certaines cibles nécessitent
l’expression de nombreux gènes à la fois.11
On distingue ainsi deux types de résistance :

1. La résistance naturelle qui est une propriété intrinsèque spécifique à la bactérie en

raison de ses caractéristiques structurelles et fonctionnelles intrinsèques.
2. La résistance acquise qui résulte soit d’une mutation des gènes bactériens soit de
l’acquisition de gènes de résistance étrangers ou bien de la combinaison de ces deux
mécanismes.25,26
10
 Chapitre 1

Figure 3. Mécanismes d’action des bêta-lactamines, leurs inhibiteurs et leurs adjuvants

11
 Chapitre 1

III. Résistance par mutations :

La résistance bactérienne peut être acquise à la suite de l’apparition de mutations dans

l’information génétique, ces mutations résultent d’erreurs dans la réplication de l’ADN, elles
apparaissent de façon continue et indépendamment de la présence ou l’absence d’un agent
antimicrobien.27-29
Evidemment des mécanismes réparateurs existent et interviennent en permanence pour corriger
ces erreurs de réplication sans laisser d’effet notable. Cependant, certaines de ces mutations
occasionnelles sont sélectionnées positivement en présence d’antibiotiques. Les bactéries qui
portent ces mutations résistent à l’action inhibitrice de l’antibiotique, survivent, prolifèrent et
deviennent le type prédominant alors que les bactéries sensibles sont inhibées et
disparaissent.27-30

Le génome bactérien est constitué d’éléments portant les informations génétiques nécessaires
tout au long du cycle de vie de la cellule bactérienne. En plus des chromosomes, d’autres
éléments génétiques accessoires comme les transposons et les plasmides jouent un rôle
important dans des situations particulières assurant la survie de la bactérie.19,31
Vu que les chromosomes peuvent être hérités de façon verticale d’une bactérie à ses
descendantes et que les éléments génétiques accessoires peuvent être transmis latéralement à
d’autres bactéries voisines,31 la résistance peut être transmise d’une bactérie à l’autre de façon
rapide et facile par transfert de plasmides, de bactériophages, d’ADN nu ou de transposons.23,32
Cette capacité à partager les gènes de résistance nouvellement acquis par transfert de gènes à la
fois vertical et horizontal constitue un grand défi pour la lutte contre la résistance aux
antibiotiques.
On note que le transfert des gènes de résistance se fait selon trois mécanismes. Premièrement,
par conjugaison : ce qui nécessite un contact physique étroit entre les deux bactéries, où
l’adhésion des bactéries les unes aux autres facilite le transfert des plasmides, des gènes de
résistance et des transposons. Dans ce cas les gènes de résistance peuvent être portés sur : un
plasmide conjugué ; un transposon porté sur un plasmide conjugué ou bien un plasmide
conjugué mobilisable sur un chromosome.33 Le deuxième mécanisme est basé sur la
transduction qui consiste en l’incorporation accidentelle d’ADN bactérien initialement porté
sur un chromosome ou un plasmide, dans un bactériophage ou un virus infectant qui va
transporter les gènes de résistance à la cellule infectée.19,34 Le troisième mécanisme possible est

12
 Chapitre 1

la transformation qui se fait par absorption d’ADN nu généré par la décomposition des cellules
bactériennes.19

IV. Adjuvants aux antibiotiques :

Dans ce contexte, la propagation des souches bactériennes à Gram-négatif résistantes apparaît

comme une préoccupation de plus en plus importante pour la santé publique puisque rendant
les antibiotiques de moins en moins efficaces. Il y a donc un besoin urgent de lignes directrices
pour développer des composés capables de traverser les membranes externes et internes de ces
bactéries. En effet, l’entrée des médicaments dans les bactéries à Gram-négatif est plus difficile
pour les antibiotiques avec des cibles cytosoliques, car ils doivent traverser deux bicouches
lipidiques protectrices. La membrane interne limite ainsi considérablement la diffusion des
molécules hydrophiles. Dans le même temps, contrairement à ce qui est observé au niveau de
la membrane externe, les molécules hydrophobes traversent facilement la membrane interne
par diffusion passive.
Au cours des vingt dernières années, quatre approches thérapeutiques principales ont été
envisagées afin de retarder le développement de la résistance aux antibiotiques, telle que :

1. Une thérapie anti-virulence où les agents qui ne sont pas bactéricides inhibent
indirectement la voie moléculaire responsable de la communication bactérienne,
2. Une thérapie combinée où les cliniciens prescrivent deux ou plusieurs antibiotiques en
même temps en traitement empirique pour assurer la couverture de tous les pathogènes
bactériens possibles,
3. Le développement d’antibiotiques moléculaires hybrides en fusionnant différents
agents biologiquement actifs en une seule entité hétéromérique avec l'espoir de
conserver les actions biologiques des différents constituants, 35
4. Une approche combinée antibiotiques-adjuvants.

La combinaison des médicaments antimicrobiens est généralement d’un usage particulier en

thérapie clinique pour couvrir un spectre de bactéries plus large, atteindre une ultime efficacité
ou vaincre la résistance aux traitements.36,37 Ces combinaisons ont représenté des stratégies
efficaces pour préserver l’efficacité des antibiotiques actuels, le résultat est une meilleure
efficacité tout en minimisant les concentrations nécessaires.38 Néanmoins, en raison de
l'émergence de souches bactériennes multirésistantes (MDR), il semble important d'envisager

13
 Chapitre 1

de nouvelles stratégies. Ce chapitre porte exclusivement sur la stratégie combinée antibiotiques-

adjuvants et ne couvre pas les autres approches qui ont déjà été largement abordées dans la
littérature. 35

La combinaison d’antibiotiques avec d’autres entités chimiques possédant des mécanismes

d’action non nécessairement antimicrobien peut être appliquée en vue de la recherche de
synergies en ciblant des étapes distinctes dans les mécanismes biochimiques, améliorant
l’absorption ou supprimant l’efflux par exemple.37,39 Ces composés particuliers sont appelés
"adjuvants". Le concept d'adjuvants aux antibiotiques traite de la capacité d'une molécule à
potentialiser et à améliorer l'effet d'un antibiotique en sa présence vis-à-vis d’une bactérie
résistante.40
Connus sous différentes appellations : «disjoncteurs de résistance», «chimiosensibilisateurs»
ou «potentialisateurs d’antibiotiques»,41,42 les adjuvants sont des composés dépourvus
d’activité antimicrobienne propre bien qu’ils puissent exercer une légère action inhibitrice de
la croissance bactérienne. En résumé, on peut considérer en première approche qu’une fois
coadministrés avec un antibiotique, ils « suppriment la résistance » et «améliorent l’effet
inhibiteur».39,43
On peut les classer de différentes manières, selon le mécanisme de résistance auquel ils
s’opposent. Par exemple, on peut distinguer les inhibiteurs de -lactamases qui sont des
molécules empêchant la dégradation de certains antibiotiques avant qu’ils n’atteignent leurs
cibles mais également les inhibiteurs des pompes à efflux qui empêchent l'expulsion des
médicaments vers l'extérieur ainsi que les perméabilisants de la membrane externe qui visent à
augmenter la concentration intracellulaire des molécules d’intérêt à l’intérieur de la bactérie.

Néanmoins, dépendant de l'action menée et de la cible considérée, on peut distinguer trois

grands groupes d'adjuvants comme le propose G. Wright 44:

1. Groupe 1 : adjuvants qui possèdent une activité antibactérienne exercée directement sur la
cellule bactérienne.44
2. Groupe 2 : englobe les composés dits « composés auxiliaires » qui augmentent la
perméabilité de l’agent pathogène à l’antibiotique.45-47
3. Groupe 3 : basé sur la nature de la cible :
3.1. Le Groupe 3A : est réservé aux adjuvants qui exercent leur action directement sur la
cible (le blocage des voies métaboliques et la perturbation de la physiologie
bactérienne).
14
 Chapitre 1

3.2. Le Groupe 3B : pour les adjuvants qui potentialisent l’activité des antibiotiques en
affectant les propriétés de l’hôte.
Il est à noter que parmi les adjuvants du Groupe 3, les adjuvants de la sous-classe A sont les
seuls utilisés en clinique, alors que ceux du Groupe 3B sont actuellement explorés dans des
modèles précliniques.37

IV.1. Inhibiteurs des bêta-lactamases :

La capacité presque illimitée des bactéries à survivre dans des conditions défavorables leur a
permis de résister à l’action inhibitrice exercée par les antibiotiques et la production d’enzymes
capables d’hydrolyser les molécules antibactériennes est l’un des mécanismes de défense mis
en place.48
Ainsi, l’émergence des souches bactériennes productrices de bêta-lactamases, enzymes
capables de dégrader les bêta-lactamines a limité considérablement l’utilisation de ces dernières
en thérapeutique à long terme. Avec l'augmentation exponentielle des bêta-lactamases, on
assiste ainsi à la nécessité à développer de nouvelles classes d’inhibiteurs efficaces.49
Ces inhibiteurs sont classés en deux types différents (irréversible et réversible) selon le type
d'inhibition exercée :

IV.1.1. Inhibiteurs irréversibles :

Les inhibiteurs irréversibles utilisent la structure bêta-lactame ou un isostère approprié pour se

fixer au plus près du site actif des lactamases en inhibant la fonction enzymatique.48 Le premier
inhibiteur irréversible de bêta-lactamase décrit et introduit en thérapeutique clinique dans les
années 1970 était l’acide clavulanique suivi de près par le Sulbactam. Le dernier introduit sur
le marché est le Tazobactam, un dérivé du Sulbactam, qui a été décrit au début des années 1980
et dont l’usage a été approuvé en 1993 en association avec la pipéracilline.48,50 Ainsi, seuls ces
trois inhibiteurs sont actuellement disponibles sur le marché,51 sous la forme de combinaisons
sous les noms commerciaux suivants : AugmentinTM (amoxicilline + clavulanate),
TimentineTM ( ticarcilline + clavulanate), UnasynTM (ampicilline + sulbactam) et ZosynTM
(pipéracilline + tazobactam) (Figure 4).

15
 Chapitre 1

Figure 4. Structures chimiques des inhibiteurs de β-lactamases (composés 10-11-14-17-18) et

des bêtalactamines (composés 12-13-15-16)

La combinaison la plus connue, AugmentinTM est une combinaison antibactérienne orale

composée d'amoxicilline et de clavulanate de potassium (inhibiteur de -lactamases) ,
employée pour traiter un large éventail de pathologies, allant de la bronchite à la maladie de
Lyme.52 L’acide clavulanique agit en synergie avec l’amoxicilline pour prévenir la croissance
bactérienne en formant une liaison irréversible avec le site fonctionnel des -lactamases. Peu
actif contre les agents pathogènes, l'acide clavulanique inhibe efficacement de nombreuses β-
lactamases à spectre étendu (BLSE),53 capables d'hydrolyser les pénicillines, les monobactames
et les céphalosporines.54,55 Les cliniciens ont estimé que les antibiotiques -lactamines
constituaient une approche thérapeutique idéale en raison de leur efficacité et de leur bonne
tolérance, mais l’émergence d’une résistance croissante a ralenti l'enthousiasme de la
communauté scientifique principalement en raison de la propagation mondiale des gènes codant

16
 Chapitre 1

pour les -lactamases bactériennes. Actuellement, les inhibiteurs de bêta-lactamases approuvés

pour leur utilisation clinique sont incapables d’inhiber à la fois la croissance des bactéries
productrices de pénicillinases de classe A et celles productrices de céphalosporinases de classe
C.

En 2019; un nouveau dérivé le bicyclo [3.2.1] diazabicyclooctanone ETX2514 19, a été

identifié comme étant un puissant inhibiteur couvrant une large gamme de bêta-lactamases et
à un niveau significativement supérieur à celui exercé par l’acide clavulanique, le tazobactam
ou le sulbactam contre les β-lactamases des classes A, C et D.56 Ainsi, il a été démontré que la
capacité de l’ETX2514 à inhiber efficacement la classe D OXA des carbapénèmases en plus
des classes A et C fait du complexe sulbactam-ETX2514 une combinaison antibactérienne
prometteuse pour le traitement des infections à acinetobactéries.56

Les bêta-lactamases sont classées en quatre classes selon des critères structuraux d’une part et
leurs mécanismes d’actions d’autre part, trois d’entre elles (sérine-lactamases (SBL) : classe A,
C et D) utilisent dans leurs mécanismes un site actif sérine, alors que les enzymes de la classe
B font intervenir des cations métalliques divalents (Zn2+) au cours de l’hydrolyse de
l’antibiotique et sont appelées "métallo-bêta-lactamases (MBL)". Actuellement, l’une des
préoccupations majeures consiste en la recherche de molécules capables d’inhiber à la fois les
deux classes de bêta-lactamases.

En 2014, l'Aspergillomarasmine A (AMA) 20, un polyaminoacide naturellement produit par la

moisissure Aspergillus versicolor, a été décrit comme étant capable d’inhiber les protéines de
résistance aux antibiotiques de type carbapénèmases NDM-1 et VIM.57-59 Ainsi, dans un modèle
de souris infectées par K. pneumoniae NDM-1-positive, une dose unique en association de
méropénème (10 mg/kg de poids corporel) et d'AMA 20 (30 mg/kg) a entraîné une survie de
95% après 5 jours post-infection et ce contrairement à l’utilisation du méropénème ou d'AMA
seul aux mêmes concentrations qui conduisent à un taux de survie de 0%.55 Récemment, le
Primaxin60 (imipenème/cilastatine 21) a été amélioré par l'ajout de rélébactam 22 (également
connu sous le nom de MK-7655) en raison de l’augmentation de la prévalence des infections
bactériennes causées par des microorganismes produisant les carbapénèmases qui inactivent
l'imipénème. L'adjuvant MK-7655 est capable d’inhiber l'activité des BLSEs, KPC et AmpC
bêta-lactamases en bloquant de façon irréversible leur site actif.

17
 Chapitre 1

IV.1.2. Inhibiteurs réversibles :

Les inhibiteurs réversibles se lient à l’enzyme de façon provisoire. Ces agents sont impliqués
dans un équilibre dynamique et la réduction de leur effet inhibiteur est sensible à une simple
dilution de l'inhibiteur. Ainsi, la conception de nombreux adjuvants tels que l'avibactam en
2015 ou le vaborbactam en 2017 inhibant les -lactamases apparaît cruciale pour maintenir une
bonne efficacité clinique de la classe -lactamine des antibiotiques. L’avibactam est déjà
disponible sur le marché et l’utilisation du varbobactam a également été approuvé récemment
aux États-Unis .1,40,61,62 De plus, contrairement aux inactivateurs décrits précédemment,
l’avibactam est un inhibiteur covalent et réversible de la plupart des enzymes, à l'exception de
l'enzyme KPC-2 pour laquelle une hydrolyse lente a été observée.63

Bien que les molécules appropriées soient difficiles à élaborer étant donné la grande différence
mécanistique et structurelle entre les sérine-bêta-lactamases (SBL) et les métallo-bêta-
lactamases (MBL) une étude a montré que les boronates cycliques 23 et 24 (Figure 5) peuvent
être considérés comme inhibiteur à double rôle, agissant comme des analogues du premier
intermédiaire tétraédrique commun à ces deux classes dans les voies d’hydrolyses catalysées
par ces enzymes. Ceci a été confirmé par une analyse cristallographique d’un boronate cyclique
complexé avec la bêta-lactamase CTX-M-15. Ceci les rend capables d’inhiber les représentants
des diverses classes des bêta-lactamases y compris A71 BLSE, CTX-M-15, les enzymes de la
classe C et deux variantes OXA-23 et OXA-48 hydrolysant les carbapénèmes.64
Aujourd’hui, les recherches continuent dans ce domaine et quatre nouvelles combinaisons dont
trois englobent une nouvelle classe d’inhibiteurs qui ne sont pas des -lactamines.51
Le choix de l’inhibiteur à combiner avec une β-lactamine est un processus complexe qui doit
prendre en considération plusieurs critères (Figure 5, Tableau 1) :

a. La capacité de l’inhibiteur à protéger l’antibiotique contre l’hydrolyse enzymatique,

b. La quantité d’inhibiteur nécessaire pour assurer cette protection
c. La stabilité de cette combinaison.

18
 Chapitre 1

O O
O S
OH NH2 OH
O
N HO NH OH
NH
O N O O
CONH2 O OH

AVE1330A 19 Aspergillomarasmine A 20

HN O
H H
N N
S O H
N
O
O OH OH N
NH2 O OSO3H

Cilastatin 21 Rélébactam (MK-7655) 22

H2N
O O
HN HN
HO HO
B B
HO O HO O
HO O HO O HO

Boronate cyclique1 23 Boronate cyclique2 24 Stigmastérol 25

Figure 5. Structures chimiques des inhibiteurs des β-lactamases (composés 19-25).

Parmi les recherches réalisées dans ce domaine, la combinaison d’un stéroïde appelé le
stigmastérol 25 avec l’ampicilline a permis une nette amélioration de la sensibilité de cette
dernière contre toutes les bactéries résistantes aux bêta-lactamines testées. Cette synergie a été
validée par le calcul de l'indice de Concentration Inhibitrice Fractionnaire (FIC) qui exprime le
degré de synergie entre les médicaments antibactériens (Voir CHAPITRE6 page 149), pour
deux médicaments A et B en interaction, la somme de leurs FICs FIC = FICA+FICB permet de
définir la nature de l'interaction (additivité, synergie ou antagonisme) .65 Ainsi, l’indice FIC de
la combinaison stigmastérol/ampicilline inférieur à 0.5 suggère que le stigmastérol peut
restaurer l’efficacité de l’ampicilline, par inhibition des bêta-lactamases.66

19
 Chapitre 1

Tableau 1. Concentrations Minimales Inhibitrices CMIs des antibiotiques en présence

d'inhibiteurs des bêta-lactamases

Adjuvant Ref Souche bactérienne Antibiotique β-lactamase CMIa CMIb (ADJ)

S. aureus >200 3,13 (ND)

(µg/mL )
S. pyogenes >200 1,56 (ND)
25 66 AMP ND
E. coli 100 6,25 (ND)
P. aeruginosa >200 6,25 (ND)
S. aureus 01A400 Penicillinase 200 1,56 (3,12)

(µg/mL)
S. epidermidis 01B116 N.D >25 1,56 (3,12)
10 67 PENI G
H. influenzae 54A042 N.D 200 1,56 (1,56)
B. fragilis 78C004 N.D 200 3,12 (0,78)
E. coli GN5482 TEM-1 (A) 4 0,5 (ND)
K. pneumoniae IP1 TEM-2 (A) 16 0,5 (ND)

( µg/mL )
K. pneumoniae 25637 TEM-4 (A) 32 0,5 (ND)
1756 CAZ
E. coli CF3 TEM-8 (A) 64 2 (ND)
K. pneumoniae IP86 SHV-2 (A) 64 1 (ND)
E. coli KB10 PER-1 (A) >64 4 (ND)
AMP >16 ≤8 (10)
PIP > 64 ≤16 (10)
AZT > 16 ≤1 (10)
E. coli (EC113) CTX-M-27 (µg/mL )
24 68 FAZ > 16 4 (10)
ST 131 (A)
CRO > 32 <0.5 (10)
CAZ 8 ≤1 (10)
FEP > 32 ≤4 (10)
(µg/mL )

K. pneumoniae
20 69 MEM NDM-1 (B) 32 1 (8)
N11-2218
(µg/mL )

K. pneumoniae KPC-2 (A) ND 4(12,5µM)

22 70 IMP
P. aeruginosa AmpC ND 4(4,7 µM)

CMIa de l’antibiotique seul ; CMIb de l’antibiotique en présence d’adjuvant (ADJ) à la

concentration requise (μg/mL) ; AMP : Ampicilline ; PENI G : Benzylpénicilline ; CAZ :
Ceftazidime ; PIP : Pipéracilline ; AZT : Aztréonam ; FAZ : Céfazoline ; CRO : Ceftriaxone ;
FEP : Céfépime ; IMP : Imipénem ; MEM : Méropénem ; ND : Non Déterminé.

20
 Chapitre 1

IV.2. Inhibiteurs des pompes d’efflux :

Les mécanismes d’efflux contribuent à la résistance vis à vis de nombreuses classes d’agents
thérapeutiques. Ils résultent de l’activité des transporteurs membranaires impliqués dans une
variété de processus physiologiques nommés les pompes d’efflux.71,72 Ces pompes exercent un
rôle protecteur par l’expulsion de l’antibiotique vers l’extérieur de la cellule bactérienne.71
Certaines sont sélectives n’expulsant qu’un substrat spécifique d’autres sont non sélectives et
transportent une large gamme de composés structurellement différents (colorants, solvants
organiques, détergents…), y compris différentes classes d’antibiotiques.73 Cette dernière
catégorie de pompes est d’un intérêt clinique majeur puisqu’elles peuvent rendre une infection
bactérienne non traitable par les antibiotiques disponibles, conférant ainsi le phénotype de
résistance multiple aux médicaments (MDR), défini par une résistance à au moins trois classes
différentes d’antibiotiques.74,75 Ainsi, la conception de molécules qui s’opposent à l’action de
ces pompes en améliorant l’entrée de l’antibiotique et en empêchant son expulsion à l’extérieur
de la cellule bactérienne constitue une approche intéressante qui ouvre la porte à la restauration
de la sensibilité bactérienne.

Dans ce contexte, une thérapie combinatoire d’antibiotiques avec de petites molécules qui
bloquent les systèmes d’efflux multidrogues nommées les inhibiteurs des pompes d’efflux
(EPI) semble constituer une stratégie prometteuse pour vaincre la multirésistance.76 La
surexpression des pompes d’efflux MDR contribue à la résistance bactérienne aux antibiotiques
soit par la résistance intrinsèque à un antibiotique spécifique ou à une famille entière
d’antibiotiques. L’inhibition des pompes d’efflux permet ainsi la restauration de la sensibilité
des souches bactériennes résistantes et limite l'émergence de nouveaux mutants résistants.73-77
Le ciblage des pompes d’efflux se fait de différentes manières à savoir :

‐ L’inhibition de l’expression des gènes codant pour ces pompes,

‐ L’empêchement de l’assemblage des composants des pompes au niveau membranaire,
‐ Le blocage du conduit de sortie de la membrane externe,
‐ L’épuisement de l’énergie nécessaire au fonctionnement des pompes.78

Le développement des inhibiteurs des pompes d’efflux doit tenir compte de trois facteurs
indispensables : le type des bactéries pathogènes à cibler, le type de pompe à inhiber, le type
d’antibiotique à potentialiser,78 également d’autres caractéristiques pharmacodynamiques et

21
 Chapitre 1

paramètres cinétiques doivent être pris en considération pour garantir l’efficacité de ces
inhibiteurs. Ainsi, l’inhibiteur idéal doit répondre aux exigences suivantes :

1. Il doit être spécifique à la cible bactérienne et idéalement exempt de toute activité

pharmacologique sur les cellules eucaryotes,
2. Il doit pouvoir atteindre une concentration sérique thérapeutiquement efficace et
atteindre sa cible in vivo pour lutter contre les infections intracellulaires, ce qui lui
nécessite aussi d’être stable sur le plan protéolytique,
3. Il doit avoir une spécificité et une efficacité maximales assurées par un index
thérapeutique et un profil pharmacocinétique amélioré,
4. Il doit être dépourvu d’activité antibactérienne propre pour réduire la possibilité de
développement des mécanismes de résistance à son encontre,
5. Et surtout, il doit être dénué de tout effet toxique pour l’homme, vu qu’il va être utilisé
à des concentrations assez élevées.77,79,80

L'une des difficultés rencontrées lors du ciblage de ces pompes d’efflux est liée à la variété des
fonctions physiologiques que ces inhibiteurs peuvent toucher, ce qui peut provoquer des
toxicités inattendues lorsqu'elles sont bloquées. C’est pourquoi la recherche s’axe sur le
développement de composés inhibant spécifiquement les pompes opérant uniquement chez les
cellules procaryotes.73 Devant cette nécessité, une grande variété d’études ont été réalisées pour
identifier les substrats et les inhibiteurs de ces pompes, ainsi que pour définir la mise en œuvre
des thérapies basées sur l'inhibition de l'efflux (Figure 6, Tableau 2). Cependant, on notera
qu’à ce jour aucun inhibiteur n’a été homologué pour ce genre de traitement des infections
bactériennes en clinique humaine ni vétérinaire et le seul inhibiteur documenté est actuellement
le MP-601.205 26 administré sous forme d’aérosol sous ventilation assistée chez les patients
atteints de pneumonie ou de mucoviscidose.72,73

Des dérivés de quinoléine ont été testés en tant qu’inhibiteurs des pompes d’efflux vis-à-vis des
souches cliniques MDR d’E. aerogenes surexprimant des pompes d’efflux de type AcrAB leur
conférant une résistance aux antibiotiques. Ainsi, avec sa chaîne latérale ramifiée
pipéridinyléthylique, le composé 7-nitro-8-méthyl-4-(2 '-(pipéridinyléthyl)-aminoquinoline 27
a présenté l’activité inhibitrice la plus élevée à la concentration la plus faible, et lorsqu’il est
utilisé en combinaison avec le chloramphénicol une accumulation intracellulaire de
l’antibiotique associé a été observée. Concernant l'inhibition de la pompe observée, une
explication a été donné, basée sur le fait que la structure TolC d’Escherichia possède un canal
22
 Chapitre 1

interne d’un diamètre de 35 Å et que le diamètre d'encombrement des alkylaminoquinoléines

est de 20 Å. Ainsi, l’inhibition de la pompe peut se faire donc au niveau du transporteur de la
membrane interne, soit au niveau de la jonction interne de la pompe et du canal externe.81

Figure 6. Structures chimiques des inhibiteurs des pompes d’efflux (composés 26-32)

Une autre étude a démontré que la Conessine 28, un alcaloïde stéroïdien naturel extrait de la
plante Holarrhena antidysenteric, présente une activité inhibitrice de la pompe d’efflux
MexAB-OprM ou de MexB exprimées chez P. aeruginosa. Cette molécule a aussi permis de
réduire les CMIs d’un facteur 8 pour tous les antibiotiques considérés, à savoir : cefotaxime,
érythromycine, lévofloxacine, novobiocine, rifampicine, tétracycline.82

23
 Chapitre 1

Dans une étude qui cible l’inhibition du transporteur AcrB d'Escherichia coli, une série de
composés basée sur un pharmacophore 2-naphthamide a été synthétisée et testée pour la
capacité de ses composés à potentialiser les antibiotiques et s’opposer à la résistance
bactérienne conférée par l’expression de la pompe d'efflux AcrAB-TolC. Ainsi, le composé 4-
isopentyloxy-2-naphthamide 29 est apparu comme étant le plus efficace en réduisant la CMI de
l’érythromycine et du chloramphénicol au seuil observé chez les souches sensibles n’exprimant
pas de pompes d’efflux. Ce composé peut ainsi être considéré comme un inhibiteur spécifique
de la pompe d’efflux AcrB puisqu’il ne montre aucun effet sur la CMI de la rifampicine qui
n’est pas un substrat d'AcrB.83

En 2015, le composé 3,4-dibromopyrrole-2,5-dione 30 a été identifié à partir d’extraits

microbiens marins, comme étant capable d’inhiber les pompes d’efflux et de restaurer l’activité
des antibiotiques comme la ciprofloxacine, l’érythromycine et le chloramphénicol vis-à-vis des
souches bactériennes à Gram-négatif MDR. Cette inhibition a été confirmée par sa capacité à
provoquer une augmentation dose-dépendante de la fluorescence due à l’accumulation d’un
substrat fluorescent de la pompe d’efflux AcrAB-TolC, le Hoechst 33342 chez une souche
sauvage d’E. coli AG100 surexprimant cette pompe, et par la non-affectation de la fluorescence
H33342 chez la souche sensible d’E. coli AG100A dépourvue de la pompe RND. Cela montre
clairement que la pompe RND est la cible de ce composé et que la restauration de la sensibilité
résulte de son inhibition.84

Chez Pseudomonas aeruginosa, la pompe d’efflux Mex-AB-OprM est responsable de la

multirésistance. Un composé polyphénolique, l’épigallocatéchin-3-gallate (EGCG) 31, extrait
du thé, a été étudié pour sa capacité à inhiber ce type de pompe. Il semble que ce composé
puisse augmenter la sensibilité aux antibiotiques de 22 souches cliniques multirésistantes de
P.aeruginosa.85 Pour une meilleure compréhension de l’effet de l’EGCG sur la sensibilité aux
antibiotiques, une mesure des indices FICs a été faite entre l’EGCG et le chloramphénicol (ou
la tétracycline), suggérant que l’EGCG améliore la sensibilité des isolats cliniques de P.
aeruginosa envers le chloramphénicol et la tétracycline de façon synergique. De même, sa
combinaison avec le PAN 32, démontré comme étant un inhibiteur spécifique de la pompe
d’efflux MexAB-OprM, améliore la sensibilité à des niveaux beaucoup plus élevés que ceux
obtenus avec l’EGCG ou le PAN seul.49

24
 Chapitre 1

Tableau 2. CMIs des antibiotiques en présence des inhibiteurs 27-31 vis-à-vis des bactéries à
Gram-négatif.

Pompe d’efflux CMIa CMIb (ADJ)

Adjuvant ref Souche bactérienne Antibiotique
ciblée (µg/mL)

NOR 256 16 (0,2 mM)

27 81 E. aerogenes EA3 AcrAB–TolC TET 8 0,5 (0,2 mM)
CHL 512 2 (0,2 mM)
CTX 64 8 (20)
ERY 256 32 (20)
P. aeruginosa
LVX 2 0,25 (20)
28 82 (PA01-nalβ) MexAB-OprM
NOV >2048 256 (20)
K1455
RIF 16 2 (20)
TET 64 8 (20)

ERY 128 16 (256)

29 83 E. coli AcrAB-TolC
CHL 8 2 (256)

CHL 24 6 (64)
CIP 0,13 0,06 (2)
ERY 128 16 (128)
KAN 16 4 (2)
84
E. coli AG102 AcrAB-TolC
30 LVX 0,13 0,03 (128)
OXA >650 650 (32)
PIP 4 2 (32)
TET 8 2 (64)

CAR 64 64 (128)
CHL 64 16 (128)
P. aeruginosa CIP 1 0,5 (128)
31 85
PA01 Mex-AB-OprM NOV 512 128(128)
TET 8 2 (128)
TMP 128 32 (128)

CMIa de l’antibiotique seul ; CMIb de l’antibiotique en présence de l’adjuvant (ADJ) à la

concentration nécessaire (μg/mL) ; NOR : Norfloxacine ; TET : Tétracycline ; CHL :
Chloramphénicol ; CTX : Céfotaxime ; Ery : Erythromycine ; LVX : Lévofloxacine ; NOV :
Novobiocine ; RIF : Rifampicine ; CIP : Ciprofloxacine ; KAN : Kanamycine ; OXA :
Oxacilline ; PIP : Pipéracilline ; CAR : Carbénicilline ; TMP : Triméthoprime ; ND : non
déterminé.

25
 Chapitre 1

IV.3. Perméabilisants membranaires :

Actuellement, la majorité des antibiotiques disponibles exercent leur action au niveau

intracellulaire, ce qui nécessite leur pénétration à l’intérieur de la cellule bactérienne en
traversant la membrane cellulaire. Les bactéries à Gram-négatif possèdent une couche
supplémentaire de protection représentée par la membrane externe.86
Pour leur pénétration à l’intérieur de la bactérie, les antibiotiques suivent deux voies différentes
conditionnées principalement par la composition chimique de la molécule médicamenteuse :

‐ Les composés hydrophobes : (comme les aminosides, les macrolides et la rifampicine)

qui diffusent à travers la bicouche lipidique,
‐ Les molécules hydrophiles : (comme les bêta-lactamines, le chloramphénicol et les
fluoroquinolones) qui diffusent via l’intermédiaire des porines de la bactérie.86,87

Ainsi, la composition de la membrane en lipides et porines protéiques conditionne sa

perméabilité et exerce un fort impact sur la sensibilité de la bactérie à l’antibiotique. Par
conséquent, il n’est pas surprenant que les souches résistantes émergentes présentent souvent
des modifications au niveau de leurs lipides ou protéines membranaires.86
Aujourd’hui, une meilleure compréhension de la structure membranaire joue un rôle crucial
dans le développement des nouveaux antibiotiques88 et la nouvelle stratégie consiste à
concevoir et à utiliser des composés capables de faciliter la diffusion des antibiotiques et
d’augmenter ainsi leur concentration intracellulaire.78

Dans ce contexte, plusieurs chimiosensibilisateurs qui altèrent les porines et les canaux
membranaires ont été étudiés comme les détergents, les tensioactifs, les polymyxines, et les
peptides antimicrobiens, certains même (les lipopeptides cycliques polycationiques et les
peptides antimicrobiens cationiques)89,90 sont utilisés en combinaison avec des antibiotiques
pour lutter contre les souches résistantes.91,92

Une étude a ainsi permis l’évaluation de l’activité antibactérienne d’un peptide, le GBP via son
action sur la membrane d’E. coli. Ce peptide a démontré une action antibactérienne
concentration dépendante vis-à-vis d’E. coli.93 L’étude de son effet sur la morphologie des
cellules d’E. coli montre que le GBP induit des dommages à ces cellules avec des changements
morphologiques importants, conduisant à des cellules possédant des structures externes
« ridées » arrivant même à des fragmentations à haute concentration de GBP. Ce peptide

26
 Chapitre 1

cationique détruit la barrière membranaire et perturbe le canal ionique d’E. coli ce qui entraine
une fuite des ions Ca2+, K+ et Mg2+. Cet effet est généralement observé chez les peptides
membranaires qui provoquent la mort cellulaire par fuite des ions (Ca2+, K+ et Mg2+) en
affectant la tension superficielle des membranes, en perturbant les canaux ioniques déjà
existants ou en provoquant la formation de nouveaux canaux.93
Son effet sur la perméabilité de la membrane externe améliore la sensibilité d’E. coli à de faibles
concentrations pour deux antibiotiques hydrophobes : l’érythromycine et la rifampicine
incapables de pénétrer la membrane intacte des bactéries à Gram-négatif, mais capables de
perforer les membranes endommagées par des polycations. Toutes ces observations tendent à
indiquer que le GBP endommage la membrane externe et augmente sa perméabilité.93

Dans le même contexte, une étude a porté sur l’évaluation de l’effet de la ménadione 33
(vitamine K) (Figure 7, Tableau 3) sur la perméabilité membranaire des souches
multirésistantes de S. aureus, P. aeruginosa et E. coli. La ménadione, est une vitamine
liposoluble synthétique convertie en vitamine K2 au niveau intestinal et a démontré une activité
antibactérienne uniquement vis-à-vis des souches de P. aeruginosa. Cependant, son utilisation
en combinaison avec des antibiotiques de la famille des aminosides a permis la réduction des
concentrations inhibitrices de ces derniers ce qui témoigne une action synergique de cette
association thérapeutique.94

O
Me

Ménadione 33

H2N O N H2N O OH
H

H H
H H
H2N O O NH2
H2N O O NH2

CSA-13 34 CSA-8 35

Figure 7. Structures chimiques de la Ménadione 33, CSA-13 34 et CSA-8 35

27
 Chapitre 1

En 2014, une étude a été réalisée sur l’extrait d’Holarrhena antidysenterica, une plante
médicinale dont l’écorce est habituellement utilisée en médecine traditionnelle pour traiter la
dysenterie surtout amibienne. 95 Présentant uniquement une faible activité antibactérienne,
l’extrait éthanolique de cette plante a été combiné avec la novobiocine, un antibiotique doué
d’une activité antibactérienne efficace contre des bactéries à Gram-positif. Cette association a
permis l’amélioration de l’activité de la novobiocine vis-à-vis des souches XDRAB, MDRAB,
et des isolats cliniques non-MDRAB.95 L’inversion de la résistance des souches à la
novobiocine a été rapportée comme étant due à l’action perméabilisante de la membrane par
l’extrait de H. antidysenterica.

Tableau 3. CMIs des antibiotiques en présence de la ménadione 31, CSA-13 32, et CSA-8 33
vis-à-vis des bactéries à Gram-négatif

Adjuvant Ref Souche bactérienne Antibiotique CMIa CMIb (ADJ)

AMK

µg/mL)
156,2 2,4 (64)
GEN
S. aureus 358 312,5 2,4 (64)
NEO
156,2 2,4 (64)
AMK

(µg/mL)
312,5 2,4 (32)
33 94 GEN
P. aeruginosa 03 625 2,4 (32)
NEO
78,1 2,4 (32)
AMK

(µg/mL)
156.2 2,4 (64)
GEN
E. coli 27 625 2,4 (64)
NEO
312,5 2,4 (64)
(µg/ mL)
ERY 70 1(1,5)
E. coli ATCC 10798 NOV >500 1(0,8)
34 96
P. aeruginosa ATCC 27853 NOV 70 1(2)
ERY 70 1(5)
(µg/ mL)

96 E. coli ATCC 10798 NOV >500 1(14)

35
P. aeruginosa ATCC 27853 NOV 70 1(13)

CMIa de l’antibiotique seul ; CMIb de l’antibiotique en présence de l’adjuvant (ADJ) à la

concentration nécessaire (μg/mL) ; AMK : Amikacine ; GEN : Gentamicine ; NEO : Néomycine
; ERY : Erythromycine ; NOV : Novobiocine.

Les peptides antimicrobiens endogènes (AMPs) sécrétés par les cellules épithéliales, les
neutrophiles et les glandes exocrines représentent une ligne de défense importante dans
l’immunité innée contre les pathogènes invasifs. Les AMPs déstabilisent ainsi la membrane

28
 Chapitre 1

externe des procaryotes suite à la formation d’une hélice amphipathique ou de courts feuillets
bêta.97,98 Ces peptides sont considérés comme des molécules antibiotiques en raison de leur
capacité à induire une dysfonction membranaire non spécifique et à la rapidité de leur
action.99,100 Cependant, leur utilisation en thérapeutique pose de nombreux problèmes à savoir
les coûts élevés de production à grand échelle, la difficulté de synthèse et de purification ainsi
que les mécanismes de résistance que développent les bactéries à leurs égards. Ainsi, les
protéases secrétées par les bactéries ont été démontrées comme étant capables de neutraliser les
AMPs.101-103

Pour remédier à ce problème et en se basant sur les propriétés avantageuses des AMPs, une
nouvelle classe d’antibiotique stéroïdiens cationiques (CSA) a été conçue et dénommée
« Céragénine » où des groupes aminoalkyles substituent le groupe alcoxyle du stérol considéré
(Figure 7, Tableau 3).104,105 Les céragénines présentent l’avantage d’être résistants à l’action
des protéases puisque ceux ne sont pas des peptides, de posséder des structures simples et faciles
à produire en grandes quantités. Par ailleurs, ils s’incorporent de façon plus stable dans les
membranes et ont une capacité inhabituelle à former des complexes avec les
phospholipides.105,106 D’autre part, la charge positive de ces lipides antimicrobiens cationiques
assure leur attraction électrostatique vers les membranes chargées négativement (bactéries,
virus, champignons et protozoaires) et cause la mort de la cellule par un dysfonctionnement de
la membrane.106
Les céragénines 34-35 synthétisés pour imiter les structures cationiques et les propriétés
amphiphiles des peptides antimicrobiens, partagent avec eux le même mécanisme d'action. Ils
induisent une dépolarisation rapide de la membrane bactérienne et perméabilisent les
membranes externes des bactéries à Gram-négatif, augmentant ainsi la sensibilité des
microorganismes aux antibiotiques hydrophobes.107-109 Ainsi, bien que la CMI de
l’érythromycine utilisée seule contre une souche résistante de Klebsiella pneumoniae soit de 70
μg/mL, sa combinaison avec le CSA-8 (35) conduit à une inhibition de la croissance à une
concentration de 1 μg/mL.101,104,110
CSA-13 (composé 34) en combinaison avec la gentamicine induit une synergie ou une
additivité contre les souches résistantes de S. aureus à la méthicilline et à la vancomycine
isolées chez des patients aux États-Unis. Ainsi, une additivité a été observée contre VRSA (S.
aureus résistant à la vancomycine de Pensylvania) dans le cas des associations de CSA-13 avec
la daptomycine, le linézolide et la vancomycine.96 Récemment, une étude réalisée sur soixante
souches d’A. baumannii résistantes aux carbapénèmes, a rapporté une activité bactéricide de
29
 Chapitre 1

CSA-13. Néanmoins, en combinant CSA-13 avec les antibiotiques tels que la colistine et la
tobramycine des synergies ont été obtenues et aucun antagonisme n'a été observé.111

Par ailleurs, une étude a montré que les polyamines de type naphthylacétylspermine 36, un
analogue synthétique de la toxine de l’araignée joro (Nephila clavata), et la méthoctramine
(N,N’-bis[6-[[(2-methoxyphenyl)methyl]amino]hexyl]-1,8-octanediamine) 37, initialement
connus comme antagonistes des récepteurs muscariniques, potentialisent l’action des
antibiotiques hydrophobes comme la novobiocine et l'érythromycine. A titre d’exemple, la CMI
de la novobiocine seule vis-à-vis d’E. coli est de 128 µg/mL alors qu’en association avec le
composé 37 à 8 µg/mL la CMI de la novobiocine baisse à 16 µg/mL. De façon similaire, la
CMI de l’érythromycine vis-à-vis de l’E. coli baisse de 64 à 16 µg/mL lors de sa combinaison
en présence du composé 37 utilisé à une concentration de 8 µg/mL. Ainsi, le composé 36 joue
le rôle de perméabilisant membranaire facilitant la diffusion de ces antibiotiques à travers la
membrane externe d’E. coli (Figure 8, Tableau 4).112 Ces deux polyamines provoquent la
libération des cations divalents (Ca2+) qui stabilisent le lipopolysaccharide LPS, et stimulent
l’absorption d'un tétraphénylphosphonium lipophile (TPP+) qui est habituellement favorisée
par la perturbation de la membrane externe.113 Ce mécanisme d’action n’est pas spécifique à
ces deux polyamines vue que d’autres peptides polycationiques comme la polylysine et la
protamine 113,114
et également d’autres antimicrobiens tels que la chlorhexidine et le
polyhexaméthylène biguanide115 ont été rapportés comme améliorant la perméabilité
membranaire par déstructuration du LPS.

