UNIVERSIDAD VERACRUZANA

FACULTAD DE BIONALISIS

LABORATORIO DE PARASITOLOGIA

MANUAL DE PARASITOLOGIA

ALUMNAS:
MAGDA ELENA HERNANDEZ HERNANDEZ SANDRA LUZ HERNANDEZ LOPEZ

* TOMA DE MUESTRA PARA EXAMEN

COPROPARASITOSCOPICO

INTRODUCCION : Regularmente en el rea de Parasitologia , las muestras ms analizadas para demostrar la presencia de parasitos intestinales del hombre son las heces fecales ; sin embargo , existen otros parsitos cuya presencia se puede evidenciar en muestras biolgicas como : bilis, jugo duodenal, esputo, secrecin , biopsia o frotis perianal , no obstante estas pruebas se harn tomando en cuenta los antecedentes clnicos especficos del paciente.

A continuacin , se har

referencia a los diversos aspectos con los cuales

debern proceder las muestras a analizar con fines parasitologicos para obtener resultados reproducibles y de esta manera ayudar eficazmente al mdico en el diagnostico, pronostico , y tratamiento del paciente. HECES FECALES SOLIDAS:

Condiciones del paciente : Durante al menos tres das previos a la prueba el paciente deber evitar tomar medicamentos (antiparasitarios , antibiticos, antidiarreicos , emplearse un

laxantes o purgantes en caso de ser necesario debern

purgante salino, como sulfato de sodio o fosfato y carbonato de sodio. Por ningn motivo debern emplearse aceites minerales o compuestos de bismuto o magnesio, ya que las gotas o cristales procedentes de ellos pueden confundirse con algunos parsitos o enmascarar su presencia. Recipiente de recoleccin :

Frasco estril de boca ancha , con tapa de rosca. Cantidad de muestra requerida : 3-6 grs Toma de muestra : La muestra deber ser recolectada de la siguiente manera : Con una abatelenguas tome directamente de la cavidad anal un

volumen de heces aprox. entre 3 -6 grs (equivalente al tamao de una nuez )

NOTA: Evite la contaminacin de la muestra con orina , papel higinico. jabn , aguao tierra.

Transfiera las heces obtenidas al contenedor estril. Cierre el envase hermticamente de forma inmediata para evitar contaminaciones bacterianas . A continuacin identifique. el frasco con una etiqueta autoadhesiva llenndola claramente con su nombre, apellidos, edad y fecha y hr de recoleccin.

NOTA : Pegue la etiqueta al frasco NUNCA en la tapadera .

Finalmente lleve la muestra al laboratorio lo ms pronto posible.

NOTA : Cuando la muestra va a demorar en llegar al laboratorio varias horas o das , se recomienda adicionarle liquido fijador y/o conservador ( formalina al 10 % , por ejemplo ) NOTA : Para aumentar la eficacia de la prueba se recomienda que para estudios parasitoscoscopicos se recolecten un total de tres muestras en 3 dias consecutivos

ya que la expulsin de parsitos puede ser intermitente . Criterios de rechazo : Que el paciente no haya tomado la muestra respectivamente de forma adecuada . Que la muestra haya sido llevada al laboratorio con mas de 1 hr de haber sido tomada o no haya sido adecuadamente conservada. Que el paciente este recibiendo tratamiento antiparasitario.

HECES FECALES DIARREICAS : Cantidad de muestra requerida : 10 ml (un volumen similar al de un cuchara sopera )
NOTA : Estas muestras deben procesarse de inmediato (30 minutos como mximo despus de la deposicin) en caso contrario se debe adicionarse algun conservador e indicarlo en la etiqueta de identificacin pues de no rexaminarse dentro de un margen de tiempo prudencial pues al acidificarse muchos grmenes patgenos se lisan .

RASPADO PERIANAL : Condiciones del paciente : La toma de muestras deber realizarse preferentemente por la noche o a primera hora de la maana antes de que el paciente orine, defeque o se bae (lo ideal es hacer la toma antes de levantarse de la cama).
NOTA : Es imprescindible el uso de guantes desechables durante la toma de la muestra y el avado cuidadoso de las manos tras su realizacin.

Recipiente de recoleccin : Portaobjetos con cinta adhesiva. Toma de muestra :

1. Se toma un abatelenguas cubierto de cinta adhesiva transparente, de manera que la superficie engomada quede expuesta hacia fuera. 2. A continuacin , se coloca al paciente en posicin perianal genupectoral quedara donde la regin

ampliamente

expuesta

para realizar varias aplicaciones con el abatelenguas alrededor de esta zona ; con la fianlidad , de que los huevos qque se encontrarab presentes queden adheridos a la superficie engomada.

3. Finalmente se pega la muestra la cinta adhesiva sobre una de las caras del porta objetos (con lo que se recolecto hacia abajo ) y se observa al microscopio.

