ACTUALIZACIN DEL CICLO ESTRAL DE LA PERRA

Generalidades Las perras se consideran monostricas estacionales ya que solo tienen un celo por estacin reproductiva, primavera y otoo. Todava existen confusiones en la subdivisin del ciclo estral en la perra. Inicialmente se plante que el ciclo de la perra se puede dividir en cuatro fases segn manifestaciones externas: Proestro, Estro, Metaestro y Anestro. 1. Proestro: A un perodo de inactividad sexual (anestro) sigue el proestro, que se identifica por aumento de tamao de la vulva y un corrimiento muco hemorrgico. Aunque la perra atrae a los machos por medio de jugueteos y escapes, tiene la vagina tapada con la cola y no acepta la monta mostrando los dientes. La duracin media es de 9 das (rango de 2-27 das). 2. Estro: En el estro, es el perodo en el que la perra acepta la monta, la vulva est an ms aumentada de tamao y turgente, y el corrimiento vulvar es de color pajizo. La duracin media es de 9 das (rango 3-21 das). En lo que es comportamiento cambia de agresiva a totalmente pasiva. Se produce en la transicin del proestro al estro, el pico de LH y la ovulacin ocurre a las 24 a 48 horas del pico, tambin se establece en la bibliografa que es aproximadamente a los dos das de comenzado el estro. 3. Metaestro: Si no tiene lugar la gestacin el estro es seguido del metaestro, donde la perra, ya no es atractiva para el macho por un efecto marcado de la elevada progesterona en sangre. La duracin media de esta etapa metaestro es de 90 das (rango 60-110 das). Este ltimo acaba en forma imperceptible en el anestro. 4. Anestro: Es un perodo de inactividad sexual, cuya duracin es variable con una media de 75 das. En general los propietarios de perras se refieren al conjunto de proestro y estro como "celo", no siendo una terminologa especfica. Se acepta que el metaestro se subdivida en dos fases: progresiva y regresiva. Inicialmente se realizaba esta divisin debido a caractersticas histolgicas, pero se relacionan estos dos estadios con la funcin lutenica. La fase progresiva, hace referencia al perodo de desarrollo lutenico post-estral (aproximadamente 20 das), y la fase regresiva, al momento del inicio de la regresin del cuerpo lteo hasta que el tero vuelve a su estado de anestro, 70 das ms tarde. La descamacin endometrial se inicia a los 90 das del inicio del ciclo y contina por unos 21 das, siendo en parte reabsorbido y desechado por el cervix. Est completamente regenerado a los 150 das del inicio del ciclo. El intervalo normal entre dos ciclos vara entre 5 y 10 meses, dependiendo de la duracin del anestro. Existe una variabilidad racial desde 4 meses de intervalo en el Pastor Alemn hasta una vez al ao en el Basenji. La duracin de la gestacin es de 63 das, con una variabilidad de 54 a 72 das si se considera desde el momento de la monta. La preez aumenta el intervalo entre ciclos una media de 28 das.

Relacin temporal entre el pico de LH y el momento ptimo en el estro

Periodo Frtil (estro)

Momento Optimo
Pico de LH

-1

+1

+2

+3

+4

+5

+6

+7

+8

Actualmente la divisin del ciclo se basa en las concentraciones plasmticas de las diferentes hormonas, el proestro y el estro se mantienen, pero el metaestro se toma como diestro, momento de elevados niveles de progesterona con una duracin de 2 a 3 meses y al anestro como el momento de niveles basales de la misma, con una duracin de 2 a 9 meses dependiendo de s la perra tiene 1, 2 o 3 ciclos en el ao (Linde Forsberg, 1996). El ovocito ovulado es an inmaduro, por lo que necesita 2-5 das para completar la maduracin y ser fecundable. Los espermatozoides que son originarios del semen fresco pueden permanecer viables por 4-5 das, pero si se utiliza semen congelado la viabilidad no supera las 12-24 horas, por lo que se debe ser muy exacto en la utilizacin del mismo, con relacin al tiempo ptimo de inseminacin artificial. La pubertad se alcanza en el entorno de los 6 a 7 meses de edad (rango 4-22 meses). Las razas pequeas tienden a presentar el primer celo a los 6-10 meses, pero las razas grandes comienzan a ciclar a los 18-20 meses de edad. Las perras ciclan a lo largo de toda la vida desde la pubertad, pero puede disminuir la fertilidad despus de los 7 aos de edad. Existe una gran variedad individual en la duracin de las diferentes etapas del ciclo estral as como en la intensidad de los signos externos de "celo". Adems, el metaestro no presenta signos externos identificables, lo que imposibilita determinar con exactitud su inicio o finalizacin. Todo esto determina una gran dificultad para identificar las etapas del ciclo estral. Como herramienta de gran utilidad para salvar esa dificultad tenemos el examen del frotis vaginal o la determinacin hormonal. Control hormonal del ciclo La actividad cclica innata del hipotlamo constituye la base hormonal de control, y es sensible tanto a cambios externos como internos en el animal. Durante el anestro los niveles de estrgeno oscilan entre 5-15 pg/ml y los de progesterona 0,5-1 ng/ml. La FSH es segregada durante las 2-3 semanas