Récemment, de nouveaux composés isolés du requin-roussette Squalus acanthias, tels que

l’aminostérol cationique soluble dans l'eau « Squalamine » 38 ont été décrits comme étant
capables de potentialiser l’activité des antibiotiques en ciblant la membrane externe des bactérie
à Gram-négatif.116 Ainsi, dans une première approche, les résultats suggèrent que la squalamine
perturbe l'intégrité membranaire entraînant un épuisement de 80% de l'ATP intracellulaire pour
une concentration de squalamine de 20 µg/mL (Figure 8, Tableau 4).116 Plus récemment
encore, son action chimiosensibilisatrice a été évaluée : en déterminant les CMIs des
antibiotiques combinés avec des concentrations sub-inhibitrices de squalamine. La squalamine
a démontré un effet synergique sur toutes les classes d'antibiotiques comme le chloramphénicol,
la tétracycline et la ciprofloxacine avec une réduction notable de la CMI observée contre des
souches surexprimant plusieurs pompes efflux. Par exemple, les CMIs du chloramphénicol, la
tétracycline et la ciprofloxacine seuls vis-à-vis de P. aeruginosa PA01 sont 512 µg/mL, 16

30
 Chapitre 1

µg/mL et 16 µg/mL , ces concentrations baissent à 16 µg/mL 4 µg/mL et 1 µg/mL

respectivement lorsqu’elle sont associés avec la squalamine 38 utilisée à une concentration de
3,2 µg/mL.117 La potentialisation de l’activité des antibiotiques contre des souches sensibles (E.
coli, E. aerogenes et P. aeruginosa) et non seulement des bactérie résistantes (AG 100, AG
100A) suggère que l’action exercée par la squalamine est fortement liée à une diffusion accrue
de l’antibiotique et pas forcément à un mécanisme de résistance. Cette fonction permet la
chimiosensibilisation des membranes des souches sensibles et ainsi favorise la réduction de la
quantité d’antibiotique utilisée.118

Récemment, la conception et l'évaluation biologique de nouveaux dérivés polyaminostéroïdiens

ont été rapportées. Ainsi, la claramine A1 39, premier membre d'une nouvelle famille de
composés structurellement analogues à la squalamine, exerce une activité bactéricide contre un
large éventail de bactéries à Gram-positif et à Gram-négatif, ainsi que contre ceux qui présentent
un profil multiple de résistance aux antibiotiques (MDR) avec des CMIs variant de 2 à 32
µg/mL. En outre, ce composé utilisé à une concentration de 2 µg/mL a permis la restauration
de l'activité antibactérienne de la doxycycline vis-à-vis de P. aeruginosa PA01 et E. aerogenes
EA289 en réduisant la CMI de 16 et 40 µg/mL à 2 et 0,5 µg/mL, respectivement. De plus, une
concentration de 4 µg/mL de claramine A1 est suffisante pour rétablir l'efficacité du
chloramphénicol vis-à-vis de P. aeruginosa PA01 (Figure 8, Tableau 4).119

Ayant comme objectif de développer des agents chimiosensibilisateurs pouvant augmenter

l’efficacité des antibiotiques conventionnels en améliorant la perméabilité membranaire des
bactéries, une étude a récemment porté sur l’évaluation d’une série de dérivés polyaminés: de
la motuporamine 40-41 initialement extraite de l’éponge marine Xestospongia exigua, pour leur
effet sur la membrane des bactérie à Gram-négatif.120 Ainsi, les thérapies combinatoires de ces
dérivés ont montré qu’ils permettaient la restauration de l’activité de la doxycycline vis-à-vis
d’E. aerogenes EA289, P. aeruginosa PA01 et K. pneumoniae KPC2-ST258 et ceci même à de
faibles concentrations en doxycycline (2 µg/mL). Plusieurs d’entre eux ont également agit en
synergie avec le chloramphénicol et l’érythromycine surtout à l’encontre de PA01 et à degré
plus faible contre EA289 et KPC2-ST258.120 Les composés 40 et 41 se sont également montrés
les plus efficaces en tant qu’adjuvant à la doxycycline au cours de l’essai de libération d’ATP.
Ainsi, le MOTU-N44 40 a causé une rupture de la membrane bactérienne augmentant sa
perméabilité et la dépolarisation membranaire qui s’en est suivie affecte le fonctionnement des
pompes d’efflux ce qui a conduit à une augmentation de l’activité de l’antibiotique associé.118

31
 Chapitre 1

Finalement, les résultats des différents essais réalisés ont permis de conclure que la
perméabilisation de la membrane bactérienne chez E. aerogenes EA289 par les dérivés de la
motuporamine était en relation avec le changement du potentiel électrique transmembranaire
conduisant à une altération de l’homéostasie des protons.120

O
Me Me
O O
NH(CH2)3NH(CH2)4NH(CH2)3NH2
CH2NH(CH2)6NH(CH2)8NH(CH2)6NHCH2

Naphthylacétylspermine 36 Méthoctramine 37

H
N NH2
NH3 OSO3H
O
3Cl OH

HN O
NH2

N OH
H2 N
H H

Squalamine 38 Claramine A1 39

NH(CH2)3NH(CH2)3NH2 NH(CH2)4NH(CH2)4NH2

MOTU-N33 40 MOTU-N44 41

Br Br
MeO 3Cl + MeO 2Cl
H2
N NH3+ NH3+
N NH N
NH Br H2+
Br H2+
O O

Ianthelliformisamine A 42 Ianthelliformisamine B 43
H2+ H2+
N N
Br
Br
OMe
MeO
HN
NH Br
Br
O
O
Ianthelliformisamine C 44
NH3+ 4Cl H2+
Br N NH2+
MeO 2Cl N N
H2+ H2+
H
N N NH3+
Br
O 46
45

Figure 8. Structures chimiques des dérivés polyamines (composés 36-46)

32
 Chapitre 1

Dans cette même ligne de recherche, une série de dérivés ianthelliformisamines A, B et C (42-
44) a été identifiée, synthétisée et utilisée pour renforcer la sensibilité des bactéries à Gram-
négatif vis-à-vis des antibiotiques hydrophobes.121 Ainsi, des dérivés naturels et synthétiques
ont été utilisés pour restaurer l’activité de la doxycycline vis-à-vis d’E. aerogenes EA289, P.
aeruginosa PA01 et K. pneumoniae KPC2-ST258. D’un point de vue mécanistique, l’absence
d’efflux d’ATP observé avec l’association de la doxycycline et du dérivé le plus actif (composé
45) témoigne de la non-affection de l’intégrité de la membrane bactérienne externe, alors que
la dépolarisation de la membrane de la souche de PA01 témoigne de la perturbation du gradient
de protons.
En vue d’ étendre cette approche à d'autres substituants hydrophobes, des dérivés polyamino-
isopréniques ont été rapportés comme étant capables de réduire les niveaux de résistance chez
des entérobactéries multirésistantes vis-à-vis de l’acide nalidixique et le chloramphénicol.122
De plus, une autre étude a démontré que le dérivé 46, lorsqu’il est utilisé en combinaison avec
la doxycycline était le plus actif en abolissant complétement la croissance bactérienne avec un
indice FIC pour la combinaison de 0.09. Ce résultat témoigne d’une forte synergie entre
l'antibiotique considéré et l'agent chimiosensibilisant polyaminoisoprényle associé. Ainsi, le
composé 46 permet la réduction de la résistance des bactéries MDR vis-à-vis de deux
antibiotiques appartenant à deux familles différentes : la doxycycline et le chloramphénicol.123
Tout cela permet de suggérer que le composé 46 est capable de surmonter la résistance naturelle
de P. aeruginosa étant donné sa structure polyamino-farnésyle facilitant la diffusion de la
molécule à travers la membrane externe de P. aeruginosa, cette membrane étant connue pour
sa forte imperméabilité due à la présence d’une double couche lipidique très hydrophobe. De
plus, la chaine spermine chargée positivement pourrait interagir avec la charge négative de la
membrane bactérienne externe conduisant à sa dépolarisation et donc sa fragilisation.123

Enfin, il a pu être démontré que le composé 46 est capable d’inhiber l’efflux chez P. aeruginosa
par réduction de la source d’énergie du gradient de proton.123
Finalement, il ne faut pas oublier que ces résultats restent préliminaires, car plusieurs des
concentrations d'adjuvant énumérées dans les tableaux sont assez élevées et il semble peu
probable que ces concentrations puissent être atteintes cliniquement sans danger chez les
patients. Néanmoins, cela ouvre la voie à une nouvelle stratégie de lutte contre la résistance
bactérienne.

33
 Chapitre 1

Tableau 4. CMIs des antibiotiques en présence des adjuvants 36-46 vis-à-vis des bactéries à
Gram-négatif

Adjuvant Ref Souche bactérienne Antibiotique CMI1 CMI2 (ADJ)

(µg/ mL)
36 112 NOV 128 1 (64)
E. coli
ERY 64 4 (64)

(µg/ mL)
NOV 128 16 (8)
37 112 E. coli
ERY 64 16 (8)

CHL 8 0,5 (0,4)

(µg/ mL)
CIP 0.25 0,03 (0,4)
TET 2 0,125 (0,4)
E. coli AG100
FEP 0.5 0.06 (0,4)
ERY 512 256 (0,4)

CHL 512 16 (3,2)

(µg/ mL)
118 CIP 16 <1 (3,2)
38 P. aeruginosa PA01
TET 16 4 (3,2)
FEP 8 1 (3,2)
ERY 512 256 (3,2)

CHL 4 0.25 (1,6)

(µg/ mL)
CIP 0,5 0.015 (1,6)
E. aerogenes ATCC 13048
TET 2 0.25 (1,6)
FEP 0,25 0.03 (1,6)
ERY 512 128 (1,6)

P. aeruginosa PA01 16 2 (2)

39 119 DOX
E. aerogenes EA289 40 0,5 (2)
(µg/mL)

E. aerogenes EA289 40 2 (2,5 µM)

40 120 DOX
P. aeruginosa PA01 20 2 (2,5 µM)
K. pneumoniae KPC2 10 2 (2,5 µM)
(µg/ mL)

E. aerogenes EA289 40 2 (5 µM)

41 120 DOX
P. aeruginosa PA01 20 2 (1,25 µM)
K. pneumoniae KPC2 10 2 (2,5 µM)
µg/ mL)

E. aerogenes EA289 25 2 (6,25µM)

DOX
45 121 P. aeruginosa PA01 50 2 (3,12 µM)
K. pneumoniae KPC2 ND 2 (3,12 µM)
µg/ mL

46 123 P. aeruginosa PA01 DOX 32 2 (1,22)

34
 Chapitre 1

CMIa de l’antibiotique seul ; CMIb de l’antibiotique en présence de l’adjuvant (ADJ) à la

concentration nécessaire (μg/mL) ; NOV : Novobiocine ; ERY : Erythromycine ; CHL :
Chloramphénicol ; CIP : Ciprofloxacine ; TET : Tétracycline ; FEP : céfépime ; DOX :
Doxycycline ; ND : non déterminé.

V. Conclusion

En résumé, plusieurs approches ont été développées pour lutter contre la résistance bactérienne.
Les inhibiteurs des bêta-lactamases actuellement disponibles sur le marché ne sont pas vendus
en tant que médicaments individuels mais ils sont co-formulés avec un autre antibiotique β-
lactamine ayant une demi-vie sérique similaire. Ceci a pour avantage en plus de la commodité
du dosage, de minimiser le développement de la résistance pouvant résulter d'une exposition
variable à l'un ou l'autre des antibiotiques. Les inhibiteurs des bêta-lactamases élargissent le
spectre des antibiotiques β-lactamines existant en inhibant les enzymes bêta-lactamases
produites par les bactéries pour les désactiver. Sans doute, assisterons-nous, dans un avenir
proche, à une efficacité réduite de cette stratégie (inhibiteurs des bêta-lactamases) en raison de
l’émergence des bactéries XDR (ultrarésistantes).

Ainsi, le développement de nouvelles classes de molécules amphipatiques telles que les

composés 41 et 45 offre la possibilité de cibler les membranes bactériennes difficiles à traverser
en fournissant à la fois des substituants hydrophiles (polyamines), qui interagissent avec les
charges négatives présentes à la surface de la membrane, ainsi que des substituants hydrophobes
qui interagissent avec et perturbent l'organisation des chaînes lipidiques dans la membrane
bactérienne. Cette conception d’adjuvant offre la possibilité d'utiliser une polypharmacie sur
les bactéries non seulement en offrant un meilleur accès interne aux antibiotiques administrés
conjointement, mais également en dé-énergisant les pompes à efflux utilisées par les bactéries
pour échapper à l'action des antibiotiques. En conclusion, la solution à la résistance aux
antibiotiques émergente impliquera probablement des thérapies combinées d'antibiotiques
existants et d'adjuvants « intelligents », qui redonneront à l'agent antibiotique les moyens de
restaurer son efficacité vis-à-vis de la souche résistante d'intérêt. Cependant, le développement
de cette stratégie nécessite des recherches approfondies pour réduire la toxicité de ces
molécules. Dans ce contexte, nous avons imaginé la synthèse d’une série de dérivés polyaminés
dans le but de développer des adjuvants permettant la restauration de l’activité des cyclines
(principalement la doxycycline) vis-à-vis de Pseudomonas aeruginosa. Les résultats sont
présentés dans le chapitre suivant (CHAPITRE 2).

35
 Chapitre 2 :

Nouveaux adjuvants polyaminés pour restaurer la sensibilité

de Pseudomonas aeruginosa aux tétracyclines

(Résultats expérimentaux)

36
 Chapitre 2

I. Introduction :

Au cours des dernières décennies, nous avons assisté à la sélection de bactéries résistantes dont
le génome a été modifié soit par mutation et/ou acquisition de matériel génétique, favorisant
leur développement au détriment des bactéries sensibles. Ce phénomène de résistance aux
antimicrobiens en constante expansion compromet l'arsenal des antibiotiques existants et met
de plus en plus les cliniciens dans des situations d’impasses thérapeutiques, notamment en ce
qui concerne les infections à bactéries à Gram-négatif qui constituent l'une des principales
menaces actuelles pour la santé publique.124,125 Dans ce contexte, Pseudomonas aeruginosa, un
agent pathogène opportuniste qui provoque rarement des maladies chez les personnes en bonne
santé mais qui est responsable d'infections graves chez les patients atteints de mucoviscidose
ainsi que chez les patients immunodéprimés, entraîne un taux de mortalité élevé dans cette
population.8,126-129 Il est donc urgent de développer des agents thérapeutiques capables de
modifier l'intégrité de la membrane externe de la bactérie et/ou sa perméabilité, car cette
dernière limite fortement la diffusion de nombreuses molécules antibiotiques hydrophobes. En
absence d’une stratégie innovante pour lutter contre les agents pathogènes multirésistants
(MDR), de nombreux domaines de la médecine seront gravement touchés. Ainsi, le concept
d'adjuvants aux antibiotiques, capables de restaurer l'efficacité de l'agent antibiotique vis-à-vis
de la souche résistante concernée, pourrait constituer une stratégie précieuse. Pour cela, un
adjuvant idéal doit répondre aux exigences suivantes :
1. Être spécifique de la cible bactérienne et idéalement exempt de toute activité
pharmacologique sur les cellules eucaryotes,
2. Pouvoir atteindre une concentration thérapeutiquement efficace dans le sérum et
atteindre sa cible in vivo,
3. Être dépourvu d'activité antibactérienne pour réduire la possibilité d’induire des
mécanismes de résistance.130
Dans ce contexte les composés dérivés des polyamines ont été récemment explorés pour leur
effet antibactérien. Ils constituent ainsi une source prometteuse de composés dans la lutte
contre la résistance bactérienne. Récemment, il a été rapporté au laboratoire la capacité d’un
dérivé polyaminoisoprényl : le composé NV716 58 à potentialiser l'activité du florfénicol dans
le traitement de l’infection pulmonaire porcine à Bordetella bronchiseptica.131 Dans la
continuité de ces études, nous décrirons ici un modèle d'adjuvant raisonné basé sur des
molécules polyaminoisoprényles substituées, constituées d'un noyau terpénique et portant
divers groupes polyaminés, permettant de réaliser une polypharmacie sur la bactérie P.
37
 Chapitre 2

aeruginosa en offrant un meilleur accès interne aux antibiotiques inactifs de type

tétracycline.132
Nous donnerons ainsi en tout premier lieu un aperçu général sur les polyamines naturelles
existantes, leurs origines et leur rôles biologiques potentiels.

II. Polyamines : origines, rôle et potentiel thérapeutique

Les polyamines sont des molécules polycationiques qui ont été décrites pour la première fois
en 1677 dans le liquide séminal et depuis largement identifiées dans tous les organismes vivants
y compris les bactéries, les champignons, les plantes et tous les types de cellules eucaryotes.
Elles sont constituées d’un squelette d'hydrocarboné aliphatique comportant des groupes azotés
quaternaires et caractérisées par une charge positive nette au pH physiologique.133

Figure 9. Structures chimiques caractéristiques de polyamines naturelles courantes

Au niveau cellulaire, les polyamines naturelles, dont la putrescine, la cadavérine, la spermidine

et la spermine (Figure 9) font partie des polycations majeurs, avec le calcium (Ca2+) et le
magnésium (Mg2+)134,135 et jouent un rôle de régulateur dans la croissance cellulaire.136 Elles
ont été décrites comme étant essentielles pour tous les types de prolifération cellulaire et sont
déterminants des voies métaboliques de synthèse et de dégradation.133 Les polyamines sont
aussi impliquées dans une grande variété de réactions biologiques. Elles existent principalement
sous forme de complexes polyamine-ARN et affectent donc la synthèse de l'acide
136,137
désoxyribonucléique (ADN), de l'acide ribonucléique (ARN) mais aussi la traduction à

38
 Chapitre 2

différentes étapes.138,139 Elles stimulent la synthèse de certaines protéines in vitro 140 et in vivo
141
et induisent également l'assemblage in vivo de la sous-unité ribosomique 30S.142,143 Des
études réalisées sur des mutants d’E. coli auxotrophes aux polyamines ont permis de mettre en
évidence le rôle des polyamines dans la croissance de la bactérie.144 En outre, certaines d’entre
elles comme la cadavérine et la spermine ont été rapportées comme étant des régulateurs
naturels de l'activité des pores réduisant la perméabilité de la membrane externe des bactéries
et donc de leur sensibilité aux traitements antibiotiques.145-149
Des études réalisées sur les polyamines ont également suggérées qu’elles jouent un rôle
important dans la protection des cellules contre les conditions toxiques externes y compris le
stress oxydatif , les radiations , le pH acide et d'autres agents toxiques.150 Dans le même temps,
il a été démontré chez E. coli que les analogues synthétiques des polyamines : la
naphtylacétylspermine et la méthoctramine synthétisées comme étant des dérivés synthétiques
respectivement de la toxine de l’araignée joro et d’un antagoniste des récepteurs muscariniques
augmentent la perméabilité de la membrane externe par perturbation de l’intégrité du LPS ; ce
qui permet d’accroitre la sensibilité bactérienne aux antibiotiques hydrophobes tels que la
novobiocine et l'érythromycine qui autrement traversent difficilement la membrane externe des
bactéries.112,150 De plus, en fonction de la dose employée, les polyamines sont capables
d’augmenter la sensibilité de P. aeruginosa aux antibiotiques de type β-lactamines, au
chloramphénicol, au triméthoprime et à l'acide nalidixique.134 L'influence critique apparente
des polyamines sur le développement et la survie des cellules ont ainsi conduit à ce que les
polyamines soient de plus en plus prises en compte pour la conception d'agents
chimiothérapeutiques.151

Nous présentons ci-après un aperçu sur des travaux antérieurs relatifs à cette thématique,
réalisés dans notre laboratoire et qui comme nous le verrons ont permis de démontrer le
potentiel des polyamines dans la lutte contre la résistance bactérienne aux antibiotiques.

Plus particulièrement, nous décrirons leur capacité à agir en tant qu’adjuvant permettant la
potentialisation et la restauration de l’activité des antibiotiques classiques vis-à-vis des bactéries
à Gram-négatif, ainsi que l’influence de chaque composant structural dans l’activité et/ou la
toxicité de ces composés.

39
 Chapitre 2

II.1. Géraniol et dérivés polyaminoisoprényles

En 2009, une étude menée par Lorenzi et al. sur les huiles essentielles extraites à partir des
plantes de Corse a permis de dévoiler la capacité de l’huile essentiel de Helichrysum italicum à
réduire la résistance au chloramphénicol de la souche EA27 à un niveau proche de celui obtenu
avec la phénylalanine arginine-β-naphtylamide (PAβN).152 Une évaluation plus approfondie de
la capacité de l’extrait d’H. italicum à réduire la résistance aux antibiotiques chez d’autres
bactéries à Gram-négatif a démontré que cette huile essentielle contient des composés qui
modulent la résistance aux antibiotiques chez plusieurs espèces de bactéries à Gram-négatif en
ciblant les mécanismes d'efflux. Plusieurs éléments ont permis d’émettre cette conclusion : cet
extrait a permis une diminution de la CMI du chloramphénicol pour les isolats d'E. aerogenes,
d'A. baumannii et de P. aeruginosa. En outre, l’huile essentielle d’H. italicum potentialise
l’activité du chloramphénicol vis-à-vis d’une souche surexprimant la pompe d’efflux AcrAB-
TolC et restaure la sensibilité d’une souche qui surexprime d’autres pompes d’efflux différentes
de AcrAB.152 Parmi les composés isolés des deux fractions les plus actives de cet extrait un
composé nommé le géraniol 47 s’est avéré être un puissant inhibiteur des mécanismes d'efflux.
En outre, un classement de l'activité des inhibiteurs des pompes d’efflux a démontré que le
géraniol est un inhibiteur très puissant de la résistance dans un mutant acrAB par rapport au
PAβN. Ces résultats ont permis de conclure que le géraniol pourrait être une nouvelle source
potentielle de médicaments utiles en thérapie, et qu’il pourrait également contribuer à mieux
comprendre la multirésistance MDR chez les bactéries à Gram-négatif.152

Figure 10. Structures chimiques du géraniol 47 et du PAβN

40
 Chapitre 2

Dans une seconde étude, l’évaluation de la relation entre la structure du géraniol et son activité
inhibitrice a permis de démontrer que la structure terpénique était essentielle à son effet
inhibiteur tandis que le groupement hydroxyle pouvait être remplacé de manière appropriée par
une fonction amine augmentant considérablement sa solubilité dans les milieux aqueux sous la
forme de sel (chlorhydrate, tartrate…).153 Ainsi, une stratégie chimique originale a été élaborée,
permettant la synthèse d’une série de nouveaux dérivés polyaminés du géraniol avec des
rendements modérés à bons.

Figure 11. Structures chimiques des deux meilleurs dérivés polyaminoisoprényles vis-à-vis
des souches MDR d’Enterobacter aerogenes Ea289 et de Salmonella enterica Thyphimurium
BN10055

II.2. Squalamine

L'utilisation des composés qui ciblent les membranes externes des bactéries à Gram-négatif a
été considéré comme une approche intéressante pour le développement d'agents antibactériens
induisant difficilement l’émergence de souches résistantes. Un autre exemple type de ces
composés polyaminés est la squalamine 38 : un aminostérol cationique soluble dans l'eau isolé
d’un requin, l’aiguillat (Squalus acanthias). Ce composé exerce une puissante activité
antimicrobienne à large spectre par perturbation de l’intégrité membranaire. En outre, grâce à
son insensibilité aux mécanismes de résistance par efflux, la squalamine reflète le fort potentiel
des polyamines comme une alternatif de lutte contre l’émergences des agents pathogènes
MDR.154

Figure 12. Structure chimique de la squalamine 38

41
 Chapitre 2

II.3. Ianthelliformisamines

Par ailleurs, un criblage à haut débit réalisé sur des fractions de produits naturels a permis
d’identifier à partir de l’extrait de l’éponge marine Suberea ianthelliformis des dérivés
polyaminés de type ianthelliformisamines capables d’agir comme adjuvants aux antibiotiques
(voir CHAPITRE 1). Ainsi, le dérivé 42 a montré une activité sélective vis-à-vis de P.
aeruginosa, une cytotoxicité IC50 (Concentration Inhibitrice médiane) de 6.8 μM (CMI = 35
μM) et 77% d’inhibition des souches de S. aureus à 175 μM.155

Figure 13. Structure chimique de l’ianthelliformisamine A 42

II.4. Motuporamines

Une autre famille des polyamines est représentée par « les motuporamines » isolées de l'éponge
marine Xestospongia exigua. Elles sont caractérisées par un large macrocycle et un motif
norspermidine leurs conférant un intérêt biologique intéressant. Les motuporamines possèdent
une puissante activité antimigratoire et antiangiogénique notamment vis-à-vis des carcinomes
mammaires et pancréatiques.

Figure 14. Structure chimique de la motuporamine MOTU-N44 41

Une étude a été réalisée dans le but de synthétiser de nouveaux analogues qui moduleraient la
cytotoxicité de cette classe de composés et amélioraient leurs propriétés antimigratoires. Les
résultats ont montré que le déplacement de la chaîne polyaminée hors du cycle permet d’obtenir

42
 Chapitre 2

de nouveaux carbocycles cyclopentadécane avec une puissance antimigratoire doublée et une

toxicité réduite de 133 fois.155

En outre, les motuporamines sont douées d’une bonne activité antibactérienne ainsi qu’une
activité potentialisatrice agissant en synergie avec de nombreux antibiotiques en particulier
avec la doxycycline vis-à-vis des bactéries à Gram-négatif (E. aerogenes EA289, P. aeruginosa
PA01 et K. pneumoniae KPC2 ST258) (Tableau 5).

Tableau 5. Concentrations du dérivé motuporamine MOTU-N44 41 (µM) nécessaires pour

restaurer l’activité de la doxycycline à (2 µg/mL) vis-à-vis des souches à Gram-négatif

CMI de la doxycycline seule Concentration de MOTU-

Souches µg/mL (µM) N44 41 (µM)
EA289 20 (45) 5
PA01 40 (90) 1,25
KPC2 ST258 10 (22,5) 2,5

Pour la plupart, les dérivés polyaminés agissent sur l’intégrité de la membrane bactérienne de
différentes manières. A titre d’exemple, le dérivé motuporamine MOTU-N44 41 (Figure 14)
induit une forte dépolarisation de la membrane bactérienne. Cet effet a été évaluée par les
changements du potentiel électrochimique de la membrane en utilisant l’iodure de 3,3'-
dipropylthiadicarbocyanine (DiSC3(5)) qui s’accumule dans les membranes hyperpolarisées
(fluorescent). En présence du MOTU-N44 41 le gradient de proton a été rompu (dépolarisation
membranaire) et le DiSC3(5) est relargué vers le milieu extérieur (atténuation de la
fluorescence) (Figure 15-b). Le mécanisme postulé semble d’autant plus plausible que la
dépolarisation membranaire désactive la pompe d’efflux par inhibition du gradient de protons
et renforce ainsi l’activité de l’agent antibiotique. Dans ce contexte, l’inhibition des pompes
d’efflux par le composé MOTU-N44 41 a été prouvée vis-à-vis de la souche EA289
surexprimant la pompe AcrAB-TolC appartenant à la famille des pompes d'efflux RND qui
utilise le gradient de protons à travers la membrane interne comme source d'énergie. Ainsi,
l’effet du composé MOTU-N44 41 sur le fonctionnement des pompes d’efflux a été observé
via la surveillance du transport d’un substrat de cette pompe : le 1,2-dinaphthylamine (1,2'-
diNA). En présence du MOTU-N44 41 une inhibition dose-dépendante du transport de ce

43
 Chapitre 2

composé a été constatée suggérant l’inhibition de la pompe d’efflux AcrAB-TolC par le

MOTU-N44 41 (Figure 15-d).

Il convient également de noter que le composé MOTU-N44 41 a manifesté une activité

perméabilisante de la membranaire externe d’E. aerogenes EA289 avec un comportement
similaire à celui de la polymyxine B (PMB). Cet effet perméabilisant a été démontré par le
changement de la couleur d’un substrat chromogène (la nitrocéfine) par suite de son hydrolyse
par les β-lactamases cytoplasmiques. En effet, la nitrocéfine est incapable de traverser seule la
membrane bactérienne et c’est donc grâce à la perméabilisation membranaire induite par la
MOTU-N44 41 qu’elle peut rejoindre les β-lactamases dans l’espace périplasmique et y subir
une hydrolyse (Figure 15-a).

Figure 15. Mécanisme d’action de MOTU-N44 41 sur la membrane bactérienne 156

Enfin, le composé MOTU-N44 41 exerce un effet perturbateur de l’intégrité membranaire

résultant en une forte libération de l’ATP intracellulaire (présent uniquement dans le
cytoplasme). La méthode d’étude utilisée consiste en l’utilisation d’un couple de réactifs
(luciférine /luciférase) responsable de la transformation de l’ATP en adénosine monophosphate
(AMP) avec formation d’oxyluciférine et émission de photons. Ainsi la perturbation de la
membrane interne est révélée via un système de bioluminescence qui mesure l’émission de ces
photons et qui permet de quantifier la puissance du phénomène engendré (Figure 15-c). 156

44
 Chapitre 2

II.5. Halocyamines

Toujours sous l’océan, les tunichromes sont des petits peptides isolés des cellules sanguines
d’organismes marins appartenant à la classe des ascidies. Plusieurs rôles biologiques ont été
rapportés pour les tunichromes allant de la formation des tuniques (réticulation), la réparation
des blessures jusqu’à la séquestration des ions métalliques ou l’inhibition de la croissance
bactérienne. Plus particulièrement, les halocyamines (A et B) isolée de l'ascidie Halocynthia
roretzi ont montré des effets antibactériens, antiviraux et cytotoxiques.

Tout d’abord, afin d’explorer le potentiel antibactérien du produit marin naturel l’halocyamine
A 50, une étude a été réalisé afin d’élaborer un protocole permettant sa synthèse chimique au
laboratoire.157 Cependant, l'halocyamine A synthétique n’a montré que de modestes activités
antibactériennes (Figure 16).

Figure 16. Structures chimiques de l'halocyamine A 50 et ses dérivés

Ainsi, une série d’analogues de l'halocyamine A 50 ont été synthétisés et évalués pour leurs
activités biologiques vis-à-vis d’un panel de bactéries à Gram-positif et à Gram-négatif. Les
résultats ont montré que les substitutions par l'alanine ont donné lieu à une augmentation de
l'activité, les analogues de di-alaninyle (l’analogue di-L-alaninyl 51 et l’analogue di-D-alaninyl
52) présentaient une activité plus puissante avec des valeurs de CMI basses vis-à-vis des
bactéries à Gram-positif (S. aureus et E. faecalis). En outre, l'activité de l’analogue lipophile
protégé par le groupement trityle de l'halocyamine A 50 à l'égard de E. coli est particulièrement

45
 Chapitre 2

encourageante, suggérant que l'exploration d'analogues plus lipophiles pourrait être utile dans
la compréhension et la recherche de nouvelles molécules efficace vis-à-vis des bactéries à
Gram-négatif.158

II.6. Dérivés indoliques

Une étude menée sur des alcaloïdes polyamines dérivés du produit naturel ianthelliformisamine
C 44 a permis d’identifier deux dérivés de la polyamine 6-bromoindolglyoxylamide 53 et 54
possédant une activité antibactérienne vis-à-vis des bactéries à Gram-positif : S. aureus et S.
intermedius et également vis-à-vis de la bactérie Gram-négatif P. aeruginosa pour le composé
53 (Figure 17). Ainsi, une série de dérivés 6-bromo a été synthétisée. L’évaluation de leurs
activités biologiques a permis de conclure que les analogues ayant un motif polyamine exercent
une activité antibactérienne plus prononcée que les dérivés qui en sont dépourvus du noyau tout
comme les dérivés ayant une chaîne polyamine plus courte. En outre, le composé 53, possédant
une chaine spermine s’est montré le plus efficace de tous les dérivés, permettant de renforcer
l’activité des antibiotiques vis-à-vis d’un panel de souches à Gram-négatif dont E. coli, K.
pneumoniae et A. baumannii. Son activité a été rapportée comme étant liée à sa capacité de
dépolarisation et de perturbation de l'intégrité des membranes bactériennes.159

Figure 17. Structures chimiques des ianthelliformisamines 44 et 53-54

46
 Chapitre 2

Néanmoins, cette capacité à perturber les membranes s’est également étendue aux cellules des
mammifères conférant au composé 53 une cytotoxicité et une forte activité hémolytique des
globules rouges. Ainsi, le composé 53 a été le point de départ d'une nouvelle étude, visant
l’exploration de l’influence de la substitution sur l’activité, à la recherche de nouveaux
potentialisateurs dépourvus de cytotoxicité (exprimée en terme de Concentration IC50) et de
propriétés hémolytiques. Quatre analogues ont été identifiés (7-méthoxyindole, 7-fluoroindole,
7-méthylindole et 5-méthylindole) démontrant une activité plus importante et à minima
équivalente à celle du produit de départ (composé 53) dans la potentialisation de l’activité de la
doxycycline vis-à-vis de P. aeruginosa ATCC27853 (Tableau 6).

Il convient de noter que la localisation relative ainsi que la nature (méthyle, méthoxy ou fluor)
de ces substituants constitue un facteur critique déterminant la puissance de l'activité observée
(Figure 18). Parmi ces quatre nouveaux potentialisateurs, le 7-méthoxyindole 55, le 5-
méthylindole 56 et le 7-méthylindole 57 étaient 3 à 10 fois moins cytotoxiques avec un faible
voir négligeable effet hémolytique sur les globules rouges 160

Tableau 6. Résumé de l’activité des différents dérivé indolique et leurs concentrations

nécessaires pour restaurer l’activité de la doxycycline à (2 µg/mL) vis-à-vis de P. aeruginosa
ATCC27853

Concentration pour la Cytotoxicité Hémolyse (%) à

Composé
potentialisation (µM) IC50 50 µM
Composé 53 6,25 7,7 10% (à 34 µM)

7-méthoxyindole 3,75 27-62 0

5-méthylindole 6,25 63,8 0,3
7-méthylindole 6,25 59,6 0,1
7-fluoroindole 3,125 18,7-38,7 8,4%

47
 Chapitre 2

Figure 18. Structures chimiques des dérivés indoliques 55- 57

II.7. Dérivé polyaminoisoprényle NV716

Un criblage à haut débit de la chimiothèque de composés polyaminoisoprényles a été réalisé

afin d’évaluer leur capacité à diminuer la résistance intrinsèque de P. aeruginosa. Ainsi, une
série de 60 composés, a été testée à une concentration de 10 µM en combinaison avec une
concentration sub-inhibitrice de doxycycline vis-à-vis de la souche de référence de P.
aeruginosa PA01. En parallèle, l'activité antimicrobienne intrinsèque de ces composés a été
évaluée pour permettre la sélection uniquement des composés agissant en tant qu’adjuvants.132
Les résultats ont permis de sélectionner quatre composés démontrant une synergie avec la
doxycycline. L’un de ces composés le NV716 58 a permis la restauration de la sensibilité à la
doxycycline de 100% des souches de P. aeruginosa utilisées dans l’étude (Figure 19). L’indice
FIC ou l’indice de la Concentration Fractionnelle Inhibitrice exprime le degré de synergie entre
les médicaments antibactériens.65 Ce paramètre sera davantage détaillé dans le CHAPITRE 6
(Voir page 149) mais l’indice FIC de la combinaison NV716-doxycycline a été déterminé à
0,09 démontrant ainsi une forte synergie entre l’adjuvant et l’antibiotique. Cette potentialisation
d’activité a été démontré pour des souches de P. aeruginosa de référence PA01, des souches
surproductrices des pompes d’efflux ainsi que pour des isolats cliniques.132
Ce composé NV716 58 réduisait fortement la résistance des souches MDR à la fois à la
doxycycline et au chloramphénicol, qui appartiennent à des familles d'antibiotiques différentes,

48
 Chapitre 2

et il pouvait également augmenter l’activité d'autres familles d'antibiotiques, notamment les ß-

lactamines, les fluoroquinolones et les aminosides, qui représentent les principales classes
d'agents anti-pseudomonaux. Cette observation suggère que cette molécule polyamino-
isoprényle est capable d’altérer directement les mécanismes de résistance naturelle de P.
aeruginosa. Une étude plus approfondie de son mécanisme d’action a permis de conclure que
le NV716 diminue fortement l'efficacité des mécanismes d'efflux et provoque une légère
déstabilisation de la membrane externe.132 Ainsi, il a été considéré comme le meilleur dérivé
polyaminoisoprényle agissant en tant qu’adjuvant à la doxycycline.

Figure 19. Structure chimique du dérivé polyaminoisoprényle NV716 58

III. Synthèse des dérivés polyaminoisoprényles

Dans le but d’optimiser encore plus l’activité du meilleur dérivé polyaminoisoprényle le NV716
58 et d’étudier la relation entre les composants de sa structure chimique et son activité nous
avons commencé nos études préliminaires d'optimisation par la synthèse du dérivé NV716 58
en mettant en œuvre une réaction de substitution nucléophile du chlorure de farnésyle par la
spermine dans diverses conditions expérimentales (Schéma 1, Tableau 7).

ou
ou Solvant,

Schéma 1. Synthèse du dérivé polyaminofarnésyle NV716 58

49
 Chapitre 2

Tableau 7. Rendement de la synthèse du composé NV716 58 obtenus avec différents solvants

Solvant Rendement (%)

THF 64
CH2Cl2 42
Toluène 51
DMF 22

Il apparaît clairement que la réalisation de la réaction dans le THF (Tétrahydrofurane) permet

d'obtenir les composés avec un rendement isolé de 64% alors que des rendements plus faibles
respectivement de 42, 51 et 22% ont été obtenus en réalisant la réaction dans du CH2Cl2, du
toluène ou du DMF. Cette stratégie de synthèse a ensuite été appliquée avec succès pour la
synthèse des dérivés 59-64 en impliquant une substitution nucléophile directe de la polyamine
considérée sur le chlorure de farnésyle ou le chlorure de géranyle (Schéma 2). Dans tous les
cas, les produits attendus ont été obtenus avec des rendements modérés à bons non optimisés
variant de 38 à 61% selon la nature de la polyamine mise en œuvre.

Schéma 2. Structures des dérivés polyaminofarnésyles et polyaminogéranyles 59-64

synthétisés

IV. Activité antibactérienne des dérivés polyaminoisoprényles

Les sept molécules 58-64 ont été évaluées pour leurs activités antibactériennes seules et en
combinaison avec un panel d’antibiotiques appartenant à la famille des tétracyclines vis-à-vis
de la souche bactérienne de référence P. aeruginosa PA01 afin de comprendre leur mécanisme
50
 Chapitre 2

d’action et de pouvoir sélectionner le meilleur adjuvant permettant la restauration de la

sensibilité de P. aeruginosa aux tétracyclines et plus particulièrement à la doxycycline.
Les protocoles des différents tests utilisés pour l’étude de l’activité antibactérienne des
différents composés ainsi que leurs mécanismes d’action seront d’avantage détaillés dans la
partie matériels et méthodes.

IV.1. Détermination des Concentrations Minimales Inhibitrices CMIs

La CMI d’un composé est définie comme étant la plus faible concentration d’une gamme de
dilution d’un antibiotique capable d’inhiber la croissance d’une culture bactérienne in vitro.
Ainsi l’activité antibactérienne d’un composé sera d’autant plus forte que la valeur de sa CMI
sera plus faible. Il existe différentes méthodes permettant la détermination de la CMI, pour la
détermination des CMIs des différents dérivés nous avons utilisé la méthode de référence de
microdilution en milieu liquide (Figure 20), réalisée selon le protocole recommandé par le
Comité de l'Antibiogramme de la Société Française de Microbiologie (CA-SFM ,
EUCAST).161,162 Elle consiste en l’exposition de la culture bactérienne à des concentrations
décroissantes de chacun des différents composés (200 µM- 0,39 µM). La valeur de la CMI de
chaque composé correspond à la concentration du premier puits où il n’y a pas de croissance
bactérienne visible.

Figure 20. Principe de l’évaluation de la CMI par la méthode de microdilution

51
 Chapitre 2

La lecture est effectuée à l’œil nu en se référant au contrôle positif (un contrôle de croissance
des bactéries seules) ou après l’ajout d’iodure de nitrotétrazolium INT dans le cas d’une culture
invisible à l’œil nu. Il s’agit d’un réactif incolore sous sa forme oxydée mais caractérisé par une
coloration rouge sous sa forme réduite par le NADH secrété par les bactéries. Ce changement
de coloration permet de révéler la présence de bactéries vivantes dans le milieu. Les valeurs de
CMIs correspondent à la moyenne de 3 déterminations indépendantes.

IV.2. Evaluation de l’activité antibactérienne des dérivés

polyaminoisopréniques seuls et en combinaison avec les différentes cyclines

Les sept composés 58-64 ont tout d’abord été évalués pour leurs activités vis-à-vis de la souche
bactérienne de référence P. aeruginosa PA01 afin de nous permettre de déterminer leurs CMIs
ainsi que la quantité de composé qui peut être utilisée sans produire d’activité antibactérienne
directe.
Comme le résume le Tableau 8, tous les composés ont montré des CMIs variant de 100 à 400
µM, à l'exception du dérivé NV716 58 qui a montré une CMI de 25 µM. Il convient également
de noter qu'une CMI de 144 µM (64 µg/mL) a été retrouvée pour la doxycycline dans les mêmes
conditions expérimentales.

Tableau 8. CMIs de la doxycycline et des dérivés 58-64 vis-à-vis de P. aeruginosa PA01

Composés 58 59 60 61 62 63 64 Doxycycline
64
CMI (µM) 25 100 100 100 >400 >400 >400 144
(µg/mL)

Les composés ont été ensuite tous testés pour leur capacité à potentialiser l'activité de la
doxycycline vis-à-vis de P. aeruginosa PA01 à 3 concentrations fixes différentes (2,5, 5 et 10
µM). Les résultats sont regroupés dans la Figure 21 et Tableau 9.

52
 Chapitre 2

CMI de la doxycycline
40
(µg/mL)
30

20

10 2,5 µm
5 µm
10 µm
0
58 59 60 61 62 63 64
Composés

Figure 21. Effet dose-dépendant des différents composés 58- 64 testés en combinaison avec
la doxycycline contre P. aeruginosa PA01

Tableau 9. Facteurs de gain obtenus pour la combinaison de la doxycycline avec les

différents composés 58- 64 utilisés à différentes concentrations (10 µM)

Composés 58 59 60 61 62 63 64
Facteur de gain (composé
128 32 32 16 4 8 2
à 10 µM)

Les résultats indiquent clairement une potentialisation dose-dépendante de l'activité de la

doxycycline en présence des différents dérivés testés. En outre, nous avons identifié deux
groupes de composés, un groupe constitué par les dérivés géranyles 62-64 qui présentaient une
faible activité chimiosensibilisante et un second groupe constitué par les composés farnésyles
58-61 qui démontraient une grande efficacité dans la restauration de la sensibilité de P.
aeruginosa à la doxycycline. Parmi eux, le meilleur composé rétablissant l'efficacité de la
doxycycline a été identifié comme étant le dérivé polyaminoisoprényle NV716 58 qui a induit
une diminution de la CMI de la doxycycline de 64 μg/mL à 0,5 μg/mL avec un facteur de gain
de 128 fois lorsqu'il est utilisé à une concentration de 10 μM.

Cependant, cette concentration pourrait être considérée comme élevée par rapport à un composé
utilisé comme adjuvant. Par conséquent, nous avons déterminé la concentration de chaque
composé nécessaire pour diminuer la CMI de la doxycycline au seuil de sensibilité (2 μg/mL).
Ainsi, les concentrations requises des différents dérivés pour restaurer l'efficacité de la
doxycycline vis-à-vis de P. aeruginosa PA01 (2 µg/mL) sont résumées dans le Tableau 10.

53
 Chapitre 2

Tableau 10. Concentrations des différents composés nécessaires pour rétablir l'activité de la
doxycycline à une concentration de 2 µg/mL vis-à-vis de P. aeruginosa PA01

Composé 58 59 60 61 62 63 64
Concentration (µM) 1,56 6,25 6,25 12,5 25 50 100

Ces données ont confirmé que parmi les composés testés le composé NV716 58 possède les
meilleures propriétés adjuvantes, puisqu’une concentration de 1,56 μM (1,6 µg/mL) permet de
diminuer la CMI de la doxycycline contre P. aeruginosa à son niveau de sensibilité de 2 μg/mL.
Les autres composés doivent être utilisés à des concentrations légèrement plus élevées dans le
cas des dérivés du groupe farnésyle (6,25 µM pour 59 et 60) ou modérément élevées pour le
dérivé 61 (12,5 μM), alors que les composés du groupe géranyle doivent être utilisés à des
concentrations très élevées comme pour le composé 64 qui doit être employé à une
concentration de 100 μM.
A partir de ces résultats, nous avons procédé à l'utilisation de divers antibiotiques de la famille
des tétracyclines et à la détermination de l'efficacité des différentes combinaisons antibiotiques-
adjuvants par rapport à P. aeruginosa PA01 (Figure 22). Ainsi, leur activité antibactérienne en
présence ou en l'absence d'adjuvants polyaminoisoprényles à une concentration de 10 µM a été
déterminée.

Doxycycline Minocycline Tigécycline

CMI concentration ( µg/mL )

64
Déméclocycline Tétracycline Oxytétracycline

32 32 32 32

16 16 16 16 16 16 16
8 8 8 8 8 8 8
0,25 2 2 4 21 4 42 4
0,50

Tétracyclines NV716 59 60 61 62 63
seules Composés

Figure 22. Restauration de l’efficacité de différentes cyclines vis-à-vis de P. aeruginosa

PA01 en présence des dérivés NV716 58 et 59-63 (10 µM)

Parmi tous les antibiotiques testés, les combinaisons de la minocycline et de la doxycycline

avec les différents adjuvants ont conduit aux meilleurs résultats. D'autre part, nous avons prouvé
54
 Chapitre 2

que plusieurs composés de ces dérivés polyaminoisoprényles possèdent des propriétés

potentialisatrices de toutes les cyclines vis-à-vis de la souche de référence de P. aeruginosa.
Cependant, les composés polyamino-farnésyliques présentent une meilleure efficacité que les
dérivés polyamino-géranyliques. Dans l'ensemble, ces résultats ont montré que les dérivés
NV716 58 et 60 représentent de meilleurs candidats pour contourner la résistance naturelle de
P. aeruginosa aux cyclines (Figure 23).

Doxycycline Minocycline Tigécycline

CMI concentration

Déméclocycline Tétracycline Oxytétracycline

( µg/mL )

16 16

8
4
0,50 0,25
2 2 1

NV716 60
Composés

Figure 23. Restauration de l'activité des cyclines vis-à-vis de PA01 en présence des dérivés
NV716 58 et 60 (utilisés à une concentration de 10 µM).

Par ailleurs, ces derniers résultats suggèrent également que l'encombrement stérique généré, et
la nature hydrophobe du groupe farnésyl constituent les facteurs les plus importants pour
déstabiliser l'intégrité de la membrane externe de la bactérie. D'autre part, en prenant en
considération pour chaque antibiotique testé le paramètre LogP qui reflète le comportement réel
et la biodisponibilité d'un composé ionisable dans une solution, une corrélation significative
avec l'activité du facteur de gain a été observée (Figure 24).

En effet, les cyclines présentant les valeurs du LogP les plus élevées (à savoir, les dérivés les
plus hydrophobes : la minocycline et la doxycycline) ont montré une meilleur activité avec des
facteurs de gain plus élevés . Ceci nous laisse penser qu’ils présentent une meilleure affinité
avec les constituants (par exemple le lipide A) de la membrane externe déstabilisée assurant de
fait une meilleure pénétration dans les bactéries.

55
 Chapitre 2

Figure 24. Corrélation du facteur de gain observé en fonction de la valeur du Log P de

l’antibiotique tétracycline considéré.

IV.3. Etude de la perméabilisation de la membrane externe

Afin d’étudier le mécanisme d’action de ces dérivés in vitro, nous avons procédé à l’évaluation
de leur effet sur l’intégrité de la membrane bactérienne externe.
La méthode utilisée est basée sur l’étude de la cinétique d’hydrolyse de la nitrocéfine 65. Le
principe est ainsi illustré par la Figure 25. La nitrocéfine est une céphalosporine chromogène
caractérisée par un changement rapide de la couleur distinctive du jaune (max à pH 7=390 nm)
au rouge (max à pH 7= 486 nm) dû à l’hydrolyse du cycle bêta-lactame par une bêta lactamase.
Elle est sensible à l’hydrolyse par toutes les β-lactamases produites par les bactéries à Gram-
positif et à Gram-négatif.163 Ainsi elle a été largement utilisée pour la détection de la production
des bêta-lactamases par les bactéries.164,165

56
 Chapitre 2

extracellulaire
nitrocéfine
1.
mesure de
l'absorbance
2.