JUGO DUODENAL Y YEYUNAL: Algunos parsitos colonizan el intestino delgado durante alguno de sus estadios, permaneciendo habitualmente en el rea yeyunal y siendo infrecuentemente detectados en las heces durante estas fases. Este es el caso de los trofozoitos de Giardia lamblia y las larvas de Strongyloides sp. NOTA : Los conductos biliares desembocan en duodeno, por lo que tambin pueden
hallarse huevos de parsitos procedentes del hgado o del rbol biliar en el jugo duodenal y yeyunal.

Toma de muestra : Las muestras de jugo duodenal y yeyunal suelen obtenerse mediante sonda gastrica o bien durante un procedimiento endoscpico, por el medico tratante , las cuales tras unas adecuada identificacin, debern ser enviadas rpidamente al laboratorio y procesadas inmediatamente . Recipiente de recoleccin : Frasco estril de boca ancha , con tapa de rosca. Cantidad de muestra requerida : 1-2 ml

ESPUTO : Condiciones del paciente :

El paciente deber recolectar la muestra de esputo en ayunas a primera hora de la maana ; para lo cual , deber enjuagarse previamente la boca solamente con agua para eliminar bacterias que se encuentren en boca y lengua que pudieran ser parte de la flora normal. NOTA : Se recomienda que el paciente no este ingiriendo medicamentos. Recipiente de recoleccin : Frasco estril de boca ancha , con tapa de rosca. Toma de muestra : Para recolectar la muestra el paciente deber toser profundamente (lo mas que pueda) y depositar el esputo obtenido en un recipiente estril . NOTA: Si el paciente no puede expectorar , existen diversas tcnicas encaminadas a
favorecer la obtencin del esputo; La induccin de la tos por inhalacin con vaporizador. Lavado bronquial, aspiracin mediante aguja transtorcica, o biopsia de pulmn.

Cantidad de muestra requerida : 1- 2 ml Criterios de rechazo : Que la muestra sea saliva. Que la muestra tenga menos de 25 leucocitos, y mas de 10 clulas epiteliales por campo (aumento X 100) .(ya que indicara que la muestra no fue adecuadamente tomada

ENVIO Y TRANSPORTE DE MUESTRAS

Las muestras deben mantenerse en un ambiente fresco y lejos de la luz solar , se deben evitar las temperaturas extremas o el desecamiento , deben contener cantidades optimas y estar en frascos o contenedores rotulados y en algunos casos necesarios en soluciones conservadoras. Condiciones de envio de la muestra segn el tipo y tiempo de demora en llegar al laboratorio para el diagnostico parasitologico presuntivo de :
TIEMPO QUE DEMORA EN LLEGAR AL LABORATORIO

TIPO DE MUESTRA

<24 HRS

> 24 HRS

AGENTES PARASITARIOS
E. histoltyca, Giardia ,

HECES FORMADAS

T ambiente

Formalina 10 % PAF; PVA Medio de transp : Cary blair

Quistes de Balantidium coli. Criptosporidium , Isospora belli. ,

(no muy comnes en personas inmunocompetentes)

Trichuris.Ascaris,Necator,Ancylostoma etc Trofozoito de Balantidium coli etc.

HECES DIARREICAS ESPUTO , SECRECIN BILIAR . CONTENIDO DUODENAL

T ambiente T ambiente

Formalina 10 %

Formalina 10 %

Pneumocistis , Paragonimus, Fasciola hepatica, ,Giardia. Giardia,

T ambiente

Formalina 10 %

Strongyloides,Paragonimus,Fasciola,Ancylostoma , Necator etc. Huevos de :

FROTIS PERIANAL

T ambiente

Enterobius vermicularis T ambiente Ascaris lumbricoides, Taenia sp. Hymenolepis nana.

SECRECION VAGINAL LCR. SANGRE BIOPSIA DE TEJIDOS

T ambiente

Frotis en lamina

Trichomona vaginalis. Naegleria, Acanthamoeba yBalamuthia Tripanosoma,Plasmodium,Leishmania

4C

Formol 10 %

Trichinella spiralis (triquinoscopia)

PROCEDIMIENTOS

DE

LABORATORIO

PARA

EL

DIAGNOSTICO

PARASITOLOGICO-HECES, I. EXAMEN DIRECTO MACROSCOPICO:

FUNDAMENTO : Permite observar directamente las caractersticas morfolgicas de los parasitos adultos, enteros o fraccionados , asi como los cambios en las caractersticas organolpticas de las heces eliminadas(color, presencia de sangre y/o moco, consistencia etc). MATERIAL
Suero fisiolgico Aplicador Pinza de metal Coladera de plstico o malla metalica.