previas al inicio del proestro en pulsos de frecuencia creciente. Esta controla el desarrollo de los folculos, que a su vez segregan principalmente estrgenos, pero tambin progesterona, a medida que alcanzan la madurez. Los niveles bajos de estrgenos causan un efecto rebote positivo sobre la adenohipfisis, estimulando a segregar FSH, que da lugar al crecimiento y desarrollo folicular y a su vez a niveles crecientes de estrgenos (niveles que oscilan entre 25-60 pg/ml durante el proestro). Este proceso contina hasta la madurez de los folculos, cercano a la ovulacin. Ya en esta fase, los altos niveles de estrgenos causan un efecto rebote negativo que inhibe la secrecin de FSH y desencadena la liberacin de LH en un gran pulso que determina la ovulacin (2-4 ng/ml de progesterona). La ovulacin se da entre 3-27 das pos inicio del proestro con niveles de 4-10 ng/ml de progesterona en sangre, lo que plantea una enorme variacin.

Estrgeno

Progesterona

Ovulacin
LH

Proestro

Boyd y col.(1977), report que los ovocitos son liberados por un solo ovario por vez, determinado por ecografa, y que la ovulacin demora 36 horas. A diferencia de otras especies, los ovocitos ovulados son inmaduros (primarios) y necesariamente precisan tiempo para madurar, que es de 2 a 5 das (Linde Forsberg,1996). El folculo que ovul, se transforma en un cuerpo lteo, que segrega altos niveles de progesterona en sangre y a su vez ejerce un efecto rebote negativo sobre la secrecin de LH, la cual mantiene al cuerpo lteo hasta el da 35, pero los niveles decrecientes ejercen un efecto rebote positivo sobre la liberacin de prolactina, que mantiene el cuerpo lteo despus del da 35. Los cambios hormonales en el ciclo de la perra pueden predisponer a dos patologas: Pimetra y Seudogestacin. Particularidades en la perra: Duracin variable de cada etapa del ciclo estral.

Estro

Diestro

Antes de la ovulacin hay bajos niveles de progesterona en aumento, producida por los folculos (luteinizacin preovulatoria) y niveles decrecientes de estrgeno, que determinan el inicio del estro. Maduracin ovocitaria pos-ovulacin. Hay un largo perodo de dominancia de la progesterona, ya que en el tero no se produce el factor luteoltico por lo que hay una lutelisis progresiva. Similitud de los ciclos en perras gestadas y no gestadas.

Deteccin de las etapas del ciclo La citologa vaginal es uno de los mtodos indirectos ms difundido, por ser simple y rpido. Presenta un grado relativo de exactitud debido a que el inicio del metaestro es el momento ms preciso de determinar, lo que marcara que la ovulacin ocurri aproximadamente 6 das antes. Ese momento sera demasiado tarde para la monta (Feldman, 1987). Esta tcnica se basa en que las clulas epiteliales vaginales responden a los cambios hormonales desde un crecimiento de 2-3 capas en anestro a 20-30 capas de clulas en el estro. Por medio del vaginoscopio, se puede identificar el momento de inicio del estro. Un experto observador determinar el momento en que comienza a plegarse la mucosa, stos se hacen fcilmente visibles unos cuatro das antes de la ovulacin, que sera el momento mas crtico para la monta (Jeffcoate, 1989). Para obtener buenos resultados habra que inspeccionar la vagina cada dos das, desde el quinto da de iniciado el proestro. El fundamento de la utilizacin de la determinacin hormonal se basa en los niveles de progesterona en sangre. La ovulacin ocurre 48 horas (rango de 24-72 horas) despus del pico de LH, la maduracin ovocitaria se da 2-3 das pos ovulacin, y el momento de fertilidad mxima es entre 2 y 5 das pos ovulacin. Debido a esto, se necesitar determinar exactamente el momento del pico de LH, pero esto es muy difcil debido a su corta vida media en sangre (1-3 das). Por esto anterior, se defini el uso de los niveles de progesterona en sangre como mtodo para determinar el momento ptimo, ya que presenta 0.5 ng/ml en etapas basales y a las 48 horas antes del pico de LH, esta aumenta a niveles entre 2-5 ng/ml, mantenindose elevada durante el estro hasta alcanzar los valores mximos en los 13-28 das de finales esta etapa (Concannon, 1989). La tcnica ms exacta para la determinacin de stas hormonas en sangre es la dosificacin mediante Radio Inmuno Anlisis, pero es caro y demora de 2-3 horas. Teniendo en cuenta los kits semicuantitativos (ELISA), se tomaran las muestras de sangre cada 2 das, a partir del da 7 del inicio del proestro, y el resultado se obtiene a los 15-30 minutos por cambios de color (LindeForsberg,