3.
β-lactamase

nitrocéfine hydrolysée
périplasme

Figure 25. Principe du suivi de la cinétique d’hydrolyse de la nitrocéfine, selon la thèse de

Marine Blanchet166

Dans notre étude, ce chromophore est incapable d’atteindre l’espace périplasmique seul
puisqu’étant dépourvu d’activité perméabilisante de la membrane bactérienne et d’activité
antibactérienne. Son entrée nécessite donc la présence de molécules capables de lyser ou
déstructurer la membrane externe. Une fois dans l’espace périplasmique, la nitrocéfine est alors
hydrolysée par les enzymes β-lactamases périplasmiques, cette réaction d’hydrolyse est révélée
par le changement de sa couleur quantifié par un changement d’absorbance. Il est ainsi possible
d’évaluer l’action de nos composés sur la perméabilité de la membrane externe en mesurant la
variation d’absorbance de la nitrocéfine hydrolysée 66 à 490 nm en fonction du temps (Figure
26).163

Figure 26. Principe de la réaction d’hydrolyse de la nitrocéfine par une β-lactamase

Plus précisément, une faible valeur d’absorbance mesurée traduit l’absence de perturbation
membranaire par le composé étudié tandis qu’une valeur élevée de l’absorbance mesurée
implique un effet perméabilisant de la membrane bactérienne externe par le composé testé,
important.

57
 Chapitre 2

Deux composés ont été utilisés comme contrôles positifs : la polymyxine B (PMB) et la
polymyxine B nonapeptide (PMBn). Les pourcentages de perméabilisation de chaque composé
testé ont été calculés par la normalisation des données en fonction de l’efficacité de la
perméabilisation induite par la PMB. La PMB est un antibiotique peptidique polycationique
appartenant à la famille des polypeptides, connue pour son activité bactéricide rapide vis-à-vis
des bactéries à Gram-négatif. La PMB exerce une double action, elle se lie à la membrane
externe entraînant sa désorganisation structurelle, ce qui facilite par la suite l'entrée de la
polymyxine elle-même et d'autres agents hydrophobes ou amphipathiques, puis elle se lie à la
membrane cytoplasmique, entraînant la fuite des composants cytoplasmiques, ce qui provoque
la mort cellulaire. Cependant, la PMB attaque également la membrane cytoplasmique des
cellules eucaryotes et est donc trop toxique pour une utilisation en clinique.167

Figure 27. Structures chimiques de la polymyxine B (PMB) et la polymyxine B nonapeptide

(PMBn)

L’élimination du groupe acyle gras de la polymyxine a permis d’obtenir la PMBn avec une
toxicité considérablement réduite; mais, l'activité bactéricide a été perdue (Figure 27).167 Bien
que la PMBn soit dépourvue d’activité antibactérienne, elle reste capable d'interagir comme son
composé parent avec le lipopolysaccharide (LPS) de la membrane externe de la bactérie.168

58
 Chapitre 2

L'interaction hydrophobe de la PMBn avec la membrane bactérienne externe est d'une grande
importance pour son action perméabilisante. En effet, la PMB a deux régions avec des
propriétés hydrophobes : la fraction d'acide gras à l'extrémité N et le segment D-Phe5-Leu6 dans
le cycle peptidique. Ainsi, l'élimination de la queue grasse a supprimé son activité
antimicrobienne directe et la modulation du segment hydrophobe de la PMBn a réduit son effet
perméabilisant de la membrane externe.169

IV.4. Effet des différents dérivés sur la perméabilité membranaire

Afin d'étudier le mécanisme d'action des dérivés polyaminoisoprényles, leur effet sur l'intégrité
de la membrane externe de la souche de référence de P. aeruginosa PA01 a été évalué en
réalisant l’étude de la cinétique d'hydrolyse de la nitrocéfine décrite précédemment.
Quatre témoins ont été utilisés : deux témoins négatifs : un témoin constitué par la bactérie P.
aeruginosa PA01 en croissance et un témoin du tampon phosphate PPB, deux témoins positifs :
le premier constitué par la PMB et le deuxième par la PMBn (voir Annexe 1). Ainsi, les courbes
de la cinétique d'hydrolyse de la nitrocéfine en présence des dérivés 58-64 sont présentés dans
la Figure 28.

PMB PMBn 58 PMB PMBn 63

59 60 61 a 62 64 b
2,5 2,5

2 2
Abs490nm (a.u.)

Abs490nm (a.u.)

1,5 1,5

1 1

0,5 0,5

0 0
0 5 10 15 20 25 30 0 5 10 15 20 25 30
Temps Temps

Figure 28. Comparaison de la cinétique d'hydrolyse de la nitrocéfine en présence de PMB,

PMBn et des dérivés 58-61 (a) et des dérivés 62-64 (b) utilisés à une concentration de 64 µM.

À la même concentration de 64 μM, les résultats ont montré une perturbation forte et rapide de
la membrane bactérienne par les dérivés du groupe farnésyle 58-61 comparable à celle causée
par la molécule du contrôle positif : la PMB (Figure 28-a). Cet effet a été révélé par une
augmentation rapide du taux d'hydrolyse de la nitrocéfine. Cependant, les dérivés 62-64 du

59
 Chapitre 2

groupe géranyle agissent lentement sur la membrane bactérienne, donnant un profil cinétique
d'hydrolyse comparable à celui obtenu avec la PMBn (Figure 28-b). Il est à noter que ces
résultats sont en bonne corrélation avec ceux obtenus dans nos tests précédents relatifs à
l’activité des combinaisons antibiotiques-adjuvants.

Les pourcentages de similarité de l'effet sur l'intégrité de la membrane causé par chaque
composé (64 μM) avec celui de la PMB sont résumés dans la Figure 29.

120 100
b
membranaire (%)
Perméabilisation

100 83
76 71 75
80 66 61
60 51
39
40
20
0
PMB NV716 59 60 61 62 63 64 PMBn
Différents composés
Figure 29. Comparaison des effets de perméabilisation membranaire des dérivé 58-64
(64µM) avec ceux de la PMB

Il est à noter que des concentrations plus faibles (32 et 16 μM) ont été testées pour chaque
composé et ont conduit à une réponse similaire démontrant que cet effet est dose dépendant. La
Figure 30 montre les résultats obtenus avec différentes concentrations du composé NV716
(pour les autres composés 59-64 (voir Annexes 2-3).

100 83
74
membranaire (%)
Perméabilisation

80 63
60
40
20
0
64 32 16
Concentrations (µM)

Figure 30. Comparaison des effets de perméabilisation membranaire du dérivé NV716 58

(utilisé à différentes concentrations) à ceux obtenus avec la PMB.

En outre, le composé NV716 58 a été choisi pour la réalisation d’une expérience contre des
mutant de P. aeruginosa déficients en pompes d'efflux : PA403 (mexAB, mexCD, mexEF,

60
 Chapitre 2

mexXY, mexJK) et PA01(OprM) (mexOprM).170-172 D’après les résultats obtenus certaines

hypothèses peuvent être mises en évidence (Tableau 11).

Tableau 11. CMIs de la doxycycline en présence ou en absence du composé NV716 58

contre des souches mutantes de P. aeruginosa

Doxycycline NV716 Doxycycline en présence

Souches
(µg/mL) (µM) du NV716 (2.5µM)
PA01 32 25 2
PA01 (OprM) 32 25 1
PA403 1 6,25 0,008

Ainsi, le dérivé NV716 58 peut être considéré comme un substrat puissant des pompes d'efflux
CD, EF et/ou JK puisqu'une faible variation de sa CMI est constatée à la fois vis-à-vis de PA01,
PA403 et PA01 (OprM). De plus, on peut noter la faible influence de la délétion de l'OprM sur
les CMIs obtenues pour la doxycycline et le NV716, ce qui suggère que les pompes CD et EF
peuvent expulser la doxycycline en dehors de la bactérie.
Enfin, en considérant la souche PA403, la concentration intracellulaire de doxycycline est
augmentée en présence du dérivé NV716 58 puisqu'on a obtenu une CMI de doxycycline de
0,008 µg/mL correspondant à 128 fois celle observée contre PA01.

Toutes nos données suggèrent que ces dérivés polyaminoisoprényles perturbent l'intégrité de la
membrane externe des bactéries à Gram-négatif de manière dose-dépendante. Néanmoins, le
groupement farnésyle (58-61) confèrent aux composés un effet perméabilisant plus important
que celui obtenu en présence du groupement géranyle (62-64).

IV.5. Effet sur la viabilité bactérienne

Une étude Time-kill vis-à-vis de P. aeruginosa PA01 impliquant différentes concentrations de

doxycycline et du composé NV716 58 en combinaison a été réalisée (Figure 31).

Aucune différence significative n'a été mesurée dans les cinétiques d’action de la doxycycline
à sa propre CMI (64 µg/mL) et la combinaison de la doxycycline avec le NV716 58 utilisés à
des concentrations de 8 µg/mL et 2,5 µM, respectivement. Elles présentent tous les deux un
effet bactériostatique puisque le compte bactérien est resté constant au cours du temps

61
 Chapitre 2

Néanmoins, l'exposition de PA01 à une combinaison de doxycycline-NV716 utilisés

respectivement à des concentrations 32 µg/mL et de 10 µM (10 µg/mL) a pu induire une
réduction de 2 Log10 de l'inoculum initial après 3 h d’incubation, avec une destruction complète
obtenue en 6 heures (une diminution de plus de 3 log10 des unités formant colonies
correspondant à la destruction de 99,9 % de l'inoculum). Ce résultat témoigne ainsi d’un effet
bactéricide de la combinaison doxycycline/NV716 58 utilisés à 32 µg/mL et 10 µM
respectivement.

Dox [8µg/mL]+ NV716 [2.5µM] Dox [32µg/mL]+ NV716 [10µM]

PA01 CMI Dox [64 µg.mL-1]

2E+10
3E+08
CFU/mL

6E+06
1E+05
3E+03
5E+01
1E+00
0 1 2 3 4 5 6
Temps (h)
Figure 31. Effet bactéricide/ bactériostatique de la doxycycline seule ou en combinaison avec
le composé NV716 58 utilisés à différentes concentrations vis-à-vis de P. aeruginosa PA01

V. Conclusion

Dans ce chapitre, une stratégie chimique originale a été développée, permettant d'obtenir de
nouveaux composés polyaminoisoprényles avec des rendements modérés à bons.
La diversité structurale de ces dérivés a permis de mieux comprendre les éléments structuraux
importants pour leur activité restauratrice de la sensibilité des souches résistantes. Ainsi, parmi
tous les dérivés synthétisés, les dérivés du groupe farnésyle 58-61 ont montré un fort effet sur
le niveau de sensibilité aux antibiotiques tétracyclines vis-à-vis des souches bactériennes
résistantes de P. aeruginosa. Le dérivé NV716 58 s’est ainsi montré comme étant l’adjuvant le
plus puissant en combinaison avec la doxycycline parmi tous les dérivés testés, permettant de
diminuer la CMI de la doxycycline vis-à-vis de la souche de référence de Pseudomonas

62
 Chapitre 2

aeruginosa PA01 au-dessous de son seuil de sensibilité (2 µg/mL) lorsqu’il est utilisé à une
faible concentration de 1,56 µM (1,6 µg/mL).
L’ensemble des résultats obtenus au cours de cette étude indiquent que l’activité de ces dérivés
est due à une perturbation de l’intégrité de la membrane bactérienne externe de manière dose-
dépendant résultant en sa perméabilisation facilitant l’entrée des antibiotiques. L’effet
perméabilisant le plus élevé a été obtenu avec le dérivé NV716 58. Cette capacité à perturber
l'intégrité de la membrane externe des bactéries a été corrélée au niveau d'hydrophobie des
antibiotiques tétracyclines.
Dans la continuité de notre travail et sur la base des résultats obtenus dans ce chapitre ainsi
qu’au cours d’autre travaux réalisés précédemment dans notre laboratoire sur le dérivé NV716
58, nous avons envisagé le développement et l’évaluation d’une forme pharmaceutique
inhalable du composé NV716 en combinaison avec la doxycycline dédiée à l’administration
par voie pulmonaire pour la prise en charge des infections respiratoires causées par
Pseudomonas aeruginosa. Avant de présenter les résultats de la caractérisation des formes
inhalées développées à partir de la combinaison NV716/doxycycline, l’administration des
thérapies antibactérienne par voie pulmonaire, ses avantages et ses limitations sont détaillés
tout au long du chapitre suivant (CHAPITRE 3).

63
 Chapitre 3 :

Avantages et limitations de l'administration des antibiotiques

par voie pulmonaire pour la prise en charge des maladies
respiratoires infectieuses

(Synthèse bibliographique)

64
 Chapitre 3

I. Introduction

Différents modes d'administration ont été mis au point pour la délivrance de médicaments et de
nanomédicaments destinés à traiter ou à diagnostiquer les maladies pulmonaires telles que le
cancer du poumon, la tuberculose ou la mucoviscidose.173 Dans ce contexte, l'augmentation de
la résistance aux antibiotiques a créé un besoin urgent de développer de nouvelles méthodes
d’administration des antibiotiques aux patients souffrant d'infections pulmonaires afin,
principalement, d'augmenter l'efficacité des médicaments, de minimiser le risque d'émergence
des souches résistantes et de prévenir la réinfection des patients.5 Ainsi, la voie pulmonaire a
connu un réel regain d'intérêt pour l'administration des antibiotiques inhalés en tant qu'outil
précieux dans la gestion des maladies pulmonaires telles que la mucoviscidose , la tuberculose
et la pneumonie.5,174-177 La maladie pulmonaire la plus courante « la mucoviscidose » est une
maladie génétique caractérisée par un trouble autosomique récessif dû à une mutation du gène
régulateur de la conductance transmembranaire (CFTR) qui entraîne un épaississement des
sécrétions de plusieurs organes.178,179 Bien que cette anomalie entraîne de nombreuses
complications, la caractéristique clinique la plus gênante est l'infection chronique à
Pseudomonas aeruginosa, qui est associée à des exacerbations aiguës et à des lésions
pulmonaires progressives nécessitant une prise en charge rapide des patients sous
antibiothérapie.178,180 Dans ce contexte, l'administration d'antibiotiques anti-pseudomonas par
inhalation a permis de délivrer de fortes doses directement dans les poumons avec une
absorption rapide et une toxicité systémique minimale.181,182 Les antibiotiques les plus
couramment utilisés sous forme d'aérosol pour la gestion à long terme de l'infection à P.
aeruginosa chez les patients atteints de la mucoviscidose sont la tobramycine et le
colistimethate de sodium. 180,181

Dans ce chapitre, nous nous concentrerons sur les avantages et les limitations de
l'administration de médicaments en aérosol pour le traitement des maladies infectieuses.

II. Anatomie

Chez l’homme, le système respiratoire représente un système complexe avec une étroite relation
structure-activité, il se devise d’un point de vue fonctionnel principalement en deux régions
vitales : les voies aériennes conductrices et la région respiratoire.183 La région conductrice est
composée de : la cavité nasale, les sinus, le nasopharynx, l’oropharynx, le larynx, la trachée,

65
 Chapitre 3

les bronches et les bronchioles, et accomplit le rôle de filtre, d’humidificateur et de réchauffeur

d’air,184 tandis que la région respiratoire est composée des bronchioles respiratoires, des
conduits alvéolaires et des sacs alvéolaires.183

Tout au long de l’épithélium respiratoire, le transport transépithélial des médicaments diffère

de façon quantitative entre ces deux régions. En raison de la surface réduite et du flux sanguin
régional faible le transport du médicament est plus limité dans les voies respiratoires
supérieures surtout à cause de la grande capacité de filtrage de cette région qui permet
l’élimination de 90% des particules inhalées. Cependant, les voies respiratoires inférieures et
les espaces alvéolaires représentant 95% de la surface pulmonaire sont directement reliés à la
circulation systémique par la circulation pulmonaire. Il convient également de noter que la
morphologie des cellules épithéliales alvéolaires majeures, la barrière pulmonaire sang/gaz, la
taille des pores et la profondeur des jonctions étroites des cellules alvéolaires et endothéliales
permettent un meilleur transport transépithélial des médicaments.185

De haut en bas on distingue (Figure 32) :

‐ La cavité nasale (le nez) : représente la voie d’entrée de l’air extérieur dans le système
respiratoire.
‐ La cavité buccale : qui assure la communication entre l’appareil respiratoire et
l’environnement extérieur en cas d’obturation des narines.
‐ Le pharynx : un conduit musculaire qui représente une voie commune entre l’appareil
respiratoire et digestif.
‐ Le larynx : qui est un organe de phonation et une partie rétrécie de l’appareil respiratoire.
‐ La trachée : un long conduit de 10 à 15 cm, qui fait suite au larynx, constitué d’une
succession d’anneaux cartilagineux superposés, sa muqueuse est tapissée d’un épithélium
cilié.
‐ Le poumon, un viscère ayant la forme d'un demi-cône, de consistance molle et élastique,
comparable à une éponge remplie d'air et de sang.

66
 Chapitre 3

Figure 32. Illustration du système respiratoire 186

Les deux poumons sont logés dans le thorax, de part et d’autre du cœur, enveloppés par la
plèvre, et partagés en lobes par des scissures (des fentes profondes), le poumon droit comprend
trois lobes (supérieur, moyen et inférieur), tandis que le poumon gauche est divisé en seulement
deux lobes (supérieur et inférieur). Chaque lobe contient des bronches toutes rattachées à la
trachée, et se ramifient en bronchioles plus étroites, qui se terminent par une dilatation brutale
formant le sac alvéolaire. La paroi de ce dernier, très mince constitue le siège des échanges
respiratoires.187,188

III. Traitements pulmonaires ciblés

Le développement d'un système de délivrance de médicaments ciblée fait actuellement l'objet

d'une attention croissante en raison des limites associées aux traitements conventionnels des
maladies chroniques.183 L'efficacité d'un médicament est conditionnée par de nombreux
facteurs dont le mode d'administration, qui influence sa concentration au niveau de son site
d’action ciblé, car une concentration supérieure ou inférieure à la plage de concentration
optimale responsable de l'activité thérapeutique maximale peut accroître la toxicité du
médicament ou conduire à son inefficacité.

L'administration ciblée d'un médicament améliore son indice thérapeutique en augmentant sa

spécificité. Cela est dû au fait que les molécules ciblent un tissu, un compartiment

67
 Chapitre 3

intracellulaire ou une cellule particulière, en contrôlant la cinétique de libération et en

protégeant les agents thérapeutiques.189,190 Ainsi, le développement de systèmes de délivrance
colloïdaux (tels que les liposomes, les micelles et les nanoparticules) a ouvert une nouvelle
frontière pour l'amélioration de la délivrance des traitements. Toutefois, cette administration
ciblée à des organes ou des sites spéciaux représente l'un des domaines de recherche les plus
difficiles de la science pharmaceutique.191

Il existe deux modes de ciblage thérapeutique, le ciblage passif et le ciblage actif. 192 Le ciblage
passif tire parti de la différence micro-environnementale entre les cellules normales et les
cellules malades en utilisant les avantages des conditions physiopathologiques des cellules,
notamment une vascularisation accrue, une surexpression des récepteurs de surface, une
porosité accrue et une morphologie variée.193,194 Le ciblage actif représente un processus bien
contrôlé et coordonné qui a été mis au point pour améliorer la rétention de médicaments sur son
site d'action ciblé, en tant qu'approche complémentaire à la méthode précédente.192 Ainsi, il
facilite la livraison de biomolécules de haut poids moléculaire telles que l'ADN et l'ARN en
surmontant le rejet par la barrière physiologique. Ce mode vise à améliorer la spécificité de la
cible en utilisant une méthode orientée vers les récepteurs de surface pour laquelle les ligands
conçus ont une grande affinité.192,195

Dans ce contexte, au fil des ans, les systèmes d'administration de médicaments colloïdaux, en
particulier les nanoparticules, ont fait l'objet d'une grande attention. Les nanoparticules
présentent de nombreux avantages par rapport aux autres systèmes d'administration de
médicaments en raison de leurs caractéristiques particulières (telles que leur petite taille, leur
grande surface et la possibilité de modifier leurs propriétés de surface). Par conséquent, elles
peuvent être administrées par différentes voies, notamment par voie parentérale, orale,
intraoculaire, transdermique ou pulmonaire.191

1. Administration de nanoparticules à visée pulmonaire par injection intraveineuse :

différents types de nanoparticules ont été utilisés pour évaluer la répartition des
nanoparticules dans le corps après injection intraveineuse. Les résultats ont montré leur
accumulation principalement dans les organes du système réticulo-endothélial tels que
le foie, la rate et les poumons.196,197 Cependant, le ciblage passif des nanoparticules vers
les poumons nécessite l'utilisation de particules de plus de 7 µm pour assurer leur
rétention dans les capillaires alvéolaires. Cela peut entraîner une agglomération des

68
 Chapitre 3

nanoparticules après leur injection en raison de la décomposition des forces de répulsion

entre les particules.198

2. Conjugaison de nanoparticules à des anticorps pour le ciblage pulmonaire : en

raison de leurs propriétés de ciblage, les anticorps monoclonaux199 peuvent être exploités
pour un ciblage actif et une meilleure administration des médicaments en les attachant à
des molécules ou à des systèmes d'administration de médicaments.200,201 Cette approche
a été utilisée pour cibler les tumeurs du poumon à l'aide de nanoparticules modifiées par
des anticorps.202 Cependant, les résultats ont montré que la taille des particules était plus
importante que l'affinité des anticorps monoclonaux pour les cellules tumorales
ciblées.191

3. Ciblage des poumons à l'aide de nanoparticules orales : traditionnellement, la voie

orale est recommandée pour l'administration de formes conventionnelles de
médicaments (gélules, comprimés, solutions). Ainsi, son utilisation pour cibler les
poumons via l'administration de nanoparticules n'a pas donné de résultats prometteurs à
ce jour.191

Dans ce contexte, l'aérosolthérapie est devenue une méthode privilégiée pour l'administration
de composés thérapeutiques ou diagnostiques, soit localement soit systématiquement .203
L'administration ciblée de nanoparticules dans les poumons est un nouveau domaine d'intérêt
car elle permet de réduire la dose thérapeutique nécessaire et les effets secondaires en diminuant
l'exposition systémique .191,204 En outre, les propriétés du vecteur peuvent être modifiées pour
cibler différents types de cellules spécifiques.204

IV. Voie d'administration pulmonaire

Actuellement, de nombreux systèmes de délivrance de médicaments sont utilisés et visent une

administration optimale en minimisant la dégradation du médicament, diminuant ses effets
secondaires et augmentant sa biodisponibilité. Dans ce contexte, la voie pulmonaire constitue
une voie de plus en plus attrayante et d’un intérêt scientifique et biomédical considérable,
surtout parce qu’elle permet une administration ciblée directement au sein du système
respiratoire permettant à la fois un dépôt local et une absorption systémique. C'est la raison pour

69
 Chapitre 3

laquelle de nombreux dispositifs et techniques d’administration de médicaments par voie

pulmonaire ont été développés au cours de ces dernières années.184

Cette voie d’administration à caractère non invasif est dotée d’une grande surface absorbante185
et une bonne perméabilité grâce à sa membrane extrêmement fine et richement vascularisée. En
terme d’administration locale, ce mode d'application topique du médicament permet de réduire
les effets secondaires engendrés par les concentrations systémiques élevées observées avec les
méthodes d’administration classiques, ce qui permet également de réduire le coût du traitement
puisque les doses utilisées seront plus faibles.188 En comparaison avec la voie orale,
l’administration systémique du médicament par voie pulmonaire permet une absorption rapide,
une faible dégradation en raison de l’activité enzymatique comparativement plus faible au
niveau pulmonaire, et d’éviter l’effet du premier passage hépatique, ce qui permet une meilleure
biodisponibilité des médicaments notamment dans le cas des peptides.183,188

De nos jours, de nombreuses pathologies respiratoires et systémiques sont traitées par des
médicaments administrés par voie pulmonaire.205,206 En outre, de nombreux laboratoires
pharmaceutiques ont profité des avantages de la voie pulmonaire pour développer des formes
inhalées permettant l’administration systémique de l'insuline, des hormones de croissance
humaines et de l'ocytocine. 184,188

IV.1. Aérosolthérapie

L’aérosolthérapie, une pratique exercée depuis l’antiquité, bénéficie aujourd’hui d’un véritable
regain d’intérêt. Elle consiste à « administrer les médicaments sous formes d’aérosol dans les
poumons à travers les voies respiratoires ». Le mot « aérosol » est utilisé pour définir un
système de particules dont le diamètre est suffisamment petit pour qu’elles restent en
suspension dans un gaz (l’air le plus souvent). Ces particules peuvent être liquides (gouttelettes)
ou solides (poudre), de différentes formes et tailles.207 L’objectif principal de l’aérosolthérapie
est généralement une délivrance locale du médicament, lorsque le poumon constitue l’organe
ciblé par le traitement administré, mais elle peut être aussi utilisée dans certains cas pour une
administration systémique permettant au médicament d’atteindre la circulation générale et ainsi
plus facilement son site d’action voulu.208 Ce mode d’administration permet d’augmenter la
rapidité et l’efficacité du traitement, et de limiter les effets secondaires en raison du dépôt local
des particules médicamenteuses ; cependant, l’efficacité du traitement est conditionnée par
plusieurs facteurs notamment le site de dépôt de l’aérosol au niveau des voies respiratoires, qui
70
 Chapitre 3

est influencé par les propriétés physiques de l’aérosol, les conditions d’inhalation et l’anatomie
des voies respiratoires.207

Les propriétés aérodynamiques des aérosols déterminent leur site de dépôt, ces propriétés sont
influencées par la taille et la densité des particules qui constituent l’aérosol, et puisque ce
dernier est un système polydispersé hétérogène de particules de différentes tailles et formes, le
diamètre aérodynamique équivalent (Dae) a été défini pour caractériser la taille des particules
quel que soit leur poids, leur forme et leur densité. Ainsi, par définition, le diamètre
aérodynamique : « est le diamètre d’une sphère ayant la même vitesse de chute que la particule
et une masse spécifique égale à 1 g/cm3».207 Le site de dépôt d'une particule inhalée dans les
poumons est principalement conditionné par son diamètre aérodynamique (Dae) et par le
schéma respiratoire du patient.209 Ainsi, la distribution aérodynamique de la taille des particules
et la vitesse des particules sont considérées comme les deux principaux facteurs physiques
affectant le dépôt total et régional de substances inhalées dans les voies respiratoires
humaines.210

Le diamètre aérodynamique est le diamètre géométrique qu'une particule semble avoir sur la
base de sa vitesse, si elle est supposée être sphérique et a une densité de 1 g/cm 3 ; en d'autres
termes, le diamètre géométrique d'une particule sphérique ayant une densité unitaire (1 g/cm3)
est équivalent à son diamètre aérodynamique.211 Comme de nombreuses particules naturelles
ont des densités massiques proches de 1 g/cm3, et en considérant que la sphéricité est une
tendance naturelle basée sur des considérations d'énergie de surface, une telle particule "de
base" s'est avérée utile pour discuter des sites et de l'étendue du dépôt des particules d'aérosol
dans les poumons en fonction de la taille des particules 211.

L’interprétation statique de la distribution en masse des particules de l’aérosol, se fait par

rapport au Diamètre Aérodynamique Massique Médian (MMAD) qui partage la masse de
l’aérosol en deux, 50% de particules ont ainsi un diamètre aérodynamique inferieur au MMAD
et 50% possèdent un diamètre aérodynamique supérieur au MMAD (Figure 33).207
En outre, la quantité de particules fines dans les aérosols est importante. La Fraction de
Particules Fines (FPF) est définie comme le pourcentage de particules ayant un diamètre
aérodynamique inférieur à 5 µm, la taille optimale des particules pour le dépôt dans les
poumons.205,212 La FPF est calculée comme étant le rapport entre la Dose de Particules Fines
(FPD) et la Dose Délivrée (DD),213 où la Dose Délivrée représente la masse totale du

71
 Chapitre 3

médicament administré dans un impacteur (voir CHAPITRE 4) à partir de l'embout buccal de

l'inhalateur, à l'exclusion de la quantité déposée sur le nébuliseur.

𝐃𝐨𝐬𝐞 𝐝𝐞 𝐏𝐚𝐫𝐭𝐢𝐜𝐮𝐥𝐞 𝐅𝐢𝐧𝐞𝐬 (𝐝𝐢𝐚𝐦è𝐭𝐞𝐫𝐞 <𝟓 µ𝐦)

FPF (%) = * 100
𝐃𝐨𝐬𝐞 𝐃é𝐥𝐢𝐯𝐫é𝐞

En outre, la Dose de Particules Fines correspond à la masse des particules de substance active
dont le diamètre aérodynamique est inférieur à 5 µm.214 La Dose Emise (DE) représente la
masse totale de substance active émise par l'inhalateur.213

50 %

Diamètre des
particules µm
50% 50%
masse masse
MMAD = 3 µm

Figure 33. Courbe de distribution massique des particules d’un aérosol

L’aérosolthérapie est indiquée principalement en traitement d’urgence pour la prise en charge

de l’asthme, les bronchites les laryngites et la décompensation d’une Bronchopneumopathie
Chronique Obstructive (BPCO) et d’une Hypertension Artérielle Pulmonaire Primitive
(HTAP). Elle est également recommandée pour le traitement chronique des
bronchopneumopathies, de la pneumocystose et de la mucoviscidose.215
En outre, le recours à la voie pulmonaire ne se limite pas à des fins thérapeutiques mais aussi
de diagnostic, notamment pour déterminer la nature et la gravité des pathologies pulmonaires,
par exemple chez les patients asthmatiques, le test de provocation bronchique avec de
l'histamine, de la méthacholine ou une solution saline hypertonique est utilisé afin de déterminer
le degré d’hyperactivité des voies respiratoires.210,216

IV.2. Biopharmaceutiques inhalés

Un produit biopharmaceutique est défini selon la réglementation de l'Union Européenne comme

"un médicament biologique" tel que "une substance pharmaceutique à base de protéines ou
d'acides nucléiques utilisée à des fins thérapeutiques ou diagnostiques in vivo et produite par

72
 Chapitre 3

des moyens autres que l'extraction directe d'une source biologique native (non modifiée)".
(Directive de la Commission 2003/63/EC).217,218 En d'autres termes, les produits
biopharmaceutiques sont des molécules complexes souvent préparées à partir de systèmes
vivants et dotées d'une certaine spécificité, nouveauté et capacité prometteuse à traiter des
maladies chroniques pour lesquelles il n'existe pas encore de traitement efficace.218
Actuellement, plusieurs produits biopharmaceutiques (dont la plupart sont à base de protéines)
sont approuvés aux États-Unis et en Europe pour le traitement de diverses maladies.219,220 Bien
que ces produits soient délivrés par injection, leur administration par d'autres voies a été
étudiée.221 L'administration par injection pose de nombreux problèmes qui limitent l'adhésion
du patient au traitement, notamment la nécessité de faire appel à un professionnel de la santé
ayant une certaine expertise.222 En outre, l'administration orale des produits
biopharmaceutiques reste assez difficile en raison de leur faible biodisponibilité due au
métabolisme par premier passage hépatique et de leur sensibilité à certaines enzymes gastro-
intestinales.223 Dans ce contexte, l'administration systémique de produits biopharmaceutiques
inhalés attire actuellement une attention considérable, principalement en raison de l'efficacité
de l'absorption de certaines de ces molécules par les poumons.224 Leur administration par
inhalation s'est avérée intéressante en raison de la grande surface des poumons et de la proximité
des systèmes alvéolaires et vasculaires, ce qui maximise le potentiel d'administration médicale
au poumon et/ou à la circulation systémique.224

Toutefois, bien qu'un grand nombre de produits biopharmaceutiques soient actuellement à

l'étude pour une administration par inhalation,225 un seul produit est actuellement approuvé par
la FDA (Food and Drug Administration) et commercialisé sous sa forme inhalée, le Pulmozyme
(désoxyribonucléase humaine recombinante, DNase), utilisé pour réduire la viscosité du mucus
dans les poumons chez les patients atteints de mucoviscidose.224 En outre, la formulation
d'insuline (une des protéines les plus étudiées pour l'administration par inhalation) proposée par
Pfizer (Exubera) pour l'administration pulmonaire a reçu en 2006 l'autorisation de mise sur le
marché de la FDA et de l'agence européenne des médicaments.224

En raison de l'auto-administration pratique et non invasive qui favorise l'observance du patient,

offerte par la voie pulmonaire, la demande de développement de produits biopharmaceutiques
sous forme de doses inhalées est susceptible d'augmenter pour faciliter la gestion à long terme
des maladies chroniques.224 Cependant, la formulation des produits biopharmaceutiques par
inhalation présente de nombreux défis pour les scientifiques. En fonction des objectifs de

73
 Chapitre 3

l'administration, les particules inhalées doivent avoir une distribution de taille spécifique pour
une administration efficace sur le site d'action souhaité.222 Les produits biopharmaceutiques ont
souvent une structure tridimensionnelle complexe, de sorte que les processus de formulation et
de génération d'aérosols doivent être réalisés de manière à garantir la non-dénaturation ou la
modification des molécules, puisque le moindre changement de structure ou de propriétés de
surface pourrait affecter son efficacité, sa toxicité et/ou son immunogénicité.224 L'incorporation
d'excipients est souvent nécessaire pour obtenir une taille de particules dans la gamme des
particules respirables et une durée de conservation maximale. Pour les thérapies protéiques, les
excipients les plus couramment utilisés sont le mannitol, le saccharose, le chlorure de sodium
et le tréhalose.226 En outre, les produits biopharmaceutiques sont des molécules relativement
grosses, qui nécessitent l'ajout d'un activateur d'absorption pour être absorbées au niveau
alvéolaire.227 Cela pourrait potentiellement augmenter la taille des particules en raison de leur
piégeage ou de leur encapsulation dans les activateurs d'absorption.228 Non seulement la taille
aérodynamique des particules produites mais aussi les propriétés de leur surface doivent être
contrôlées, car la micronisation augmente la charge électrostatique des particules, favorisant
ainsi leur agglomération.222 Un autre défi est l'élimination rapide des protéines des poumons,
qui nécessite l'administration répétée de ces produits biopharmaceutiques (une ou deux fois par
223,224,229
jour), ce qui limite l'observance du patient. Dans ce contexte, la PEGylation semble
être une approche prometteuse pour assurer l'efficacité thérapeutique des protéines, puisque la
conjugaison avec le polyéthylène glycol (PEG) améliore la stabilité de la protéine et prolonge
sa rétention sous forme intacte dans l'organisme.222 Elle consiste en la fixation covalente d'une
ou plusieurs chaînes de PEG (un polymère composé d'unités répétitives d'éthylène glycol) à une
molécule.230 Cela réduit la fréquence d'administration pulmonaire et améliore ainsi l'observance
du patient, en particulier dans le cas de traitements chroniques.222

IV.3. Mécanismes d'élimination des particules d'aérosol après inhalation

À l'intérieur des voies respiratoires, les particules inhalées sont soit éliminées vers l'extérieur
de l’organisme, soit absorbées dans la circulation sanguine ou lymphatique, soit dégradées.231
Le poumon humain est équipé de nombreux mécanismes dans différentes régions des voies
respiratoires pour empêcher les particules d'aérosol de pénétrer dans le poumon profond.232,233
Bien que ces mécanismes protègent les voies respiratoires d'une exposition désastreuse à des
matières étrangères, ils constituent de véritables barrières à l'administration de médicaments par

74
 Chapitre 3

inhalation.209 Par conséquent, pour qu'une particule de substance active puisse pénétrer
profondément dans les poumons, elle doit être capable de surmonter les obstacles suivants 233:

IV.3.1. Clearance Mucociliaire (CMC)

Principalement, la région oropharyngée et l'arbre bronchique sont d'excellents filtres pour

éliminer les particules inhalées insolubles et les agents pathogènes déposés sur l'épithélium
cilié.233 Ce système de transport mucociliaire croissant, qui agit comme une barrière physique
potentielle à la pénétration des médicaments, est composé de cellules sécrétoires non poilues et
de cellules poilues.234,235 Ainsi, chez les sujets sains, la majorité des particules déposées dans la
région trachéobronchique des voies respiratoires seront éliminées par le mouvement des cils
faisant remonter les particules le long de l’arbre bronchique, dans les 24 heures.232

IV.3.2. Dégagement mécanique

Une autre ligne de défense innée est représentée par l'élimination mécanique, qui comprend la
toux, l'éternuement ou l'ingestion de particules inhalées déposées dans les voies respiratoires
supérieures. Ce mécanisme concerne les particules d'une taille ≥ 10 μm et se produit
instantanément après leur dépôt dans les grandes voies respiratoires ou il n'est efficace qu'en
raison du débit d'air élevé dans cette région.232 Ainsi, la toux devient le principal mécanisme de
libération dans de nombreuses maladies respiratoires (telles que la bronchite, l'asthme ou la
pneumonie) où la CMC est altéré, ce qui nécessite de maintenir la taille des particules au-dessus
de ≤10 μm pour obtenir l'effet optimal du médicament.236,237 En outre, les particules encore
plus petites qui peuvent s'échapper et se déposer dans la région alvéolaire du poumon subissent
un certain nombre de mécanismes qui inhibent leur absorption.234,238 Ces barrières d'absorption
agissent à des degrés divers en inhibant la perméation des médicaments dans la circulation : la
couche de mucus, la couche de liquide de la muqueuse alvéolaire, l'épithélium alvéolaire, les
macrophages et d'autres cellules.233

IV.3.3. Macrophages Alvéolaires (MA)

Les macrophages sont considérés comme des cellules essentielles pour le maintien des
processus tissulaires homéostatiques, la réparation et l'immunité.239 Ainsi, les macrophages
pulmonaires résidant dans l'espace alvéolaire sont dotés d'une capacité phagocytaire.234 Ils

75
 Chapitre 3

assurent une fonction centrale de maintien de la réponse immunitaire innée, en tuant les agents
pathogènes et en éliminant les particules inhalées peu solubles qui restent dans l'espace
alvéolaire pendant un temps suffisant.234 Cela réduit considérablement la quantité de
médicament nécessaire pour obtenir l'effet thérapeutique.232,240 Cependant, ils sont inefficaces
pour éliminer les particules inférieures à 200 nm.209 En outre, ils participent au mécanisme
d'activation des réponses immunitaires adaptatives par la sécrétion de cytokines et la
transduction de signaux.234,239 D'autre part, les macrophages alvéolaires représentent le
principal obstacle à la libération contrôlée de médicaments dans les alvéoles.232 La majorité des
matériaux utilisés pour prolonger la libération d'un médicament présente toutes les
caractéristiques physico-chimiques qui en font une cible idéale pour l'élimination par les
MA.236,237

IV.3.4. Dégradation enzymatique

Un autre obstacle au développement de formes de médicaments à libération contrôlée par voie

pulmonaire est la dégradation métabolique.241 Bien que le niveau des enzymes de dégradation
et la capacité pulmonaire du métabolisme soient beaucoup plus faibles que ceux du système
hépatique, on observe l'expression des familles de cytochromes P450 (CYP) dans les
poumons.241 Certains tels que le CYP2S et le CYP2F ont été identifiés comme étant spécifiques
aux poumons.242 En outre, d'autres enzymes métaboliques de phase II (telles que les estérases
et les peptidases) sont également exprimées dans le poumon. Leurs concentrations diffèrent
considérablement entre les différents types de cellules qui tapissent les différentes régions des
poumons.243

IV.4. Mécanismes et facteurs influençant le site de dépôt des particules

inhalées

La délivrance pulmonaire des médicaments sous forme d’aérosol se fait principalement selon
deux modes d’administration : l’inhalation nasale et l’inhalation orale. Cependant, plusieurs
caractéristiques anatomiques limitent l’administration nasale et rendent l’administration orale
plus favorable.185 Des études réalisées dans ce domaine ont démontré une meilleure
administration orale des particules ayant un diamètre de 5 µm avec un pourcentage de perte de
seulement 20% comparé à 85% de pertes lors d’une administration nasale.237,244 L’efficacité
des traitements inhalés ne dépend pas seulement du principe actif mais elle est également
76
 Chapitre 3

influencée par la proportion du médicament déposée dans les poumons 245,246 et par son site de
dépôt dans les voies respiratoires. Pour certaines substances, cette proportion est retenue dans
les zones périphériques de l’appareil respiratoire.247 Ainsi, les voies respiratoires ont fait l’objet
de nombreuses études au cours des 50 dernières années, principalement pour évaluer les doses
absorbées des substances inhalées surtout suite à l’exposition au niveau professionnel.248,249
Dans ce contexte, les résultats ont permis la compréhension des mécanismes de dépôt et de
transport des aérosols.205

De nombreux facteurs déterminent et influencent le site de dépôt des particules inhalées, on

peut distinguer :

1. Les facteurs liés aux propriétés physiques de l’aérosol : tels que la taille des particules
générées par le dispositif d’inhalation, leur forme, densité, charge électrique et
hygroscopicité. Trois principaux paramètres déterminent ces propriétés physiques : la
formulation chimique du médicament y compris le principe actif, l’appareil générateur de
l’aérosol et le gaz vecteur. Ainsi deux nébuliseurs différents peuvent générer à partir du
même médicament deux aérosols avec des MMADs différents ; à l’inverse, deux
médicaments différents nébulisés avec le même appareil peuvent conduire à deux aérosols
présentant des paramètres physiques proches.
2. Les facteurs liés aux conditions de l’inhalation notamment le rythme respiratoire y
compris le débit inspiratoire, le volume d'inspiration, la pause respiratoire en fin
d’inspiration et la coordination main-inspiration.
3. Les facteurs liés aux voies respiratoires, tels que la clairance mucociliaire plus rapide au
niveau des voies aériennes proximales, la géométrie des voies aériennes qui dépend
principalement de l’âge, du sexe, de la nature et la sévérité de la maladie obstructive
bronchique.250 205,245,251

De nombreuses études ont été menées à grande échelle en utilisant des modèles in vivo, in vitro
et mathématiques pour étudier le dépôt d'aérosols dans les poumons.252 Ainsi, il a été démontré
que la quantité de médicament atteignant les voies respiratoires est directement proportionnelle
à son efficacité clinique.253 Récemment, de nouvelles études portant sur le dépôt oro-pharyngé
des médicaments ont identifié d’autres facteurs contrôlant le transport et le dépôt oro-pharyngé,
notamment la vitesse des particules, le diamètre de l’embout buccal, et les effets électrostatiques
liés à l’appareil d’administration.205,254-257

77
 Chapitre 3

Principalement, la taille des particules inhalées et leur taux d'inhalation sont les facteurs qui
déterminent où elles se déposent dans les différentes parties des voies respiratoires.258,259 Ce
260
dépôt est le résultat de l'interaction de différents mécanismes physiques fondamentaux .
Cependant, l'impaction, la sédimentation et la diffusion sont les principaux mécanismes de
dépôt.261 Ces mécanismes sont examinés ci-dessous (Figure 34 ) :

IV.4.1. Impaction inertielle

Elle dépend du débit, qui est conditionné par le diamètre aérodynamique des particules. Ce
mécanisme concerne les grosses particules ou gouttelettes (≥5 μm). Les particules inhalées ont
tendance à se déplacer en ligne droite.259,261 À grande vitesse, les grosses particules ne peuvent
pas suivre le trajet du flux d'air dans la zone où il y a un changement massif de sa direction.233,261
En conséquence, les particules de grande taille et de masse (densité) élevée heurtent les parois
et se déposent dans les zones où les voies respiratoires supérieures se ramifient. 252 La
probabilité d'un impact augmente avec l'augmentation de la vitesse de l'air, de la fréquence de
respiration et de la taille des particules.233 Ainsi, l'impaction représente le principal mécanisme
de dépôt observé dans les voies respiratoires supérieures et lors du passage dans la région oro-
pharyngée et trachéo-bronchique où la vitesse de l'air est élevée et le flux d'air est
turbulent.185,262,263 Ainsi, elle peut être partiellement influencée par l'hyperventilation (Figure
34-a).185

IV.4.2. Sédimentation

C'est le mécanisme par lequel les particules se déposent dans les zones où le débit d'air est plus
lent (dans les voies respiratoires inférieures des bronches et dans la région alvéolaire).261 Les
particules ayant un diamètre aérodynamique compris entre 0,5 et 5 μm peuvent éviter
l'impaction dans les voies aériennes supérieures et ainsi atteindre les régions
trachéobronchiques et alvéolaires inférieures où elles se déposent par sédimentation.261 Cette
dernière se produit lorsque la force gravitationnelle agissant sur une particule dépasse la force
totale de la résistance de l'air.233 Ainsi, les particules en phase dispersée sédimentent et tombent
hors du flux d'air à un rythme constant en raison de la gravité ou d'une force centrifuge imposée
dans ces régions pulmonaires.233,252 Ce mécanisme s'observe principalement pour les particules
supérieures à 0,5 μm.237,259,263,264 La probabilité de dépôt de particules par sédimentation est
proportionnelle au temps de séjour dans les voies respiratoires, augmente avec l'augmentation
78
 Chapitre 3

de la taille des particules et diminue avec l'augmentation de la fréquence respiratoire.233 Elle

peut ainsi être influencée par la pause respiratoire en fin d'inspiration qui laisse le temps à la
gravité de s'installer (Figure 34-b).265

IV.4.3. Diffusion

C'est le principal mécanisme de dépôt des particules inférieures à 0,5 μm, causé par les
mouvements browniens.261 La collision des molécules de gaz avec de petites particules
d'aérosol exerce des pressions discrètes et non uniformes sur la surface des particules, ce qui
entraîne un mouvement brownien aléatoire.233 Ce dernier conduit au dépôt de la substance
active et à sa diffusion dans les alvéoles.252 La diffusion est régie par la taille géométrique plutôt
qu'aérodynamique des particules.266-268 Le mouvement brownien est plus important avec la
diminution de la taille des particules et du débit d'air, et devient le principal mécanisme de dépôt
des particules dans les bronchioles, les alvéoles et aux bifurcations des voies respiratoires
bronchiques.233,261 La probabilité de dépôt par diffusion dans la région alvéolaire augmente avec
le rétrécissement des voies aériennes et l'augmentation du temps de séjour (Figure 34-c).269

Impaction (a)
Exhalation
Dae ˃ 5µm
Dae ˂ 0,5µm

Sédimentation (b)
1 ˂ Dae ˂ 3µm

Diffusion (c)
Dae ˂ 1µm

Figure 34. Les principaux modes de dépôt des particules d'aérosol dans les voies respiratoires

Les particules en suspension dans l'air, vont être inhalées et pénètrent dans les voies
respiratoires via les voies nasale ou orale. On définit la propriété d’inhalation d’une particule
par sa capacité à pénétrer les voies aériennes principales, elle dépend du diamètre
aérodynamique des particules inhalées, et représente la fraction d’air qui entre dans les voies
79
 Chapitre 3

respiratoires. Une fois à l’intérieur de l’appareil respiratoire, les particules inhalées peuvent se
déposer dans différentes régions. 205,245,250

Le flux d’air subit des changements de vitesse et de direction au fur et à mesure qu’il pénètre
plus profondément dans l’appareil respiratoire. Au niveau de la trachée, le flux d’air est à une
vitesse maximale, qui diminue lorsque l’air passe dans les poumons. Puis, au niveau des voies
respiratoires supérieures, l’élasticité des poumons donne lieu à un changement de géométrie,
favorisant l’impaction des grosses particules (> 5 µm) puisqu’elles ne peuvent pas suivre le
courant d’air. Les bifurcations carinii représentent le principal site d’impact des particules
inhalées. Généralement, une partie importante de la dose émise par les inhalateurs-doseurs
pressurisés (pMDIs) et les Inhalateurs de Poudre Sèche (IPS) se dépose par impaction au niveau
oro-pharyngé. Les particules d’un diamètre compris entre 2 et 5 µm subissent une réduction de
l’influence des effets inertiels. Leur dépôt se fait par sédimentation gravitationnelle au niveau
des petites voies aériennes et de la région alvéolaire, tandis que les plus fines particules (<0,2
µm) sont soumises à des mouvements browniens et se déposent par diffusion d’une manière
aléatoire sur les parois et à la périphérie des poumons (Figure 35).205,245,250

Dae >5 μm

2 < Dae < 5 μm

0.5 < Dae < 3 μm

Dae < 0.5 μm

1< Dae < 5 μm Intérêt thérapeutique

Figure 35. Influence de la taille des particules sur leur site de dépôt au niveau pulmonaire

V. Dispositifs d’inhalation

Les formes inhalées sont l'une des formes pharmaceutiques les plus difficiles à développer.258
La complexité de cette forme découle du fait que son efficacité dépend non seulement de la

80
 Chapitre 3

molécule pharmacologiquement active, mais aussi de sa formulation et surtout du système

d'administration.258 Par conséquent, un développement réussi des thérapies par inhalation
nécessite une bonne optimisation de l'ensemble du système (médicament, formulation et
dispositif).258 Ainsi, la conception du dispositif d'inhalation est d'une importance capitale pour
obtenir une meilleure administration du médicament sous forme d'aérosol avec une distribution
optimale de la taille des particules pour assurer le dépôt dans la région souhaitée du
poumon.258,270,271

L'administration de médicaments sous forme d'aérosol au système pulmonaire est assurée

principalement par trois dispositifs d'inhalation : les nébuliseurs (à jet d'air, à ultrasons et à
mailles vibrantes), les inhalateurs-doseurs (pMDI) et les inhalateurs de poudre sèche (IPS) 272
273,274
. En outre, une nouvelle classe a récemment été introduite, la classe des inhalateurs de
brouillard doux (SMI).Cette classification prend en considération l’état physique de la phase
dispersée et celui de la phase continue.212

V.1. Nébuliseurs :

Les nébuliseurs sont des dispositifs de conversion des solutions médicamenteuses en aérosol
pour inhalation.275,276 La substance médicamenteuse est dissoute ou en suspension dans un
liquide (généralement une solution aqueuse).212 Ces nébuliseurs utilisent deux principes pour
engendrer des aérosols selon un mécanisme mécanique et selon un mécanisme électrique. Il
existe trois types de nébuliseurs.