PROCEDIMIENTO :

1. Observar cuidadosamente las caractersticas organolpticas de la muestra a analizar con la finalidad de determinar su :

CONSISTENCIA: COLOR: OLOR: MOCO:

Deber ser pastosa y dura Marrn oscuro ( *Ver Anexo) Caracterstico ,puede mostrarse ftido (anomala) La presencia de moco nos indica gastritis, ulcera o amibiasis. La sangre nos indica hemorragia intestinal por

SANGRE

ulceras perforadas intoxicacin con medicamentos o cidos, hemorroides y en ocasiones amibiasis

2. Despus de ello, es necesario agregar suero fisiolgico a la muestra (en cantidad suficiente ) para homogeneizarla. 3. Finalmente las heces debern ser cuidadosamente pasadas a travs de un tamiz con la finalidad de aislar gusanos cilndricos, anillados o aplanados que pudieran encontrarse en las heces,

RESULTADOS . Se informar detalladamente aquellas caractersticas macroscpicas observadas durante el anlisis coproparasitoscopico as como se deber hacer referencia en su caso el aislamiento de algn gusano durante el tamizado especificando su especie .

TIPOS DE EXAMENES PARASITOLOGICOS:

TIEMPO QUE DEMORA EN LLEGAR AL LABORATORIO TIPOS DE EXAMNES MUESTRA <24 HRS > 24 HRS TECNICA EXAMEN DIRECTO EN FRESCO Formalina 10 % PAF; PVA Medio de transp : Cary blair HECES DIARREICAS SECRECION VAGINAL ESPUTO SECRECIN SECRECIONES BILIAR . T ambiente Formalina 10 % T ambiente T ambiente FAUST (FLOTACION) RITCHIE (SEDIMENTACION) DEMOSTRACION DE LARVAS: KATO STOLL EXAMEN DIRECTO EN FRESCO EXAMEN DIRECTO EN FRESCO TINCION DE GRAM Y GIEMSA TINCION DE GRAM Y GIEMSA EXAMEN DIRECTO EN FRESCO FAUST Y RITCHIE CAPSULA DUODENAL DE BEAL T ambiente Giardia, Formalina 10 % CAPSULA DUODENAL DE BEAL (Strongyloides,Paragonimus,Fasciola,Ancylostoma, Necator etc. Hemoprotozooarios SANGRE SANGRE
FROTIS DIRECTO DE SANGRE, HEMOCULTIVO

AGENTES PARASITARIOS E. histoltyca, Giardia , Quistes de Balantidium coli. Criptosporidium , Isospora belli. , (no muy comnes en personas inmunocompetentes) Trichuris.Ascaris,Strongyloides,Necator,Ancylostoma etc Trofozoito de Balantidium coli etc. Trofozoitos Trichomona vaginalis. Pneumocistis ,

HECES COPRO FORMADAS

T ambiente

Formalina 10 %

Frotis en lamina

Fasciola hepatica, ,Giardia. Paragonimus,

CONTENIDO DUODENAL

Tripanosoma,(xenodiagnostico) Plasmodium, (Frote grueso) Leishmania Trichinella spiralis Huevos de :

FROTE EN GOTA GRUESA DE SANGRE TINCION DE GIEMSA

TEJIDOS

BIOPSIA

4C

Formalina 10 %

TRIQUINOSCOPIA

EXAMENES ESPECIALES

FROTIS PERIANAL

T ambiente

T ambiente

METODO DE GRAHAM (Raspado perianal)

Enterobius vermicularis Ascaris lumbricoides, Taenia sp. Hymenolepis nana.

SIGNIFICADO CLINICO DEL COLOR DE LAS HECES: El color de las heces proporciona una significativa informacin al qumico clnico , ya que con solo realizar un detallado anlisis macroscpico de estas , le puede orientar en gran parte para detectar alguna patologa, disfuncion orgnica,

hemorragia, o bien hacer de su conocimiento el tipo de alimentacin o ingestin de algn medicamento que este presentando el paciente en ese momento . El color anormal ayuda al mdico a seleccionar las pruebas tanto qumicas como microbiolgicas necesarias para llegar finalmente a extender un buen diagnostico , pronostico y plan de tratamiento adecuados para el paciente. A continuacin se har referencia a los colores ms comunes que pueden presentar las heces fecales ya sea por alguna patologa o bien por algn otro factor externo :

COLOR
AMARILLO VERDOSO AMARILLENTAS YEMA DE HUEVO

SIGNIFICADO
Diarrea abundante. Se presentan en las "diarreas de fermentacin" y en las esteatorreas . Heces procedentes de un trnsito acelerado a partir de las partes ms altas del intestino delgado. Heces caractersticas de las ictericias obstructivas y de la fase aguda de las hepticas,.
NOTA : La ingestin de papilla de bario puede producir el mismo efecto.