1996). Si el nivel de progesterona es alto indica que la hembra ya ovul y esto determina que la monta deba ser inmediatamente para un resultado eficaz. Resultado inferior a 5 ng/ml 5-6 ng/ml 6-12 ng/ml superior a 12 ng/ml (van Haaften, 1989) Gestacin La duracin de la gestacin es de 63 das (rango de 54-72 das) con relacin a la monta, lo que es variable. Pero si relacionamos la fecha del parto con el pico de LH, es de 65 das (+/- 1 da). La progesterona se mantiene en meseta y el estrgeno aumenta en el ltimo tercio de la gestacin (Concannon, 1989). Durante la gestacin se modifica el cuerpo de la perra, aumentndose de peso con una variacin de un 20-55%, destacndose mas al final de la preez, tambin hay desarrollo mamario y cambio en la silueta. Accin otra muestra monta entre 33-57 horas monta a las 24 horas monta en el da

CITOLOGIA VAGINAL EXFOLIATIVA

Metodologa de toma de muestra En la bibliografa consultada hay reportes de varios mtodos para recoger las muestras para realizar frotis vaginales. El mtodo seleccionado se basa en cumplir algunos principios bsicos: a) Debe ser simple de realizar y econmico. b) No debe ser doloroso. c) Debe poderse realizar en presencia o ausencia de descarga vaginal. d) Debe ser realizable por los dueos despus de un breve aprendizaje. e) Debe ser realizable, a pesar del tamao o temperamento de la perra. Lo ideal es que el tcnico se acostumbre a una metodologa exitosa. En lo que a m respecta, recomiendo la utilizacin de la tcnica del hisopo de algodn porque cumple con los criterios anteriores. Tcnica del Hisopo La perra debe colocarse de pie, mientras un asistente le sostiene la cabeza con una mano y la cola con la otra mano. Los labios de la vulva son separados suavemente con una mano del operador. Con la otra mano se sostiene un hisopo de algodn estril de 15 cm de longitud. El hisopo es pasado por la comisura dorsal de la vulva, avanzando en direccin crneodorsal hasta que se pasa el arco isquitico por la regin dorsal de la vagina de manera de evitar la fosa del cltoris. La distancia que se debe introducir el hisopo depende de las dimensiones del animal, teniendo en cuenta que se debe alcanzar el canal plvico. Luego de rotarlo sobre la pared dorsal hacia lateral, ste se retirara tratando de no arrastrarlo por la regin ventral. Todo este procedimiento abarca solo unos segundos y es raro que sea doloroso. Si la perra no presenta descarga, puede manifestarse desconforme con la manipulacin, por lo que seria conveniente que se humedezca el hisopo con unas gotas de solucin salina fisiolgica para lubricar y facilitar la toma de muestra. No es recomendable la utilizacin de agua destilada o del grifo porque altera las clulas. Una vez que es retirado el hisopo, el mismo es girado suavemente a lo largo de un portaobjeto, realizando tres impresiones lineales separadas entre s. Se debe realizar dos frotis de cada muestra. Cada portaobjeto es secado al aire y posteriormente sumergido en alcohol absoluto o alcohol 95GL para fijar las clulas. Este frotis puede ser coloreado en el momento o guardados para ser coloreados posteriormente.