1. Les nébuliseurs à jet d’air (pneumatiques) qui utilisent une source de gaz
comprimé (air ou oxygène) permettant la création des gouttelettes à partir d’une
solution ou d’une suspension pour nébulisation, tel que le PARI LC PLUS® (PARI
GmbH, Stranberg, Germany) (Figure 36).

81
 Chapitre 3

Aérosol généré

Déflecteur Impaction des gouttelettes

Venturi Atomisation
Recyclage des gouttelettes
Solution à nébuliser
Aspiration du liquide

Gaz comprimé

Figure 36. Schéma d'un nébuliseur à jet d'air

2. Les nébuliseurs ultrasoniques dont la création de l’aérosol se base sur les

vibrations d’un cristal piézoélectrique qui génère des ondes à haute fréquence (tels
que les systèmes AeroSonic® et Sonix 2000 systems®) (Figure 37).275

Aérosol généré

Entrée d'air

Solution à nébuliser
Eau
Ondes ultrasoniques
Cristal piézoélectrique

Figure 37. Schéma d'un nébuliseur ultrasonique

3. Les nébuliseurs à mailles vibrantes sont définis comme des systèmes de micro-
pompes en raison de leur mécanisme de génération d'aérosols impliquant de
l'énergie forçant la solution médicamenteuse à s'écouler par de petites ouvertures à
travers une plaque ou une membrane (tels que les nébuliseurs eFlow®rapid et
Atomisor Pocket Aeroneb® Go ) (Figure 38).277

82
 Chapitre 3

Solution à nébuliser
Tamis vibrant

Aérosol généré

Figure 38. Représentation schématique d'un nébuliseur à mailles vibrantes

Avec les progrès de la technologie de nébulisation, de nombreuses nouvelles méthodes ont été
développées, en particulier celles utilisant les ultrasons et l'atomisation électrohydrodynamique,
278-280
permettant un contrôle plus rigoureux du processus d'atomisation pour fournir des
aérosols monodispersés ou à dispersion réduite avec la possibilité d'ajustement de la taille des
gouttelettes,281 en modifiant la fréquence de fonctionnement de la vibration ultrasonore grâce à
la conception de l'électrode.282-284 Ainsi, l'atomisation par ondes acoustiques de surface (SAW)
est une technique simple et rapide qui peut être réalisée sur un microdispositif à l'échelle de la
puce pour la génération de gouttelettes d'aérosol dans la gamme du micron et du
submicron.282,285 Par rapport aux techniques d'atomisation ultrasonique standard,286 elle offre
des fréquences de fonctionnement beaucoup plus élevées et permet donc la génération de
gouttelettes de plus petite taille constituant des aérosols monodispersés,282 Ainsi, elle a été
considérée comme une alternative prometteuse à la nébulisation ultrasonique et représente une
révolution dans la technologie microfluidique pour la formation de nanoparticules pour
l'administration ciblée de médicaments et de nombreuses autres applications.287 En outre, en
raison de la fréquence de travail plus élevée, la propension du médicament pulvérisé à la
dénaturation est fortement réduite.288,289

Les nouveaux nébuliseurs basés sur des technologies émergentes telles que l'atomisation
microfluidique par ondes acoustiques de surface ont démontré une grande efficacité de diffusion
(FPF allant de 70 à 80 %). Il convient également de noter que certains d'entre eux sont équipés
d'un logiciel de contrôle numérique et d'un retour d'information sur les performances du
nébuliseur.290 Leur utilisation s'est révélée efficace pour la production d'aérosols appropriés
contenant du salbutamol, utilisé pour le traitement de l'asthme. Les gouttelettes de l'aérosol
produites avaient une taille optimale de 2,84 µm de MMAD, adaptée au dépôt dans la région

83
 Chapitre 3

ciblée par le traitement, avec environ 70 à 80 % du médicament fourni à l'atomiseur déposé

dans le poumon.281

Les nébuliseurs sont des dispositifs polyvalents, qui ont été utilisés pour la nébulisation d’un
large éventail de composés thérapeutiques, permettant une administration passive aux
patients.212,275 Cependant, ils sont encombrants, nécessitent une source d’alimentation externe,
un long temps d’administration et un bon entrainement du patient ou une supervision
professionnelle.260 Par ailleurs, leur portabilité limitée et leurs coûts relativement élevés ont
limité leur emploi à l’utilisation hospitalière et aux soins ambulatoires.212,291,292

V.2. Inhalateurs-doseurs pressurisés (pMDIs)

Les inhalateurs-doseurs constituent un autre système de conversion des médicaments en

aérosols, connu par sa fiabilité et son faible coût.272 Les pMDIs sont utilisés pour délivrer des
principes actifs dissous ou en suspension dans un gaz propulseur volatil non polaire ou dans
une combinaison de gaz propulseurs avec des solvants.212 Ils permettent la délivrance d’un
volume dosé de gaz propulseur contenant une quantité prédéterminée du principe actif. Le
dispositif est composé de trois principales parties : le réservoir destiné à contenir la substance
active (dissous ou en suspension dans le propulseur), la valve doseuse et le bouton poussoir
avec l’orifice de pulvérisation, responsable de la création du nuage d’aérosol.275

Le premier pMDI a été approuvé en 1956 ; au fil des ans, en raison de leur facilité d’emploi ils
ont représenté le système de délivrance par inhalation le plus populaire. Ils sont connus comme
étant le pilier du traitement par inhalation de l'asthme.273,293,294 Ils représentent environ 80% du
marché mondial, surtout parce qu’il s’agit d’un dispositif portable, discret, et relativement facile
à utiliser particulièrement dans les situations critiques telles que les crises d’asthme aigues.
En outre, la haute étanchéité de ces dispositifs empêche la contamination microbienne et leur
confère une longue durée de vie, ce qui fait du pMDI un dispositif attractif pour l’industrie
pharmaceutique (Figure 39).212,295

84
 Chapitre 3

Réservoir
Phase gazeuse

Phase liquide

Valve doseuse

Bouton pressoir avec orifice

Figure 39. Schéma des inhalateurs-doseurs pressurisés pMDIs

Le chlorofluorocarbone (CFC) était le premier gaz propulseur utilisé dans les inhalateurs-
doseurs. 204 Toutefois, en raison de son effet délétère sur la couche d'ozone, son utilisation a été
interdite par les Nations Unies conformément au protocole de Montréal.258,296 Après de
nombreux essais, les hydrofluoroalcanes (HFA), en particulier le HFA-134a et le HFA-227, ont
été choisis pour remplacer les propulseurs CFC en raison de leurs propriétés adaptées à cette
forme pharmaceutique.210,258 Les HFA ne contiennent pas de chlore et n'ont donc pas de
potentiel d'appauvrissement de la couche d'ozone. Ainsi, la béclométhasone et l'albutérol, deux
médicaments majeurs dans le traitement de l'asthme, ont été formulés dans le HFA-134a et sont
actuellement approuvés dans plusieurs pays.210,297 Cependant, les HFA ont des propriétés
physiques et chimiques différentes de celles des CFC.258 Les inhalateurs-doseurs à base de CFC
nécessitent l'utilisation d'agents tensioactifs pour améliorer la stabilité physique des
suspensions, pour empêcher l'agrégation des particules de substance active et pour lubrifier la
valve doseuse. Dans le cas des inhalateurs-doseurs à base d'HFA, le pouvoir de solubilisation
limité des agents de surface a conduit à l'utilisation de l'éthanol pour dissoudre les agents de
surface. Ainsi, certains stéroïdes solubles dans l'éthanol (comme le dipropionate de
béclométhasone) forment une solution dans la formulation à base de HFA, plutôt qu'une
suspension obtenue dans le CFC. Ces solutions peuvent donner lieu à des aérosols présentant
une FPF plus élevée, ce qui permet un dépôt plus important de médicament à la périphérie du
poumon.258,297
Outre les problèmes de solubilisation et de compatibilité entre le principe actif et le propulseur
rencontrés lors de la formulation des inhalateurs-doseurs (en particulier dans le cas de certains

85
 Chapitre 3

médicaments à base de peptides), ils présentent plusieurs autres inconvénients tels que
l'obstruction de l’orifice du bouton pressoir, l'augmentation de la taille des particules pendant
le stockage et la vitesse initiale élevée de pulvérisation entraînant un dépôt oropharyngé
important et une perte substantielle du médicament.275
Récemment, des pMDIs avec un MMAD proche de 1 μm ont été développés et commercialisés.
Ils présentent des propriétés intéressantes par rapport au dépôt dans les poumons, mais jusqu’à
ce jour aucune application avec des antibiotiques n’a été rapportée.

V.3. Inhalateurs de poudre sèche (IPS)

Un troisième système de délivrance pulmonaire a été développé dans le but de résoudre les
problèmes de coordination et d’éviter l’utilisation des gaz propulseurs CFCs des pMDIs : les
inhalateurs de poudre sèche (IPSs). 272

L’utilisation de ces dispositifs d’administration pulmonaire par voie sèche est devenue très
attractive, parce qu’ils offrent plusieurs avantages notamment la stabilité chimique de la poudre
par rapport aux solutions aqueuses administrées par nébulisation.298 Ils sont adaptés à la
délivrance des médicaments faiblement solubles dans l'eau et les médicaments à base de
protéines et de peptides fragiles aux contraintes de cisaillement produites lors de l'inhalation.
299
Ainsi, ils ne posent pas de problèmes de stockage (pas de respect de la chaîne du froid) ni
des problèmes liés à la reconstitution des poudres sous forme de solutions pour nébulisation,
cela est particulièrement intéressant dans le cas des antibiotiques et des vaccins dans les pays
en développement où le transport et le stockage au froid peuvent être problématiques.300

En outre, les IPSs sont faciles à utiliser, beaucoup plus pratiques que les nébuliseurs à jet
classiques car ils sont petits, portables et réduisent considérablement le temps nécessaire à
l'administration d'une dose,301-303 ce qui permet une meilleure observance thérapeutique par le
patient.304 En comparaison avec les pMDIs, la plupart des IPSs sont actionnés par l’inspiration
du patient ce qui permet une coordination automatique entre le fonctionnement de l’inhalateur
et la respiration du patient ;305,306 par conséquent, ils ne nécessitent pas de coordination entre le
déclenchement de la dose et l’inhalation au moment de la libération du médicament. Ils
présentent l’avantage de n’utiliser aucun gaz propulseur, en particulier les CFCs.272,305,307,308 En
outre, ils permettent une meilleure délivrance pulmonaire des médicaments contrairement aux
pMDIs qui fonctionnent sous pression et émettent la dose du médicament à une grande vitesse,
entrainant un dépôt élevé au niveau de l’oropharynx.212,309,310

86
 Chapitre 3

Les inhalateurs de poudre sèche délivrent des formulations médicamenteuses sous forme de
poudres respirables seules ou mélangées avec un excipient non respirable.311-313 Ils sont classés
en deux classes :

1. Les IPSs passifs : qui dépendent entièrement de la capacité inspiratoire du patient.

Ils utilisent le flux inspiratoire pour fournir l'énergie nécessaire à la dispersion de la
poudre.291 L’inconvénient majeur de cette classe de dispositifs est la dépendance de
leurs performances vis-à-vis du débit d’inhalation, ce qui résulte en une forte
variabilité intra et interindividuelle, en particulier chez les patients atteints de
pathologies respiratoires.314 Cette première génération de IPSs est connue pour sa
faible efficacité en terme de Fraction des Particules Fines (10 à 15%) et de
l’incohérence de la Dose Emise.315-317

2. Les IPSs actifs : « de nouvelle génération » ont été conçus afin de surmonter ce
problème et de permettre une précision de la dose émise et une aérosolisation
reproductible. Ils apportent une énergie externe pour disperser la poudre et ne
dépendent pas du débit d’inspiration du patient.291,314 Ainsi, ils ont montré une
efficacité de dispersion supérieure à celle obtenue avec les IPS passifs. D'autre part,
il convient de noter que cette énergie vient soit d’un gaz comprimé, d’un moteur de
roues motrices ou de cristaux piézo-électriques vibrants. 318,319

Ces appareils sont principalement utiles pour une délivrance pulmonaire ou systémique dans
des conditions où le pouvoir inspiratoire du patient ne peut pas être invoqué.320,321
Selon la méthode d’administration de la poudre, ils sont classés en trois types :
Les IPSs à dose unique : qui délivrent une seule dose fournie dans une gélule (en gélatine ou
hydroxypropylméthylcellulose HPMC) qui sera perforée lors de l’actionnement de l’IPS pour
libérer la poudre. Les dispositifs à doses multiples qui contiennent un certain nombre de doses
préremplies dans des gélules ou des blisters et les IPSs multidoses composés de réservoirs
remplis de poudre. Dans ce dernier type, les doses sont échantillonnées par un système de
mesure volumétrique à chaque actionnement par le patient (Figure 40).291,322

87
 Chapitre 3

IPS à dose
unique

IPS à doses
multiples

IPS multidoses
(reservoir)

Figure 40. Représentation schématique des types d'inhalateurs à poudre sèche IPSs

La première génération des poudres sèches pour inhalation était basée sur la préparation de
poudres simples (obtenues par un simple mélange de médicaments micronisés) et d’inhalateurs
simples (IPSs passifs à gélule).

La deuxième génération est constituée des mêmes poudres simples de première génération
associées à des dispositifs plus sophistiqués sur le plan technique.270 Traditionnellement, la
plupart des formulations d’IPS sont composées d'un mélange de particules de substance active
micronisées mélangées avec du lactose comme support, ou parfois d'agrégats de particules de
substance active pures. Pour ces formulations, les fabricants se sont concentrés à optimiser les
performances des dispositifs d'inhalation, par exemple en améliorant la conception de l'embout
buccal, ils ont pu obtenir une faible turbulence de l'air et donc une désintégration plus efficace
des agrégats de particules et une dose plus élevée de particules fines.316 Ces dispositifs
comprenaient des IPSs multidoses passifs et des IPSs actifs.270

La troisième génération de poudres inhalées se caractérise par des poudres sophistiquées ( taille,
granulométrie...) et par l'utilisation de dispositifs d'inhalation très simples.270 Il convient de
noter que l'optimisation de l'administration du traitement par inhalation peut être réalisée non
seulement grâce à des dispositifs améliorés, mais aussi grâce à une formulation plus
sophistiquée qui se disperse facilement dans le flux d'air qui traverse l'inhalateur et peut donc
être administrée à l'aide de simples dispositifs d'inhalation.323 Ainsi, les poudres sophistiquées
se caractérisent par une meilleure fluidification et une cohésion interparticulaire réduite. Les
progrès de l'ingénierie des particules ont conduit à un meilleur contrôle des propriétés des
particules, notamment la taille et la distribution des particules, leur morphologie, leur porosité,

88
 Chapitre 3

leur densité et leur énergie de surface. Le contrôle de ces propriétés a, à son tour, conduit à un
contrôle optimal d'attributs tels que la fluidisation, la dispersibilité, la stabilité chimique et les
propriétés pharmacocinétiques/pharmacodynamiques des poudres, permettant une libération
optimale par inhalation, le plus souvent par des dispositifs simples.270

La dispersion de la poudre à partir d’un IPS fait intervenir deux mécanismes consécutifs, le
processus appelé « fluidification » qui permet de délivrer une dose précise de médicament dans
l’air inhalé par le patient en une seule respiration, ensuite les agglomérats de particules sont
désagrégés afin de créer un nuage respirable de particules fines qui seront transportées vers les
poumons avec l'air inspiré.253,314,324,325 La désagglomération est favorisée par l’augmentation de
la turbulence du flux d’air.326,327 Ainsi, un plus grand effort inspiratoire du patient permet une
meilleure dispersion des agglomérats et la création d’un aérosol avec des particules plus fines
par rapport à un débit plus faible rencontré chez les patients souffrant de problèmes respiratoires
(obstruction grave des voies respiratoires). Cependant, une inhalation très rapide peut entrainer
un dépôt pharyngé important par impaction.275

Deux principaux problèmes sont rencontrés lors de la formulation des IPSs ; le pourcentage de
particules fines FPF et la dose émise ED relativement faibles, cela est généralement attribué
aux forces inter-particulaires et leur tendance à former des agglomérats rendant leur dispersion
très difficile et empêchant leur dépôt optimal au niveau pulmonaire.291,328
Conventionnellement, les poudres pour inhalation sont formulées à partir de particules de
substance active micronisées d’un diamètre compris entre 1 et 5 µm mélangées à de grosses
particules porteuses (excipient) afin d’améliorer leur écoulement, réduire leur agrégation et
faciliter leur dispersion.324,325,329

Par actionnement de l’IPS, le mélange des particules de la substance active et celles de

l’excipient se disperse par cisaillement ou par les forces mécaniques générées par l’inspiration.
Les particules de l’excipient de grande taille se déposent sur l’oropharynx et seront ensuite
avalées dans le tractus gastro-intestinal alors que les petites particules de la substance active
continuent leur trajet vers les poumons.291 Ainsi, le choix du support est primordial dans les
formulations sèches pour inhalation. Il doit être soigneusement sélectionné sur la base de ses
propriétés physico-chimiques telles que la taille et la morphologie, qui affectent profondément
les performances de la formulation.212
L’excipient le plus utilisé est le lactose en raison de ses avantages et surtout son approbation
par la FDA aux Etats-Unis et par les Autorités de Santé des Etats Membres en Europe pour

89
 Chapitre 3

l'utilisation en IPS.291 Cependant, les problèmes d’allergie, d’intolérance au lactose chez

certains patients ainsi que la propriété de réduction et les réactions du lactose avec certains
principes actifs ont conduit à la recherche d’autres supports, certains étant approuvés en dehors
des États-Unis tels que des sucres non réducteurs (p. ex. tréhalose), mannitol, glucose, sorbitol,
raffinose et dextrose.330,331 Des polymères tels que la polyvinylpyrrolidone (PVP) ou povidone
et l’acide polylactique-co-glycolique (PLGA) ont été également étudiés en tant qu'excipients
pour l'inhalation,332 des oligosaccharides cycliques comme (les cyclodextrines ) ont été
proposés pour améliorer la solubilité des composés hydrophobes, stabiliser les principes actifs
contre la dégradation et améliorer les performances aérodynamiques des poudres.212,333-336
D'autre part, la combinaison des principes actifs avec des excipients transporteurs entraine des
variations de propriétés des particules qui entrainent des interactions entre le principe actif,
l’excipient et l’inhalateur.337 En conséquence, le comportement aérodynamique, le site de dépôt
et la dose émise varient considérablement.338 En outre, la distribution de la taille des particules
de la substance active est modifiée par l'ajout d'excipients, ce qui influence grandement
l'efficacité de l'IPS.212 La fonction de particules porteuses des excipients vise à réduire la
cohésion interparticulaire en occupant les sites à haute énergie des particules de substance
active, améliorant ainsi la manipulation, la distribution et le dosage des médicaments. Elles sont
des déterminants essentiels de la performance globale de l'IPS puisqu'elles peuvent représenter
plus de 99 % du poids du produit fini. En outre, les forces adhésives doivent être soigneusement
prises en compte ; car une séparation inadéquate des particules du principe actif et du support
modifie la distribution de la taille des particules de la substance active et est donc la principale
cause des problèmes de dépôt.212
En outre, les excipients approuvés par la FDA ou par l’Agence Européenne des Médicaments
(EMA) pour l’administration pulmonaire étant en nombre très limité,339,340 cette utilisation doit
être limitée aux composés biocompatibles ou endogènes aux poumons et qui peuvent être
métabolisés ou éliminés facilement.292

Une délivrance efficace de la poudre exige que les forces d’adhésion entre le principe actif et
le support ne soient pas trop fortes pour permettre un détachement facile du transporteur lors
de l’inhalation. Ainsi, un équilibre entre les forces d’adhésion et celles de cohésion doit être
ajusté pour assurer une adhésion suffisante qui assure à son tour la stabilité de la formulation
(mélange homogène et uniformité de la dose) et aussi pour garantir un détachement aisé entre
les particules actives médicamenteuses et les particules du support. Il a été démontré que
l’efficacité d’une formulation en poudre est influencée fortement par la qualité du lactose, sa
90
 Chapitre 3

source, sa taille et sa distribution granulométrique.341,342 Bien que la conception d’inhalateurs

plus sophistiqués utilisant la dispersion active des poudres et la synchronisation électronique
aient permis la résolution des problèmes de formulation des IPSs, ces inhalateurs restent
complexes et couteux et leur fiabilité est contestable.315
Étant donné le nombre limité d'excipients autorisés pour l’utilisation par inhalation260 et afin de
résoudre les problèmes de formulation liée au lactose ou aux autres supports, plusieurs
recherches ont ciblé la conception de systèmes sans support. Ces formulations sont obtenues
par des technique d’ingénierie des particules. Elles permettent d’éviter les problèmes
d’uniformité de mélange et d’aérosolisation de la formulation. En outre, ces formulations sans
support sont particulièrement bénéfiques dans le cas des médicaments administrés à forte dose
tels que les antibiotiques, l’absence ou la quantité limitée d’excipients rend leur administration
pulmonaire possible, et limite la masse inhalée pour les autres médicaments. Parallèlement, de
nombreux inhalateurs ont été développés afin d’assurer l’efficacité de l’administration et de la
dispersion des poudres sans support.341

V.3.1. Ingénierie des particules pour inhalation

Les progrès récents et la sophistication croissante de la thérapie par inhalation ont suscité un
intérêt considérable pour le développement de nouvelles technologies pour formuler des
particules inhalées sur mesure, permettant une délivrance pulmonaire optimale.315 L’ingénierie
des particules est un outil pratique permettant la production contrôlée de particules avec des
caractéristiques souhaitées pour un coût moindre. Une grande variété de techniques a émergé
au cours de la dernière décennie pour fabriquer des particules avec des propriétés pour
l’inhalation adaptées telles que : une distribution granulométrique peu étendue (dispersée), une
dispersion améliorée et une biodisponibilité optimisée pour une utilisation simple. Certaines
sont même à libération prolongée et/ou permettent un ciblage précis.260,315,343 En outre, la taille
géométrique de ces particules comprise entre 100 nm et 100 µm a démontré une diversité de
propriétés physico-chimiques et biologiques. Par exemple, les particules ultrafines sont
capables de contourner la clairance par les macrophages et passent facilement à travers
l’épithélium pulmonaire. Bien que cette propriété soit particulièrement intéressante pour une
administration systémique, elle est en contre partie liée à une augmentation apparente de la
toxicité.344-347

91
 Chapitre 3

Plusieurs études épidémiologiques ont montré le lien entre une exposition accrue à des
concentrations élevées de particules fines ou ultrafines et des effets néfastes sur la santé. 344,348
Principalement, l'observation des effets cardiovasculaires a déclenché la discussion sur
l'amélioration du passage de ces particules à travers l'épithélium respiratoire vers la circulation
et ensuite vers d'autres organes cibles (tels que le cœur, le foie et le cerveau) avec des
conséquences néfastes sur la fonction cardiaque, la coagulation sanguine et les fonctions du
système nerveux central.344,349 En outre, en raison de leur surface spécifique élevée, ces
particules ultrafines sont considérées comme ayant une toxicité spécifique, qui pourrait
conduire à l'induction de radicaux d'oxygène et à la catalyse de réactions chimiques.344,350-352

V.4. Inhalateurs à brume douce (Soft Mist Inhalers) SMIs

En vue d’améliorer l’administration des médicaments dans les poumons et surtout de surmonter
les difficultés rencontrées par les patients avec l'utilisation des pMDIs et des IPSs (supprimer
la nécessité de la coordination main-poumons des patients, permettre une utilisation facile sans
effort inspiratoire important) un nouveau système d’inhalation a été conçu : l’inhalateur de
brume ultra-fine (SMI).353 Par définition, les inhalateurs de brume ultra-fine, sont des
pulvérisateurs similaires aux pMDIs, qui atomisent la solution médicamenteuse permettant son
administration sous forme de brouillard plus fin et d’une façon plus lente comparablement aux
autres dispositifs de pulvérisation. La durée de pulvérisation plus lente est destinée à faciliter
voire à réduire la coordination du patient entre l’action de la main pour libérer la dose et
l’inhalation exigée pour les pMDIs.274,354 Actuellement, un seul produit appartenant à cette
classe est disponible sur marché le Respimat® Soft Mist™ Inhalateur (Boehringer Ingelheim,
Ingelheim am Rhein, Allemagne),274 développé avec les caractéristiques d'un inhalateur idéal
qui fonctionne indépendamment de l'état de santé du patient (Figure 41).353 Pour la
pulvérisation d’une dose précise de la solution médicamenteuse en fines particules inhalables,
l’inhalateur Respimat® utilise un système de buse extrêmement fine, l'Uniblock, sans l’emploi
de gaz propulseur. L’aérosol ainsi généré est caractérisé par une fraction élevée de particules
fines FPF et un profil de dépôt au niveau pulmonaire favorable par rapport aux inhalateurs à
poudre sèche et aux inhalateurs-doseurs pressurisés (le dépôt de la substance active au niveau
pulmonaire est maximisé tandis que le dépôt oropharyngé est minimisé). En raison de sa plus
grande efficacité de délivrance des médicaments, il permet l’administration de doses plus
faibles tout en offrant un meilleur contrôle des symptômes.353,355 L’équivalence clinique entre

92
 Chapitre 3

le Respimat® (5 μg) et le HandiHaler® (18 μg) a été démontré dans l’administration du

tiotropium pour le traitement d'entretien des maladies pulmonaires obstructives chroniques. De
plus, les études comparatives ont montré que les patients préfèrent le Respimat® en raison de
son utilisation plus facile.353
L’inhalateur Respimat® "jetable" fonctionne avec une seule cartouche, à partir de laquelle
l’aérosol est généré, une fois que le nombre de doses indiqué est atteint l’inhalateur se verrouille
et ne peut plus être utilisé. En conséquence, il a été mis à jour afin d’optimiser le nombre de
doses et le rendre réutilisable jusqu'à six cartouches. Cette actualisation vise à améliorer la
convivialité et l'impact environnemental de l'inhalateur Respimat®, tout en gardant ses
performances de base.355

Embout buccal
Uniblock

Bouton d'émission de dose Sortie de buse

Tube capillaire Structure de filtrage

Plaque de silicone

Verre
Base transparente

Ressort

Cartouche

Figure 41. Illustration schématique de l’inhalateur Respimat® Soft Mist™ montrant les
composants clés de l’appareil et les détails de l’uniblock 356

VI. Antibiotiques inhalés

Les antibiotiques en aérosol sont de plus en plus utilisés pour la prise en charge des infections
pulmonaires à Pseudomonas aeruginosa chez les patients atteints de la mucoviscidose, ces
infections sont généralement associées à une perte plus rapide de la fonction pulmonaire et une
diminution significative de la survie.357-359 L’administration répétée des antibiotiques inhalés
chez ces patients a été de plus en plus pratiquée au cours des deux dernières décennies,360 ce
qui a permis de contourner les problèmes de faible pénétration des antibiotiques dans le tissu
pulmonaire parenchymateux et les sécrétions bronchiques ainsi que leur toxicité systémique
due à l’exposition prolongée, rencontrés dans le cas de l’administration intraveineuse.361 En
93
 Chapitre 3

outre, les antibiotiques inhalés ont entrainé une amélioration de la fonction pulmonaire et une
diminution du taux d’hospitalisation.362

Les seuls antibiotiques approuvés pour une administration pulmonaire sont : la tobramycine
[Tobramycine Solution pour Inhalation (TIS ; TOBI®, 300 mg/5 mL)], le colistiméthate de
sodium [Colistine pour nébulisation (Colimycine ®, 1 MUI/ 3 mL)], et plus récemment,
l'aztréonam [Aztréonam Solution pour Inhalation (AZLI ; Cayston®, 75 mg)].363 En 2018, la
formulation pour inhalation à base de liposomes d’amikacine [Suspension d’Inhalation de
Liposome d’Amikacin (ALIS ; Arikayce®, 70mg/mL)] a été approuvée par la FDA aux États-
Unis.364

Dans ce contexte, la tobramycine a été commercialisée sous la forme d’une solution nommée
TOBI® ( 300mg/ml) administrée à l’aide d’un nébuliseur à jet réutilisable : le PARI LC PLUS®
combiné à un compresseur approprié assurant un débit de 4 à 6 L/min , et également sous le
nom de Bramitob® (300 mg/4 ml) en combinaison avec le nébuliseur à jet réutilisable PARI
LC PLUS ™ et le compresseur PARI TURBO BOY ™.361 Ainsi, une dose de 300 mg de
tobramycine administrée deux fois par jour de façon intermittente améliore significativement
la fonction pulmonaire et réduit la densité de P. aeruginosa dans les expectorations.361,365,366 Il
convient également de noter que plusieurs études ont rapporté une réduction importante de
l'inflammation des voies respiratoires ainsi qu'une éradication totale de P. aeruginosa jusqu'à
trois mois après la fin du traitement.366-368

La colistine représente un exemple type de médicaments qui ont bénéficié des avantages de
l’administration par inhalation. Ainsi, en 1985 une étude a démontré que l’administration locale
de la colistine par inhalation s'est avérée cliniquement efficace dans le traitement des patients
atteints de mucoviscidose.369 Une autre étude a montré que l’inhalation de la colistine réduit la
détérioration des fonction pulmonaires ainsi que la réponse inflammatoire qui se manifeste
généralement après l’achèvement d’une cure de thérapie vis-à-vis de Pseudomonas aeruginosa
par voie intraveineuse.370

Les antibiotiques disponibles dans le commerce sous forme de solutions pour nébulisation
présentent plusieurs inconvénients, puisque leur administration nécessite un compresseur et un
nébuliseur et dure environ 20 minutes par dose sans tenir compte du temps nécessaire pour le
nettoyage et la désinfection de l’équipement. Ces inconvénients peuvent être un fardeau et
conduire à une mauvaise adhésion à ce type de traitement par les patients et notamment les
patients jeunes atteints de mucoviscidose.362,371,372 D’autre part, les caractéristiques favorables
94
 Chapitre 3

des inhalateurs de poudres sèches (IPS) (diminution du temps d’administration, élimination du

besoin de nettoyage et de stérilisation de l’équipement d’administration et de réfrigération des
médicaments ainsi que leur portabilité) ont suscité l'engouement des chercheurs pour les IPSs
en tant que alternative aux nébuliseurs pour résoudre les problèmes de délivrance des
antibiotiques par inhalation. Cependant, la plupart des IPSs ne délivre que de faibles quantités
de l’ordre du microgramme. L’approche envisagée pour palier à ce problème a consisté en la
formulation des antibiotiques sous la forme de poudre sèche qui pourrait atteindre des doses
pulmonaires thérapeutiques tout en gardant les caractéristiques aérosols souhaitées.362,363 Ainsi,
en 2007 362 une formulation de tobramycine sous forme de particules creuses et poreuses créant
une poudre facilement dispersible et utilisable avec un simple inhalateur de poudre IPS a
constitué une avancée importante dans l'administration des médicaments par voie inhalée.
L’administration d’une dose unique de tobramycine de 4 gélules de 28 mg (112 mg) sous forme
de poudre (TIP) a démontré ainsi une efficacité supérieure et un effet plus rapide que la dose
de tobramycine utilisée en solution pour nébulisation (TSI). La délivrance de la tobramycine en
poudre dans les poumons était ainsi presque trois fois plus efficace que la tobramycine en
solution inhalable, et bien tolérée par la majorité des sujets atteints de mucoviscidose.362 Ce
dernier protocole a fait l'objet de deux études de phase 3 démontrant son innocuité apportant un
bénéfice clinique en améliorant la fonction pulmonaire et en diminuant la charge microbienne
de P. aeruginosa dans les crachats et ceci en utilisant un système d'administration plus pratique
permettant d’améliorer l'observance thérapeutique par le patient et les résultats
cliniques.362,363,373

Malheureusement, un tel traitement par la tobramycine a montré plusieurs inconvénients y

compris les risques potentiels pour la sécurité liés au traitement à long terme par les aminosides,
la possibilité de développement de la résistance à la tobramycine par P. aeruginosa, et le
problème d’antagonisme entre la tobramycine et les constituants du mucus.374-377 Ce
phénomène d’antagonisme a été attribué à plusieurs facteurs, tels que l’acidité et la force
ionique élevée des expectorations ainsi que l’inhibition de l’activité de la tobramycine par sa
liaison potentielle aux composants d’expectoration (tels que les glycoprotéines de la mucine et
l'ADN).377 En outre, chez les patients atteints de mucoviscidose, la teneur en glycoprotéines
dans les expectorations est fortement augmentée, elle peut atteindre une teneur 2,5 fois plus
élevée que la moyenne.378 Ainsi, dans ce dernier cas, la dose d’antibiotique nécessaire pour
maximiser le dépôt et l’absorption dans les poumons doit être augmentée. Par conséquent le
développement de nouveaux antibiotiques inhalés capables de résister à l’inhibition par les

95
 Chapitre 3

constituants du mucus ou à la dégradation par aérosolisation semble justifié. Ces antibiotiques

seront plus efficaces dans la prise en charge des infections endo-bronchiques chez les patients
atteints de mucoviscidose (c’est-à-dire fournir une inhibition bactérienne efficace avec une dose
délivrée dans les voies respiratoires plus faible).377

Dans ce contexte, la formulation de l’aztréonam sous forme de sel de lysine a été développée
pour l’administration pulmonaire. Contrairement au phénomène d’antagonisme observé avec
la tobramycine, le lysinate d’aztréonam n’a pas démontré une diminution d’activité en présence
des composants d’expectoration des patients atteints de mucoviscidose.377 L’étude de la
pharmacocinétique et de la tolérance du lysinate d’aztréonam à des doses croissantes (75, 150
et 225 mg) a montré immédiatement après l’administration d’une dose unique dans chacun des
cas des concentrations d’aztréonam dans les expectorations supérieures à la CMI connue pour
P. aeruginosa vis-à-vis de cet antibiotique (32 mg/ml).377 En outre, l’exposition systémique
était faible, les concentrations plasmatiques d’aztréonam ont été démontrées très inférieures à
celles observées avec l’administration intraveineuse et également à celles associées à la toxicité
systémique.377 Sur la base de ces résultats, d’autres études ont été réalisées pour évaluer
l'innocuité, la tolérance et l'efficacité de l’aztréonam en inhalation selon différents critères de
patients et schémas posologiques.379-381 Elles ont démontré que l’utilisation de l’aztréonam en
inhalation à court terme n’entraine pas une diminution de la sensibilité de P. aeruginosa à
l’aztréonam et n’est pas associé à l'apparition de nouveaux agents pathogènes dans les
poumons.379 En outre, il a été rapporté que l'aztréonam inhalé constitue un traitement d'appoint
efficace pour la prise en charge des infections chroniques à P. aeruginosa des voies respiratoires
chez les patients atteints de mucoviscidose déjà traités de manière intensive par la tobramycine
inhalée.380 Par ailleurs, chez les patients avec une exacerbation pulmonaire modérée à sévère
n’ayant pas reçu un antibiotique antipseudomonal ou d'azithromycine, un traitement de 28 jours
avec l’aztréonam en inhalation améliore significativement les symptômes respiratoires.381

Il est également à noter que le mode de croissance de type biofilm ralentit considérablement la
pénétration des aminosides et représente un défi majeur pour la délivrance des antibiotiques,382
à cause des interactions électrostatiques des aminosides avec le mucus et la matrice du biofilm
et de leurs faibles activités vis-à-vis des bactéries avec un phénotype de croissance lent.383 Face
à une telle situation, l’approche envisagée est l’administration directe d’antibiotiques aux
poumons via l’inhalation, cependant, la taille trop petite des particules inhalées résulte en leur
élimination rapide des poumons,384,385 limitant la durée à laquelle l’antibiotique se trouve à un

96
 Chapitre 3

niveau supérieur à sa CMI au voisinage local de la bactérie. Ainsi, ce temps de séjour court au
niveau pulmonaire exige une administration répétée d’au moins deux fois par jour.382

En 2008, l’utilisation des liposomes inhalés a permet une délivrance efficace avec des
concentrations suffisantes de l’antibiotique au niveau des sites d’infections cibles sur une
période prolongée qui pourrait améliorer le traitement des infections pulmonaires dues à la
mucoviscidose.382 Dans ce contexte, la délivrance intratrachéale d’une formulation de
tobramycine sous forme de liposomes inhalés a permis d’augmenter significativement la
rétention médicamenteuse dans les poumons et d’améliorer ainsi l’activité antibactérienne.386-
388

Par ailleurs, l’étude du mécanisme d’action de liposomes nanométriques à base d’amikacine

conçus spécifiquement pour la nébulisation pulmonaire a démontré une pénétration aisée dans
les biofilms et le mucus infecté avec une libération lente et continue de l’amikacine liposomale
dans les poumons des rats infectés et considérablement plus efficace que celle obtenue avec
l’amikacine libre inhalée, pouvant ainsi représenter une alternative pour le traitement des
infections pulmonaires chroniques. 382

En septembre 2018, La Suspension de Liposomes d’ Amikacine pour Inhalation (ALIS ;

ARIKAYCE®) a été approuvée par la FDA comme étant le premier médicament pour la prise
en charge des Mycobactérioses pulmonaires Non-Tuberculeuses (MNT) causées par
Mycobacterium avium complex (MAC).389 Il est important de noter que la Mycobactériose
pulmonaire Non-Tuberculeuse est particulièrement difficile à traiter car elle nécessite la
présence de grandes quantités d'antibiotiques au niveau pulmonaire tout en maintenant des
concentrations systémiques faibles pour éviter la toxicité.390 Ainsi, la formulation de
l’amikacine sous forme de suspension de liposomes inhalés a constitué une approche
thérapeutique prometteuse pour la prise en charge des MNTs.389 Il a été démontré que cette
formulation facilite la pénétration de l’amikacine au niveau du mucus des Mycobactéries non
tuberculeuses (MNT), améliore son absorption dans les macrophages, à la fois in vitro et in
vivo et permet sa rétention dans les voies respiratoires et le tissu pulmonaire. Ainsi, une fois
inhalée, l’ALIS se disperse dans les poumons et passe à travers le mucus pour atteindre les
zones infectées. L’administration de l’ALIS chez des animaux sains résulte en une répartition
de l’amikacine de manière égale dans les poumons (des concentrations d’amikacine égales dans
tous les lobes des deux poumons).391 Bien que le mucus représente un obstacle supplémentaire
à la distribution des particules inhalées, l’administration de l’amikacine sous forme de

97
 Chapitre 3

liposomes facilite sa diffusion à travers le mucus humain de 500 à 1000 µm d'épaisseur.392

Cependant, de nombreux effets indésirables respiratoires ont été observés au cours du premier
mois de traitement touchant principalement les voies aériennes supérieures (dysphonie, toux,
douleurs oropharyngées) et les voies respiratoires inférieures (dyspnée, respiration sifflante,
bronchospasmes).393,394

Une étude réalisée récemment a démontré que ces effets indésirables peuvent être gérés à l'aide
de diverses techniques et approches en vente libre permettant aux patients de continuer à utiliser
ce traitement. On peut ainsi prendre l’exemple de la dysphonie (effet indésirable le plus signalé)
qui a été considérablement réduit par l'ingestion de liquides apaisants, le gargarisme avec de
l'eau chaude ou de la glycérine et le rinçage de la bouche après la nébulisation.389 Il convient
de noter que l'éducation des patients avant et pendant le traitement par l’ALIS est essentielle
pour optimiser le potentiel de réussite de cette thérapie. Ainsi, les patients bien informés sont
plus conscients des effets indésirables potentiels liés au traitement et des stratégies de gestion
des symptômes sans avoir besoin de l’intervention d'un prestataire ni d’arrêt du traitement, ce
qui renforce considérablement à la fois la tolérance et l'observance.389

Tableau 12. Avantages et limitations des différents antibiotiques commercialisés sous forme
d’aérosol

Composé
Ref Forme Problèmes résolus Avantages Limitations

−Mauvaise pénétration des −Niveaux pulmonaires

antibiotiques dans le tissu supérieurs à ceux obtenus par
Solution pour
pulmonaire administration entérale ou
nébulisation :
parenchymateux et les parentérale
−TOBI®
Tobramycine sécrétions bronchiques −Amélioration de la fonction
(300 mg/5mL)
361
−Toxicité systémique des pulmonaire et diminution du
antibiotiques administrés taux d'hospitalisation −L'administration
−Bramitob® nécessite un
par voie intraveineuse en −Réduction de la densité de P.
(300 mg/4mL) compresseur et un
raison d'une exposition aeruginosa dans les
prolongée nébuliseur
expectorations
−La nébulisation
dure environ 20
−La colistine inhalée n'induit minutes par dose
pas de résistance de P. −Longue durée de
aeruginosa ni d'infection
−Le développement de la nettoyage et de
secondaire par d'autres micro- désinfection du
Solution pour résistance à la tobramycine
organismes résistants à la matériel
Colistine nébulisation : par P.aeruginosa
colistine
370
− Colimycine® −Faible diffusion de la
−L'administration locale de
(1 MUI/ 3 mL) colistine par
colistine inhalée réduit la
administration systémique
détérioration de la fonction
pulmonaire et la réponse
inflammatoire

98

− Les risques potentiels
pour la sécurité associés au
Solution pour traitement à long terme par
Aztréonam nébulisation : les aminosides
377
− Cayston® − Le problème de
(75 mg) l'antagonisme entre la
tobramycine et les
constituants des crachats
− Les inconvénients des
solutions pour nébulisation
Tobramycine Poudre pour
362 des antibiotiques
inhalation
entraînent une mauvaise
observance du traitement
− Le mode de croissance
de type biofilm ralentit
considérablement la
pénétration des
aminosides.
Liposomes
− La très petite taille des
pour
Amikacine particules inhalées entraîne
382 nébulisation :
leur élimination rapide
− Arikayce®
dans les poumons.
(70mg/mL)
− Aucun médicament
approuvé pour la gestion
de la Mycobactériose
pulmonaire Non-
Tuberculeuse (MNT)
VII. Conclusion
Actuellement, les infections respiratoires représentent un véritable problème de santé mondial.
Elles sont considérées comme étant la première cause de décès dans les pays en développement
Chapitre 3
− Le lysinate d'aztréonam n'a
pas montré de diminution
d'activité en présence des
composants des
expectorations des patients
atteints de mucoviscidose
− Les concentrations
plasmatiques d'aztréonam sont
beaucoup plus faibles que
celles observées en cas
d'administration par voie
intraveineuse
− L'utilisation à court terme de
l'aztréonam inhalé ne diminue
pas la sensibilité de P.
aeruginosa à l'aztréonam et
n'est pas associée à
l'apparition de nouveaux
pathogènes dans les poumons
− L'administration d'une dose
unique de 112 mg de
tobramycine sous forme de − La plupart des
poudre (TIP) a démontré une IPS ne délivrent
efficacité supérieure et plus que de faibles
rapide qu'une dose de 300 mg doses de l'ordre
de tobramycine en solution du microgramme
pour nébulisation (TSI) (µg).
− Il faut moins d'un tiers du
temps pour son administration
− L'administration directe − De nombreux
d'antibiotiques dans les effets indésirables
poumons sous forme de respiratoires,
liposomes inhalés permet de affectant à la fois
délivrer des antibiotiques de les voies
manière durable aériennes
− Pénétration facile dans le supérieures
biofilm et le mucus infecté (dysphonie, toux,
− Libération lente et continue douleur
de l'amikacine liposomale oropharyngée) et
dans les poumons les voies
− Plus efficace que aériennes
l'amikacine libre inhalée inférieures
− Augmente significativement (dyspnée,
la rétention de la drogue dans respiration
les poumons et améliore ainsi sifflante,
l'activité antibactérienne bronchospasme).
99
 Chapitre 3

et la troisième cause de décès dans le monde.395 En raison de la profondeur de la localisation

des micro-organismes au niveau des voies respiratoires, seule une partie du médicament peut y
arriver après l’administration orale ou parentérale. Par conséquent, des doses élevées
d’antibiotiques sont nécessaires pour maintenir les niveaux des substances actives au-dessus de
leurs CMIs sur les sites d'infection. Malheureusement, les thérapies basées sur l’administration
systémique de fortes doses d’antibiotiques peuvent entraîner des effets indésirables graves.