BLANQUECINAS O GRISACEAS (ACOLIA)

VERDOSAS

NEGRO

Diarrea abundante. Tambien se presentan en las diarreas duodenales . Por otra parte se pueden presentar por una ingestin excesiva de vegetales cloroflicos los cuales darn un tono verdoso a las heces, En los lactantes son frecuentes las diarreas verdes, pero es normal que en los nios criados al pecho las deposiciones se tornen verdes al contacto del aire. Heces que proceden generalmente de una hemorragia del aparto gastrointestinal alto (>100 ml de sangre).

ARCILLA MARRON INTENSO

Sin embargo tambin se pueden presentar cuando se ingiri una elevada proporcin de carnes en la dieta , cerezas, o alimentos con colorante artificial. Heces caractersticas de un bloqueo del conducto biliar comn. Probable hemorragia del aparato gastrointestinal bajo ( por ejemplo: tumores, hemorroides, fisuras, procesos inflamatorios).

ROJIZA (MELENA)

Rojizas, irregularmente, son las deposiciones que contienen sangre no transformada, de origen bajo (hemorroides, tumores de colon distal, etc.). Unas heces rojizas tambin pueden presentarse por la ingestin abundante de betabel o tomate .

MEDICAMENTOS QUE PROVOCAN CAMBIOS EN LA COLORACIN DE LAS HECES : Negro: Sales de hierro, Sales de bismuto, carbn. Verde: cloruro de mercurio, indiometicina, calomel. Verde a azul: ditiazanina. Marrn: antraquinonas. Rojo: fenolftalena, pamoato de pirivino, tetraciclinas em jarabe, bromosulfalena. Amarillo: santonina, antibiticos. Claro a blancuzco: brio, anticidos. Naranja rojizo: fenazopiridina. Rosa a rojo a negro: anticoagulantes dosis excesivas, salicilatos.

Como se pude observar la historia clnica del paciente , los antecedentes dietticos y el tratamiento bajo el cual se encuentre el paciente , son aspedctos sumamente importantes que debe saber el Qumico clnico para poder distinguir anormalidades importantes en las heces fecales de simples interferencias.

EXAMENES PARASITOLOGICOS :
CARACT. DE LAS HECES :
I

Consistencia Color Mucus, Sangre Especmenes

* EXAMEN MACROSCOPICO : TAMIZADO

(Nematodos adultos y huevos de Taenia) SOLUCION SALINA: METODO DIRECTO

ideal para buscar trofozoitos mviles larvas Trofozoitos y Quistes al natural

LUGOL :

Estructuras internas , ncleos y vacuolas . Huevos y lavas

FLOTACION

FAUST (ZnSO4)
(til para quistes y huevos)

MUESTRA:
Heces Esputo , Contenido duodenal Secrecin biliar

II

* EXAMEN MICROSCOPICO :

TUBO METODOS DE CONCENTRACION COPA

POR SEDIMENTACION -FLOTACION

RITCHIE
huevos)

(til para quistes ooquistes y

BAERMAN (til para

larvas de Strongyloides Necator y Ancylostoma)

III

* EXAMEN CUANTITATIVO
(Recuento de huevos )

POR DILUCIN FROTIS GRUESO

STOLL
Ideal para huevos de Ancylostoma y Necator

KATO
Ideal para huevos de helmintos

GRAHAM til para huevos de Enterobius ,Ascaris,Trichuris,Hymenolepis,y Taenia CPSULA DUODENAL DE BEAL(til para trofozoitos de Giardia, larvas de Strongyloides
huevos de Uncinarias)

IV

EXAMENES ESPECIALES:

HARADA MORI HEMOCULTIVO

(til para Uncinarias y Strongyloides) Hemoflagelados Tripanosomiasis.

*DIAGRAM A DE FLUJO DE UNA :

* MUESTRA FRESCA DE

HECES

DIARREICAS

LIQUIDAS

SIN MOCO :

CON MOCO

SIN MOCO

CON MOCO

EXAMEN EN FRESCO CENTRIFUGAR : POSITIVO

**TROFOZOITOS: E.histolytica Giardia lamblia Balantidium coli

MEZCLAR Y

NEGATIVO SEDIMENTO

CENTRIFUGAR

SEDIMENTO

QUISTES Balantidium coli Giardia lamblia

FROTIS DEL SEDIMENTO NEGATIVO POSITIVO

OOQUISTES: Cryptosporidium I. belli B, hominis Cyclosporidium

**
BAERMAN
Larvas Strongyloides

HEMATOXILINA FERRICA O TRICROMICA

Trofozoito de Entamoeba Quistes de G,lamblia

ZIEHL-NEELSEN
Coccidios til para Ooquistes de I, belli

LARVAS:

S, stercolaris
HUEVOS :