Coloracin

Existen mltiples tcnicas para colorear el frotis e incluso est descrita la observacin de los mismos con un microscopio de contraste de fase. La tcnica a utilizar debera ser fcil de realizar, econmica, que permanezca sin modificarse por un tiempo considerable y quizs en forma permanente por varios aos. Las coloraciones ms utilizadas son las siguientes: May Grunwald Giemsa o Wright-Giemsa, Diff-Quick, Azul de Metileno nuevo Azul de Toluidina o Violeta de Genciana Papanicolao o Harris-Shorr

Se realiz una comparacin de tres tcnicas de coloracin para la colpocitologa vaginal, Azul de Metileno (AM), Azul de Toluidina (AT) y HarriisShorr (HS), frente a 10 perras a lo largo de su ciclo estral. En funcin de los resultados obtenidos, se observ la sencillez y practicidad de dos de la tcnicas (AM y AT). Si comparamos estas dos tcnicas, la permanencia en el tiempo de la coloracin de AT frente al AM. Si observamos los resultados frente a una tcnica control especfica (HS), los resultados no presentan diferencias estadsticas. Por lo anterior se seleccion la tcnica de Azul de Touidina por su practicidad, sencillez, permanencia y su efectividad en pruebas de campo. Sin ser en desmedro de estas tcnicas sencillas de trabajo en la clnica, en el caso de ser necesario es recomendable utilizar la tcnica de Harris-Shorr. Azul de Toluidina

1- Secar el frotis al aire 2- Colocar el colorante sobre el porta 3- Dejar actuar dos minutos 4- Volcar el excedente de colorante 5- Dejar secar al aire 6- Evaluar

Usos Clnicos Manejo de la monta normal

En este contexto, se utiliza para ayudar a los dueos o criadores a determinar el momento ptimo para la monta de una perra. Es una excelente ayuda para distinguir entre proestro, estro o diestro dentro del ciclo estral de la perra. Para realizar esto, es recomendado realizar 2-3 frotis en el entorno de 4 a 7 das. Como rutina recomendamos comenzar a realizar el frotis al tercer da de que la perra es identificada en celo (presencia de descarga vaginal), y luego continuar cada 48 horas realizando 3 frotis por perra para poder observar la evolucin del epitelio vaginal y determinar claramente el momento de comienzo del estro. Ciclos inusuales Todas aquellas perras que en su ciclo estral no se comportan como una perra promedio (o sea que no se cumple que el estro comience al da 10 de iniciado el proestro), realmente causan errores al intentar prearlas. Esto correspondera a perras que en forma normal presentan sus proestros cortos (3-5 das) o proestros largos (21-25 das), estos animales estn dentro de los rangos normales de duracin de las etapas del ciclo estral en caninos. Se debe tener en cuenta la variabilidad, o sea el rango de duracin, de cada etapa del ciclo. Ciclos anovulatorios Parea determinar esta patologa es necesario realizar un seguimiento desde el inicio del celo. Realizando esto podemos determinar que de la mitad del proestro se produce la transicin al diestro, por lo que nos orienta hacia una maduracin folicular incompleta. Predecir el momento del parto La duracin de la preez en la perra suele ser un rango variable desde 57-72 das desde el momento de la monta. Pero si nosotros determinamos claramente el momento de inicio del estro (coincidira con el pico de LH), la duracin de la preez en relacin con el pico de LH varia de 63-65 das de duracin. Problemas de infertilidad La citologa vaginal es el reflejo de los niveles de estrgeno plasmtico y de la funcin folicular. Por intermedio de esta tcnica se puede determinar si existieron problemas de manejo (momento errneo de monta), nivel de estrgeno inadecuado (pobre desarrollo folicular), u otros desrdenes menos comunes. Patologas

Puede colaborar en el diagnstico de algunas patologas como ser: quistes foliculares, vaginitis, tumores vaginales, pimetra, y metritis aguda. Utilizacin de Progestgenos Los mejores resultados con la utilizacin de los mismos se manifiesta cuando el animal est en anestro, lo que se solucionara con un frotis vaginal realizando la teraputica, disminuyendo los riesgos de pimetra. El de mejor resultado a la utilizacin a inicio del ciclo es la proligestona (Covinan), pero an sera recomendable la utilizacin de esta tcnica teniendo en cuenta no pasarnos de la mitad del proestro.