Dans de telles situations, l’administration des antibiotiques sous leurs formes inhalées
directement dans les vois aériennes offre une solution prometteuse qui a démontré son efficacité
dans la gestion des maladies infectieuses pulmonaires, permettant d’atteindre une
administration ciblée et d’obtenir des concentrations plus élevées au niveau du site d’infection
avec une faible exposition systémique. Il a été démontré que cette voie d'administration
maximise la concentration pulmonaire des antibiotiques tout en minimisant les effets
secondaires dus à une faible exposition systémique. En outre, la majorité des études ont
confirmé le profil de sécurité acceptable des antibiotiques inhalés. Contrairement à
l'administration systémique des antibiotiques, qui est considérée comme le principal facteur de
résistance bactérienne aux antibiotiques, leur administration pulmonaire locale n'est pas
associée à une résistance accrue ou à une toxicité systémique. Cependant, les formes inhalées
sont considérées comme des formes de dosage complexes et difficiles à développer en raison
de la nécessité d'un contrôle strict de la distribution granulométrique des aérosols ainsi que de
leur comportement aérodynamique et de leurs propriétés de surface pour assurer un dépôt
optimal sur le site d'infection cible.

Bien que la mise au point de traitements efficaces basés sur des antibiotiques inhalés soit
complexe, les récents progrès technologiques ont permis de faciliter le développement de
médicaments inhalés. Ainsi, les nouveaux nébuliseurs à mailles ont permis de réduire au
minimum les résidus de médicaments et d'augmenter l'aérosolisation. Grâce à des techniques
avancées d'ingénierie des particules et la conception intelligente des appareils, les inhalateurs à
poudre sèche sont devenus un moyen attrayant pour l'administration de fortes doses
d'antibiotiques. En outre, les formulations liposomales, polymères et nanoparticulaires des
antibiotiques représentent des systèmes avancés d'administration de médicaments permettant le
ciblage des sites d’infection, le contrôle de la libération et l'amélioration de l'activité
antimicrobienne des antibiotiques dans les poumons.

100
 Chapitre 3

Ainsi, grâce à cet examen de différentes nouvelles techniques mises à disposition pour le
traitement des maladies respiratoires infectieuses par inhalation, nous pouvons conclure avec
certitude que le développement de ces traitements est entre les mains sûres des scientifiques qui
se concentrent sur le développement de nouvelles techniques d'administration des médicaments.
Cependant, il est essentiel que la communauté médicale continue d'innover dans le
développement de formulations et de dispositifs d’administration pour la voie respiratoire afin
de résoudre les complications du traitement des infections pulmonaires ; en effet, l'application
de ces techniques peut apporter des changements révolutionnaires dans le traitement de ces
maladies et améliorer considérablement la qualité de vie des patients.

Cependant, actuellement, uniquement quatre antibiotiques sont approuvés pour l’administration

par inhalation ; la plupart étant particulièrement destinés au traitement des infections
respiratoires à P. aeruginosa chez les patients atteints de mucoviscidose. Dans ce contexte,
l’une des préoccupations cruciales des cliniciens est sans doute la disponibilité de nouvelles
options pour le traitement des bactéries à Gram-négatif difficiles à éradiquer dans un avenir
proche. 396 Cette préoccupation est d'autant plus forte qu'il existe peu de nouveaux antibiotiques
en cours de développement. En outre, aucun nouvel antibiotique n'est à un stade de
développement avancé pour la prise en charge des bactéries multirésistantes MDR à Gram-
397
négatif. Par conséquent, il est impératif que nous abordions le traitement avec les agents
existants de nouvelle manière pour gagner la guerre à long terme contre les micro-organismes
respiratoires.

Dans ce contexte, et sur la base des résultats présentés dans le CHAPITRE 2 détaillant la
restauration de l’efficacité de la doxycycline en présence du composé NV716, et en vue
d’exploiter les avantages du concept d’adjuvant aux antibiotiques ( CHAPITRE 1) en tant que
stratégie prometteuse pour lutter contre l’émergence des souches résistantes et pour restaurer
l’efficacité des antibiotiques classiques déjà commercialisés, nous avons envisagé le
développement et l’évaluation d’une solution dédiée à l’administration par inhalation pour la
prise en charge des infections respiratoires à Pseudomonas aeruginosa permettant de bénéficier
des avantages de cette voie d’administration..

101
 Chapitre 4 :

Caractérisation aérodynamique d’une solution pour

nébulisation de la combinaison NV716/doxycycline

(Résultats expérimentaux)

102
 Chapitre 4

I. Introduction

Récemment, les antibiotiques inhalés sont devenus un outil précieux dans la gestion des
maladies pulmonaires pour augmenter l'efficacité de l'administration du médicament sur le site
de l'infection. Ainsi, l’aérosolthérapie offre l’avantage de cibler efficacement les voies
respiratoires avec la rapidité de l’obtention de l’effet pharmacologique tout en évitant l’effet du
premier passage hépatique.398 En outre, elle permet de réduire la dose de médicament inhalée
par rapport à celle administrée par voie orale ou parentérale tout en conservant le même effet
local. Cela permet de limiter considérablement les effets indésirables systémiques liés à la forte
dose de médicament. D'autre part, la concentration locale du médicament dans les voies
respiratoires est beaucoup plus élevée en cas d'administration par voie pulmonaire qu'en cas
d'administration par voie orale ou parentérale. Grâce à ces avantages, l’aérosolthérapie a connu
une forte expansion durant ces dernières années. Ce qui a fait du poumon une porte d’entrée
des médicaments à visée locale et/ou systémique et non pas seulement un organe à traiter.399
Les statistiques réalisées par l’Observatoire National de la Mucoviscidose (ONM) ont montré
qu’en 2004 sur 4500 patients recensés 75% reçoivent des aérosols en thérapie au long cours,
certains d’entre eux reçoivent même deux médicaments par cette voie d’administration (un
antibiotique et un mucomodificateur).215

La complexité de la voie pulmonaire pour l’administration des médicaments découle de la

nécessité de transformer les formulations médicamenteuses en nuages d’aérosols à dose fixe, le
plus rapidement possible et avec des propriétés optimales, puis les délivrer en un minimum
d’inspirations. Un aérosol aux propriétés optimales doit être ainsi composé de goutelettes ni
trop petites (pour éviter qu’elles soient éliminées au cours de l’exhalation) ni trop grosses (pour
éviter leur dépôt dans les voies supérieures, la bouche et la gorge).400

Après administration par inhalation, seule une fraction du médicament peut atteindre la zone
cible prévue.205 Ainsi, la connaissance de la quantité effective du médicament déposée est
primordiale dans la compréhension et l’optimisation de la délivrance dans les régions
ciblées. Cette compréhension est aussi nécessaire pour la mise au point du schéma posologique
qui assure la délivrance des quantités suffisantes de substances actives au patient.205
Bien que la compréhension du dépôt des particules inhalées au niveau pulmonaire reste un
problème complexe,401 une meilleure compréhension des divers facteurs influençant leur dépôt
augmente la précision du dépôt pulmonaire et permet de cibler une maladie spécifique et de
réduire l’exposition des voies respiratoires saines aux médicaments.265 Plusieurs facteurs

103
 Chapitre 4

influencent le site de dépôt des particules inhalées au niveau de l’appareil respiratoire. En plus
des conditions respiratoires, il dépend principalement de la distribution granulométrique des
particules de l’aérosol.401 Ainsi, il est important de déterminer la taille des particules générées
par le dispositif d’inhalation utilisé ainsi que le pourcentage des particules ayant un intérêt
thérapeutique par inhalation.

Plusieurs paramètres sont utilisés pour la caractérisation aérodynamique des aérosols le

Diamètre Aérodynamique Massique Médian MMAD, la dose et le pourcentage des particules
fines FPD et FPF. Ces paramètres (MMAD, FPD et FPF) sont déterminés en utilisant un
appareil d'échantillonnage aérodynamique tel que l’Impacteur de Nouvelle Génération NGI.250
Dans ce contexte, le but de notre étude est de développer et d'évaluer in vitro une nouvelle
forme pharmaceutique destinée à l'administration pulmonaire pour la prise en charge des
infections pulmonaires à P. aeruginosa, basée sur l'utilisation d'une combinaison
antibiotique/adjuvant originale impliquant la doxycycline et le dérivé polyaminoisoprényle
NV716.

II. Évaluation aérodynamique des particules fines : L’Impacteur de

Nouvelle Génération NGI

L’évaluation aérodynamique des particules fines des aérosols thérapeutiques consiste en la

détermination des caractéristiques granulométriques des nuages d’aérosols générés à partir des
préparations pour inhalation.

Le test d’impaction a été réalisé conformément aux recommandations de la Pharmacopée

Européenne (Ph. Eur.),402 pour les formes pharmaceutiques destinées à être administrées par
inhalation orale sous forme d’aérosol [2.9.18 monographie], il est basé sur le fractionnement et
la collecte des particules sur les plateaux d’un impacteur multi-étages : l’Impacteur de Nouvelle
Génération NGI (Next Generation Impactor) ; cet appareil correspond aujourd’hui à l’état de
l’art pour la mesure de la taille des particules inhalées pour des médicaments. Le NGI, connu
également sous le nom de l’appareil E (Ph. Eur.) est un impacteur à cascade composé de 7
étages et d’un collecteur terminal à micro-orifices (CMO : étage 8) qui permet la collecte des
particules extrêmement fines non récoltées par les étages précédents. L’appareil comporte trois
parties principales : une base comportant des logements destinés à contenir des coupelles
d’impaction amovibles, un corps intermédiaire assurant la fermeture hermétique des coupelles

104
 Chapitre 4

et qui porte les buses, et un couvercle à l’intérieur duquel s’effectue le passage entre les
différents étages (Figure 42). En outre, une tuyère d’admission avec des dimensions internes
bien définies et adaptées au trajet de circulation de l’air est attachée à l’entrée de l’impacteur.
Un adaptateur d’embout est utilisé pour assurer l’étanchéité entre l’inhalateur et la tuyère
d’admission. La circulation de l’air à travers l’impacteur s’effectue selon un trajet en dents de
scie.

Figure 42. Impacteur de Nouvelle Génération NGI utilisé pour la caractérisation

aérodynamique des aérosols 402

Ainsi, le principe de fonctionnement de l’impacteur repose sur le passage d’un flux d’air généré
par un dispositif d’inhalation (nébuliseur) ayant entraîné les particules médicamenteuses, à
travers les orifices de plus en plus étroits des différents étages séparés par les plateaux
d’impaction. Au fur et à mesure que l’on pénètre plus profondément dans l’impacteur, le flux
d’air devient de plus en plus rapide permettant ainsi à l’impacteur de fractionner les particules
inhalées qui selon l’énergie cinétique qu’elles auront emmagasinée s’impacteront sur un plateau
ou continueront leur chemin avec le flux d’air vers l’étage suivant. L’appareil est calibré de
telle sorte que, pour un flux d’air déterminé, chaque étage récolte la fraction du nuage d’aérosol
présentant un Dae seuil bien défini.

105
 Chapitre 4

Il est recommandé de refroidir l’impacteur à 5°C pendant au minimum 90 min et effectuer le

test dans un délai ne dépassant pas 5 min après le retrait du NGI du réfrigérateur. Cette étape a
pour but pour prévenir l'évaporation de l'eau des gouttelettes aérosolisées, limiter la possibilité
de changement de leur taille durant le test et d’assurer un environnement proche de 100%
d'humidité relative à l'intérieur du NGI. En effet, la température d'une solution émise par un
nébuliseur à jet peut tomber à une température bien inférieure à la température ambiante, et
lorsque ces gouttelettes froides entrent en contact avec l'air à température élevée, elles peuvent
commencer à s'évaporer.

Le nébuliseur est attaché à la tuyère d’admission et la nébulisation est pratiquée pendant la

durée déterminée selon le test (Figure 43). Une pompe appropriée est branchée à la sortie de
l’appareil pour assurer l’aspiration des particules de l’aérosol dans des conditions standards
mimant une inspiration. La quantité de substance active nébulisée (qui dépend de la
concentration et durée de nébulisation) doit être suffisante pour permettre une détermination
exacte et fidèle de la dose des particules fines. A la fin de la nébulisation la substance active
déposée sur chaque étage du NGI ainsi que sur la tuyère d’admission et l’embout du nébuliseur
est recueillie par un volume approprié de solvant (dans lequel la substance active est soluble)
pour être par la suite quantifiée par chromatographie en phase gazeuse couplée à la
spectrométrie de masse (GC-MS).

Figure 43. Attachement du nébuliseur à l’impacteur NGI au cours du test d’impaction

Ce test permet le calcul des paramètres nécessaire à l’évaluation des aérosols principalement :
le Diamètre Aérodynamique Massique Médian MMAD, la dose de particules fines FFD et le
pourcentage de particules fines FPF. L’interprétation statistique de la distribution en taille des
particules de l’aérosol se fait par rapport au MMAD qui partage la masse des particules de
l’aérosol en deux moitiés également réparties de part et d’autre du MMAD : 50 % des particules
(exprimées en masse ) déposées sur les étages de l’impacteur ont un diamètre aérodynamique

106
 Chapitre 4

(Dae) inferieur au MMAD et 50 % ont un Dae supérieur au MMAD.398 La FPD représente la

masse des particules de la substance active ayant un diamètre inférieur à 5 µm. Le FPF
correspond au pourcentage de particules avec un Dae inferieur à 5 µm, tailles adaptées à un
dépôt pulmonaire.

III. Analyse des données

Le calcul des différents paramètres nécessaires à la caractérisation aérodynamique des aérosols

a été fait à l’aide du logiciel d’analyse des données Copley Inhaler (CITDAS, Copley Scientific,
Nottingham, Royaume-Uni). Le diamètre de coupure effectif (DCE) de chaque étage de
l’impacteur NGI varie en fonction du débit utilisé. Pour un débit compris entre 15 et 100 L/min
le logiciel CITDAS calcule le diamètre de coupure effectif pour chaque étage en utilisant la
formule suivante : DCE’= DCE * (60 / Q) x où :

Etages du NGI X
Etage 1 0,54
Etage 2 0,52
Etage 3 0,50
Etage 4 0,47
Etage 5 0,53
Etage 6 0,60
Etage 7 0,67
X = facteur de normalisation prédéterminé pour chaque étage
DCE’= diamètre de coupure effectif au débit d'échantillonnage Q
DCE = diamètre de coupure effectif au débit de 60 litres/min
Q = débit d'échantillonnage [litres/min].

Ainsi dans notre cas, à un débit de 15 L/min les diamètres de coupure effectifs des différents
étages sont :

Etages du NGI DCE (µm)

Etage 1 14,10
Etage 2 8,61
Etage 3 5,39
Etage 4 3,30
Etage 5 2,08
Etage 6 1,36
Etage 7 0,98

107
 Chapitre 4

La Fraction de Particules Fines est calculée comme suit :

𝐃𝐨𝐬𝐞 𝐝𝐞 𝐩𝐚𝐫𝐭𝐢𝐜𝐮𝐥𝐞𝐬 𝐟𝐢𝐧𝐞𝐬 (𝐝𝐢𝐚𝐦è𝐭𝐫𝐞 <𝟓 µ𝐦)

FPF (%) = * 100
𝐃𝐨𝐬𝐞 𝐝é𝐥𝐢𝐯𝐫é𝐞

La dose délivrée représente la masse totale de médicament administrée dans l’appareil (NGI) à
partir de l’embout buccal de l’inhalateur en excluant la quantité déposée sur le nébuliseur.

Le MMAD et l'écart type géométrique GSD, sont calculés à partir du graphe représentant la
fraction cumulative de la substance active par rapport au diamètre de coupure effectif en échelle
log-probabilité (la distribution étant supposée être log-normale). Le MMAD correspondant à
50% de particules inferieures à cette taille (ou Probit 5) est calculé à partir du graphique
représentant la fraction cumulative de la substance active par rapport au diamètre effectif de la
coupure en échelle log-probabilité (la distribution étant supposée être log-normale) (voir les
données supplémentaires Annexe 4).

IV. Evaluation de l’efficacité de la combinaison doxycycline/NV716 vis-à-vis

des souches cliniques de P. aeruginosa

Dans la continuité de l’étude réalisée précédemment (CHAPITRE 2) nous avons procédé à

l’évaluation de l’efficacité de l’adjuvant NV716 dans la restauration de l’activité de la
doxycycline vis-à-vis d’un large panel de souches cliniques de P. aeruginosa. Comme l'illustre
la Figure 44, le composé NV716 a été testé avec succès pour sa capacité à potentialiser l'activité
de la doxycycline contre 64 souches bactériennes de P. aeruginosa.

70 50 44
Pourcentage de souches (%)

a
Pourcentage de souches (%)

60 58 b
40
50 33

40 30
32
30 20
20
8 10 6
4
10 2 1
2
0 0
[4 - 24] [42-64] [100 - 256] >1000 0,25 0,5 0,75 1 2 >4
Facteur de gain CMI de doxycycline (10 µM de NV716)

Figure 44. Pourcentage de souches de P. aeruginosa (a) et facteur de gain (b) lié à la
restauration de l'activité de la doxycycline en présence de l’adjuvant NV716

108
 Chapitre 4

Les résultats indiquent que l’utilisation du NV716 en combinaison avec la doxycycline conduit
à une amélioration de l'activité antibactérienne contre un large panel de souches résistantes de
P. aeruginosa. Ainsi, la combinaison doxycycline/NV716 était plus bactéricide que les
composés purs utilisés seuls, l’adjuvant NV716 a induit une diminution de la CMI de la
doxycycline de 64 μg/mL à 0,25-0,5 μg/mL avec un facteur de gain de 42-256 fois lorsqu'il est
utilisé à une concentration de 10 µM. Ainsi, la CMI de la doxycycline vis-à-vis de plus de 96%
des souches bactériennes de P. aeruginosa considérées a été abaissée à un niveau inférieur ou
égal au seuil de sensibilité de P. aeruginosa (2µg/mL) (voir les données supplémentaires
Annexe 5). En outre, 77% des souches sont très sensibles à la combinaison doxycycline/NV716
et impliquant une CMI pour la doxycycline variant de 0,25 à 0,5 µg/mL en présence de NV716
(10 µg/mL). Ces résultats soutiennent l'hypothèse que la forme combinée augmente l'effet de
destruction vis-à-vis des souches avec un gain énorme en termes d’efficacité antibactérienne
par rapport à la doxycycline utilisée seule, ce qui suggère l'utilisation puissante d'une telle
combinaison en aérosolthérapie pour la prise en charge des infections respiratoires à
Pseudomonas aeruginosa.

V. Caractérisation aérodynamique des aérosols de la doxycycline et du

NV716 séparément puis en combinaison

Sur la base de l’analyse bibliographique précédente et des résultats de l’activité antibactérienne

de la combinaison doxycycline/NV716 nous avons envisagé l’évaluation des solutions
aqueuses de ces deux composés en inhalation en vue d’étudier leurs propriétés aérodynamiques
et leur site de dépôt au niveau de l’appareil respiratoire lorsqu’ils sont nébulisés séparément ou
sous forme de combinaison.

Dans un premier temps, la solution pour inhalation de chaque composé a été évaluée, puis la
solution des deux composés pris ensemble (doxycycline /NV716) a été testée. La nébulisation
a été réalisée à l’aide du nébuliseur PARI LC Plus®, qui est un nébuliseur pneumatique.

Les propriétés aérodynamiques de l’aérosol de chaque composé nébulisé seul (doxycycline et

NV716) sont résumées dans le Tableau 13.

109
 Chapitre 4

Tableau 13. Paramètres aérodynamiques de l'aérosol de chaque composé nébulisé séparément

doxycycline et NV716 :

Substance Concentration Durée de MMAD FPF

Nébuliseur GSD
active (mg/mL) nébulisation (min) (µm) (%)
PARI LC Doxycycline 10 6 3,5 3,2 55
Plus® NV716 10 6 4,5 1,8 57

Ainsi, la caractérisation aérodynamique de l’aérosol de chaque composé (doxycycline et

NV716) seul a montré un MMAD de 3,5 µm pour l’aérosol de la doxycycline et de 4,5 µm pour
celui de l’adjuvant NV716. Ces valeurs (MMAD inferieurs à 5 µm) sont en accord avec les
recommandations des bonnes pratiques de la nébulisation et de la Pharmacopée Européenne
pour les aérosols thérapeutiques.

En outre, la caractérisation aérodynamique des aérosols est également réalisée par la Fraction
de Particules Fines (FPF) qui représente le pourcentage de particules ayant un diamètre
aérodynamique (Dae) adapté à un dépôt pulmonaire. La FPF obtenue pour l’aérosol de la
doxycycline est de 55%, et de 57% pour l’aérosol du NV716. Les deux aérosols présentent plus
de 50 % de FPF, ce qui reflète l’efficacité des deux aérosols, étant donné que plus de 50 % des
particules de chaque aérosol ont un diamètre aérodynamique inférieur à 5 μm, leur permettant
d'atteindre les régions profondes des poumons (site d'infection) assurant des quantités
suffisantes sur le plan thérapeutique.

L'écart-type géométrique GSD obtenu avec l'aérosol de doxycycline de 3,2 est supérieur à celui
obtenu avec l'aérosol NV716 de 1,8 ; ce qui entraîne une large dispersion du diamètre
aérodynamique des gouttelettes de doxycycline autour de la moyenne (MMAD) par rapport à
la dispersion du Dae des gouttelettes du NV716. Il en résulte une plus grande quantité de
doxycycline déposée sur le 1er et le 7ème étage par rapport à celle du NV716 très minime sur ces
deux étages.

D'autre part, la masse de chaque composé déposé sur chaque étage de l'impacteur, la tuyère et
l'embout du nébuliseur, résultant de la nébulisation de chaque composé seul par le nébuliseur
PARI LC Plus® a été déterminée comme l'illustre la Figure 45.

110
 Chapitre 4

Doxycycline NV716

Quantité déposée (mg)

4

Les étages de l’impacteur NGI

Figure 45. Distribution massique de chaque composé (Doxycycline et NV716) sur les étages
de l’impacteur NGI résultant de la nébulisation de chaque composé seul

L'histogramme de dépôt in vitro des deux composés sur les étages de l'impacteur NGI montre
une distribution gaussienne avec un maximum de dépôt sur l'étage 4 de l'impacteur et ce pour
les deux aérosols testés.

Les résultats de cette première partie de l’étude ont démontré pour les aérosols de chaque
composé seul des propriétés aérodynamiques convenables pour la voie inhalée. Ils peuvent
atteindre les derniers étages de l’impacteur qui représentent des régions profondes de l’appareil
respiratoire avec des quantités satisfaisantes. A partir de ces résultats, nous avons envisagé la
nébulisation des deux composés ensemble.

Les paramètres de nébulisation de la combinaison doxycycline/NV716 (volume nébulisé et

débit de nébulisation) obtenus avec le nébuliseur PARI LC Plus® (en triplicat) ainsi que les
conditions utilisées (concentration de chaque composé et durée de nébulisation) sont résumés
dans le Tableau 14.

Tableau 14. Paramètres de nébulisation de l'aérosol de la combinaison (doxycycline/NV716)

Doxycycline Durée de Volume Débit

Nébuliseur Essais
(NV716) (mg/ml) nébulisation (min) nébulisé (ml) (ml/min)
1 10 (10) 6 2,06 0,34
PARI LC
2 10 (10) 6 1,87 0,31
Plus®
3 10 (10) 6 1,72 0,29

111
 Chapitre 4

Le PARI LC Plus® a montré des débits de nébulisation compris entre 0,29 et 0,34 mL/min
permettant de nébuliser pendant 6 min des volumes compris entre 1,72 et 2,06 mL.

Les propriétés aérodynamiques des gouttelettes de l’aérosol de combinaison ainsi que le

pourcentage des particules fines obtenu en tripliquat dans les conditions mentionnées dans le
Tableau 14 sont résumés dans la Figure 46 (a et b respectivement).

MMAD (µm) GSD a 61 % b

6
MMAD (µm)/ GSD

5
4,2
3,1 3,1 64 %
4 3,1 2,9
2,6
3 55 %
2 ème
1
3 mesure
ème
0 2 mesure
ère
1ère mesure 2ème mesure 3ème mesure 1 mesure

Figure 46. Caractérisation des gouttelettes (MMAD et GSD) (a) et Fraction des Particules
Fines (FPF%) (b) obtenues par la nébulisation de la combinaison doxycycline/NV716

Les résultats de la caractérisation aérodynamique de l’aérosol de la combinaison

doxycycline/NV716 ont montré que la nébulisation simultanée des deux composés génère des
particules avec des MMADs (compris entre 3,1 et 4,2 µm) adaptés à l’administration
pulmonaire et conformes aux recommandations pour les aérosols thérapeutiques (MMAD < 5
µm). Ainsi, l’écart type géométrique GSD du diamètre moyen des gouttelettes de l’aérosol de
la combinaison doxycycline/NV716 a été trouvé compris entre 2,6 et 3,1 ce qui donne une large
dispersion du diamètre aérodynamique des gouttelettes inhalées autour de la moyenne MMAD,
leurs permettant d’être dispersées sur les différents étages de l’impacteur et ainsi couvrir
plusieurs parties de l’appareil respiratoire.

Les profils de distribution in vitro de l’aérosol de la combinaison sur les différents étages du
NGI, la tuyère et l’embout du nébuliseur (Figure 47) confirment cette large dispersion des
gouttelettes et montrent une bonne distribution gaussienne des deux composés avec un
maximum de dépôt sur l’étage 4 de l’impacteur qui représente les bronches secondaires, même
étage présentant le maximum de dépôt que ceux obtenus avec les aérosols de chaque composé
seul.

112
 Chapitre 4

Finalement, il est à noter que la nébulisation simultanée des deux composés permet d’obtenir
jusqu’ à 64% de FPF c’est à dire que 64% des gouttelettes de l’aérosol de combinaison ont un
intérêt thérapeutique et peuvent atteindre le site de l’infection, ce qui montre une bonne
efficacité de l’aérosol de la combinaison par rapport à celles des aérosols des composés pris
séparément.

Doxycycline + NV716
Masse déposée (mg)

4
3
2
1
0

Les étages de l'impacteur NGI

Figure 47. Distribution massique sur les étages de l’impacteur NGI résultant de la
nébulisation des deux composés ensemble (doxycycline/NV716)

VI. Détermination de l'influence des concentrations des substances actives

et de la durée de nébulisation sur les propriétés aérodynamiques

Tout d'abord, les propriétés aérodynamiques de l'aérosol généré à partir de la solution des deux
composés pris ensemble (doxycycline et NV716) à différentes concentrations ont été évaluées.
La durée de la nébulisation a été fixée à 6 minutes et quatre concentrations différentes ont été
utilisées pour chaque composé : 10, 15, 20 et 30 mg/mL (Tableau 15).

Tableau 15. Paramètres de nébulisation utilisés pour la caractérisation aérodynamique de

l'aérosol de la combinaison pour différentes concentrations

Doxycycline NV716 Durée de nébulisation

Nébuliseur
(mg/mL) (mg/mL) (min)
10 10 6
PARI LC
15 15 6
Plus® 20 20 6
30 30 6

L'influence du temps de nébulisation (1, 3, 6 et 10 min) sur les propriétés aérodynamiques de

l'aérosol considéré a été évaluée alors que la concentration pour chaque composé a été fixée à

113
 Chapitre 4

10 mg/mL (Tableau 16). Le nébuliseur utilisé dans ces deux séries de tests est le nébuliseur
PARI LC Plus®.

Tableau 16. Paramètres de nébulisation utilisés pour la caractérisation aérodynamique de

l'aérosol de la combinaison pour différentes durées de nébulisation

Doxycycline NV716 Durée de nébulisation

Nébuliseur
(mg/mL) (mg/mL) (min)
10 10 1
PARI LC 10 10 3
Plus® 10 10 6
10 10 10

Les MMADs ainsi que les FPFs obtenus à partir de la nébulisation des deux composés ensemble
(doxycycline et NV716) à l'aide du nébuliseur PARI LC Plus® pour différentes concentrations
des deux composés impliqués ainsi que pour différentes durées de nébulisation sont résumés
dans la Figure 48 (a et b respectivement).

Figure 48. Propriétés aérodynamiques de l'aérosol de la combinaison selon différentes

concentrations de doxycycline et du NV716 (a) et différentes durées de nébulisation (b)

La caractérisation aérodynamique des différents aérosols générés à partir de différentes

concentrations des deux composés a montré des Diamètres Aérodynamiques Massiques
Médians allant de 3,1 à 4,5 μm et des FPF variant de 52 à 60% (Figure 48-a).

114
 Chapitre 4

Les résultats obtenus permettent ainsi de conclure que la concentration en principes actifs
n'influence pas les propriétés aérodynamiques de l'aérosol de la combinaison, puisqu'un FPF
supérieur à 50% est toujours obtenu. Cela permet d'adapter la posologie sans influencer les
propriétés aérodynamiques et la capacité des particules à atteindre le site de l'infection en
quantité nécessaire pour assurer leur efficacité thérapeutique.

Les résultats obtenus par l’évaluation de l'effet de la durée de nébulisation sur les paramètres
aérodynamiques obtenus précédemment n'ont montré aucune variation du diamètre
aérodynamique en fonction de la durée de nébulisation, avec des MMADs allant de 3,4 à 4 μm
conformes aux normes requises pour les aérosols thérapeutiques (MMAD < 5 μm). De plus, le
pourcentage de particules fines FPF (allant de 55 à 60 %) n'est pas influencé par la durée de
nébulisation (1, 3, 6 ou 10 min) et reste toujours dans la même zone comprise entre 50 et 60%
(Figure 48-b).

Ces résultats nous ont permis de conclure que les paramètres aérodynamiques de l'aérosol de la
combinaison doxycycline/NV716 généré par le PARI LC Plus® ne dépendent pas de la durée
de nébulisation et sont reproductibles dans le temps, ce qui évite l'absence du dépôt des
gouttelettes en quantité insuffisante au niveau du site d'action souhaité même si le patient ne
respecte pas précisément la durée de nébulisation requise.

VII. Influence du dispositif de nébulisation sur les propriétés de l’aérosol de

la combinaison Doxycycline/NV716

Il existe trois types de nébuliseurs : les nébuliseurs pneumatiques (jet d'air), les nébuliseurs
ultrasoniques et les nébuliseurs à membrane vibrante.403 Le type de nébuliseur le plus
couramment utilisé est le nébuliseur à jet, qui utilise une source de gaz comprimé (compresseur)
pour créer l'aérosol à partir de la solution médicamenteuse.404 Le gaz comprimé est forcé à
travers un système de tubes reliés à une buse. Lorsque la section du tube diminue, la vitesse de
l'air augmente, créant une zone de basse pression autour de la buse (effet Venturi). La chute de
pression créée par le passage du jet à grande vitesse à travers la buse fait monter la formulation
liquide sur les parois internes d’un tube d'alimentation depuis le réservoir de liquide (effet
Bernoulli). A l’extrémité de ce tube, un film liquide est constitué, puis il se produit un processus
complexe de fragmentation du film liquide qui permet la création de gouttelettes d'aérosol. Les
grosses gouttelettes peuvent alors se heurter aux parois du nébuliseur et se recycler dans le

115
 Chapitre 4

réservoir. Cependant, les gouttelettes suffisamment petites contournent ces barrières

(gouttelettes secondaires) et forment l'aérosol respirable généré par les nébuliseurs à jet.405 Par
conséquent, la conception et les dimensions des nébuliseurs influencent largement les
caractéristiques de l'aérosol. Cette raison renforce l'idée que les nébuliseurs devraient être
évalués comme un système à plusieurs composants pour la génération d'aérosols respirables.
277,406,407
Dans le cas des nébuliseurs ultrasoniques, la solution médicamenteuse est nébulisée
par l'énergie des ondes sonores à haute fréquence (effets de cavitation). Ils peuvent être équipés
d'un réglage de la puissance de nébulisation.408 Les nébuliseurs à mailles vibrantes sont
considérés comme des systèmes de micro-pompes. Cette technologie est le résultat d'une
énergie qui force le liquide à passer par les petites ouvertures d'une plaque ou d'une
membrane.277

Ainsi, une étude portant sur l'influence du dispositif de nébulisation et visant l’amélioration des
propriétés aérodynamiques de l’aérosol généré à partir de la combinaison doxycycline/NV716
a été réalisée à l'aide de trois nébuliseurs différents. Deux autres nébuliseurs ont été choisis, en
plus du PARI LC Plus® utilisé précédemment, le PARI Sprint® : un nébuliseur pneumatique à
jet d’air appartenant à la même famille de nébuliseur que le PARI LC Plus® et le PARI eFlow®
: un nébuliseur à membranes vibrantes. Le choix des nébuliseurs pneumatiques (à jet d'air) était
basé sur le fait que ce sont les dispositifs d'administration de médicaments les plus couramment
409
utilisés pour les maladies pulmonaires et sur leur capacité à s'adapter à la nébulisation de
mélanges de médicaments. Nous avons débuté notre étude avec le nébuliseur pneumatique
PARI LC Plus®, qui est le nébuliseur pneumatique le plus couramment utilisé dans le domaine
de la nébulisation. La société Pari nous a par la suite proposé le PARI Sprint®, qui représente
la nouvelle version de ses nébuliseurs pneumatiques. Afin de comparer les nébuliseurs
pneumatiques à un nébuliseur utilisant une autre technologie, un nébuliseur à membrane
vibrante (PARI eFlow®) a été choisi. Les nébuliseurs à membrane vibrante représentent la
technologie la plus récente, qui surmonte les inconvénients des nébuliseurs à jet et à
ultrasons.410 Les nébuliseurs ultrasoniques de moins en moins utilisés pour l'administration
pulmonaire de médicaments n'ont pas été retenus car ils conduisent à des gouttelettes d'un
diamètre relativement important de (3,7- 10,5 µm) par rapport à ceux obtenus avec des
nébuliseurs pneumatiques (1,2- 6,9 µm),185 ne permettant pas un dépôt des principes actifs dans
la partie des poumons ciblée par notre formulation (lieu de résidence de Pseudomonas
aeruginosa dans les poumons). Par ailleurs, ils ne sont pas recommandés pour la nébulisation
de mélange de médicaments.187

116
 Chapitre 4

Ainsi, après avoir fixé la concentration des principes actifs et la durée de nébulisation, nous
avons procédé à la caractérisation des différents aérosols générés par les différents nébuliseurs.
Les conditions de nébulisation (les concentrations des deux substances actives, la durée de la
nébulisation et le dispositif de nébulisation) ainsi que les paramètres de nébulisation (volume
nébulisé et débit de nébulisation) obtenus avec chaque nébuliseur sont résumés dans le Tableau
17.

Tableau 17. Comparaison des paramètres de nébulisation obtenu par trois nébuliseurs
différents (PARI LC Plus®, PARI Sprint and PARI eFlow®)

Doxycycline Durée de Volume Débit

Nébuliseur
(NV716) (mg/mL) nébulisation (min) nébulisé (mL) (mL/min)
PARI LC Plus® 10 (10) 6 1,88 (+/- 0,17) 0,31 (+/- 0,04)
PARI Sprint® 10 (10) 6 3,54 (+/- 0,12) 0,59 (+/- 0,02)
PARI eFlow® 10 (10) 6 2,90 (+/- 0,70) 0,45 (+/- 0,15)

Il apparaît clairement que le nébuliseur PARI LC Plus® permet la nébulisation de 1,88 mL de

la solution en 6 min avec un débit moyen de 0,31 mL/min. Le PARI Sprint® nébulise en 6 min
à un débit moyen de 0,59 mL/min, les 3,54 mL de la combinaison. D'autre part, pendant la
même durée de nébulisation (6 min), le nébuliseur PARI eFlow® a pu nébuliser 2,9 mL avec
un débit moyen de 0,45 mL/min.

La Figure 49 (a et b) résume les paramètres de caractérisation aérodynamique (MMAD, GSD

et FPF) des aérosols produits par les nébuliseurs PARI LC Plus®, PARI Sprint® et PARI
eFlow® pour la combinaison antibiotique-adjuvant (doxycycline et NV716).

Ainsi, l'aérosol produit par le PARI Sprint® a un MMAD de 4,4 μm et un GSD de 2,3 alors que
la nébulisation avec le PARI LC Plus® conduit à un aérosol avec un MMAD de 3,4 μm et un
GSD de 2,8. Les gouttelettes d'aérosol produites par le nébuliseur à mailles vibrantes PARI
eFlow® présentaient quant à elles un MMAD de 4,2 μm et un GSD de 1,8. Par ailleurs, les
fractions de particules fines FPF varient de 60% pour le dispositif PARI LC Plus®, 54% pour
le PARI Sprint® et 60% pour le PARI eFlow®.

D’après les résultats obtenus, on peut remarquer que chaque nébuliseur possède sa propre
spécificité :

- Le PARI LC Plus® a généré des gouttelettes avec le MMAD le plus petit de 3,4 μm.

117
 Chapitre 4

- Le PARI Sprint® a donné les meilleurs résultats en termes de débit de nébulisation de 0,59
mL/min qui assure la nébulisation en 6 min de 3,5 mL de la solution d'inhalation contre 1,88
mL et 2,9 mL nébulisés par le PARI LC Plus® et le PARI eFlow® respectivement.

- Le PARI eFlow® et le PARI LC Plus® ont donné le plus haut pourcentage de particules fines
de 60 % contre 54 % de particules fines générées par le PARI Sprint®.

Figure 49. Caractérisation des gouttelettes (a) et Fraction des Particules Fines (b) de l'aérosol
de la combinaison doxycycline/NV716 généré par différents nébuliseurs

Les histogrammes de la distribution de masse des deux composés (doxycycline et NV716) sur
les différents étages de l'impacteur, la tuyère et l'embout du nébuliseur obtenus avec chaque
dispositif : le PARI LC Plus®, le PARI Sprint® et le PARI eFlow® sont présentés dans la
Figure 50. Les trois nébuliseurs ont généré des aérosols avec un maximum de dépôt sur l'étage
4 de l'impacteur en présentant des histogrammes de distribution d’allure gaussienne dans les
trois cas.

118
 Chapitre 4

Doxycycline NV716 a
10

Quantité déposée (mg)

8
6
4
2
0
PARI EFLOW®

Les étages de l’impacteur NGI

b
Quantité déposée (mg)

Doxycycline NV716
10

0
PARI LC® SPRINT

Les étages de l’impacteur NGI c

Quantité déposée (mg)

10 Doxycycline
8
6
4
2
0
PARI LC PLUS®

Les étages de l’impacteur NGI

Figure 50. Distribution de masse de la doxycycline et du NV716 sur les étages du NGI
obtenue avec trois nébuliseurs différents : PARI eFlow® (a), Pari Sprint® (b) et Pari LC
Plus® (c)

L'écart-type géométrique (GSD) du diamètre aérodynamique des gouttelettes produites par le

PARI eFlow® de 1,8 est inférieur à ceux obtenus avec le PARI LC Plus® et le PARI Sprint®
de 2,8 et 2,3 respectivement ce qui donne une distribution plus étroite des gouttelettes des deux
composés (doxycycline et NV716) produites par le PARI eFlow® sur les différents étages de
l'impacteur. En outre, la distribution de masse des deux composés obtenue avec le nébuliseur
PARI eFlow® montre un maximum de dépôt sur l'étage 4, des quantités moyennes déposées
sur les étages 3 et 5, et de faibles quantités sur les étages 2 et 6 alors que des quantités minimes

119
 Chapitre 4

de doxycycline ont été déposées sur les étages 1 et 7 et presque aucune trace du NV716 à l'étage
7.

Le PARI LC Plus® et le PARI Sprint® ont donné des GSDs similaires de 2,8 et 2,3 permettant
une large dispersion des deux composés sur les différents étages de l'impacteur. Le dépôt
maximal étant observé sur l'étage 4 avec une distribution homogène des deux composés sur les
autres étages ce qui permet de garantir la synergie entre la doxycycline et l'adjuvant NV716 et
donc l'efficacité de la combinaison vis-à-vis de P aeruginosa. De plus, on constate la présence
de NV716 sur tous les étages de l'impacteur même sur l'étage 7 contrairement à ce qui est
observé avec le PARI eFlow®.
En outre, une étude comparative des performances des trois nébuliseurs souligne clairement
leurs différentes spécificités, comme l'illustre la Figure 51.

PARI LC Plus® PARI Sprint® PARI eFlow® a

70
60
50
40
30
20
10
0
0 1
DE 2
DD 3
FPD 4
FPF 5
Dose Emise Dose Délivrée Dose de Particules Fraction de Particules
Nébuliseur
DE (mg) DD (mg) Fines FPD (mg) Fines FPF (%)
PARI LC Plus® 30 29 17 60
PARI Sprint® 43 42 23 54
PARI eFlow® 32 31 18 59

Figure 51. Comparaison des performances des trois nébuliseurs (PARI LC Plus®, PARI
Sprint® et PARI eFlow®).

Les résultats indiquent clairement que bien que le nébuliseur Pari Sprint® donne un FPF
légèrement inférieur (54 %) à celui obtenu avec le PARI LC Plus® (60 %) et le PARI eFlow®
(60 %), il conduit à la plus forte Dose Emise de 43 mg par rapport à 30 et 32 mg nébulisés avec
le PARI LC Plus® et le PARI eFlow®), respectivement. Il est à noter que ces résultats sont dus
à sa haute performance permettant la nébulisation d'un volume supérieur à ceux nébulisés par
les deux autres nébuliseurs. Par conséquent, la Dose Délivrée (DD) qui correspond à la masse

120
 Chapitre 4

totale de médicament délivrée par le nébuliseur est de 42 mg contre 29 et 31 mg délivrées

respectivement avec le PARI LC Plus® et le PARI eFlow®).

Ainsi, le nébuliseur PARI Sprint® semble préférable pour la délivrance de notre combinaison
(Antibiotique-Adjuvant) car en plus de sa capacité à assurer une distribution homogène des
deux composés sur les différents étages de l'impacteur NGI nécessaire à la restauration de
l'activité de la Doxycycline par le NV716, il génère des gouttelettes avec un MMAD adapté à
l'administration pulmonaire et permet aux particules de médicament d'atteindre le site de
l'infection. De plus, ses performances élevées en termes de nébulisation rapide (0,59 ml / min)
permettront au patient de réduire la durée de sa séance de nébulisation et donc d'améliorer sa
qualité de vie.

VIII. Conclusion

La nouveauté du travail décrit ici consiste en (a) l'utilisation d'une combinaison adjuvant-
antibiotique pour le traitement des infections respiratoires causées par Pseudomonas
aeruginosa ; (b) la préparation de l’adjuvant NV716 sous forme de sel hydrosoluble facile à
solubiliser pour l'aérosolisation et (c) son incorporation avec la doxycycline dans une forme
liquide aérosolisée pour tirer parti de l'administration locale dans les poumons.

Ainsi, la combinaison doxycycline/NV716 pourrait apparaître comme un traitement potentiel

prometteur pour le traitement des infections pulmonaires à P. aeruginosa telles que celles
rencontrées chez les patients atteints de mucoviscidose. Grâce à de nouvelles interprétations du
mécanisme d'action du composé non cytotoxique NV716 et de sa fraction active, la
doxycycline, de nouvelles stratégies de développement pharmaceutique pourraient fournir une
thérapie pulmonaire complémentaire pour diminuer la durée du traitement et améliorer
l'efficacité du régime médicamenteux actuel. Enfin, la solution contenant la combinaison
doxycycline/NV716 s'est avérée adaptée à l'aérosolisation, et la morphologie et la taille des
gouttelettes se situaient dans la plage appropriée pour l'administration pulmonaire.