H, nana

* TAMIZADO

GENERALIDADES: La tcnica de tamizado Permite observar directamente las caractersticas morfolgicas de los parsitos adultos, enteros o fraccionados. tal es el caso de los helmintos: Taenia solium y T. saginata Es un parsito importante del hombre en aquellos lugares donde el consumo frecuente de la carne de cerdo y de res cruda o insuficientemente cocida, ya que la carne de estos animales puede contener las fases larvarias de las tenias mencionadas, las cuales se denominan metacstodos o cisticercos. Fases de desarrollo:

Adulto (de T. solium.) Mide de 2 a 7 metros de longitud y posee esclex o cabeza cuadrangular de aproximadamente 1 mm de dimetro, con cuatro ventosas musculares grandes en forma de copa que miden 0.5 mm de dimetro y rostelo prominente, redondeado y armado con una doble corona de ganchos en nmero de 22 a 32. Luego sigue el cuello y la cadena estrobilar compuesta por unos 1,000 a 2,000 segmentos o progltidos. Metacstodo, cisticerco, etc. Existen dos tipos fundamentales el de T. solium, tambin denominado Cysticercus cellulosae, el cual es una vescula blanquecina de 0.5 a 1.5 cm de ancho, con esclex invaginado y armado con doble corona de ganchos, al igual que el adulto, y el de T. saginata, denominado Cysticercus bovis, ms o menos con las mismas caractersticas que el anterior, pero sin corona de ganchos en el esclex. Huevos: Los huevos que producen los adultos de ambas especies de Taenia son semejantes e indistinguibles al examen microscpico. Son esfricos, miden de 30 a 45 micras de dimetro y poseen una cpsula gruesa radiada y una membrana hialina de origen embrionario. En su interior, se encuentra el embrin (oncosfera o embrin hexacanto) que generalmente posee tres pares de ganchos.

EXAMENES DE LABORATORIO: Despus de la expulsin espontnea de progltidos, estos se pueden recuperar por medio de la tcnica de TAMIZADO en heces expulsadas durante 24 horas. En caso de obtenerse progltidos, deben comprimirse entre dos portaobjetos y observarlos a contraluz o en un microscopio estereoscpico. Hay que estudiar los progltidos grvidos y contar el nmero de ramas uterinas, ya que en caso de pertenecer a la especie T. solium son poco numerosas (8 a 12), y si se trata de T. saginata, generalmente son numerosas (12 a 24). Mediante el TAMIZADO de las heces tambin es posible recuperar el esclex, sobre todo despus de los tratamientos, el cual se observar bajo el microscopio para determinar sus caractersticas morfolgicas. Ocasionalmente se pueden encontrar huevos de Taenia sp. por los exmenes coproparasitoscpicos de flotacin como el Faust, Ferreira, etc, o de sedimentacin, como el Ritchie, o a buscar huevos de Enterobius vermicularis mediante el mtodo de Graham. Es importante decir, que el hallazgo de los huevos de Taenia sp. por cualquiera de los mtodos empleados de ninguna manera permiten realizar el diagnstico de una especie de tenia, y slo se informan como "huevos de Taenia sp." Recientemente, se ha desarrollado la deteccin de coproantgenos de Taenia; pero tampoco permiten discriminar la especie.

II.

EXAMEN MICROSCPICO:

* COPROPARASITOSCOPICO

DIRECTO

FUNDAMENTO : Este mtodo permite buscar principalmente en muestras frescas , la presencia de formas evolutivas mviles de parsitos de tamao microscpico ( trofozoitos, quistes de protozoos: Entamoeba histolytica,Giardia lamblia (duodenalis) ,Balantidium coli etc, as como larvas o huevos de helmintos: Strongyloides stercolaris, Ancylostoma duodenale, Necator americanus, Paragonimus,Fasciola etc) MATERIAL y EQUIPO Aplicadores de madera Portaobjetos de 25 X 76 mm Cubreobjetos de 22 X 22 mm Solucin salina isotnica Lugol Microscopio METODO: a) En un portaobjetos limpio y desengrasado, se colocan separadamente, una gota de solucin salina y otra de lugol. b) Con el aplicador de madera se toma una muestra de 1 a 4 mg de heces 8 en muestras con sangre y moco elegir esa parte para estudiar) y se mezcla con la solucin, con el mismo aplicador se retiran las fibras y otros fragmentos gruesos, procurando hacer una suspensin no un frotis. c) Colocar el cubreobjetos. d) Repetir estas operaciones en la gota de lugol. e) Observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X. No es recomendable usar objetivo de inmersin (100 x) , pues se puede ensuciar el microscopio. Recorrer la lamina siguiendo un sentido direccional , ejemplo :de derecha a izquierda , o de arriba abajo.
NOTA: Con el suero fisiolgico, los trofozoitos y quistes de los protozooarios se observan en forma natural , y con lugol , las estructuras internas , ncleos y vacuolas.