Limitaciones de la colpocitologa
Esta tcnica es una herramienta muy utilizada en la reproduccin canina. Hay que tener en cuenta que es muy sencilla, a pesar de ello, la observacin del frotis implica entrenamiento para un correcto diagnstico. Hay que tener presente que con un solo frotamiento no se puede identificar el da de la ovulacin o el momento ptimo para la monta, as como tampoco el da del parto. Tambin se debe tener en cuenta, que esta tcnica no debera sustituir la anamnesis, el estudio de la sintomatologa y del comportamiento en las diferentes etapas del ciclo estral de la perra. La utilizacin de esta tcnica implica una complementariedad con lo antes mencionado. Clasificacin de las clulas del epitelio vaginal. Las modificaciones que ocurren en la mucosa vaginal son un resultado de las variaciones de la concentracin plasmtica de estrgeno, remarcado especialmente en el proestro y estro como va indirecta de deteccin. La nomenclatura de las clulas vaginales est basada en su morfologa, algunos autores las describen diferencindolas en queratinizadas y no queratinizadas o cornificadas y no cornificadas. En lo particular, prefiero una descripcin celular basada en su morfologa y en el propio proceso de muerte celular. Cuando las clulas vivas redondeadas se mueren, modifican su morfologa hacia una forma ms irregular y aumenta su tamao. Tambin los ncleos celulares reflejan los cambios de la muerte celular, estos se tornan cada vez ms pequeos, picnticos, antes de convertirse en una figura fantasma o desaparecer dejando a este tipo celular como anucleado. Encontramos entonces, varios tipos celulares: Parabasales, Intermedias, Superficiales, Escamosas, Metaestrales y Espumosas.
Parabasales

Intermedias

Superficiales nucleadas

Superficiales Anucleadas o Escamosas 9

Anestro La observacin de frotis obtenidos en el anestro es relativamente constante. A una primera observacin se encuentran clulas parabasales e intermedias. Los glbulos rojos y las bacterias estn generalmente ausentes, y los neutrfilos pueden o no estar presentes. Proestro Para interpretar los resultados de la colpocitologa durante el proestro se debe dividir el mismo en tercios, proestro temprano, mitad del proestro y final del proestro. En el proestro temprano lo que se observa en el frotis sera similar a lo que se observa en el anestro. Pero, en general, el proestro temprano presenta una cantidad variable de glbulos rojos, una cantidad abundante de clulas parabasales y un porcentaje bajo de clulas intermedias y superficiales. Esto significa que las clulas intermedias, superficiales y escamosas oscilan entre 20-40 %. Puede dar una imagen "sucia" debido a la presencia secreciones vaginales o cervicales en pequeas cantidades. En la mitad del proestro, se refleja sobre el tracto genital, los primeros efectos de la presencia predominante de estrgenos en sangre. Incluye la desaparicin de los neutrfilos y la aparicin de abundante cantidad de glbulos rojos. Adems, las clulas superficiales comienzan predominar sobre las clulas parabasales e intermedias. Esto significa que las clulas superficiales y escamosas oscilan entre 40-60 %.

PROESTRO (Azul de Toluidina)

En el final del proestro no se observa neutrfilos, pero hay una cantidad variable de glbulos rojos, y cambia la predominancia a clulas intermedias, superficiales y escamosas. Esto significa que las clulas superficiales y escamosas oscilan entre 60-80 %.

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Estro Una vez que comienza esta etapa, el frotis se convierte en una imagen relativamente constante, ya que las clulas que predominan, son las superficiales y escamosas, que se aproximan a un 100%. Los glbulos rojos pueden o no estar presentes, y en general los neutrfilos se encuentran ausentes. En las ltimas 24 horas del estro, se produce una cada dramtica de las clulas del epitelio observables encontrando un 20 % de clulas superficiales y escamosas anucleadas.

ESTRO:Comparacin de tamao de una celula superficial anucleada con un neutrfilo

Diestro El frotis obtenido de una perra en esta etapa, es claramente diferente a lo observado en el estro. El cambio es bien marcado y aparecen clulas que solo se observan en esta etapa. Pueden reaparecer los neutrfilos. Ocasionalmente aparecen clulas metaestrales que nos permiten identificar claramente la diferencia entre el inicio del proestro y el inicio del diestro. Las clulas metaestrales son clulas epiteliales vaginales "parabasales o intermedias" que en su citoplasma presentan incluidos uno o dos neutrfilos. Las clulas espumosas son clulas epiteliales vaginales que presentan un citoplasma espumoso o vacuolado. Las clulas epiteliales que predominan en esta etapa son las clulas intermedias y las clulas parabasales.

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BIBLIOGRAFA
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APENDICE: Imagenes de los distintos tipos celulares

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CEL.PARABASAL Azul de Toluidina

CEL. PARABASAL Azul de Toluidina

CEL. INTERMEDIA Azul de Toluidina

CEL. INTERMEDIA Azul de Toluidina

CEL.SUPERFICIAL NUCLEDA Y ANUCLEADA Azul de Toluidina

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