121
 Chapitre 5 :

Faisabilité d'une poudre sèche inhalée à partir de la

combinaison doxycycline/NV716 selon la méthodologie des
plans d’expériences

(Résultats expérimentaux)

122
 Chapitre 5

I. Introduction

Les Inhalateurs de Poudres Sèches (IPS) possèdent de nombreux avantages par rapport aux
autres dispositifs d’inhalation, l’absence de propulseur ainsi que leur état solide leur confèrent
une meilleure stabilité chimique par rapport aux aérosols liquides et aux inhalateurs doseurs
pressurisés.411 En outre, ils ne nécessitent pas une force motrice externe pour assurer leur
fonctionnement et sont d’une utilisation plus facile pour les patients puisqu’ils sont portables et
ne nécessitent pas une coordination entre l'inhalation et l'actionnement de l’inhalateur.271,412,413

Récemment, l'accent a été mis sur le développement de l'inhalation de poudre sèche 412 et une
large gamme d’IPS est ainsi actuellement disponible permettant de maximiser la délivrance
pulmonaire des médicaments avec une faible variabilité.413

De façon générale, les formulations de poudres sèches pour inhalation sont basées soit sur des
agglomérats libres de particules médicamenteuses micronisées dont la taille aérodynamique est
inférieure à 5 µm, soit sur un mélange de ces particules médicamenteuses adhérant à la surface
de larges particules porteuses d’excipient (généralement le lactose).413,414 L’ajout de ce support
a pour but d’augmenter la fluidité et la dispersion des particules de substance active.415
Cependant, le problème majeur avec les antibiotiques tant pour la formulation que pour la
conception du dispositif est leur administration constante à forte dose dans les poumons. La
difficulté provient de la forte teneur en principe actif (PA) respirable de taille micrométrique,
dont l’augmentation de la cohésion entre ces particules médicamenteuses entraîne une
diminution de leur désagglomération et favorise leur adhésion à la paroi de l'inhalateur, ce qui
entraîne une diminution des propriétés d'écoulement et de la dispersion des aérosols.415 Ainsi,
pour surmonter la nature cohésive des fines particules inhalables du PA, améliorer leur
écoulement et favoriser leur aérosolisation, des particules porteuses relativement grosses sont
généralement utilisées.416-418 Il existe un certain nombre d'excipients qui peuvent être
incorporés dans une poudre sèche pour inhalation, tel que le lactose, le mannitol, le glucose et
des agents de lubrification qui améliorent l’écoulement de la poudre tel que le stéarate de
magnésium.260,419,420 L’excipient le plus couramment employé est le lactose, également utilisé
dans certains produits commercialisés, sous forme de fines particules de taille micrométrique
incorporées en vue d’augmenter la performance aérosol d'une formulation.421-423

Cependant, les formulations à base de particules porteuses présentent certaines limites,

notamment l'encombrement dû à l’incorporation de grandes quantités de particules

123
 Chapitre 5

porteuses.415 L’augmentation de la masse de la poudre nécessite plus d’énergie (air inspiré)

pour mettre la poudre en mouvement et fournir les forces nécessaires au détachement et à
l'aérosolisation efficace de la poudre.415 En outre, une charge de poudre aussi élevée peut rendre
l'inhalateur multidose très volumineux et nécessite un nombre d'inhalations plus important pour
assurer la délivrance de la dose.424 Par conséquent, la minimisation du nombre et de la quantité
d'excipients utilisés est un facteur important pour faciliter l’administration de la posologie et
ainsi favoriser l’adhésion du patient au traitement médical.416

De plus, l’adhérence de la particule médicamenteuse à la particule porteuse ne doit pas être trop
forte pour faciliter son détachement et assurer une bonne délivrance dans les poumons.342

Dans ce contexte, il a été démontré que l’ajout du lactose fin permet d’augmenter la Fraction
de Particules Fines.425 Ainsi, les particules fines de lactose favorisent la rupture des agglomérats
du PA en se répartissant sur la surface du support, amortissant ainsi les forces de frottement et
de pression et permettant de diminuer les forces d’adhésion PA-support.415 Plus précisément,
la liaison des particules de lactose fin aux sites actifs du support empêche les particules
médicamenteuses fines de se lier à ses sites à haute énergie, qui se lient ainsi aux régions de
surface du support comparativement plus lisses et à faible énergie,426 ne demandant que des
forces relativement faibles pour le détachement PA-support.415

Dans ce chapitre, une autre forme pharmaceutique pour inhalation basée sur la même
combinaison de la doxycycline avec le dérivé polyaminoisoprényle NV716 est étudiée afin
d'évaluer l'adaptabilité de ce mélange à l'administration pulmonaire sous forme d’une poudre et
d'identifier l'influence de plusieurs paramètres non médicamenteux sur l'efficacité
d'aérosolisation de ce mélange pour optimiser sa délivrance vers son site d'action cible.

II. Méthodologie des plans d’expériences

Dans le domaine de la recherche, du développement et de la production, la conception

expérimentale et l’optimisation constituent des outils utiles pour l’analyse systématique des
différents types de problèmes rencontrés. Ainsi, pour éviter d’obtenir des résultats aléatoires, il
est évident que les expériences doivent être réalisées d’une manière non aléatoire et planifiée
permettant d’en tirer les informations nécessaires.427

Dans ce contexte, un plan d’expérience est un plan qui permet d’attribuer des unités
expérimentales à des niveaux de traitement et d’analyse statistiques. Il permet aussi

124
 Chapitre 5

l’identification des variables indépendantes, dépendantes et nuisibles et indique la manière dont

la randomisation et les aspects statistiques d'une expérience doivent être effectués.428 En outre,
la méthode des plans d’expérience permet une meilleure organisation des essais qui
accompagnent la recherche scientifique ou les études industrielles. Ils peuvent être appliqués à
de nombreuses disciplines afin de déterminer le lien entre une grandeur d’intérêt y et des
variables xi, on fait ainsi appel aux plans d’expérience devant une fonction de type :

Y = f (x )
i

Son objectif principal est d'établir le lien de causalité entre les variables indépendantes et
dépendantes dans un espace expérimental défini.428 En outre, son objectif secondaire est
d'extraire le maximum d'informations avec le minimum de ressources (réalisation du minimum
d’expériences), grâce à l’application des règles mathématiques et à l’adoption d’une démarche
rigoureuse.428,429

II.1. Terminologie

Dans le but de simplifier la communication dans le domaine des plans d’expériences ; différents
termes ont été introduits, on peut citer :

− Le domaine expérimental : signifie la zone expérimentale étudiée et qui est définie par
les normes inférieures et supérieures des variables expérimentales.
− Les facteurs : sont les variables expérimentales qui peuvent être modifiées
indépendamment les unes des autres.
− Les variables indépendantes : identiques aux facteurs.
− Les variables continues : sont les variables indépendantes qui peuvent être modifiées
de façon continue.
− Les variables discrètes : sont les variables indépendantes qui seront modifiées par
étapes, (tel que le type de solvant).
− Les réponses : la valeur mesurée des résultats des expériences.
− Le résidu : la différence entre le résultat calculé et le résultat expérimental. 427

Une bonne compréhension de la méthode des plans d’expériences s’appuie sur deux notions
principales : la notion de l’espace expérimental et celle de la modélisation mathématique.
Dans chaque étude réalisée, l’expérimentateur s’intéresse à une grandeur qu’il mesure à chaque
essai ; c’est la réponse qui est une grandeur d’intérêt. Sa valeur dépend de plusieurs variables,

125
 Chapitre 5

appelées facteurs. Chaque grandeur dépend donc de plusieurs facteurs, et chaque facteur est
représenté par un axe gradué et orienté (Figure 52).

II.2. Espace expérimental

Dans chaque essai, la valeur attribuée à un facteur est appelée niveau. Afin d’étudier l’influence
d’un facteur donné, on limite ses variations entre deux bornes : une borne inferieure ou niveau
bas et une borne supérieure qui est le niveau haut. Le domaine de variation du facteur ou plus
simplement le domaine du facteur regroupe toutes les valeurs que peut prendre le facteur entre
le niveau bas (noté – 1) et le niveau haut (noté +1) (Figure 52-a). Ainsi, le second facteur est
représenté par un second axe gradué, orienté et disposé perpendiculairement au premier, il sera
également défini par son niveau haut, son niveau bas et son domaine de variation. Ses différents
facteurs permettent l’obtention d’un repère cartésien qui définit un espace euclidien à deux
dimensions limitant un espace connu sous le nom d’espace expérimental (Figure 52-b).430

a b

Figure 52. Représentation du domaine de variation avec les niveaux bas et haut d’un facteur
(a) ainsi que du domaine expérimental défini par les domaines des différents facteurs (b).430

Le domaine d'étude est défini par le regroupement des domaines de tous les facteurs, il
représente la zone de l’espace expérimental choisie par l’expérimentateur pour réaliser ses
expériences (Figure 52-b). Ainsi, une étude comportant une série d’expériences bien définies
est représentée par des points répartis dans le domaine d’étude.430

Ainsi, l’extraction d’un nombre suffisant N de combinaisons à partir du domaine expérimental

permet la construction d’un plan d’expériences qui à son tour permet d’estimer les coefficients
du modèle (additif ou polynomial) en prenant en considération les contraintes techniques et
économiques de l’étude.430 Il convient de noter qu’il existe différents types de plans
d’expériences adaptés à tous les cas rencontrés par un expérimentateur.

126
 Chapitre 5

III. Elaboration des plans d’expériences utilisés dans l’étude

III.1. Détermination du meilleur lactose constitué de particules de grande taille

La forte cohésion inter-particulaires et le mauvais écoulement des fines particules des poudres
à inhaler nécessite l'ajoute des particules porteuses (généralement de lactose) plus grosses pour
améliorer leur aérosolisation. Les particules de principe actif d'une taille inférieure à 5 µm se
détacheront de leur support (le lactose) et continueront leur chemin vers les poumons à travers
les voies respiratoires pour exercer leur effet thérapeutique tandis que les grosses particules de
lactose seront bloquées dans la sphère ORL et resteront ensuite avalées, dissoutes et éliminées
par le tube digestif.

Dans notre étude d’optimisation nous avons utilisé trois types de lactose grade
inhalation (fournis par la société DFE Pharma, Allemagne) : deux lactoses constitués de larges
particules (Large lactose) : le Lactohale® 206 (LH206) et le Respitose® ML003 (RESPI003),
le dernier est constitué de fines particules (Lactose fin) : le Lactohale® 210 (LH210) (Voir
Partie matériels et méthodes).

Ainsi, nous avons commencé par une pré-étude, afin de déterminer quelle taille entre les deux
types de lactose LH206 et RESPI003 était la plus convenable pour améliorer la dispersibilité
des poudres inhalées de nos composés. Pour cela, un plan d'expérience a été mis en place
comportant 2 facteurs : le principe actif (PA) avec 2 niveaux (doxycycline, NV716 et
doxycycline+NV716 ensemble) et le type de lactose (Lactose) avec 2 niveaux (lactose LH206
et lactose RESPI003) (Tableau 18).

Tableau 18. Résumé des facteurs et des niveaux de la pré-étude conçue pour choisir la
meilleure taille du large lactose

Nombre de niveaux Nom

Facteur 1 3 PA
Niveau 1 Doxycycline
Niveau 2 NV716
Niveau 3 Doxycycline+NV716
Facteur 2 2 Lactose
Niveau 1 LH206
Niveau 2 RESPI003

127
 Chapitre 5

Ainsi, les deux types de lactose ont été utilisés en association avec la doxycycline seule, le
NV716 seul ainsi qu'avec le mélange doxycycline/NV716 pour la caractérisation
aérodynamique de la poudre à l'aide de l'impacteur NGI (Tableau 19).

Chaque mélange (M) a été rempli manuellement dans une gélule HPMC
(hydroxypropylméthylcellulose) de taille 3 (Voir Partie matériels et méthodes). Les gélules
ont ensuite été testées in vitro par inhalation en utilisant le HandiHaler® DPI (Boehringer
Ingelheim Ltd, Allemagne), pour réaliser l'évaluation aérodynamique de la poudre.

Tableau 19. Différents mélanges proposés pour la pré-étude permettant de choisir la taille
optimale du large lactose

Excipient PA
Taille des
Nom (%) Doxycycline (%) NV716 (%)
particules (µm) *
5 0 M1
95
LH206 75-95 0 5 M2
90 5 5 M3
5 0 M4
95
RESPI003 20-50 0 5 M5
90 5 5 M6

* Taille des particules de lactose mesurée par une méthode laser par le fournisseur

III.2. Détermination des facteurs influençants les propriétés aérodynamiques

de la combinaison doxycycline/NV716

Dans cette partie de l'étude, notre objectif était d'étudier l'adaptabilité des deux composés
(doxycycline et NV716) à être inhalés simultanément sous forme d'une poudre préparée par la
lyophilisation des deux composés sans utilisation d'excipients. Par la suite, nous avons procédé
à l’étude des facteurs influençant leur comportement aérodynamique en inhalation en vue
d’optimiser leur aérosolisation. Ainsi, l'influence du taux de remplissage de la gélule, du taux
des principes actifs, du type de lactose (deux types ont été utilisés : le large lactose seul et le
mélange de large lactose avec du lactose fin) et de l'ordre d'introduction des différents
composants du mélange a ainsi été prise en compte en relation avec le Diamètre Aérodynamique
Massique Médian (MMAD) et la Fraction des Particules Fines (FPF). Cette approche permet
d'examiner les facteurs affectant le comportement aérodynamique et la dispersibilité de la
combinaison des deux composés (doxycycline et NV716) et de comprendre comment ils

128
 Chapitre 5

peuvent influer l'efficacité et le site de dépôt de la poudre d'inhalation considérée dans les voies
respiratoires. Un plan d'expérience a été établi en étudiant quatre paramètres comme preuve de
concept : la teneur en principes actifs (doxycycline + NV716), le taux de remplissage des
gélules, le taux de principe actif, le type de lactose et l'ordre d'introduction des différents
composés. Les différents facteurs ont été étudiés en utilisant deux niveaux, sauf pour le dernier
(l'ordre d'introduction des composants du mélange) qui comporte quatre niveaux, les valeurs
utilisées pour chaque niveau et chaque facteur sont indiquées dans le Tableau 20, et la
conception des expériences réalisées sont résumées dans le Tableau 21. Le plan d'expérience
choisi est un plan de dépistage dont l'objectif est de comparer le comportement des différents
niveaux pour chaque facteur.431

Tableau 20. Domaine expérimental résumant les différents facteurs étudiés et leurs niveaux

Nombre de niveaux Nom Abréviation

Facteur 1 2 Taux de remplissage des gélules Remplis

Niveau 1 50%
Niveau 2 100%
Facteur 2 2 [Principe Actif] dans la poudre [PA]
Niveau 1 2.5 %
Niveau 2 10 %
Facteur 3 2 Lactose en quantité suffisante Lactose
Niveau 1 Large
Niveau 2 Fin +large
Facteur 4 6 Ordre d’introduction Ordre
Niveau 1 Doxy 2mn+NV716 2mn
Niveau 2 Doxy 4mn+NV716 4mn
Niveau 3 NV716 2mn+Doxy 2mn
Niveau 4 NV716 4mn+Doxy 4mn
Niveau 5 NV716/L* 2mn Doxy/L 2mn
Niveau 6 NV716/L 4mn Doxy/L 4mn
* /L : substance active ajoutée, mélangée au lactose

129
 Chapitre 5

Tableau 21. Plan expérimental proposé pour étudier l'influence de plusieurs facteurs sur
l'efficacité d'aérosolisation du mélange de poudre de la doxycycline et du NV716

Taux de Taux de
Expérience Lactose Ordre d’introduction
remplissage [PA]

E1 50% 2.5 % Large Doxy 2mn+NV716 2mn

E2 100% 2.5 % Fin +large NV716 2mn+Doxy 2mn

E3 100% 10 % Fin +large Doxy 2mn+NV716 2mn

E4 100% 2.5 % Large Doxy 4mn+NV716 4mn

E5 50% 10 % Large NV716 2mn+Doxy 2mn

E6 50% 2.5 % Large NV716 4mn+Doxy 4mn

E7 50% 10 % Fin +large Doxy 4mn+NV716 4mn

E8 100% 10 % Fin +large NV716 4mn+Doxy 4mn

E9 100% 10 % Large NV716/L 4mn Doxy/L 4mn

E10 100% 2.5 % Large NV716/L 2mn Doxy/L 2mn

E11 50% 10 % Fin +large NV716/L 2mn Doxy/L 2mn

E12 50% 2.5 % Fin +large NV716/L 4mn Doxy/L 4mn

IV. Résultats et discussion

L'objectif principal de cette étude est d'étudier l'influence de plusieurs facteurs sur l'efficacité
d'aérosolisation d'une poudre pour inhalation constituée d'un mélange de deux principes actifs
(doxycycline et l'adjuvant NV716) qui agissent en synergie. Ainsi, dans un premier temps, nous
avons commencé par étudier l'aptitude des deux composés (doxycycline et NV716) à
l’inhalation séparément ou en combinaison, en utilisant comme excipient deux types de lactose
pour inhalation. Ces deux types de lactose diffèrent par la taille de leurs particules mais sont
tous les deux considérés comme étant à large gamme.

Le Tableau 22 résume les résultats de la caractérisation aérodynamique (MMAD et FPF) des

trois poudres (doxycycline seule, NV716 seul et de la combinaison doxycycline/NV716)
délivrées en mélange avec le lactose LH206 ou le lactose RESPI003.

130
 Chapitre 5

Tableau 22. Paramètres aérodynamiques des aérosols impliquant la doxycycline, le NV716

séparément ou en mélange, en association avec le lactose LH206 ou RESPI003

Diamètre Aérodynamique Massique Fraction de Particules Fines

Médian (MMAD) (µm) FPF (%)
LH206 RESPI003 LH206 RESPI003
Doxycycline seule 3,4 3,4 33 42
NV716 seul 9,4 9,2 6 6
Doxycycline + NV716 5,3 5,6 13 22

Comme indiqué dans le Tableau 22, l'utilisation du lactose LH206 a conduit respectivement à
des MMAD de 3,4 ; 9,4 et 5,3 µm et des FFP de 33 ; 6 et 13 % pour la poudre de la doxycycline
seule, l'adjuvant NV716 seul et pour le mélange doxycycline/NV716. L'ajout de lactose
RESPI003 à la poudre de la doxycycline seule, du NV716 seul et de leur mélange (Doxycycline/
NV716) a permis d’obtenir des FPFs de 42 ; 6 et 22 % et des MMAD de 3,4 ; 9,2 et 5,6 µm
respectivement.

La Figure 53 résume les MMADs des particules des aérosols des différentes poudres
(doxycycline, NV716 ou doxycycline/NV716) délivrées en mélange avec le lactose LH206 ou
le RESPI003 (a) ainsi que le domaine de variation du MMAD (b) :

a
Doxycycline seule
10 9.4 9.2
NV716 seul
8 Doxycycline/NV716 b
MMAD (µm)

6 5.3 5.6

4 3.4 3.4

0
ES 6

ES 6

ES 6
3

3
20

20

20
00

00

00
LH

LH

LH
PI

PI

PI
R

Type de lactose

Figure 53. MMADs obtenus pour les particules des deux composés en association avec les
deux types de large lactose (a) ainsi que leur domaine de variation (b)

Comme le montre la Figure 53-a, la poudre de doxycycline a donné un MMAD de 3,4 µm,
quel que soit le type de lactose utilisé. La poudre du composé NV716 a donné un MMAD de
9,4 µm avec le LH206 et de 9,2 µm avec le RESPI003. En revanche, le mélange des deux

131
 Chapitre 5

poudres (doxycycline/NV716) avec le LH206 ou le RESPI003 a conduit à des MMAD de 5,3

et de 5,6 µm respectivement. On peut ainsi clairement remarquer que le changement de type de
large lactose (deux tailles de particules différentes) n'a pas influé de manière significative sur
le diamètre aérodynamique des trois poudres testées.

LH206 9 .4 Doxycycline/NV716
RESPI003
9 .1 a Dxycycline
b
NV716
9 .4
9 .1

MMAD (µm)
MMAD (µm)

5 .6
5 .3

5 .6
3 .4 5 .3

3 .4 3 .4

Dxycycline NV716 Doxycycline/NV716 LH206 RESPI003

[PA] Lactose

Figure 54. Effets d'interaction de premier ordre – MMAD, en fonction du type de lactose (a)
et en fonction du principe actif (b)

En outre, comme le montre la Figure 54, pour cette première réponse (MMAD) étudiée par le
plan d’expérience réalisé, le seul facteur influent est le principe actif. Le type de lactose de
grande taille n'a montré aucune influence sur le MMAD des particules, les résultats obtenus
avec les deux types sont similaires (Figure 54-a). Toutefois, on peut observer que la réponse la
plus faible est obtenue avec la doxycycline seule, la réponse la plus élevée est obtenue avec
l'adjuvant NV716 seul et le mélange des deux poudres conduit à un résultat intermédiaire
(Figure 54-b). La Figure 55 montre la fraction de particules fines obtenue avec les différents
mélanges testés des deux composés avec les deux types de large lactose.

132
 Chapitre 5

a
Doxycycline seule
50
42 NV716 seul
40 Doxycycline/NV716
32
FPF (%)
b
30
22
20
13
10 6 6

0
ES 6

ES 6

ES 6
3

3
20

20

20
00

00

00
LH

LH

LH
PI

PI

PI
R

R
Type de lactose

Figure 55. Fraction de Particules Fines obtenues avec les différents mélanges des deux
composés avec les deux types de large lactose (a), le domaine de variation des FPFs (b)

Les formulations basées sur le lactose LH206 ont donné des FPFs de 33, 6 et 13 % pour la
poudre de doxycycline seule, de NV716 seul et de leur mélange (doxycycline/NV716)
respectivement. Alors que l'utilisation du lactose RESPI003 permet l’obtention des FPF de 42
% pour la doxycycline seule, 6 % pour le NV716 et 22 % pour le mélange doxycycline/NV716.
A partir de ces résultats, on peut noter que même si le RESPI003 n'influence pas la FPF obtenu
avec la poudre de NV716, son utilisation a permis une nette amélioration du pourcentage de
particules fines obtenu avec la doxycycline seule et avec le mélange doxycycline/NV716.

LH206 Doxycycline/NV716
RESPI003
a Dxycycline b
42 NV716 42

32 32
FPF (%)

FPF (%)

22 22

13
13

6 6
6

Dxycycline NV716 Doxycycline/NV716 LH206 RESPI003

[PA] Lactose

Figure 56. Effets d'interaction de premier ordre – FPF, en fonction du type de lactose (a) et
en fonction du principe actif (b)

133
 Chapitre 5

La Figure 56 confirme que dans le cas de la poudre d'adjuvant NV176 (Figure 56-a), le type
de lactose n'a aucune influence sur la FPF. Cependant, dans le cas de la poudre de doxycycline
seule ou en mélange avec le NV176, le type de lactose a une influence notable puisque le lactose
RESPI003 permet une augmentation significative du pourcentage de particules fines.

La Figure 57 résume les résultats des doses émises et délivrées obtenues suite à la délivrance
de la doxycycline seule, du NV716 seul ou de la combinaison des deux, en mélange avec le
lactose RESPI003 (a) ou le lactose LH206 (b).

a b
100 Dose Emise 100 Dose Emise
Dose Délivrée Dose Délivrée
80 80

Doses (mg)
Doses (mg)

60 60

40 40

20 20

0 0
Doxycycline NV716 Doxycycline/NV716 Doxycycline NV716 Doxycycline/NV716
Principes actifs Principes actifs

Figure 57. Doses Emises et Doses Délivrées obtenues à partir des différents mélanges des
deux composés avec le lactose LH206 (a) ou RESPI003 (b)

Comme le montre la Figure 57, le lactose RESPI003 permet l'administration de doses plus
élevées que le lactose LH206, et ce pour les poudres des deux composés délivrés séparément
ou en combinaison. En outre, le lactose RESPI003 (Figure 57-b) conduit à une perte moindre
en principes actifs (différence entre la Dose Emise et la Dose Délivrée) par rapport au lactose
LH206, en particulier dans le cas de la combinaison doxycycline/NV716.

Les profils de dépôt sur les différents étages de l'impacteur NGI, des particules inhalées des
deux composés délivrés séparément ou en combinaison en utilisant le lactose LH206 ou le
lactose RESPI003 comme excipient sont regroupés dans la Figure 58.

134
 Chapitre 5

7 a 7 b
Doxycycline_LH206 NV716_LH206
6 Doxycycline_RESPI003 6 NV716_RESPI003

Masse déposée (mg)

Masse déposée (mg)

5 5
4 4
3 3
2 2
1 1
0 0
1

8
e

e
ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag
Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et
Les étages du NGI Les étages du NGI
12 12
c d
Doxycycline Doxycycline
10 10
NV716 NV716
Masse déposée (mg)

8 Masse déposée (mg) 8

6 6

4 4

2 2

0 0
1

8
e

e
ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag

ag
Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et

Et
Les étages du NGI Les étages du NGI

Figure 58. Profils de dépôt sur les étages du NGI des particules inhalées de la doxycycline (a) ou du
NV716 (b) délivrées séparément ou en tant que combinaison NV716/doxycycline en mélange avec le
lactose LH206 (c) ou RESPI003 (d)

Les deux types de lactose de grande taille ont conduit à une distribution gaussienne des
particules des différentes poudres testées sur les étages de l'impacteur avec des maximums de
dépôt sur : l'étage 2 pour la poudre de l’adjuvant NV716 et son mélange avec la doxycycline et
sur l'étage 3 pour la poudre de la doxycycline seule. Cependant, le lactose RESPI003 permet
un dépôt de particules supérieur à celui obtenu avec le LH206 et ce pour tous les mélanges
testés. De plus, pour la formulation du mélange de la doxycycline avec le NV716, le RESPI003
permet un dépôt élevé des deux composés sur les étages du NGI par rapport à ceux obtenus
avec le LH206. Plus précisément, dans le cas du composé NV716, on remarque que le
RESPI003 facilite sa dispersion sur les différents étages en donnant une masse déposée plus
élevée par rapport à celles obtenues avec le lactose LH206, améliorant ainsi le rapport entre les
deux composés (doxycycline et NV716) sur chaque étage, ce qui est fortement recommandé
dans notre cas pour assurer la synergie de l'activité antibactérienne entre les deux composés.

135
 Chapitre 5

Ainsi, nous pouvons conclure que le mélange obtenu avec le lactose RESPI003 est moins
cohésif que celui obtenu avec le lactose LH206, ce qui permet un détachement plus facile des
particules fines. Cette légère amélioration de la fluidité apportée par le RESPI003 facilite la
désagglomération de la poudre. Il a été ainsi démontré que le lactose RESPI003 est adapté à
l'optimisation des propriétés d'aérosolisation de notre poudre afin d'obtenir un comportement
aérodynamique optimal des particules.

D'après les résultats obtenus dans cette étude préliminaire, nous pouvons conclure que le lactose
RESPI003 améliore la fluidité de notre mélange à inhaler, ce qui facilite la désagglomération
des particules. Il sera ainsi utilisé dans le reste de notre étude d'optimisation de l'aérosolisation
des poudres sèches pour obtenir un comportement aérodynamique optimal des particules.

IV.1. Influence de différents facteurs sur les propriétés aérodynamiques de la

poudre de la combinaison doxycycline/NV716

La partie précédente de l'étude nous a permis de sélectionner la taille optimale du lactose pour
une bonne dispersion des poudres sèches des deux composés qui ont été testés séparément ou
en combinaison. Dans cette seconde partie, nous porterons uniquement notre attention sur
l'optimisation du mélange des deux composés (délivrance de la doxycycline et du NV716
simultanément).

Nous avons ainsi procédé à l’évaluation du comportement de la combinaison (doxycycline et

NV716) lors de l'inhalation en suivant une approche expérimentale utilisant deux types de
lactose (large lactose seul et mélange de large lactose avec du lactose fin) ainsi qu’en variant
d’autres facteurs non impliqués dans la formulation. Cela a été fait principalement pour limiter
l'utilisation de réactifs et d'excipients qui peuvent nuire aux voies respiratoires souvent dans un
état pathologique. Cette approche permet d'examiner les facteurs influençant le comportement
aérodynamique et la dispersibilité du mélange des deux composés (doxycycline et NV716) pour
mieux comprendre et optimiser leur site de dépôt au niveau pulmonaire.

Les résultats de la caractérisation aérodynamique des différents mélanges de poudres testés

selon le plan d'expérience détaillé précédemment sont résumés dans la Figure 59.

136
 Chapitre 5

7
a Valeur b
6 Moyenne 4.6
MMAD (µm)

Ecart-type 0.6
5 Minimum 3.6
Maximum 5.9
4 Q1 4.2
Médiane 4.3
3 Q3 5.2
3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0
MMAD (µm)
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
E8
E9

0
1
2
E1
E1
E1
Expériences
40
c Valeur d
30 Moyenne 24
Ecart-type 6
FPF (%)

20 Minimum 14
Maximum 38
10 Q1 21
Médiane 24
Q3 26
0 15 20 25 30 35
FPF (%)
E1
E2
E3
E4
E5
E6
E7
E8
E9

0
1
2
E1
E1
E1

Expériences

Q1 : le 1er quartile, représente la donnée de la série ≥ à au moins 25% des données ;

Q3 : le 3èm quartile, représente la donnée de la série ≤ à au moins 75% des données.

Figure 59. Propriétés aérodynamiques MMAD (a) et FPF (b) des aérosols impliquant un
mélange des poudres de la doxycycline et du NV716 selon différents facteurs. Box Plots pour
les réponses MMAD (c) et FPF (d) représentent graphiquement leur plage de variation.

La variation des différents facteurs étudiés par le plan d'expérience a donné lieu à une large
gamme de MMAD compris entre 3,6 et 5,9 µm avec un MMAD moyen de 4,6 µm. En outre, la
FPF moyenne obtenu était de 24 %, la plus faible FPF obtenue était de 14 % tandis que le
pourcentage le plus élevé de particules fines obtenu était de 38%. Ainsi, d'après ces résultats,
nous pouvons remarquer une différence dans les MMADs obtenus, certains sont adaptés à
l'administration pulmonaire (inférieurs à 5 µm), tandis que d'autres sont supérieurs aux normes
recommandées pour une administration par voie pulmonaire (supérieurs à 5 µm). En outre, il
existe une énorme différence entre le pourcentage de particules fines allant de 14 à 38%, ce qui
influence la concentration des principes actifs au niveau de leurs sites cibles dans les zones
profondes des poumons, et par conséquent leur activité antibactérienne et leur efficacité
thérapeutique.

La variation des propriétés aérodynamiques des poudres obtenues reflète l'influence des
différents facteurs étudiés, et souligne la possibilité d'optimiser l'aérosolisation des poudres
conçues pour l'inhalation sans même avoir recours aux techniques sophistiquées d'ingénierie

137
 Chapitre 5

343
des particules inhalées (telles que la préparation de grosses particules poreuses pour
432,433
l'administration pulmonaire ) ainsi que l'importance de les prendre en considération lors
de la mise au point d’une poudre sèche pour inhalation.

La Figure 60 montre l'analyse des différents facteurs qui influent sur les propriétés
aérodynamiques : MMAD (Figure 60- a, b) et FPF (Figure 5- c, d) des différents mélanges de
poudres obtenus en fonction des différentes expériences réalisées.

a b

Remplis 50 %
Remplis (1)
[PA] 100 %
Lactose
Ordre
2.5 %
Ordre [PA] (2)
Ordre 10 %
Ordre
Ordre Large
Ordre Lactose (3)
Ordre
Fin + large
Ordre
Ordre Doxy 2mn + NV716 2mn
Ordre Doxy 4mn + NV716 4mn
Ordre
NV716 2mn + Doxy 2mn
Ordre Ordre (4)
Ordre NV716 4mn + Doxy 4mn
Ordre NV716/L 2mn + Doxy/L 2mn
Ordre NV716/L 4mn + Doxy/L 4mn

c d
Remplis
50 %
[PA] Remplis (5)
Lactose 100 %
Ordre
Ordre 2.5 %
Ordre [PA] (6)
10 %
Ordre
Ordre
Ordre Large
Lactose (7)
Ordre Fin + large
Ordre
Ordre Doxy 2mn + NV716 2mn
Ordre
Ordre
Doxy 4mn + NV716 4mn
Ordre NV716 2mn + Doxy 2mn
Ordre NV716 4mn + Doxy 4mn Ordre (8)
Ordre NV716/L 2mn + Doxy/L 2mn
Ordre NV716/L 4mn + Doxy/L 4mn

Figure 60. Analyse de l'impact de plusieurs facteurs sur les caractéristiques aérodynamiques :
le MMAD (a, b) et la FPF (c, d) du mélange doxycycline/NV716 testé en inhalation.

138
 Chapitre 5

IV.1.1. Influence du taux de remplissage sur l'aérosolisation de la poudre du

mélange Doxycycline/NV716

Afin d'identifier l'impact du taux de remplissage de la gélule sur la facilité de dispersion et

d'aérosolisation du mélange des deux composé (doxycycline/NV716), deux taux de remplissage
ont été choisis : 50% et 100% du volume de la gélule.
La Figure 60-b-1 indique que le taux de remplissage n'influe pas sur le MMAD des particules
inhalées, cependant, la diminution du taux de remplissage à 50% est associée à une nette
augmentation des FFP (Figure 60-d-5). Ceci peut être dû à l'augmentation de l'espace libre à
l'intérieur de la gélule permettant une meilleure désagglomération de la formulation, ce qui
facilite la dispersion de la poudre et le détachement des particules fines de leur support (lactose).
Ainsi, pour augmenter le taux de FPF, un remplissage à moitié des gélules devrait être envisagé.

IV.1.2. Influence du taux de principes actifs

L'influence du taux de principe actif (PA) sur le profil aérodynamique du mélange de poudres
(doxycycline et adjuvant NV716) a été étudiée en fixant deux taux de PA : 2,5 % et 10 % du
mélange des deux poudres par rapport au volume total de la poudre dans la gélule (volume total
Vt = VPA + VLactose).

Comme le montre la Figure 60-b-2, le taux de PAs a une influence sur le MMAD des particules
inhalées, qui est inversement proportionnelle à ce taux de PA, puisqu'un taux de 2,5% est
associé à une augmentation du MMAD alors que l'augmentation du taux de PA à 10% entraîne
sa diminution. En revanche, pour la Fraction de Particules Fines (Figure 60-d-6), le taux de PA
est directement proportionnel à la FPF. Un taux élevé en principe actif (10 %) entraîne une
augmentation de la FPF alors que sa diminution à 2,5 % permet la diminution de la FPF.

Ce résultat est particulièrement avantageux dans notre cas, puisqu'un résultat optimal se résume
en un faible MMAD (moins de 5 µm) permettant un dépôt optimal dans les parties profondes
des poumons (le site de l'infection bactérienne) et une FPF élevée assurant une concentration
suffisante (supérieure à la CMI de l'antibiotique) au site de l'infection. Ainsi, pour une
délivrance optimale de notre mélange de poudre, un taux élevé de PA de 10% est fortement
recommandé, permettant une diminution du MMAD et une augmentation de la FPF.

139
 Chapitre 5

IV.1.3. Influence de l'excipient support

Comme expliqué précédemment, la première partie de l'étude nous a permis de sélectionner la

taille optimale du grand lactose. Dans cette deuxième partie, deux types d'excipients ont été
utilisés, le premier est le lactose RESPI003 seul choisi en fonction des résultats obtenus dans la
première partie de l'étude. Le second est le mélange du lactose RESPI003 avec un autre type de
lactose fin LH210. L'ajout de fines particules de lactose est généralement recommandé pour
augmenter la capacité de détachement du principe actif de son support, car ces fines particules
de lactose occuperont les sites actifs à haute énergie à la surface du lactose de grande taille.
Ainsi, le principe actif s'adsorbera sur les sites moins puissants, assurant une fixation moins
forte et donc un détachement plus efficace. D'après les résultats obtenus, présentés dans la
Figure 60-b-3, on peut clairement voir que le type d'excipient utilisé n'a pas d'impact sur le
MMAD des particules. Cependant, il a un impact direct sur la FPF. Les deux types d'excipients
testés ont conduit à des réponses similaires en termes de MMAD, tandis que le lactose
RESPI003 seul était plus favorable à l'optimisation du niveau de FPF par rapport à son mélange
avec le lactose fin.

IV.1.4. Influence de l'ordre d'introduction des différents principes actifs

Le dernier facteur étudié est l'ordre d'introduction (avec la durée de mélange) des différents
constituants (principes actifs et excipient) dans le mélange final délivré à l'aide de l'inhalateur
de poudre sèche. Ainsi, six niveaux d’étude définis pour ce facteur, sont résumés dans la Figure
61.

Figure 61. Ordre et durée de mélange des deux composés avec le lactose pour obtenir une
poudre pour inhalation.

140
 Chapitre 5

Selon les résultats obtenus, résumés dans la Figure 60, l'ordre d'introduction des différents
composants dans le mélange final pour inhalation a un impact sur le MMAD et aussi sur la FPF.

Selon la Figure 60-b-4, l'ordre qui conduit au plus faible MMAD est obtenu avec le mélange
de la doxycycline d'abord avec le lactose (pendant 4 min) suivi de l'ajout de NV716 (Figure
61-b). En outre, le mélange du NV716 en premier lieu avec du lactose (pendant 4 minutes) puis
l'ajout de la doxycycline (mélange pendant 4 minutes) entraîne également une diminution du
MMAD (Figure 61-d). Ce résultat implique que l'ordre dans lequel les deux composés sont
mélangés avec le lactose a peu d'influence, cependant la durée de 4 min est plus favorable pour
obtenir de faibles valeurs de MMAD.

Le mélange de la doxycycline avec le lactose pendant 2 min suivi de l'ajout du NV716 conduit
au MMAD le plus élevé et est donc l’ordre le plus défavorable (Figure 61-a). En outre, la
division du lactose en deux parties et les mélanger avec chaque composé séparément pendant 2
min ou 4 min ((Figure 61-e et f) ont montré des effets similaires avec une augmentation du
MMAD et sont ainsi défavorables.

En ce qui concerne la FPF (Figure 60-d-8), l’ordre le plus défavorable est celui impliquant le
mélange de chaque composé séparément avec le lactose pendant 2 min, suivi du mélange des
deux mélanges (Figure 61-e), cela conduit ainsi à la réponse la plus faible du FPF.

En outre, les deux expériences commençant par la doxycycline, qu'ils aient été mélangés
pendant 2 min ou 4 min à chaque fois, sont également défavorables (Figure 61-a et Figure 61-
b) et présentent de faibles FPF. En revanche, les 3 expériences commençant par le NV716
(pendant 2 ou 4 min ou son mélange avec la moitié de la quantité de lactose pendant 4 min)
permettent l'augmentation de la FPF et sont recommandées pour l'optimisation de la FPF
(Figure 61-c, Figure 61-d et Figure 61-f). Ainsi, pour ce paramètre (FPF), l'ordre
d'introduction est plus influent par rapport à la durée du mélange, et c'est l'introduction du
NV716 en premier qui est la plus favorable permettant l'augmentation de la FPF.

Donc, si l'on combine les résultats obtenus pour les deux réponses (MMAD et FPF), on peut
conclure que l'ordre d'introduction optimal pour notre mélange de composés est celui qui
prévoit de mélanger d'abord le NV716 avec du lactose pendant 2 min, puis d'ajouter la
doxycycline et de mélanger encore pendant 2 min (Figure 61-c), puisque cela entraîne une
diminution du MMAD et une augmentation de la FPF.

141
 Chapitre 5

IV.2. Mélange optimal

Tous les résultats précédemment présentés nous permettent d’envisager une formulation
optimale pour les deux composés assurant un meilleur profil aérodynamique en inhalation sous
forme de poudre. Le Tableau 23 et Figure 62 résument les différents constituants du mélange
optimal ainsi que ses caractéristiques aérodynamiques et son profil de dépôts sur les étages de
l’impacteur.

Tableau 23. Constituants de la formulation optimale (doxycycline/NV716) et ses

caractéristiques aérodynamiques en inhalation

Taux de remplissage 50 %
[PA] 10 %
Lactose Large (RESPI003)
Ordre d’introduction NV716 2mn+Doxy 2mn
MMAD (µm) 4.1 (+/- 0.1)
FPF (%) 38 (+/- 0.9)

Ainsi, la combinaison des meilleurs facteurs identifiés préalablement permet d'obtenir un

MMAD de 4,12 µm qui correspond aux normes recommandées pour les traitements inhalés (˂
5 µm) et qui permet aux particules d'atteindre les régions profondes des poumons. En outre,
cette formule a démontré une FPF approprié de 38% (la valeur la plus élevée obtenue)
permettant aux PAs d'atteindre les concentrations nécessaires à leurs activités antibactériennes
sur le site de l'infection.

La Figure 62 laisse apparaitre que les deux composés sont uniformément répartis sur les
différents étages du NGI. On peut observer sur chaque étage de l’impacteur la présence des
deux composés déposés de manière homogène. De plus, leurs quantités déposées sont égales
sur la plupart des étages (étages 1,5, 6, 7 et 8) et très proches sur le reste (étages 2, 3 et 4). Ceci
est particulièrement important pour notre combinaison afin d'assurer la potentialisation de
l'activité de la doxycycline par l'adjuvant NV716 permettant d’atteindre l'effet pharmacologique
souhaité.

142
 Chapitre 5

0,8
a
Doxycyline

Masse déposée (mg)

0,6 NV716

0,4

0,2

0,0
Etage 1 Etage 2 Etage 3 Etage 4 Etage 5 Etage 6 Etage 7 Etage 8

Les étages du NGI

Figure 62. Modèles de dépôt sur les étages du NGI du mélange doxycycline /NV716 délivrés
selon les facteurs optimaux

V. Conclusion :

Les résultats obtenus ont démontré l'influence de différents facteurs sur l'efficacité
d'aérosolisation de notre combinaison de principes actifs, dont certains permettent d'améliorer
leur comportement aérodynamique (tels que le taux de remplissage de 50% du volume de la
gélule, le taux de PAs de 2,5% et l’emploi du large lactose RESPI003 en tant qu’excipient
utilisé seul). A l’inverse d’autres paramètres entraînent une augmentation du MMAD ou une
diminution de la FPF et sont donc défavorables à notre formulation (comme le remplissage à
100% des gélules et le taux de principes actifs de 2,5%). Ainsi, la combinaison des différents
facteurs favorables nous a permis de trouver la bonne formulation permettant d'optimiser au
mieux la délivrance simultanée des deux composés sous forme de poudre inhalable. Nous avons
ainsi pu identifier les facteurs influençant le comportement aérodynamique de notre poudre
combinée pour inhalation, ce qui nous a permis de trouver la meilleure formulation en
regroupant les facteurs optimaux sans même avoir recours à des techniques sophistiquées
d'ingénierie des particules ou utiliser un panel d'excipients (comme les agents améliorant la
fluidité et les lubrifiants) qui peuvent affecter négativement les voies respiratoires souvent
affaiblies par une infection à P. aeruginosa.

143
 Chapitre 6

Les Hanamines

(Résultats expérimentaux)

144
 Chapitre 6

I. Introduction

Dns ce chapitre, nous décrirons le développement d’une nouvelle classe de dérivés d’acides
gras polyaminés en vue d’améliorer les activités biologiques du dérivé polyaminoisoprényle
NV716, qui a été envisagé en jouant sur la longueur de la chaine hydrophobe (acide gras)
possédant comme dans le cas de NV716 de nombreuses double liaison permettant ainsi
d’accroitre le degré d'hydrophobicité de la molécule ce qui semblait selon nos études
antérieures contribuer à une bonne activité des dérivés polyaminoisoprényles. Nous étudierons
également leurs mécanismes d’action vis-à-vis des bactéries à Gram-négatif.

II. Synthèse des dérivés Hanamines :

La synthèse de nouveaux types de dérivés polyaminés, les Hanamines (HD), s’effectue à partir
d’acides gras naturels tels que l’acide oléique, linoléique, docosahexaénoïque, et
eicosapentaénoïque. A titre d’exemple pour la synthèse du dérivé HD1, nous avons réalisé un
couplage peptidique entre l’acide oléique et la spermine dans les conditions suivantes.

Schéma 3. Procédé de synthèse du dérivé HD1

Les dérivés HD1, HD2, HD3 et HD4 sont ainsi obtenus suivant les mêmes conditions
opératoires avec un rendement de 47%, 53%, 61% et 22% respectivement.

Schéma 4. Structures chimiques des composés HD2, HD3 et HD4

145
 Chapitre 6

Par la suite et par analogie avec la structure du dérivé NV716 précédemment étudié contenant
un grand nombre d’insaturations dans sa structure mais également de résultats biologiques
préliminaires, un grand nombre d’analogues du composé HD3 ont été préparés et sont présentés
dans le Tableau 24.

Tableau 24. Synthèse et structures chimiques des dérivés HD5-HD17

Composé Amine (RNH2) Rendement (%)

HD5 56

HD6 61

HD7 49

HD8 52

HD9 61

HD10 56

HD11 48

HD12 42

HD13 42

HD14 28

HD15 30

HD16 41

HD17 53

146
 Chapitre 6

III. Étude de l’activité antibactérienne et de la capacité des Hanamines à

potentialiser l’activité des antibiotiques

L’activité antimicrobienne (CMI) des Hanamines a été évaluée vis-à-vis de trois souches
bactériennes à Gram-négatif : Pseudomonas aeruginosa PA01, K pneumoniae ATCC51296 et
E. coli ATCC25922. Nous avons également procédé à l’évaluation de leur effet en tant
qu’adjuvant à la doxycycline et à l’érythromycine utilisées à une concentration de 2 µg/mL vis-
à-vis de ces mêmes souches bactériennes. Les résultats sont présentés dans le Tableau 25.