INTERPRETACION DE RESULTADOS: Se informar detalladamente la presencia de alguna forma parasitaria observada durante el anlisis coproparasitoscopico , indicando su especie y estado evolutivo (trofozoito, quiste en caso de un protozoo) (huevo , larva en caso de un helminto)

* COPROPARASITOSCPICO MEDIATO O INMEDIATO CON

COLORANTES VITALES

FUNDAMENTO: Este mtodo nos permite diferenciar correctamente los diferentes protozoos basndose en las caractersticas morfolgicas de cada uno de ellos observando sus ncleos, endosomas, etc .mediante la utilizacin de los colorantes vitales ( azul de metileno, rojo congo, eosina, verde de malaquita, verde de Janus, Safranina) MATERIAL y EQUIPO Aplicadores de madera Portaobjetos de 25 X 76 mm Puente de tincin Lmpara de alcohol Azul de metileno al 3.5% Agua destilada Microscopio

METODO: a) En un portaobjetos se coloca una gota de azul de metileno al 3.5% b) Se toma una porcin pequea de heces fecales con un aplicador y se realiza una suspensin homognea con el colorante. c) Se deja actuar el colorante por 3 minutos o bien se flamea pero sin que hierva la muestra, slo hasta la emisin de vapores. Observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X. INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algn parasito durante la realizacin de esta prueba se deber anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito as como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

* MTODO DE CONCENTRACIN
FAUST

POR FLOTACION

FUNDAMENTO: Se basa en que los quistes y/o huevos de los parsitos flotan en la superficie por ser de menor densidad que el sulfato de zinc a 33,3%, cuya densidad es 1180. Es til para la bsqueda de quistesy/o huevos de parsitos y excepcionalmente se observan larvas. Se recomienda controlar la densidad del sulfato de zinc y usar agua filtrada para el lavado previo de la muestra.

MATERIAL y EQUIPO Vaso de precipitado de 50 ml Tubos de ensaye de 15 X 100 mm Gradilla Embudo de polietileno Gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado Portaobjetos de 76 X 26 mm Cubreobjetos de 22 X 22 mm Aplicadores de madera Asa de alambre terminada en crculo de 3 a 5 mm de dimetro y formando ngulo recto con el resto del alambre. Solucin de Sulfato de Zinc 1.180 Baum Lugol Microscopio Centrfuga

METODO: a) Se hace una suspensin homognea con 1 g de materia fecal y 10 ml de agua. b) Se filtra la suspensin a travs de la gasa colocada en el embudo, colectando el filtrado directamente en el tubo. c) Se centrifugan los tubos a 2000 rpm durante 1 min. d) Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento con agua. Se centrfuga nuevamente, repitiendo la misma operacin hasta que el sobrenadante se observe limpio. e) Se decanta el ltimo sobrenadante, se resuspende el sedimento y se agrega Sulfato de Zinc 1.180 Baum y se centrfuga a 2000 rpm durante 1 min. f) Con el asa se recoge la muestra de la pelcula superficial que se encuentra en el menisco, dos o tres ocasiones y se deposita sobre el portaobjetos; se aade una gota de lugol, se mezcla con el ngulo del cubreobjetos y se cubre con el mismo. g) Se observa la preparacin con objetivos de 10 X y 40 X.

INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algn parasito durante la realizacin de esta prueba se deber anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito as como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

METODO DE CONCENTRACION POR SEDIMENTACIN RITCHIE

FUNDAMENTO: Se basa en la concentracin de los quistes y huevos por sedimentacin mediante la centrifugacin, con la ayuda de formol y ter para separar y visualizar los elementos parasitarios. Unas ventajas que tiene este mtodo es concentrar y no deformar las formas parasitarias, permite el transporte y almacenamiento de la materia fecal procesada antes de ser examinada, se usa cuando se necesita una tcnica para evaluacin de tratamiento y determinacin de frecuencia. MATERIAL y EQUIPO Centrfuga Tubos de ensaye cnicos de 15 ml Gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado Embudos de polietileno Vasos de precipitado de 50 ml Aplicadores de madera Pipetas Pasteur con bulbo Portaobjetos de 26 X 76 mm Cubreobjetos de 22 X 22 mm Solucin salina isotnica Solucin de formaldehido al 10% Microscopio