Tableau 25. CMIs des Hanamines (µM) seules et en combinaison avec la doxycycline
(SYN1) ou avec l’érythromycine (SYN2) utilisées à 2 µg/mL vis-à-vis de PA01, K
pneumoniae ATCC51296 et E. coli ATCC25922

Concentration Minimale Inhibitrice (µM)

PAO1 K pneumoniae ATCC51296 E. coli ATCC 25922
1 2 2
CMI SYN CMI SYN CMI SYN
HD1 100 100 400 200 100 100
HD2 200 12.5 400 200 100 50
HD3 100 6.25 100 12.5 50 12.5
HD4 200 50 200 200 50 25
HD5 400 400 400 200 200 50
HD6 400 200 400 200 100 50
HD7 400 200 400 200 200 50
HD8 400 400 400 200 200 200
HD9 400 400 400 400 400 400
HD10 400 100 400 25 200 50
HD11 400 400 400 400 400 100
HD12 400 100 100 12.5 100 25
HD13 100 50 100 1.56 50 12.5
HD14 400 400 400 400 400 400
HD15 400 200 400 400 400 50
HD16 400 400 400 400 400 400
HD17 400 400 400 400 400 400
CMI de la doxycycline vis-à-vis de PA01 est de 64 µg/mL, CMI de l’érythromycine
est de 256µg/mL vis-à-vis de K pneumoniae ATCC51296 et de 128 µg/mLvis-à-vis
d’ E. coli ATCC25922
Comme le montre les résultats regroupés dans le Tableau 25 toutes les Hanamines sont
dépourvues d’activités antibactériennes propres vis-à-vis des bactéries à Gram-négatif utilisées
dans cette étude avec dans la majorité des cas des CMIs supérieures ou égales à 200 µM.
Cependant, ce critère est important dans la recherche des composés adjuvants aux antibiotiques
où l’absence d’activité antibactérienne intrinsèque est très favorable afin d’éviter le
développement des mécanismes de résistance bactérienne vis-à-vis de ces adjuvants.
147
 Chapitre 6

Par la suite, nous avons procédé à l’évaluation de ces composés en tant qu’adjuvants à la
doxycycline vis-à-vis de PA01 et à l’érythromycine vis-à-vis de K. pneumoniae ATCC51296
et E. coli ATCC25922.
Les résultats ont permis d’identifier deux composés permettant la réduction de la CMI de la
doxycycline et de l’érythromycine au seuil de sensibilité de 2 µg/mL. Le composé HD3 qui a
permis la restauration de l’activité de la doxycycline vis-à-vis de PA01 lorsqu’il est utilisé à
6.25 µM (3.2 µg/mL) et la potentialisation de l’activité de l’érythromycine vis-à-vis de K.
pneumoniae et E. coli lorsqu’il est utilisé à 12.5 µM (6.4 µg/mL). Le deuxième composé est le
composé HD13 qui restaure l’efficacité de l’érythromycine vis-à-vis de K. pneumoniae et E.
coli lorsqu’il est utilisé à 1.56 µM (0.7 µg/mL) et à 12.5 µM (5.5 µg/mL) respectivement.

La Figure 63-a résume les CMIs du composé HD3, de la doxycycline, du HD3 en présence de
la doxycycline à son seuil de sensibilité (2µg/mL) et de la doxycycline en présence du HD3 (5
µg/mL). On peut clairement voir que l’utilisation du composé HD3 à 5 µg/mL permet de réduire
la CMI de la doxycycline de 64 à 0.25 µg/mL, et que la restauration de l’efficacité de la
doxycycline (CMI = 2 µg/mL) nécessite l’utilisation du composé HD3 à 3.2 µg/mL.

a b
100 HD3 300 HD13
HD3 (Doxycycline : 2µg/mL) HD13 (Erythromycine 2 µg/mL)
256
Doxycycline Erythromycine
250
80 Doxycycline ( HD3 : 5 µg/mL) Erythromycine (HD13 6.6 µg/mL)
64 200
CMI (µg/mL)
CMI (µg/mL)

60
50
150 128
40
100

20 44
50
22
3.2
3 0.25 5.5
6
3e-001 0.7
1 0.25
3e-001 1
0 0
PA01 Kp ATCC 51296 E. coli ATCC 25922

Figure 63. CMIs du composé HD3 et de la doxycycline vis-à-vis de PA01 (a). CMIs (µg/mL)
du composé HD13 et de l’érythromycine vis-à-vis de K. pneumoniae ATCC 51296 et de E.
coli ATCC 25922 (b)

La Figure 63-b regroupe les CMIs du composé HD13 et de l’érythromycine seuls ou en

combinaison vis-à-vis de K. pneumoniae et E. coli. Ces résultats ont montré que l’utilisation du
composé HD13 à 6.6 (µg/mL) permet de réduire la CMI de l’érythromycine de 256 à 0.25
µg/mL vis-à-vis de K. pneumoniae et de 128 à 1 µg/mL vis-à-vis de E. coli. Il résulte de cette
étude que l’abaissement de la CMI de l’érythromycine vis-à-vis de K. pneumoniae et de E. coli

148
 Chapitre 6

à 2 µg/mL requiert l’utilisation du composé HD13 à une concentration de 0.7 et 5.5 µg/mL
respectivement.

III.1. Détermination de la nature de l’interaction

Afin d’évaluer les interactions in vitro entre la doxycycline et le composé HD3 vis-à-vis de
PA01 et de l’érythromycine avec le composé HD13 vis-à-vis de K. pneumoniae et E. coli nous
avons procédé à la détermination de la Concentration Fractionnée Inhibitrice qui nous a permis
de calculer l’indice de Concentration Fractionnaire Inhibitrice (Index FIC : Fractionnal
Inhibitory Concentration Index).65

La méthode utilisée pour la détermination de l’indice FIC est la technique de l’échiquier ou «

checkerboard study ». Elle consiste en l’évaluation de l’effet inhibiteur de la croissance
bactérienne de la combinaison de deux composés utilisés à différentes concentrations dans
chaque puit. Ainsi, sur l'axe X de la microplaque 11 concentrations ont été testées pour le
premier composé (dans notre cas : la doxycycline ou l’érythromycine), et sur l’axe Y 7
concentrations du deuxième composé (dans notre cas : le composé HD3 ou HD13) sont
évaluées. La colonne 12 étant réservée à la détermination de la CMI de l’antibiotique seul et la
ligne H à la détermination de la CMI de l’Hanamine seule comme illustré dans la Figure 64.

Figure 64. Principe du test d’échiquier permettant la détermination simultanée des CMIs et de
la FIC

Après 24 h d’incubation à 37 °C, la concentration la plus faible à laquelle aucune croissance

visible ne s'est produite a été enregistrée comme étant la CMI des composés testés de façon

149
 Chapitre 6

individuelle et combinée. À partir de là, il a été possible de déterminer la Concentration

Inhibitrice Fractionnée, de calculer l’indice FIC et d'évaluer les interactions antibactériennes
comme suit434 :

Les valeurs de FIC sont calculées à l’aide de la formule suivante :

FIC = FICATB + FICHD où

La concentration FIC (FICATB et FICHD) d’une drogue correspond à la Concentration Minimale

Inhibitrice (CMI) de la croissance bactérienne de cette drogue en combinaison divisée par sa
CMI agissant seule.

[𝐴𝑇𝐵]𝑒𝑛 𝑝𝑟é𝑠𝑒𝑛𝑐𝑒 𝑑𝑒 𝐻𝐷 [𝐻𝐷]𝑒𝑛 𝑝𝑟é𝑠𝑒𝑛𝑐𝑒 𝑑′𝐴𝑇𝐵

FICATB = et FICHD =
CMI ATB CMI HD

Ainsi, pour deux molécules A et B en interaction, l’indice FIC de cette combinaison exprime la
nature de l'interaction (synergie, indifférence ou antagonisme).65 La définition des seuils des
différents types d’interaction selon EUCAST 435 est comme suit : une interaction est considérée
synergique lorsque son indice FIC est inférieur à 0.5, un effet additif est retenu lorsque 0.5 <
FIC ≤ 1, des seuils compris entre pour 1 < FIC < 2 signifient une indifférence et des valeurs de
FIC ≥ 2 sont utilisées pour définir un antagonisme.436

Les résultats de l’évaluation de la nature des interactions entre deux antibiotiques (la
doxycycline et l’érythromycine) avec les deux meilleures Hanamines (HD3 et HD13) sont
regroupés dans le Tableau 26.

Tableau 26. Valeurs des FICs obtenues avec différentes combinaisons de la doxycycline ou
érythromycine) avec les Hanamines HD3 et HD13 vis-à-vis de 3 souches à Gram-négatif

FIC Meilleure combinaison

Composé HD ATB
Souche Composé 1 Moyenne Min Max FIC TYPE
2 (µg/mL) (µg/mL)
HD3 0.43 0.1 0.81 5 0.2 0.1 SYN
PA01 Doxycycline
HD13 0.85 0.33 1.1 8.8 8 0.33 SYN
K. HD3 0.56 0.08 1.01 10 8 0.08 SYN
Erythromycine
pneumoniae HD13 0.58 0.1 1.03 4.4 0.25 0.1 SYN
HD3 0.71 0.18 1.01 10 32 0.18 SYN
E. coli Erythromycine
HD13 0.73 0.22 1.05 8.8 1 0.22 SYN

150
 Chapitre 6

Vis-à-vis de PA01, la combinaison de la doxycycline avec le composé HD3 a démontré des

valeurs de FIC comprises entre 0.1 et 0.81 traduisant des synergies et des additivités des actions
des deux composés. Le ratio donnant le plus faible FIC de 0.1 (synergie) est celui mettant en
œuvre 0.2 µg/mL de doxycycline en présence de 5 µg/mL du composé HD3. La combinaison
de la doxycycline avec le composé HD13 conduit à des valeurs de FICs comprises entre 0.33
et 1.1 (Synergie – Additivité). Dans ce cas, la meilleure combinaison est obtenue pour un ratio
en concentrations de doxycycline et HD3 de 8 µg/mL pour 8.8 µg/mL respectivement.
Ainsi, Vis-à-vis de PA01 on peut clairement conclure que le composé HD3 potentialise mieux
l’activité de la doxycycline que HD13.

Vis-à-vis de K pneumoniae, la combinaison de l’érythromycine avec le composé HD3 a

démontré des FICs compris entre 0.08 et 1.01, la meilleure combinaison met en jeu 10 µg/mL
de HD3 et 8 µg/mL d’érythromycine. En outre, la combinaison de l’érythromycine avec le
composé HD13 a démontré des valeurs de FICs comprises entre 0.1 et 1.03, la meilleure étant
obtenue avec une combinaison de 4.4 µg/mL de HD13 pour une concentration en
érythromycine de 0.25 µg/mL. Ainsi, pour la potentialisation de l’activité de l’érythromycine
vis-à-vis de K pneumoniae, on peut clairement observer que le composé HD13 est meilleur que
le composé HD3

Les différentes combinaisons du composé HD3 avec l’érythromycine vis-à-vis d’E. coli en vue
d’étudier la nature de leur interaction ont démontré des valeurs de FICs comprises entre 0.18 et
1.01 avec une valeur moyenne de 0.71 qui s’interprète comme la résultante d’une additivité des
activités des deux composés. La meilleure combinaison est celle impliquant l’utilisation de 10
µg/mL du composé HD3 avec 32 µg/mL d’érythromycine. De plus, la combinaison de
l’érythromycine avec le composé HD13 a donné des FICs compris entre 0.22 et 1.05 avec une
valeur moyenne de 0.73 traduisant une additivité des activités des deux composés vis-à-vis de
E. coli. La meilleure combinaison est celle de 8.8 µg/mL de HD13 avec 1 µg/mL
d’érythromycine.

IV. Etude du mécanisme d’action antibactérien des Hanamines HD3 et HD13

L’étude du mécanisme d’action des Hanamines HD3 et HD13 a été menée sur 4 souches
bactériennes à Gram-négatif différentes à savoir Pseudomonas aeruginosa PA01, K.
pneumoniae ATCC 51296, E. coli ATCC 25922 et E. aerogenes EA289.

151
 Chapitre 6

IV.1. Évaluation de l’effet membranotrope des Hanamines HD3 et HD13

IV.1.1. Perméabilisation de la membrane externe : étude de l’hydrolyse de la

nitrocéfine

De nombreux antibiotiques sont beaucoup plus efficaces contre les bactéries à Gram-positif que
contre de multiples bactéries à Gram-négatif.437 Cette différence est due principalement à la
présence d’une couche membranaire supplémentaire " la membrane externe" chez les bactéries
à Gram-négatif.437,438 qui représente une structure hautement spécialisée et forme l'interface
entre la cellule bactérienne et son environnement externe.439 cette membrane sert de barrière
protectrice importante très difficile à franchir qui contrôle efficacement et bloque l'accès des
solutés et des agents externes à la membrane cytoplasmique y compris les antibiotiques, les
détergents et les produits chimiques toxiques.439 La plupart des antibiotiques visent des
processus intracellulaires, d’où la nécessité de pénétrer l'enveloppe de la cellule bactérienne
pour accéder à leurs cibles.438 Cependant, dans le cas des bactéries à Gram-négatif, la faible
perméabilité de la paroi bactérienne extérieure empêche l'obtention d’un effet antibiotique
suffisant à faibles doses.86,440

En vue d’évaluer l’effet des deux meilleurs Hanamines HD3 et HD13 sur la membrane
bactérienne externe, nous avons réalisé le test de perméabilisation bactérienne vis-à-vis de
Pseudomonas aeruginosa PA01 (bactérie type qui secrète les béta-lactamases nécessaire au
test) basé sur l’hydrolyse de la nitrocéfine et dont le principe a été déjà expliqué précédemment
(Voir CHAPITRE 2). La Figure 65 regroupe les résultats de la cinétique d’hydrolyse de la
nitrocéfine en présence des composé HD3 et HD13.

2.0 a
a
PMB
2.0
b
b PMB
PMBn PMBn
(a.u.)

(a.u.)

1.5 1.5
HD3 (256 µM) HD13 (256 µM)
490nm

490nm

1.0 HD3 (128 µM) HD13 (128 µM)

1.0
HD3 (64 µM) HD13 (64 µM)
Abs

Abs

0.5 HD3 (32 µM) 0.5 HD13 (32 µM)

0.0 0.0
0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60
Temps (min) Temps (min)

Figure 65. Cinétique d’hydrolyse de la nitrocéfine en présence du HD3 (a) et HD13 (b)

152
 Chapitre 6

Comme le montre la Figure 65-a, l’utilisation du composé HD3 à différentes concentrations

s’accompagne d’une augmentation progressive de la mesure de l’absorbance à 490 nm ce qui
traduit l’effet perméabilisant exercé par le composé HD3 sur la membrane externe de PA01. La
perméabilisation maximale (Figure 65-c) est obtenue avec une concentration en HD3 de 128
µM (concentration équivalente à la CMI vis-à-vis de PA01) De la même manière, le composé
HD13 (128µM) induit une augmentation d’absorbance à 490 nm reflétant son effet
perméabilisant de la membrane bactérienne externe.
Ainsi, les deux composés possèdent un effet sur la perméabilité membranaire. Toutefois, cet
effet est moins rapide dans le cas du composé HD3, l’absorbance maximale étant atteinte après
25 minutes (courbe en vert clair ; Figure 65-a) par rapport à 18 minutes avec le composé HD13
(courbe en vert clair; Figure 65-b).

IV.1.2. Perturbation de l’intégrité membranaire : étude de la libération d’ATP

Afin d’évaluer l’effet des deux composés HD3 et HD13 sur l’intégrité membranaire des
bactéries à Gram-négatif (PA01, K pneumoniae et E. coli) nous avons procédé au suivi de la
libération d’Adénosine Triphosphate (ATP), un nucléotide présent uniquement dans le
cytoplasme bactérien. Ainsi, le principe de la méthode utilisée est basé sur la quantification par
bioluminescence de l’ATP relargué dans le milieu extracellulaire par suite de l’addition d’un
couple de réactifs (luciférine/luciférase) responsable de la formation d’oxyluciférine
accompagnée de l’hydrolyse de l’ATP en AMP avec émission de photons quantifiable à 560
nm.166 L’émission de photons mesurée par bioluminescence reflète ainsi la perturbation de
l’intégrité de la membrane bactériennes induite par le composé testé (Figure 66).
Dans notre cas différentes concentrations (128-4 µM) ont été testées pour chacun des deux
composés (HD3 et HD13) vis-à-vis des trois souches bactériennes. La luminescence a été
mesurée après un temps de contact de 1 minute. Le pourcentage de libération d’ATP a été
calculé par rapport à celui obtenu en utilisant le cétyl de tétrabutylammonium (CTAB) pris
comme témoin positif permettant une libération totale de l’ATP.

153
 Chapitre 6

Figure 66. Principe de l’étude de l’effet d’un composé sur l’intégrité membranaire (libération
d’ATP intracellulaire) des bactéries à Gram-négatif, selon la thèse de Marine Blanchet 166

Ainsi, sur PA01 (Figure 67-a) on observe très nettement que l’ajout du composé HD3 entraine
une importante libération d’ATP même à de faibles concentrations, le maximum de libération
d’ATP étant induit pour la plus grande concentrations (128 µM). Cette libération d’ATP
témoigne ainsi d’un fort effet de lyse membranaire. En outre, on observe une libération d’ATP
dose-dépendante induite par le composé HD13. Cependant, l’effet du composé HD3 sur la
libération d’ATP dans le cas de PA01 est beaucoup plus important que celui exercé par le
composé HD13.

A l’inverse, sur K. pneumoniae (Figure 67-b) et E. coli, le composé HD13 induit une libération
d’ATP plus importante que celle observée en présence du composé HD3. On constate donc
que de faibles modifications structurales entre les composés HD3 et HD13 conduisent à des
comportements différents au niveau de leurs interactions avec les membranes bactériennes.

154
 Chapitre 6

210000 aa

175000 HD3

Efflux d'ATP (RFU)

HD13
140000

105000

70000

35000

0
128 64 32 16 8 4 CTAB 0.1%
Concentration (µM)
b cc
210000 b 210000

175000 HD3 175000 HD3

Efflux d'ATP (RFU)

Efflux d'ATP (RFU)

HD13 HD13
140000 140000

105000 105000

70000 70000

35000 35000

0 0
128 64 32 16 8 4 CTAB 0.1% 128 64 32 16 8 4 CTAB 0.1%
Concentration (µM) Concentration (µM)

Figure 67. Mesure de la libération d’ATP en présence des composés HD3 et HD13 chez
PA01(a), K. pneumoniae ATCC51296 (b) et E. coli ATCC25922 (c)

IV.1.3. Dépolarisation membranaire : mesure de la libération du DiSC3(5)

Afin d’évaluer l’impact des Hanamines HD3 et HD13 sur la membrane cytoplasmique des
bactéries à Gram-négatif utilisées précédemment, nous avons procédé à l’étude de la
dépolarisation de leurs membranes internes en présence de ces deux composés. Le principe de
la méthode consiste en la mesure de la fluorescence d’une sonde carbocyanine hydrophobe
(l’iodure de 3,3'-dipropylthiadicarbocyanine (DiSC3(5)) caractérisée par sa capacité à
s’accumuler dans les membranes hyperpolarisées. En milieu extracellulaire, cette sonde est
fluorescente, cependant son accumulation dans les membranes hyperpolarisées provoque un
phénomène d’auto-atténuation du signal de fluorescence (quenching de fluorescence) Figure
68-1. 166,441

L’ajout d’un composé capable d’induire une dépolarisation de la membrane bactérienne, permet
d’établir un équilibre des charges de part et d’autre de la membrane, le gradient de proton est
ainsi rompu, ce qui conduit au relargage du DiSC3(5) qui n’a plus d’affinité pour la membrane
dépolarisée (Figure 68-2). Ainsi, le suivi de la variation de la fluorescence (RFU, Relative
Fluorescence Unit; excitation à 622 nm, émission à 690 nm) en fonction du temps permet
d’évaluer l’état de l’environnement du DiSC3(5) et d’étudier l’impact des composés sur la
155
 Chapitre 6

membrane bactérienne (Figure 68-3).166,441 Plus précisément, une augmentation de la

fluorescence mesurée après l’addition d’un composé traduit son action dépolarisante tandis
qu’un faible signal de fluorescence mesuré implique l’absence de dépolarisation.

mesure de la
1. 2. Composé à 3. fluorescence
DiSC3(5) +
+ tester

milieu
extracellulaire

périplasme porine
+ +
+ + + + + H +- +- + H

cytoplasme - - - - - + - +- +- +
H H

Figure 68. Principe du test de dépolarisation membranaire (libération du DiSC3(5)) réalisé sur
une bactérie à Gram-négatif, issu de la thèse de Marine. Blanchet 166

Les résultats du test de dépolarisation membranaire montrent que les deux composés (HD3 et
HD13) exercent un effet de dépolarisation sur les membranes bactériennes des trois bactéries testées
même lorsqu’ils sont utilisés à de faibles concentrations ( Figure 69). On observe qu’à forte
concentration (128, 64 et 32 µM), la dépolarisation induite par le composé HD13 sur les 3 souches
testées est plus importante que celle induite par le composé HD3. Cependant, parmi les trois
bactéries utilisées, la bactérie K. pneumoniae est plus sensible à la dépolarisation.

A faible concentration le composé HD3 exerce un effet perturbateur du potentiel transmembranaire

sur PA01 plus important que celui induit par le composé HD13 (Figure 69-a). En outre, chez K.
pneumoniae les deux composés ont démontré une similarité en terme d’action (Figure 69-b).
Cependant, le composé HD13 est plus actif que le composé HD3 vis-à-vis d’E. coli (Figure 69-c).
Ces résultats attestent du fait que ces deux composés HD3 et HD13 perturbent fortement l’intégrité
membranaire (effet de lyse et/ou déstabilisation membranaire à l’origine d’une perturbation du
potentiel transmembranaire) et ceci même à de faibles concentrations correspondant aux
concentrations auxquelles ces deux composés agissent en tant qu’adjuvants à la doxycycline et
l’érythromycine. On peut donc supposer que ces deux composés facilitent l’entrée de ces
antibiotiques à travers les membranes des bactéries à Gram-négatif leur permettant d’exercer leur
action à l’intérieur de la cellule bactérienne.

156
 Chapitre 6

100
a HD3
Membrane depolarization (%)

80 70
HD13
60 62 57 59
60
47
42 37 42 100

Membrane depolarization (%)

34 HD3
40 33 32 c
80 70
HD13
20 66
60 46
0 36 47
128 64 32 16 8 4 32 28 29 32
40 27 31 29
Concentration (µM)
100
Membrane depolarization (%)

HD3 20
b
78 HD13
80 73
65 0
56 128 64 32 16 8 4
60
47 43 Concentration (µM)
38 35
40 32 31
31 30

20

0
128 64 32 16 8 4
Concentration (µM)

Figure 69. Mesure de la fluorescence du DiSC3(5) chez PA01(a), K. pneumoniae

ATCC51296 (b) et E. coli ATCC25922 (c) en présence des composés HD3 et HD13

IV.2. Action des composés HD3 et HD13 sur la performance des pompes
d’efflux d’E. aerogenes EA289

Afin d’évaluer la capacité des deux composés HD3 et HD13 à inhiber les pompes d’efflux nous
avons procédé à la mesure de la fluorescence en temps réel d’une sonde connue comme étant
substrat des pompes AcrAB-TolC de la bactérie EA289 à savoir le 1,2'-dinaphthylamine (1,2'-
diNA).
La souche bactérienne EA289 est un isolat clinique multirésistant d’E. aerogenes 442,443

caractérisé par la surexpression des pompes d’efflux de type AcrAB-TolC appartenant à la

superfamille de transporteurs RND (Resistance Nodulation Division). Ce système d’efflux est
composé d’un assemblage protéique tripartite et utilise un gradient électrochimique de protons
(force proton-motrice) comme source d’énergie pour assurer l’expulsion active des substrats
indésirables vers l’espace extracellulaire (tels que les antibiotiques).166,444

157
 Chapitre 6

Dans ce contexte, le suivi du relargage extracellulaire d’un substrat des pompes d’efflux
AcrAB-TolC permet d’étudier le fonctionnement de ces pompes et ainsi l’évaluation de la
capacité des molécules à les inhiber.166
Dans un premier temps, les bactéries sont incubées avec la sonde lipophile (le 1,2'-diNA)
fluorescente en milieu membranaire en présence de carbonylcyanure m-chlorophénylhydrazone
(CCCP) (Figure 70).445,446 Ce dernier est un ionophore capable de désactiver la force proton-
motrice nécessaire au fonctionnement des pompes d’efflux par le transport des protons de part
et d’autre de la membrane cytoplasmique. Les composés à tester sont alors ajoutés à différentes
concentrations suivis par l’addition du glucose (source d’énergie) en vue de réactiver les
pompes d’efflux désactivées par l’action du CCCP (Figure 70).445,446 166
La variation de la
fluorescence du 1,2'-diNA est mesurée en fonction du temps (RFU, Relative Fluorescence Unit
; excitation à 370 nm, émission à 420 nm) afin d’évaluer l’inhibition de son efflux par HD3 et
HD13. La RFU mesurée a été normalisée afin d’exprimer un pourcentage d’inhibition de
l’efflux (% RFU). La réalisation du test sans l’ajout du composé d’intérêt (glucose seul) atteste
de l’activité des pompes d’efflux.
Les résultats de l’efflux en temps réel du 1,2'-diNA en présence du composé HD3 et HD13 sont
représentés sur la Figure 71.

Figure 70. Principe du test d’efflux en temps réel par l’évaluation de l’efflux du 1,2'-diNA
déclenché par le glucose, selon la thèse de Marine Blanchet166

158
 Chapitre 6

a b
120
addition de glucose
a 120
addition de glucose
b
Inhibition d'efflux (% RFU)

Inhibition d'efflux (% RFU)

Glucose seul Glucose seul
100 HD3 (256 µm) 100 HD13 (256 µm)
80 HD3 (128 µM) 80 HD13 (128 µM)
60 HD3 (64 µm) 60 HD13 (64 µm)
HD3 (32 µm) HD13 (32 µm)
40 40
HD3 (16 µm) HD13 (16 µm)
20 20

0 0
0 400 800 1200 1600 2000 0 400 800 1200 1600 2000
Temps (s) Temps (s)

Figure 71. Mesure de la capacité des composés HD3 (a) et HD13 (b) à inhiber l’efflux chez
EA289

Comme le montre la Figure 71, l’addition du glucose seul (contrôle négatif) induit le transport
actif de plus de 55% du 1,2’-diNA, ce qui traduit le bon fonctionnement des pompes d’efflux
et l’absence de toute inhibition de l’efflux. Cependant, en présence des composés HD3 ou
HD13 (Figure 71 -b) à forte concentration (256 et 128 µM) on observe une inhibition totale de
l’efflux du 1,2’-diNA. Cette inhibition diminue progressivement avec la dose, le plus faible
pourcentage d’inhibition (80 %) est observé avec la plus faible concentration testée (16 µM).

Ces résultats suggèrent donc que les Hanamines HD3 et HD13 exercent un effet d’inhibition
sur le fonctionnement des pompes d’efflux AcrAB-TolC. Cependant, d’après les résultats des
tests précédents qui montrent l’impact des deux composés sur l’intégrité de la membrane
bactérienne et leur capacité à déstabiliser le potentiel transmembranaire des bactéries à Gram-
négatif, cette inhibition de l’efflux peut être également une conséquence de la désactivation de
la force protomotrice (gradient de proton) qui constitue la source d’énergie des pompes d’efflux
AcrAB-TolC.

L’ensemble des résultats obtenus nous ont permis d’imaginer le mécanisme d’action des deux
meilleurs Hanamines HD3 et HD13, la Figure 72 résume leurs différents sites d’action et le
principe de leur activité potentialisatrice des antibiotiques.

159
 Chapitre 6

Sans HD Avec HD
Perméabilisation membranaire

HD
ATB

Entrée de l’antibiotique
Perméabilité limitée
Dépolarisation
Pompe d’efflux membranaire

Action de
l’ATB

Inhibition de l’efflux
Membrane polarisée

La perméabilité limitée (1) de la membrane des bactéries à Gram-négatif ainsi que l’expression des pompes d’efflux (2)
empêche l’entrée et l’accumulation de certains antibiotiques (ATB). Le composé HD (HD3/HD13) perméabilise la membrane
externe (4), perturbe l’intégrité des membranes bactériennes (5) et induit sa dépolarisation (6). En outre, il inhibe le
fonctionnement des pompes d’efflux (7). Ceci facilite l’entrée des antibiotiques à cible intracellulaire
(Doxycycline/Erythromycine), empêche leur expulsion et ainsi potentialise leurs actions.

Figure 72. Mécanisme d’action des deux meilleurs Hanamines (HD3 et HD13)

Il convient de préciser que l’activité du nouveau dérivé HD3 en tant qu’adjuvant à la

doxycycline est proche à celle exercée par le composé NV716, puisqu’une concentration de 3,2
µg/mL du HD3 ou de 1,6 µg/mL du NV716 permet de rétablir l’efficacité de la doxycycline
(CMI= 2µg/mL). En outre, l’utilisation du composé NV716 à 10 µg/mL ou du composé HD3
à 5 µg/mL permet d’abaisser la CMI de la doxycycline à 0,5 µg/mL et à 0,25 µg/mL
respectivement vis-à-vis de PA01.

L’amélioration a été observée dans l’absence d’activité antibactérienne propre du composé

HD3 vis-à-vis de PA01 (avec une CMI de 100 µM par rapport à 25 µM retrouvée pour le
NV716) recommandée pour les adjuvants aux antibiotiques parce qu’elle évite le
développement des mécanismes de résistance bactérienne contre ces composés.130

160
 Chapitre 6

V. Conclusion

Dans ce chapitre, nous avons décrit le procédé de synthèse d’une série de dérivés d’acides gras
polyaminés de façon simple et avec de bons rendements chimiques.
L’étude de leurs activités antibactérienne in vitro vis-à-vis de trois souches bactériennes à
Gram-négatif (PA01, K pneumoniae et E. coli) a permis de confirmer qu’ils sont dépourvus
d’activité antibactérienne propre. Cependant, leur utilisation en combinaison avec la
doxycycline et l’érythromycine nous a permis d’identifier les deux meilleurs dérivés : le
composé HD3 qui potentialise l’action de la doxycycline vis-à-vis de PA01 et le composé
HD13 permettant la restauration de l’efficacité de l’érythromycine vis-à-vis de K pneumoniae
et E. coli. La détermination de l’indice FIC de leurs différentes combinaisons a permis de
confirmer la nature synergique de leurs interactions.
Par ailleurs, l’étude mécanistique réalisée pour deux des composés (HD3 et HD13) a permis de
démontrer leur capacité à agir sur l’intégrité des membranes bactériennes. Ils induisent ainsi la
perméabilisation de la membrane externe et la dépolarisation de la membrane cytoplasmique chez
les bactéries à Gram-négatif avec une capacité à déstabiliser le potentiel transmembranaire qui s’est
traduit par la libération de l’ATP intracellulaire. De plus, nous avons également pu mettre en
évidence leur effet perturbateur sur le bon fonctionnement des pompes d’efflux de type AcrAB-
TolC chez EA289.
Cependant, d’autres études d’optimisation et d’évaluation de leur toxicité restent à réaliser en vue
d’aboutir au design du meilleur adjuvant possible utilisable à une concentration optimale
équivalente ou inférieure à celle de l’antibiotique qui lui sera associé.

161
 CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES

En vue de contribuer à la lutte contre la résistance bactérienne aux antibiotiques, l’objectif

principal de ce travail de thèse était le développement et la caractérisation aérodynamique in
vitro d’une forme pour inhalation à base d’une combinaison innovante Antibiotique/Adjuvant
permettant l’éradication des souches pulmonaires résistantes de P. aeruginosa. Afin
d’accomplir cet objectif nous avons commencé notre étude par la synthèse d’une série de
dérivés polyaminoisoprényle, qui par la suite ont été évalués pour leurs potentiels antibactériens
seuls et en combinaison avec la doxycycline vis-à-vis de P. aeruginosa PA01. Ces dérivés ont
été obtenus en seulement une étape de synthèse avec des rendements modérés à bons en suivant
une stratégie chimique originale mise au point dans notre laboratoire. Les résultats de leurs
activités antibactériennes présentés dans le CHAPITRE 2 ont démontré l’efficacité de certains
composés (dérivés du groupe farnésyle) dans la restauration de l’efficacité des antibiotiques
tétracyclines vis-à-vis de P. aeruginosa. En outre, leur diversité structurale a permis de mettre
en évidence les éléments structuraux indispensables pour leur activité restauratrice de la
sensibilité des souches résistantes. Parmi tous les dérivés testés le dérivé NV716 a donné les
meilleurs résultats en tant qu’adjuvant de la doxycycline permettant de réduire sa CMI vis-à-
vis de PA01 à son seuil de sensibilité (2 µg/mL) lorsqu’il est utilisé à une faible concentration
de 1.56 µg/mL. Son mode d’action a été démontré comme étant lié à une perturbation de
l’intégrité de la membrane bactérienne externe de manière dose-dépendante induisant sa
perméabilisation ce qui facilite l’entrée des antibiotiques à cible intracellulaire et ainsi la
potentialisation de leurs activités.
Cette première partie a été suivie par l’évaluation de l’efficacité de cette combinaison
(doxycycline/NV716) vis-à-vis d’un large panel de souches cliniques de P. aeruginosa. Les
résultats obtenus ont démontré la diminution de la CMI de la doxycycline vis-à-vis de plus de
96% des souches bactériennes de P. aeruginosa considérées à un niveau inférieur ou égal au
seuil de sensibilité (2µg/mL). Ainsi, l’ensemble de ces résultats a permis d’établir la preuve de
concept in vitro du potentiel du composé NV716 dans la potentialisation de l’action
antibactérienne de la doxycycline et l’efficacité de cette combinaison dans l’inhibition de la
croissance des souches résistantes de P. aeruginosa.

Ainsi, nous avons envisagé l’évaluation de cette combinaison dans une solution pour inhalation
dédiée à la prise en charge des infections respiratoires causées par P. aeruginosa. D’après les

162
 Conclusion générale et perspectives

résultats de la caractérisation aérodynamique in vitro des solutions aqueuses de la doxycycline

et du composé NV716 seuls et en combinaison selon les recommandations de la Pharmacopée
Européenne, nous pouvons conclure que le Diamètre Aérodynamique Massique Médian des
gouttelettes de l’aérosol de la combinaison doxycycline/NV716 compris entre 3,4 et 4,4 µm est
adapté à l’administration pulmonaire et conforme aux normes recommandées pour les aérosols
thérapeutiques (diamètre inférieur à 5µm). En outre, la nébulisation simultanée des deux
composés a démontré une Fraction de Particules Fines (FPF) élevée (53 – 60 %) ce qui veut
dire plus de 50 % des gouttelettes de l’aérosol doxycycline/NV716 présentent un intérêt
thérapeutique, peuvent atteindre le site de l’infection et ainsi garantir le maintien des
concentrations des deux composés dans leur site d’action à un niveau supérieur à leurs CMIs.
De plus, l’évaluation aérodynamique de cette combinaison à différentes concentrations en
principes actifs (doxycycline et NV716) ou durée de nébulisation a permis de confirmer que
ces paramètres n’influencent pas les propriétés aérodynamiques de l'aérosol de la combinaison
et qu’ils sont reproductibles dans le temps. Ceci permet ainsi l’adaptation de la posologie et
évite un dépôt insuffisant des gouttelettes au niveau du site d'action souhaité même si le patient
ne respecte pas de façon précise la durée de nébulisation requise. Parmi les trois nébuliseurs
étudiés, le nébuliseur à jet PARI Sprint® semble préférable pour la délivrance de notre
combinaison puisqu’il permet une distribution homogène des deux composés, sur les différents
étages de l'impacteur NGI, nécessaire à la restauration de l'activité de la doxycycline par le
NV716 et donc l'efficacité de la combinaison vis-à-vis de P aeruginosa. En outre, il assure une
nébulisation rapide avec un débit de 0,6 mL/min permettant au patient de réduire la durée de sa
séance de nébulisation et favorisant son adhésion thérapeutique.

Afin d'exploiter les avantages de la poudre sèche pour inhalation et d’évaluer l'adaptabilité de
cette même combinaison (doxycycline/NV716) à l'administration pulmonaire sous forme d’une
poudre, une étude supplémentaire a ensuite été réalisée en utilisant la méthode des plans
d’expériences. Il s’agissait de faire varier différents facteurs en vue d’étudier leur probable
influence sur l’efficacité de délivrance de notre combinaison et de trouver la formule optimale
permettant un dépôt optimal des deux composés (doxycycline et NV716) au niveau du site
d’infection ciblé. Les résultats obtenus discutés dans le CHAPITRE 5 permettent de surligner
l’influence des différents facteurs étudiés. Ainsi, la formulation optimale a été définie en
combinant les meilleurs facteurs permettant l’obtention des meilleurs propriétés
aérodynamiques (le plus faible MMAD et la plus élevée FPF) de la poudre combinée pour
l’inhalation et ceci sans même avoir recours à des techniques sophistiquées d'ingénierie des

163
 Conclusion générale et perspectives

particules ou utiliser plusieurs excipients (tels que les agents améliorant la fluidité) qui peuvent
affecter négativement les voies respiratoires déjà affaiblies par une infection à P. aeruginosa.

Finalement, en vue d’améliorer les activités biologiques du dérivé polyaminoisoprényle

NV716, nous avons décrit dans le CHAPITRE 6 la synthèse d’une nouvelle série de dérivés
polyaminés, les Hanamines (HD) par couplage peptidique entre différents acides gras et de
nombreuses polyamines. Ses dérivés ont été démontrés dépourvus d’activités antibactériennes
in vitro vis-à-vis de trois souches bactériennes à Gram-négatif (PA01, K pneumoniae et E. coli).
Cependant, leur utilisation en association avec la doxycycline ou l’érythromycine a permis
d’identifier les deux meilleurs dérivés agissant en tant qu’adjuvants, les composés HD3 et
HD13. Ces deux composés ont démontré une capacité à agir sur l’intégrité des membranes
bactériennes des bactéries à Gram-négatif. Ils perméabilisent ainsi la membrane externe,
dépolarisent la membrane interne et déstabilisent le potentiel transmembranaire chez les
bactéries à Gram-négatif. En outre ils exercent un effet inhibiteur sur les pompes d’efflux de
type AcrAB-TolC chez EA289.

L’ensemble des résultats des différentes études réalisées dans ce travail de thèse démontre que
la combinaison doxycycline/NV716 pourrait apparaitre comme un traitement potentiel
prometteur pour la prise en charge des infections pulmonaires à P. aeruginosa. Il convient de
mentionner que l'originalité de ce travail provient de l'administration simultanée par inhalation
de deux principes actifs qui agissent en synergie, ce qui signifie que la présence des deux
composés en quantité suffisante et à des proportions précises sur le même site est essentielle
pour obtenir l'effet pharmacologique attendu, ce qui complique son développement. En outre,
l’adjuvant NV716 a été préparé sous forme de sel hydrosoluble facile à solubiliser pour
l'aérosolisation, sa combinaison avec la doxycycline ainsi que leur administration par inhalation
permet d’espérer la réduction des doses administrées et ainsi la diminution des effets
indésirables systémiques.

Ces premiers résultats sont suffisamment encourageants pour espérer de nouveaux travaux dans
la continuité de ce sujet original et innovant. Ainsi, de nombreuses perspectives de recherche
in vitro/in vivo peuvent être proposées à la suite de ce travail :

- L’évaluation de l’activité antibactérienne de la combinaison doxycycline/NV716 in-

vitro vis-à-vis des souches de P. aeruginosa dans un biofilm.

164
 Conclusion générale et perspectives

- Des études complémentaires doivent être menées pour une meilleure évaluation in vivo
de cette formulation sur un modèle animal avant d’envisager une application potentielle
clinique. On peut citer :
• Des études pharmacocinétiques chez des rats sains afin de déterminer la dose
optimale à administrer qui assure des concentrations efficaces pour l’activité
antibactérienne tout en restant loin de la zone de toxicité et des effets
indésirables résultant de l’exposition systémique.
• Des études pharmacocinétiques chez des rats infectés sont nécessaires pour
évaluer l'efficacité de la combinaison doxycycline/NV716 dans des
conditions pathologiques.

En outre, d’après ce travail de thèse nous avons pu surligner et démontrer l’utilité et

l’importance des adjuvants aux antibiotiques en tant que stratégie prometteuse pour la
préservation de l’arsenal des antibiotiques existants et pour faire face au problème de la
résistance bactérienne. En ce qui concerne la série des nouveaux dérivé polyaminés « les
Hanamines », les résultats obtenus illustrent leur intérêt thérapeutique pour un usage en tant
qu’adjuvants d’antibiotiques vis-à-vis des bactéries à Gram-négatif. Cependant, d’autres études
d’optimisation, d’évaluation de leur toxicité et d’exploration de leur potentiel antibactérien vis-
à-vis des bactéries à Gram-positif ou de leur activité potentialisatrice d’autres antibiotiques
doivent être menées en vue d’aboutir au design du meilleur adjuvant possible utilisable à une
concentration optimale équivalente ou inférieure à celle de l’antibiotique qui lui sera associé.

165
Matériels et méthodes

166
 Matériels et méthodes : Chimie

A. Chimie
I. Matériels

I.1. Réactifs:

Tous les solvants ont été purifiés selon les procédures standards, et les réactifs utilisés étaient
disponibles dans le commerce. Le méthanol, l'acétate d'éthyle et le dichlorométhane ont été
achetés auprès de VWR et utilisés sans autre forme de purification. La chromatographie sur
colonne a été réalisée sur du gel de silice SDS (70-230 mesh). Les spectres RMN 1H et RMN
13
C ont été enregistrés en CD3oD sur un spectromètre Bruker AC 300 fonctionnant à 300 et 75
MHz, respectivement (les abréviations habituelles sont utilisées : s : singulet, d : doublet, t :
triplet, q : quadruplet, m : multiplet). Le tétraméthylsilane a été utilisé comme étalon interne.
Tous les déplacements chimiques sont donnés en ppm. L'analyse par spectroscopie de masse a
été effectuée par le Spectropole (Laboratoire d'analyse, Université d'Aix-Marseille). La pureté
des composés a été vérifiée par HPLC analytique (colonne C18, éluant CH3CN-eau-TFA
(90:10:0,025, v/v/v), 0,5-1 mL/min) avec un détecteur PDA couvrant de 210 à 310 nm. Tous
les composés présentaient une pureté supérieure à 95%, déterminée par HPLC-PDA à 214 et
254 nm.

II. Méthodes

II.1. Synthèse des dérivés polyaminoisoprényles 58-64

Pour la synthèse du dérivé NV716 (composé 58) on a procédé comme suit : à une solution de
spermine (450 mg, 2,27 mmol) et de triéthylamine (450 µL, 4,5 mmol) dans du THF distillé
(10 ml) est ajouté goutte à goutte du chlorure de farnésyle 1 (480 mg, 2 mmol) dans du THF
distillé (15 ml).

ou
ou Solvant,

167
 Matériels et méthodes : Chimie

Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 24 h, puis concentré sous vide.
Le résidu brut est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant
CH2Cl2/MeOH/NH4OH, 7:3:1) pour obtenir le composé pur souhaité sous la forme d’un solide
jaune avec un rendement de 64 %.

Composé 58 (NV716): solide jaune; Rdt : 64%; 1H NMR (MeOD, 250 MHz):  = 5.05-4.93
(m, 3H), 2.93-2.57 (m, 14H), 2.19-1.92 (m, 10H), 1.63-1.87 (m, 23H). 13C (MeOD):  = 142.24,
134.83, 131.09, 124.86, 124.17, 117.32, 47.90, 47.69, 47.64, 46.61, 44.01, 40.60, 39.83, 33.97,
31.20, 26.97, 26.30, 25.66, 25.11, 24.90, 17.62, 16.90, 15.93. C25H50N4 MS (ESI+) m/z 407.41
(100%, [M + H]+).
Composé 59 : huile jaune; Rdt: 41%; 1H NMR (MeOD, 250 MHz):  = 5.33-5.38 (m, 1H),
5.15-5.21 (m, 2H), 3.22-3.24 (m, 2H), 2.63-2.72 (m, 2H), 2.49-2.59 (m, 10H), 1.59-1.92 (m, 31
H) . 13
C (MeOD):  = 141.16, 135.71, 132.01, 124.30, 123.51, 120.56, 47.41, 46.32, 45.32,
39.71, 39.41, 33.25, 31.92, 27.35, 26.74, 24.12, 22.10, 18.68, 16.03. C24H48N4 MS (ESI+) m/z
393.39 (100%, [M + H]+).
Composé 60 : huile jaune ; Rdt : 61%; 1H NMR (MeOD, 250 MHz):  = 5.34-5.38 (m, 1H),
5.16-5.21 (m, 2H), 3.32 (s, 1H), 3.22-3.26 (m, 2H), 2.63-2.69 (m, 2H), 2.49-2.55 (m, 6H), 2.02-
2.06 (m, 8H), 1.59-2.00 (m, 19H) . 13C (MeOD):  = 141.66, 135.71, 132.11, 124.30, 123.51,
120.51, 47.41, 46.31, 46.02, 45.21, 39.69, 39.41, 33.19, 31.89, 26.74, 24.62, 22.00, 18.78,
16.43. C21H41N3 MS (ESI+) m/z 336.33 (100%, [M + H]+).
Composé 61: huile jaune; Rdt: 42% ; 1H NMR (MeOD, 250 MHz):  = 5.34-5.38 (m, 1H),
5.16-5.20 (m, 2H), 3.34 (s, 1H), 3.22-3.26 (m, 2H), 2.39-2.50 (m, 12H), 2.02-2.04 (m, 8H),
1.52-1.79 (m, 16H) . 13C (MeOD):  = 141.56, 136.01, 132.01, 124.32, 123.50, 120.41, 59.91,

168
 Matériels et méthodes : Chimie

58.02, 47.21, 45.31, 39.69, 38.82, 33.42, 26.64, 24.52, 21.95, 18.78, 16.41. C21H42N4 MS
(ESI+) m/z 351.34 (100%, [M + H]+).
Composé 62: huile jaune; Rdt: 38%; 1H NMR (MeOD, 250 MHz):  = 5.34-5.38 (m, 1H), 5.17-
5.22 (m, 1H), 3.29 (s, 1H), 3.22-3.24 (m, 2H), 2.60-2.67 (m, 2H), 2.53-2.55 (m, 10H), 2.01-
2.04 (m, 4H), 1.49-1.79 (m, 19H) . 13C (MeOD):  = 141.68, 132.00, 123.32, 120.11, 47.41,
46.32, 45.39, 45.32, 39.46, 31.92, 27.33, 26.44, 24.42, 18.63, 16.09. C19H40N4 MS (ESI+) m/z
325.33 (100%, [M + H]+).
Composé 63: huile jaune; Rdt: 54%; 1H NMR (MeOD, 250 MHz):  = 5.33-5.38 (m, 1H),
5.16-5.22 (m, 1H), 3.32 (s, 1H), 3.22-3.26 (m, 2H), 2.60-2.68 (m, 2H), 2.50-2.55 (m, 6H), 2.02-
2.04 (m, 4H), 1.52-1.79 (m, 16H) . 13C (MeOD):  = 141.58, 132.01, 123.52, 120.51, 47.41,
46.31, 46.01, 45.32, 39.43, 31.92, 26.44, 24.32, 18.78, 16.11. C16H33N3 MS (ESI+) m/z 268.27
(100%, [M + H]+).
Composé 64: huile jaune; Rdt: 46%; 1H NMR (MeOD, 250 MHz):  = 5.33-5.38 (m, 1H), 5.17-
5.22 (m, 1H), 3.32 (s, 1H), 3.22-3.23 (m, 2H), 2.39-2.60 (m, 12H), 1.98-2.01 (m, 4H), 1.52-
1.79 (m, 13H) . 13C (MeOD):  = 141.62, 132.00, 123.54, 120.51, 59.95, 56.03, 47.21, 45.19,
45.32, 39.45, 38.82, 26.44, 24.62, 18.63, 16.19. C16H34N4 MS (ESI+) m/z 283.28 (100%, [M +
H]+).

II.2. Synthèse des Hanamines

II.2.1. Synthèse du dérivé HD1

Dans un ballon, on place 282 mg d’acide oléique (1 mmole) dans 15 mL de CH2Cl2 et on ajoute
202 mg de spermine (1 mmole), 129 mg de diisopropylethylamine (1 mmole) et 442 mg de
BOP (1 mmole). On laisse sous agitation 12h à température ambiante. On concentre sous vide
et on purifie par chromatographie sur gel de silice en utilisant un éluant de type méthanol puis
un mélange de CH2Cl2/méthanol/ NH4OH (7/3/1). Le produit est obtenu sous la forme d’une
huile jaune visqueuse avec un rendement de 47%.

169
 Matériels et méthodes : Chimie

HD1 : huile jaune visqueuse (mélange d’isomères): 1H NMR (250MHz) : 0.83 (t, J = 2.5 Hz,
3H), 1.10-1.62 (m, 22H), 1.69-2.15 (m, 17H), 2.67-2.96 (m, 10H), 3.12-3.29 (m, 3H), 5.27 (m,
13
2H), 7.53 (m, 1H) , C NMR (62.5 MHz) : 183.14, 130.81, 128.87, 125.38, 125.27, 49.61,
46.40, 37.04, 33.11, 30.88, 30.65, 30.39, 30.28, 28.18, 27.04, 23.78, 14.52. C28H58N4O MS
(ESI+) m/z 467.463 (100%, [M + H]+).

II.2.2. Synthèse du dérivé HD2

Mode opératoire identique en utilisant l’acide linoléique. Rdt : 53%

HD2 : huile jaune visqueuse 1H NMR (250MHz) : 0.97 (t, J = 2.5 Hz, 3H), 1.27-1.35 (m, 18H),
1.57-1.93 (m, 9H), 1.98-2.27 (m, 8H), 2.65-2.82 (m, 10H), 3.29 (t, J = 2.5 Hz, 3H), 3.45 (s,
13
2H), 4.82 (s, 1H), 5.37-5.48 (m, 4H), 7.53 (m, 1H) , C NMR (62.5 MHz) : 176.54,
130.95,130.85, 129.12, 129.03, 49.15, 47.12, 37.69, 37.10, 32.66, 30.74, 30.47, 30.37, 30.34,
30.27, 29.46, 28.17, 27.43, 27.07, 26.55, 23.64, 14.50. C29H58N4O MS (ESI+) m/z 479.465
(100%, [M + H]+).

170
 Matériels et méthodes : Chimie

II.2.3. Synthèse du dérivé HD3

Mode opératoire identique en utilisant l’acide docasahexanoique. Rdt : 61%

HD3 : huile jaune visqueuse 1H NMR (250MHz) : 0.72 (t, J = 2.5 Hz, 3H), 1.07-1.53 (m, 10H),
1.84-1.98 (m, 3H), 1.98-2.18 (m, 3H), 2.37-2.46 (m, 8H), 2.52-2.70 (m, 16H), 3.03 (m, 3H),
3.45 (s, 2H), 4.82 (s, 1H), 5.21-5.06 (m, 12H), 8.02 (m, 1H). 13C NMR (62.5 MHz) : 175.54,
132.88, 130.27, 129.54, 129.33, 129.28, 129.22, 129.18, 129.00, 128.26, 50.27, 47.61, 40.45,
38.05, 37.01, 31.68, 30.01, 28.03, 26.65, 26.60, 26.53, 24.82, 21.60, 14.82. C32H56N4O MS
(ESI+) m/z 513.455 (100%, [M + H]+).

II.2.4. Synthèse du dérivé HD4

Mode opératoire identique en utilisant l’acide eicosapentaenoique. Rdt : 22%

HD4 : huile jaune visqueuse 1H NMR (250MHz) : 083 (t, J = 2.5 Hz, 3H), 1.38-1.54 (m, 8H),
1.72-1.79 (m, 5H), 2.04-2.34 (m, 8H), 2.53-2.63 (m, 8H), 2.68 (t, J = 2.5 Hz, 2H), 2.79-2.82
(m, 8H), 3.43 (t, J = 2.5 Hz, 2H), 5.29-5.43 (m, 10H), 7.73 (s, 1H) , 13C NMR (62.5 MHz) :
172.61, 132.23, 128.64, 128.49, 127.71, 127.42, 49.71, 46.02, 39.40, 38.71, 36.61, 31.92, 29.23,
28.83, 25.32, 20.63, 14.32. C30H54N4O MS (ESI+) m/z 487.432 (100%, [M + H]+).

Les dérivés HD5 et HD17 ont tous été synthétisés suivant le mode opératoire mise en œuvre
dans la synthèse de HD3.

171
 Matériels et méthodes : Microbiologie

B. Microbiologie
I. Matériel

I.1. Souches bactériennes

La souche bactérienne ciblée dans cette étude est la souche de référence de Pseudomonas
aeruginosa PA01, deux autres mutants de P. aeruginosa déficients des pompes d'efflux : PA403
(mexAB, mexCD, mexEF, mexXY, mexJK) et PA01(OprM) (mexOprM) ainsi qu’un panel
de souches cliniques de P. aeruginosa (voir Données Supplémentaires Annexe 5) et d’autres
bactéries ont été utilisées : E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae ATCC 51296 et E. aerogenes
EA289. Les souches bactériennes ont été préalablement stockées dans du glycérol à 15% (v/v)
à -80 °C pour une cryoprotection. Une colonie de la culture fraîche de chaque souche a été
incubée dans un tube de culture contenant 3 mL de bouillon Mueller-Hinton (MH) à 37 °C
pendant une nuit sous agitation. Cette suspension a été utilisée pour la préparation de
l'inoculum.

I.2. Les antibiotiques

Un large panel d’antibiotiques de la famille des cyclines (doxycycline, minocycline,

chlortétracycline, tigécycline, déméclocycline, tétracycline et oxytétracycline) ainsi que
l’érythromycine, la polymyxine B et la polymyxine B nona peptide ont été utilisés. Ils ont été
achetés auprès de Sigma (St Quentin Fallavier, France). Ces antibiotiques ont été dissous dans
de l'eau distillée stérile ou du diméthylsulfoxyde (DMSO) pour obtenir la concentration
souhaitée.

I.3. Composés et réactifs :

Les composés chimiques synthétisés sous forme de chlorhydrate (NV716, les dérivés
polyaminoisoprényles, polyaminogéranyles et les Hanamines) ont été solubilisés dans de l’eau
distillée et des solutions stocks à 10 mM ont été préparées.
La phénylalanine arginine ꞵ-naphthylamide (PAꞵN) a été achetée auprès de Sigma, la
nitrocéfine a été achetée auprès de la société Thermo Fisher Scientific (Illkirch, France).
Le réactif luciférine/luciférase, la nitrocéfine, l’iodure de 3,3'-dipropylthiadicarbocyanine
(DiSC3(5)), le 1,2'-dinaphthylamine (1,2’-diNA) et le carbonylcyanure m-

172
 Matériels et méthodes : Microbiologie

chlorophénylhydrazone (CCCP) ont respectivement été achetés auprès de Yelen (France),

Oxoid, Sigma-Aldrich et TCI.

II. Méthodes

II.1. Evaluation de l’activité antibactérienne des antibiotiques et des différents

composés

L’activité antibactérienne des antibiotiques et des différents composés a été évalué par la
détermination de leurs CMIs vis-à-vis des souches décrites précédemment. La CMI est par
définition la plus faible concentration d’un composé nécessaire pour induire une inhibition
visible de la croissance bactérienne après un temps d’incubation de 24 h à 37 ° C.

Les CMIs des différents composés ont été déterminées par la méthode de microdilution en
plaque conformément aux recommandations du Comité de l’Antibiogramme de la Société
Française de Microbiologie (CA-SFM). A partir des solutions mères à une concentration de
départ de 6,4 mg/mL pour les antibiotiques et 10 mM pour les composés, des dilutions en
cascades ont été réalisées à partir de la 3ème ligne de la microplaque, la première étant réservé
au milieu de culture (le témoin négatif) et la deuxième sert de témoin positif contenant la
suspension bactérienne seule sans composés antibactériens. Les suspensions bactériennes ont
été ajustées au standard de 0,5 McFarland (environ 1,5 × 108 unités formant des colonies UFC/
ml). L’inoculum final est ajusté à 1,5 × 105 UFC/puits. La lecture des plaques se fait après 18
h d’incubation à l’étuve 37 °C par examen visuel pour déterminer leur turbidité. Les mesures
ont été répétées 3 fois.

II.2. Evaluation de la synergie entre les antibiotiques et les différents

composés

Dans ce test on a évalué les effets antibactériens des combinaisons de chaque antibiotique avec
chacun des différents composés. Cette évaluation a été faite de deux manières.

Dans une première approche, l'influence des adjuvants considérés à divers concentrations sur
la CMI de l’antibiotique a été évaluée. Une série de dilutions en cascade de l’antibiotique (de
128 μg/mL à 0,25μg/mL) a été réalisée à partir de la solution de départ (6,4 mg/mL). Dans
chaque colonne de la microplaque, la concentration de chaque adjuvant a été fixée à 2,5 ou 5

173
 Matériels et méthodes : Microbiologie

ou 10 μM / puits). Le facteur de gain a été défini comme le rapport de la CMI de l’antibiotique

seul, à sa CMI déterminée en présence du composé.

Dans un second temps, la concentration de la doxycycline a été fixée dans chaque puits à 2
mg/µL qui correspond au seuil de sensibilité selon le CLSI (même chose pour les autres
antibiotiques) et on a varié la concentration des différents composés pour évaluer l’effet
potentialisateur de chaque composé et de déterminer sa CMI en combinaison. La concentration
de départ de chacun des composés est de 10 mM. Des dilutions en série de chaque composé ont
été réalisées dans des microplaques à 96 puits stériles. L’antibiotique a été ajusté dans chaque
puits à 2 µg/mL. La suspension bactérienne de la souche considérée a été préparée à partir de
colonies ayant été cultivées pendant une nuit. La concentration bactérienne est ajustée à 1,5 ×
105 UFC / puits. La CMI de chaque combinaison a été déterminée après 18 h d'incubation à 37
°C à l’étuve. Le test a été répété trois fois.

II.3. Détermination de l’indice FIC

Une méthode de microdilution en échiquier ou « Checkerboard method » a été utilisée pour

déterminer les Concentrations Minimales Inhibitrices et les Concentrations Inhibitrices
Fractionnaires des composés (HD) et des antibiotiques (ATB) ainsi que l'indice FIC de leurs
combinaisons vis-vis des 3 souches bactériennes de PA01, E. coli ATCC 25922, K. pneumoniae
ATCC 51296. Des contrôles appropriés ont été inclus.

Des solutions mères de ces agents ont été préparées dans de l'eau distillée stérile à une
concentration de 10mM pour les Hanamines (HD3 et HD13) et de 12.8 mg/mL pour les
antibiotiques (doxycycline et érythromycine). Les essais ont été réalisés sur des microplaques
à 96 puits sur la base des valeurs CMIs obtenues précédemment. Ainsi, sur l'axe X de la
microplaque 11 concentrations ont été testées pour le premier composé (la doxycycline ou
érythromycine) : 256, 128, 64, 32, 16, 8, 4, 2, 1, 0.5 et 0.25 µg/mL et sur l’axe Y 7
concentrations du deuxième composé (le composé HD3 ou HD13) sont évaluées 40, 20, 10, 5,
2.5, 1.25, 0.62 µM. La colonne 12 étant réservé à la détermination de la CMI de l’antibiotique
seul et la ligne H est réservée à la détermination de la CMI de l’Hanamine seul. 92 µL de
suspension bactérienne standardisée à 0,5 McFarland ont été ajoutés dans chaque puits.

Après préparation, toutes les plaques ont été incubées pendant 24 heures à 37 °C. Ensuite, la
concentration la plus faible à laquelle aucune croissance visible ne s'est produite a été

174
 Matériels et méthodes : Microbiologie

enregistrée comme étant la valeur CMI des agents testés de façon individuelle ou combinée.
Ces CMIs sont utilisées pour déterminer la Concentration Inhibitrice Fractionnée qui permet le
calcul de l’indice FIC à l’aide de la formule suivante :

FIC = FICATB + FICHD où

[𝐴𝑇𝐵]𝑒𝑛 𝑝𝑟é𝑠𝑒𝑛𝑐𝑒 𝑑𝑒 𝐻𝐷 [𝐻𝐷]𝑒𝑛 𝑝𝑟é𝑠𝑒𝑛𝑐𝑒 𝑑′𝐴𝑇𝐵

FICATB = et FICHD =
CMI ATB CMI HD

L'indice FIC a été ensuite utilisé pour déterminer la nature de l’interaction (synergie,
antagonisme ou indifférence) entre les agents antibactériens et les composés testés.

II.4. Détermination de l’effet bactéricide/bactériostatique (time-kill study)

Les cinétiques de bactéricidie ont été réalisées avec des concentrations en doxycycline et en
NV716 correspondantes à leurs CMIs vis-à-vis des souches de référence P. aeruginosa PA01.
On ajoute la doxycycline et le composé NV716 à une suspension bactérienne contenant environ
5.105 UFC/mL de bactérie. 2 mL de la suspension bactérienne testée sont ensuite prélevés après
0, 1, 3 et 6 h et différentes dilutions de la suspension sont réalisées. Chaque inoculum bactérien
est utilisé pour ensemencer une gélose MHII et le comptage des colonies effectué après
incubation des géloses à 37 °C pendant 24h permet de calculer la concentration bactérienne en
UFC/mL (technique du dénombrement en milieu solide).

II.5. Test de perméabilité membranaire : test d’hydrolyse de la nitrocéfine

A partir d’une culture de nuit, une dilution de PA01 à 1/100 a été faite dans un bouillon de
MHII (100 µL de suspension bactérienne dans 10 mL de MHII), et mise sous agitation à 37 °C
jusqu’à atteindre la phase exponentielle de croissance (Densité Optique DO600nm ˃ 0,5).
Ensuite, l’imipénème est ajouté à la dilution précédente en raison de 10 mg/ mL pour induire
un taux plus élevé de β-lactamases. Après 2h, les cellules sont récupérées par centrifugation
(4000 tours à 20 °C pendant 20 min) et lavées deux fois avec le tampon phosphate de potassium
stérile 20 mM (pH= 7,2). Après le deuxième lavage, le culot est récupéré et la DO600nm est ajusté
à 0,5 avec le tampon sans forte agitation pour éviter l’éclatement des cellules.
Une série de dilutions de chaque composé a été réalisée (128 µM - 16 µM) dans une
microplaque. Trois puits témoins ont été utilisé : un témoin négatif contenant le tampon PPB,
deux témoins positifs : le premier contentant la PMB et le deuxième contenant la PMBn. 100

175
 Matériels et méthodes : Microbiologie

µL de la suspension bactérienne ajustée à une DO600nm de 0,5 ont été ajoutés dans tous les puits
remplis précédemment, puis 50 µL de nitrocéfine sont ajoutés pour une concentration finale de
50 µg/mL. La lecture de la plaque a été faite à 490 nm à l’aide d’un lecteur de microplaque
Infinite M200 (Tecan) équipé d’un spectrophotomètre pendant 1h avec un intervalle de 1
minute entre deux mesures.

II.6. Mesure de l’efflux d’ATP

La mesure de l’efflux d’ATP a été réalisée en vue d’évaluer l’effet des composés (HD3 et
HD13) sur l’intégrité membranaire des bactéries PA01, Kp ATCC 51296 et E. coli ATCC
25922. Une colonie de chacune des souches a été préalablement cultivée dans du milieu MH
toute la nuit à 37 °C. Une solution a été préparé contenant l’HEPES (5 mM) et le glucose (250
mM, pH 7.2) dans l’eau distillée stérile. Dans une microplaque 96 puits, 100 µL de cette
solution sont déposés dans chaque puits et des dilution successive au 1/2 d’une ligne à l’autre
ont été réalisé à partir de la solution du composé à tester (10 mM).
Dans une autre plaque (Corning 96 Flat white) 10 µL de chaque dilution du composé sont
transférés à partir de la première plaque et 90 µL de la suspension de la bactérie considérée
ajusté a une DO600nm= 0.1 dans du milieu HEPES glucose sont ajoutées dans chaque puits.
Après 1 min de contact, 50 μL de réactif luciférine/luciférase sont ajoutés dans chaque puits.
Après 1 min de contact une mesure de la bioluminescence est effectuée à 37 °C par un lecteur
de microplaque Infinite M200 (Tecan). Une solution de CTAB à 0.1% final dans un puits
contenant 10 μL de milieu et 90 μL de suspension bactérienne a été utilisée comme contrôle
positif (il induit l’efflux d’ATP).

II.7. Mesure de la libération du DiSC3(5)

En vue d’évaluer la dépolarisation membranaire induite par les composés (HD3 et HD13) chez
PA01, Kp ATCC 51296 et E. coli ATCC 25922, nous avons procédé à la mesure de la
fluorescence de l’iodure de 3,3'-diéthylthiacarbocyanine DiSC3(5). Une colonie de chaque
bactérie a été cultivée dans un bouillon MHII pendant 24 h à 37 °C. Les suspensions
bactériennes ainsi préparées sont centrifugées à 10000 tours/min à 20 °C pour récupérer les
bactérie (le surnageant est jeté) qui sont par la suite lavées deux fois avec une solution de
saccharose tamponnée (250 mM) contenant le sulfate de magnésium (25 mM) et l’HEPES (5
mM). Les bactéries sont remises en suspension et la DO600nm est ajustée à 0.1. Elles sont

176
 Matériels et méthodes : Microbiologie

incubées avec le colorant fluorescent DiSC3(5) (concentration finale de 3 μM) pendant 15 min
à 37 °C (pénétration du colorant dans les membranes bactériennes). Les bactéries sont ensuite
lavées pour éliminer le colorant non lié.
Dans une microplaque 96 puits, 90 µL de bactéries contenant le DiSC3(5) sont ajoutées dans
chaque puits, ensuite 10 µL de chaque concentration du composé à tester (dilutions au ½
réalisées dans une autre plaque) sont ajoutées. Le DiSC3 relargué est mesuré par fluorescence
(RFU, Relative Fluorescence Unit ; λex = 622 nm, λem = 690 nm) en utilisant un lecteur de
plaque Infinite M200Pro (Tecan). L’efficacité de dépolarisation est calculée en tenant compte
de la RFU maximale enregistrée correspondant à la fluorescence d’une solution de CTAB à
0.1% dans du tampon HEPES.

II.8. Mesure d’efflux en temps réel (ETR)

La capacité des composés (HD3 et HD13) à inhiber l’efflux chez E. aerogenes EA289 a été
évaluée en mesurant en temps réel la fluorescence d’une sonde connue comme étant substrat
des pompes AcrAB-TolC, le 1,2'-dinaphthylamine (1,2'-diNA).
Une colonie de la bactérie E. aerogenes EA289 est cultivé dans le milieu MH. Une fois la phase
stationnaire de croissance bactérienne est atteinte, les bactéries sont recueillies par
centrifugation, remises en suspension dans du PPB contenant du carbonylcyanure m-
chlorophénylhydrazone (CCCP, 5 μM) pour obtenir une DO600 nm de 0.2. Elles sont ensuite
incubées toute la nuit à 37°C avec le 1,2'-diNA (32 μM).
Avant l'addition des composés à tester à la concentration désirée, les cellules bactériennes sont
lavées avec du PPB pour éliminer l’excès du CCCP puis remise en suspension. 100 μL de cette
suspension sont ajoutés dans chaque puits d’une microplaque (Corning 96 Flat Bottom black)
avec 50 µL du composé à tester. Après 5 min, 10 µL du glucose (50 mM) est ajouté pour
énergétiser les bactéries et réactiver les pompes d’efflux désactivées par l’ajout du CCCP.
L’efflux du 1,2'-diNA incorporé dans la membrane est suivi par mesure de la fluorescence du
1,2'-diNA (RFU, Relative Fluorescence Unit ; λex = 370 nm ; λem = 420 nm) en utilisant un
lecteur Infinite M200Pro (Tecan).

177
 Matériels et méthodes : Pharmacie galénique

C. Pharmacie galénique
I. Matériels

I.1. Les dispositifs de nébulisation :

I.1.1. Les nébuliseurs :

Trois systèmes de nébulisation ont été utilisés pour la nébulisation des différentes solutions
dans l’ensemble des tests réalisés. Le nébuliseur pneumatique à jet d’air le Pari LC Plus® a été
sélectionné (approuvé par la FDA pour la nébulisation de plusieurs médicaments) pour la
caractérisation aérodynamique des différents aérosols et selon différentes conditions. Le Pari
LC Plus® est relié au compresseur PARI BOY® SX qui génère de l’air comprimé à une
pression opérationnelle (nébuliseur raccordé) de 1,6 bar.

Deux autres nébuliseurs ont été utilisés pour étudier l’effet du dispositif de nébulisation sur les
propriétés aérodynamiques de l’aérosol généré à partir de notre solution : le Pari Sprint® couplé
au compresseur PARI BOY® SX et le PARI eFlow® rapid : un nébuliseur à tamis vibrant qui
fonctionne par vibration d’un tamis au contact avec le liquide à nébuliser. Les 3 dispositifs de
nébulisation ont été offerts par la société PARI.

I.1.2. L’inhalateur de poudre sèche IPS :

Le dispositif d'inhalation utilisé pour la caractérisation aérodynamique dans cette étude est
l'inhalateur à poudre sèche IPS : le HandiHaler® (Boehringer Ingelheim Ltd, Allemagne), un
inhalateur à dose unique activé par la respiration, ce qui signifie que l'inhalation déclenche la
libération du médicament. Une gélule remplie en poudre est placée dans l'appareil. Son
fonctionnement est basé sur la libération de la poudre de la gélule percée, suivant l'inspiration
du patient. La taille portable, l'efficacité et la commodité de l'HandiHaler® en font une méthode
simple et adaptée au traitement par inhalation.

I.2. Excipients:

Trois lactoses pour inhalation ont été utilisés dans cette étude, ils ont été fournis par la société
DFE Pharma (DFE Pharma, Allemagne). Deux types de lactose sont constitués de larges

178
 Matériels et méthodes : Pharmacie galénique

particules (Large lactose) : le Lactohale® 206 (LH206) et le Respitose® ML003 (RESPI003),

le dernier est constitué de fines particules (Lactose fin) : le Lactohale® 210.

D10 D50 D90

Lactose Abréviation Description
(µm) (µm) (µm)
Lactose broyé dont la taille des
115 -
Lactohale® 206 LH206 particules est étroitement 20 - 50 50 - 75
170
contrôlée
65 -
Respitose® ML003 RESPI0003 Lactose finement broyé 1-6 20 - 50
140
Lactose fin, broyé avec des
Lactohale® 210 LH210 2-4 14 - 19 35 - 50
particules de forme irrégulière

D10 = diamètre de 10% des particules, mesuré par une analyse Laser. D50 = diamètre de 50% des
particules, mesuré par une analyse Laser. D90 = diamètre de 10% des particules, mesuré par une
analyse Laser.

I.3. Analyse des données :

Le logiciel CITDAS® (version 3.10 Wibu qui répond aux exigences de l'USP 32 et de la
Ph.Eur.6, Copley Scientific Ltd, Nottingham, UK) a été utilisé pour le calcul des différents
paramètres de performance d'aérosolisation. Le logiciel GraphPad Prism 8 (GraphPad
Software, Etats Unis) a été utilisé pour créer les différents graphiques. Le logiciel Azurad
(AZURAD SAS, France) a été utilisé pour la construction et le traitement du plan expérimental.

II. Méthodes

II.1. La caractérisation aérodynamique des aérosols utilisant le Next

Génération Impactor (NGI)

La caractérisation aérodynamique des différentes solutions pour inhalation a été réalisée selon
les recommandations de la Pharmacopée Européenne en vigueur, en utilisant l’impacteur de la
nouvelle génération (NGI). Le NGI est un impacteur en cascade à haute performance, de
précision, classifiant les particules et comportant sept étages, plus un collecteur de micro-
orifices (CMO). Une tuyère d’admission a été attachée à l’entrée de l’impacteur. Un adaptateur
d’embout en caoutchouc a été utilisé à l’entrée du port d’induction du NGI pour assurer
l’étanchéité de l’assemblage du nébuliseur au NGI.

Le NGI a opéré à un débit de 15 L/min conformément aux recommandations de la monographie

2.9.18 de la Pharmacopée Européenne (Ph. Eur.) pour l’évaluation des solutions pour

179
 Matériels et méthodes : Pharmacie galénique

inhalation, le débit a été mesuré par un débitmètre Copley, un régulateur de flux (Copley
Scientific,UK) et une pompe (Copley Scientific,UK) ont été assemblés au NGI. Un filtre interne
était nécessaire au débit utilisé, il a été placé avant le dernier étage Collecteur Terminal à Micro-
orifices (CMO) pour collecter toutes les gouttelettes extra-fines à la sortie du NGI.

Le NGI a été refroidi pendant au minimum 90 min à 5 °C pour réduire l'évaporation des
gouttelettes, limiter la possibilité de changement de taille des particules et assurer un
environnement proche de 100% d’humidité relative à l'intérieur du NGI pendant l’expérience.
La nébulisation doit commencer dans un délai qui ne dépasse pas 5 min après le retrait du NGI
du réfrigérateur.

Le nébuliseur est attaché à la tuyère d’admission, 5 mL de la solution pour inhalation ont été
mis dans le réservoir du nébuliseur et la nébulisation a été pratiqué pendant la durée déterminée
selon le test. A la fin de la nébulisation la pompe est arrêtée et la quantité de principe actif
déposé sur chaque étage de l’impacteur NGI ainsi que sur la tuyère d’admission, le filtre interne
et l’embout du nébuliseur est récupéré avec un volume suffisant d’eau ultra pure.

La détermination de la quantité déposée sur chaque étage est faite par dosage par
chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectroscopie de masse (GC-MS). Pour chaque
test, trois différentes déterminations ont été réalisées.

II.2. La caractérisation aérodynamique de la solution pour inhalation de la

doxycycline et du NV716 séparément puis en combinaison

Dans un premier temps, la solution pour inhalation à base de chaque composé seul a été évaluée
puis on a procédé à l’évaluation de la solution des 2 composés ensemble (doxycycline/NV716)
en inhalation (Tableau 1). Le nébuliseur utilisé dans cette partie de l’étude est le Pari LC
Plus® ; 5 mL de chaque solution ont été ajoutés au réservoir du nébuliseur à chaque fois. La
dose de chaque composé est de 10 mg/mL choisie en fonction de la limite de détection des deux
composés par la méthode de dosage utilisée, étant donné que la quantité nébulisée de chaque
composé sera répartie sur les différents étages de l’impacteur et ensuite récupérée par un volume
suffisant d’eau ultra pure c’est à dire diluée au fur et à mesure du test. La durée de nébulisation
a été fixée à 6 min. Chaque test a été réalisé en triplicata.

180
 Matériels et méthodes : Pharmacie galénique

II.3. Effet de la concentration en substances actives et de la durée de

nébulisation sur les propriétés aérodynamiques de l’aérosol de la
combinaison Doxycycline/NV716

D’abord, les propriétés aérodynamiques de l’aérosol généré à partir de la solution de la

combinaison doxycycline/NV716 ont été évaluées selon différentes concentrations des deux
composés, pour cela on a fixé la durée de nébulisation à 6 min et on a varié la concentration des
deux composés de 10, 15, 20 et 30 mg/mL. Puis, pour évaluer l’effet de la durée de nébulisation
sur ces propriétés aérodynamiques, on a fixé la concentration à 10 mg/mL pour chaque composé
et on a testé cette formulation en nébulisation selon différentes durées de nébulisation de 1, 3,
6 et 10 min. Le nébuliseur utilisé dans ses deux séries de test est le Pari LC Plus®. A chaque
fois le réservoir du nébuliseur est rempli de 5 ml de la solution pour inhalation.

II.4. Effet du dispositif de nébulisation sur les propriétés aérodynamiques de

l’aérosol de la combinaison Doxycycline/NV716

En plus du Pari LC Plus® utilisé dès le début de l’étude, deux autres nébuliseurs ont été
sélectionnés pour l’évaluation aérodynamique de la solution de la combinaison
doxycycline/NV716 en inhalation. Le Pari Sprint® est un nébuliseur pneumatique à jet d’air
qui utilise une source d’air comprimé pour générer l’aérosol comme le Pari LC Plus® et le Pari
eFlow® rapid utilise la technologie de membranes vibrantes pour la création de l’aérosol. La
durée de nébulisation a été fixée à 6 min et la concentration de chaque composé à 10 mg/mL
pour la doxycycline et 10 mg/mL pour le NV716. Le volume initial mis dans le réservoir de
chaque nébuliseur est 5 mL. Chaque nébuliseur a été pesé vide, après le remplissage par la
solution et après la nébulisation pour déterminer le volume nébulisé et le débit de nébulisation
pour chaque nébuliseur.

II.5. Préparation de la poudre pour inhalation

II.5.1. Préparation de solutions destinées à la lyophilisation

Trois solutions ont été préparées : la première contient de la doxycycline seule, la deuxième
contient du NV716 seul et la troisième contient le mélange doxycycline/NV716 ensemble. Les
solutions ont été préparées avec de l'eau hautement purifiée (Millipore Synergy® UV, Système

181
 Matériels et méthodes : Pharmacie galénique

de Purification d’Eau). 20 mL de chaque solution concentrée à 3 mg/mL de doxycycline, 3

mg/mL de NV716 ou de la Doxycycline : NV716 (1,5 mg/mL : 1,5 mg/mL) ont été stockées
dans des flacons de verre (300 mL) puis congelées à -80°C pendant 24 heures.

II.5.2. Séchage par congélation : Lyophilisation

Elle a été réalisée dans un lyophilisateur à l'échelle du laboratoire (Alpha 1-4 LSCbasic, Martin
Christ, GmbH, Allemagne).
− Préchauffage : le lyophilisateur a été programmé pour 30 min à une pression de 5,17
mbar et une température de 20 °C.
− Le séchage primaire a été effectué à une température de 32 °C et à une pression de 1
mbar pendant 20 h.
− Pour le séchage secondaire, la température de conservation a été portée à 37°C pendant
40 heures.
Après la lyophilisation, les flacons contenant les poudres lyophilisées ont été immédiatement
scellés hermétiquement et stockés dans un dessiccateur sur gel de silice jusqu'à leur utilisation
pour la caractérisation aérodynamique.

II.5.3. Remplissage des gélules

Les différents mélanges ont été remplis individuellement dans des gélules HPMC
(hydroxypropylméthylcellulose) de taille 3 (0,3 ml) à l'aide d'un gélulier manuel (Voir données
supplémentaires Annexe 6). Le poids cible d'un remplissage à 100 % a été fixé à 200 mg.

Les Tableau 19 et Tableau 21 résument le taux des différents composants de chaque mélange,
leur ordre de mélange et leur durée. Les gélules remplies ont été immédiatement utilisées pour
la caractérisation aérodynamique ; ainsi, aucune gélule n'a été stockée pendant plus de 2 h, pour
éviter l'absorption d'humidité qui pourrait influencer le comportement de la poudre en
inhalation et donc la reproductibilité des résultats. Chaque gélule a été pesée avant et après le
remplissage afin d'évaluer l'uniformité de la masse remplie.

182
 Matériels et méthodes : Pharmacie galénique

II.6. Évaluation aérodynamique de l’aérosol de poudre sèche à l'aide de

l’Impacteur de Nouvelle Génération NGI

La performance des aérosols de poudre lyophilisée a été évaluée selon les recommandations de
la Pharmacopée européenne (Ph. Eur.) [monographie 2.9.18] en utilisant l'impacteur de
nouvelle génération (NGI, Copley, Nottingham, UK). Il a été couplé à une gorge USP fixée à
son entrée à un adaptateur d'embout buccal permettant la fixation de l'inhalateur de poudre
sèche IPS utilisé : le "Handihaler®". Le NGI était également équipé d'un préséparateur
conforme à la recommandation de la Pharmacopée pour la caractérisation aérodynamique de
l'inhalation de poudre sèche.

Avant chaque dispersion, une fine couche d'huile de vaseline a été appliquée sur les différentes
étages de l'impacteur (E1-E8) et à la plaque du pré-séparateur pour minimiser le rebond des
particules. Pour chaque dispersion, l’IPS a été chargé avec une gélule HPMC de taille 3 remplie
de la poudre à inhaler. Pour toutes les mesures, un débit de 43 ± 0,5 L/min a été appliqué à
travers l'impacteur pendant 6 s, pour faire passer un total de 4 L d'air à travers l'inhalateur avec
une chute de pression d'environ 4 kPa appliquée à travers l'inhalateur. Ce débit a été obtenu à
l'aide d'un régulateur de débit (Copley Scientific,UK) et d'une pompe (Copley Scientific,UK)
assemblés au NGI et a été mesuré par un débitmètre Copley.

La gélule est percée, l'IPS est fixé à la tuyère via l'adaptateur de l'embout buccal, puis la pompe
est mise en marche pour réaliser l'aérosolisation de la poudre. Un lot de plusieurs gélules (en
fonction de la dose de principe actif incorporée dans la gélule) est dispersé à chaque passage
afin de garantir l'obtention d'une dose quantifiable à chaque étage.

Après la dispersion, la poudre déposée sur chaque étage du NGI ainsi que dans la tuyère, le pré-
séparateur et l'embout buccal de l'inhalateur IPS est récupérée avec un volume suffisant d'eau
ultra-pure. Différents volumes d'eau ultra-pure ont été utilisés pour récupérer la poudre, afin de
permettre une concentration quantifiable des deux composés (doxycycline et NV716) : 5 ml
pour la gorge, 15 ml pour le pré-séparateur, 2 ml pour l'inhalateur et 1 ml pour chacune des
différents étages du NGI (étage 1 - étage 8). La détermination de la quantité déposée à chaque
étage est effectuée par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectroscopie de masse.
Pour chaque test, les résultats donnés correspondent à la moyenne de 2 mesures.

183
 Matériels et méthodes : Pharmacie galénique

II.7. Chromatographie en phase gazeuse - spectrométrie de masse Conditions

GC-MS

La séparation et l'analyse chromatographiques des échantillons ont été réalisées à l'aide d'un
système de chromatographie en phase gazeuse en réseau Agilent Technologies 6890N
(injecteur et passeur d'échantillons Agilent 7683B) et couplé au détecteur de spectromètre de
masse Agilent 5973 Network. La séparation a été réalisée dans une colonne capillaire Zebron
ZB50 (Phenomenex) de 30m × 0,25mm de diamètre interne (I.D.) × 0,25μm d'épaisseur de film.
Le volume d'injection était de 1 μL, et le débit du gaz vecteur hélium était de 1mL/min. Les
températures de la ligne de transfert MS, de la source d'ions et du quadripôle ont été fixées à
280, 230 et 150◦C, respectivement. La température de l'injecteur était de 250◦C (splitless), et le
four a été programmé de 40 (temps de maintien : 0,5 min), à 280◦C à 10◦ C/min, (temps de
maintien : 5 min). Ions sélectionnés pour la détection de chaque composé : Doxycyline : 393 ;
315 ; 255 ; 175 ; 147 ; NV716 : 205 ; 177 ; 159, 137. Les chromatogrammes des deux composés
sont présentés dans les données supplémentaires (Annexe 7-8-9).

II.7.1. Préparation des solutions standard pour l’analyse GC-MS

Deux solutions mères concentrées de chacun des deux composés (doxycycline et NV716) ont
été préparées par dissolution de quantités suffisantes (1 mg de chaque composé à part) dans de
l’eau ultra pure pour obtenir une solution concentrée (1000 µg/ml) qui sert de solution mère
pour la préparation des solutions filles diluées à des fins d'étalonnage.

Des solutions de concentrations de plus en plus faibles (500, 250, 125, 62,5 et 31,25 µg/ml) de
chaque composé (doxycycline et NV716 ont été préparées par des dilutions en cascade en
rajoutant à chaque fois le volume nécessaire d’eau ultra pure à un volume initial de la solution
mère.

Les solutions ont été agitées à la main puis à l’aide d’un agitateur vortex IKA Lab Dancer
pendant 3 minutes. Les solutions sont ensuite transférées dans des vials et directement soumises
au dosage par chromatographie en phase gazeuse couplée à la masse.

184
Donnés supplémentaires

185
 Donnés supplémentaires

Annexe 1. Courbes des témoins positifs (PMB et PMBn) et négatifs (Bactérie PA01 et tampon
PPB) utilisés pour l’évaluation des effets de perméabilisation membranaire des différents
composés
PAO1 PBB PMB PMBn
2,5

2
Abs490nm (a.u.)
1,5

0,5

0
1 6 11 16 21 26
Temps (min)

Annexe 2. Comparaison des effets de perméabilisation membranaire des différents composés

avec ceux de la PMB (tous utilisés à une concentration de 32 µM)

120 100
membranaire (%)
Perméabilisation

100
74
80 67
60
54 51
44 43
40 33 28
20
0
PMB NV716 59 60 61 62 63 64 PMBn
Différents composés

Annexe 3. Comparaison des effets de perméabilisation membranaire des différents composés

avec ceux de la PMB (tous utilisés à une concentration de 16 µM)

120 100
membranaire (%)
Perméabilisation

100
80 63
60 51
41
40 30 29 32
20 17
20
0
PMB NV716 59 60 61 62 63 64 PMBn
Différents composés

186
 Donnés supplémentaires

Annexe 4. Calculs du MMAD

Annexe 5. CMIs de la doxycycline et du NV716 seuls ou en combinaison vis-à-vis d’un panel

de souches cliniques de Pseudomonas aeruginosa

CMI Doxycycline (µg/mL) CMI NV716 (µM)

Avec Avec
Souches cliniques de Facteur de
Seule NV716 (10 Seul doxycycline
P. aeruginosa gain (10µM)
µM) (2µg/mL)
Souches cliniques
Lav 1 32 0.25 128 50 3.12
Lav 2 64 0.25 256 50 3.12
Lav 3 64 0.5 128 50 6.25
Lav 4 32 0.25 128 25 3.12
Lav 5 64 0.5 128 50 6.25
Lav 6 64 0.25 256 25 3.12
Lav 7 32 0.25 128 25 3.12
Lav 8 32 0.25 128 25 3.12
Lav 9 64 0.5 128 50 6.25
Lav 10 32 0.25 128 25 6.25
Lav 11 32 0.25 128 12.5 3.12
Lav 12 32 0.25 128 50 3.12
Lav 13 32 0.25 128 50 6.25
Lav 14 64 0.5 128 50 6.25
Lav 15 64 0.25 256 50 3.12
Lav 16 64 0.5 128 50 6.25
Lav 17 32 0.25 128 50 3.12
Lav 18 64 0.25 256 50 3.12
Lav19 64 1 64 25 6.25

187
 Donnés supplémentaires

Pw 2960 128 1 128 50 12.5

Pw 8621 128 2 64 50 12.5
Pw 7951 64 1 64 50 6.25
Pw 3638 128 2 64 50 12.5
MPA01 256 0.25 1024 50 6.25
PA EL3627 64 0.25 256 50 3.12
PA D36286 64 0.25 256 50 3.12
PA 3628 64 0.5 128 25 3.12
PA 391 128 0.5 256 25 6.25
PA Cip 76110 32 0.25 128 25 3.125
PA FB 32 0.5 64 25 3.125
PA 892 128 0.5 256 25 6.25
PA 3628 64 0.5 128 25 3.125
PA 40 32 0.5 64 37.5 6.25
PA 10660 16 0.25 64 50 6.25
PA 626 16 0.25 64 50 3.125
PA 22511 32 0.5 64 50 12.5
PA 21803 32 0.5 64 50 6.25
PA 4013916 32 0.5 64 50 6.25
PA SR3014 64 1.5 42 50 12.5
PA SR645 64 0.25 256 25 6.25
PA 432 48 0.25 192 50 6.25
PA 38173 32 0.5 64 50 4.68
PA P60 256 48 5 50 50
PA 1066013 32 0.25 128 50 6.25
PA SR663 64 1 64 50 12.5
PA 40 098E 192 1 192 50 12.5
PA 405b4240 32 0.5 64 50 6.25
PA 4098 32 4 8 50 25
PA S21803 32 0.5 64 50 6.25
PA Z64bF 6 0.25 24 25 1.56
PA SR3021 256 2.5 102 50 12.5
Mutants de PA01
PYO-PIC NOR 192 1 192 25 12.5
PA 403 1 0.25 4 6.25 0.39
PA01 Aiguier 64 0.5 128 50 6.25
PA01 CH103 32 0.5 64 50 6.25
PA01 Soft3 2 0.25 8 12.5 0.39
Souches de références
PA ATCC15442 32 0.5 64 50 6.25
PA01 32 0.75 42 50 6.25
Souches surexprimants les pompes d'efflux
PA01 Mex CD++ 32 0.25 128 25 3.12
PA01 Mex EF++ 64 1 64 25 6.25
PA01 Mex XY++ 64 0.5 128 50 6.25

188
 Donnés supplémentaires

PA01 MexAB ++ 128 2 64 25 12.5

PA01 Mex AB CD
2 0.25 8 12.5 0.39
XY
PA01 Opr 32 0.25 128 50 6.25

Annexe 6. Le remplissage manuel des gélules utilisées pour la délivrance de la poudre via le
HandiHaler®

Annexe 7. Chromatogramme CG-MS-SIM du composé NV716

NV716

189
 Donnés supplémentaires

Annexe 8. Chromatogramme CG-MS-SIM de la doxycycline

Doxycycline

Annexe 9. Chromatogramme CG-MS-SIM regroupant la doxycycline et le NV716

NV716

Doxycycline

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J. Pharm., 119548 (2020). Publiée

3. Douafer, H., Andrieu, V. & Brunel, J.M. Scope and limitations on aerosol drug delivery

for the treatment of infectious respiratory diseases. J. Control. Release (2020). Publiée

4. Azza, T., Douafer, H., Jean-Michel Bolla, Klibi, N. & Brunel, J.M. Antibiotic Adjuvants to

Rescue Pseudomonas Aeruginosa from Tetracycline Antibiotics Resistance. Anti-Inf

Agents 18, 1-7 (2020). Publiée

5. Douafer, H., Andrieu, V., Wafo, E., Sergent, M. & Brunel, J.M. Feasibility of an inhaled

doxycycline/adjuvant dry powder combination for the treatment of P. aeruginosa

respiratory infections using an experimental design approach. J. Control. Release.

Soumise

Présentations orales & Posters

1. Douafer, H., Andrieu, V. & Brunel, J.M. Characterization of a new aerosol

antibiotic/adjuvant combination for the treatment of P. aeruginosa lung infections.

55th INTERNATIONAL CONFERENCE ON MEDICINAL CHEMISTRY INTERFACING

CHEMICAL BIOLOGY AND DRUG DISCOVERY, 3-5 july 2019, Nantes, France.

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