METODO a) Con el aplicador de madera se coloca aproximadamente 1 gr. de la materia fecal en el vaso de precipitado, se aaden 10 ml de solucin salina y se homogeniza. b) Se filtra la suspensin a travs de la gasa colocada en el embudo, recogiendo el filtrado en el tubo cnico. c) Se centrfuga la suspensin durante 1 min a 2000 rpm. d) Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento con solucin salina, centrifugando, decantando y resuspendiendo las veces necesarias hasta que el sobrenadante sea claro. e) Al ltimo sedimento se agregan 10 ml de solucin de formaldehdo al 10%, se mezcla y se deja reposar durante 10 min. f) 6.- Se aaden despus 5 ml de ter, se tapan los tubos con tapones de caucho y se agitan enrgicamente durante 30 segundos. g) Se centrfuga durante 2 minutos a 1500 rpm. h) Despus de centrifugar se observan 4 capas: ter en la superficial, un tapn de restos fecales, formaldehdo, sedimento en el fondo del tubo, conteniendo los elementos parasitarios.

i) Se introduce la pipeta Pasteur hasta la capa d, se extrae con cuidado una gota del sedimento y se coloca en un portaobjetos. j) Se le aade una gota de lugol y con uno de los ngulos del cubreobjetos, se homogeniza, cubrindolo con el mismo. k) Se observa la preparacin en el microscopio con objetivos de 10X y 40X.

INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algn parasito durante la realizacin de esta prueba se deber anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito as como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

III.

EXAMEN CUALITATIVO :

* MTODO DE DILUCION

DE STOLL

FUNDAMENTO: Este mtodo se basa en los principios de saponificacin, homogenizacin y aclaracin. El NaOH 0.1 N al ponerse en contacto con las grasas de las heces se saponifica, hace que los huevos de los parsitos sean menos pegajosos, desinfecta y deodoriza la muestra.

MATERIAL y EQUIPO Probeta graduada de 100 ml con tapn esmerilado Pipetas de Stoll o graduadas de 2 ml en 0.01 ml. Varilla de vidrio de 20 cm de longitud Perlas de vidrio Portaobjetos de 74 X 38 mm NaOH 0.1 N Microscopio

METODO: a) Se coloca en la probeta Hidrxido de Sodio 0.1 N hasta la marca de 56 ml. b) Con la varilla de vidrio, se aade materia fecal hasta aforar a 60 ml. c) Si las heces son duras, se espera un tiempo a que se reblandezcan. d) Se aaden 15 perlas de vidrio, se tapa la probeta, se agita fuertemente, de arriba abajo, durante 1 minuto, hasta formarse una suspensin homognea. e) Los huevos y restos empiezan a precipitar en cuanto cesa la agitacin. Con la pipeta se toma inmediatamente 0.075 o 0.15 ml del centro de la suspensin. Se recomienda el segundo volumen, que da una muestra mayor para el recuento. Llevando la punta de la pipeta al centro del matraz, el error debido a la precipitacin de los huevos disminuye. f) Se pasa la totalidad del contenido de la pipeta a un portaobjetos y se cubre la gota con el cubreobjetos.

g) Se examina la preparacin sistemticamente con el objetivo seco dbil y se cuentan todos los huevos y larvas presentes cuidando no contar dos veces la misma estructura. CALCULOS: El nmero de huevos y larvas contados se multiplica por: 100, si la materia fecal es dura. 200, si la materia fecal es pastosa. 400, si la materia fecal es lquida.

NOTA: Estos factores dependen de la cantidad de agua que las muestras contengan. El resultado se expresa en huevos o larvas por ml de heces ( H.ml.H) Los quistes nicamente se reportan, sin cuantificarse.

INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algn parasito durante la realizacin de esta prueba se deber anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito as como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

* METODO CUANTITATIVO DE FROTIS GRUESO KATO

FUNDAMENTO: Es un mtodo cuantitativo de helmintos. El cual se basa en la accin que tiene la glicerina como aclarador de los huevos de helmintos y el verde de malaquita como colorante de contraste. MATERIAL y EQUIPO Aplicadores de madera Malla de alambre Papel celofn de grosor medio, no resistente a la humedad recortado en cuadros de 22 X 40 22 X 30 mm Recipiente conteniendo glicerol Verde de malaquita al 3% Microscopio METODO: a) Con un abatelenguas, pasar 50- 60 mg de materia fecal a un portaobjetos a travs de la malla metlica. b) Cubrir la muestra con el cubreobjetos de celofn embebido en la solucin de verde de malaquita y glicerol. Invertir la preparacin, presionar sobre una hoja de papel filtro contra la superficie de la mesa de trabajo, para lograr la extensin de la muestra hasta cubrir un rea de 20 a 25 mm de dimetro. c) Dejar reposar la preparacin con el cubreobjetos de papel celofn hacia arriba durante una hora a temperatura ambiente o 30 minutos a 34-40C. Esto motivar el aclaracin de las heces, sin que se aclaren los huevos de helmintos. d) Observar al microscopio, hacer el conteo de los huevos que se encuentren en la preparacin. Para obtener la cifre total, cada cuenta alcanzada, multiplicarla por el factor correspondiente para expresarla en huevos por gramo de heces (h.g.h) Si se pesaron 50 mg , multiplicar por 20 que es un factor constante y el producto ser la cifra a reportar. e) Debe evitarse exceder el tiempo de aclaracin porque esto dificultara la observacin de los huevos de helmintos. Si fuese necesario demorar la observacin puede detenerse el proceso de aclaracin invirtiendo la preparacin es decir colocarla con el papel celofn hacia abajo hasta el momento que se vaya a observar. INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algn parasito durante la realizacin de esta prueba se deber anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito as como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

IV.

EXAMENES ESPECIALES :

* METODO DE GRAHAM (RASPADO PERIANAL)

FUNDAMENTO: Esta tcnica se basa en que la hembra adulta de Enterobius vermicularis habitualmente no deposita sus huevos en el interior del intestino, sino que por lo general emigra durante la noche, hacia las mrgenes del ano, depositando los huevos en los pliegues perianales. Es por esto que la toma debe efectuarse en la maana indicando que debe ir a defecar y no debe baarse. Ocasionalmente se pueden encontrar huevos de Ascaris 28umbricoides, Trichuris trichiura, Hymenolepis nana, Taenia sp. MATERIAL y EQUIPO Portaobjetos De 26 X 76 mm Abatelenguas Cinta de celulosa Scotch Microscopio

METODO: a) Sobre un extremo del abatelenguas se coloca la cinta Scotch con la parte adherente hacia fuera, sujetndola con los dedos pulgar e ndice. b) Se presiona la superficie sobre la regin perianal hacia uno y otro lado, finalmente se hace un frote perianal. c) Separar cuidadosamente la cinta del abatelenguas y adherirlo sobre un portaobjetos. d) Observar con objetivo de 10X.

INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algn parasito durante la realizacin de esta prueba se deber anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito as como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

* MTODO DE HARADA MORI

FUNDAMENTO: este mtodo permite Realizar un cultivo de huevos para obtener desarrollo de larvas y as poder precisar la especie. MATERIAL Y EQUIPO: Agua Destilada Tubos de ensaye de punta cnica de 15 ml Gradilla Abatelenguas o aplicadores de madera Tiras de papel filtro de 13 X 120 mm Portaobjetos de 26 X 76 mm Cubreobjetos de 22 X 22 mm Pipetas Pasteur con bulbo Sol. De lugol o cido actico al 20% Microscopio METODO: a) Se extiende una fina pelcula de heces ( de 1 a 2 mm) en un lado del tercio medio de una tira de papel filtro. b) Se coloca el papel en un tubo de ensaye con 3 ml de agua destilada forzando la tira hasta aproximadamente el nivel de 1 cm y presionando el lado limpio contra la pared del tubo. c) Se conserva el cultivo a temperatura ambiente (24-28C) en la oscuridad durante un periodo de 1-5 das aadiendo agua segn se vaya necesitando para mantener el nivel bastante por encima del extremo inferior del papel filtro. d) El flujo capilar del agua que sube a travs del papel y la pelcula fecal mantiene hmedas las heces y transporta sus elementos solubles hacia la parte superior del papel, donde se evaporan o acumulan en un depsito oscuro. e) Al alcanzar la fase infecciosa, las larvas migran hacia abajo contra la corriente del flujo del agua, y al alcanzar el nivel de sta se sumergen hacia el fondo, donde pueden verse con una lupa y tomarse con una pipeta para su examen microscpico. f) La tira de papel filtro puede transferirse a un tubo limpio lleno de agua para recoger las larvas que hayan podido quedar en la pelcula fecal. g) Algunas especies de larvas tienen tendencia a no migrar hacia abajo. Antes de retirarlas, las larvas pueden inmovilizarse introduciendo el tubo a bao Mara (5060C) o aadiendo una cantidad de cido Actico al 20%.

INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algn parasito durante la realizacin de esta prueba se deber anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito as como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

* METODO DE BAERMAN
Fundamento: Se basa en los tropismos positivos: geotropismo, termotropismo e hidrotropismo de los trofozotos de protozoos y larvas de helmintos. Es til principalmente para Balantidium coli y larvas de Strongyloides stercoralis. MATERIAL Y EQUIPO: Embudo de vidrio Gasa Coladera metalica Pipeta pasteur Portaobjetos Solucin salina Microscopio Estufa METODO: a) b) c) d) e) Colocar la coladera metlica con la gasa doblada dentro del embudo Colocar dentro de la gasa de 3 a 4 grs de heces Verter solucin salina a 370C en cantidad suficiente Dejar a temperatura o en la estufa a 280C 370C de 30 a 50 minutos. Sacar la coladera o rejilla y con ayuda de una pipeta Pasteur, obtener un mililitro de sedimento. f) Colocar dicho sedimento en un portaobjetos y observar al microscopio. g) Se debern reportar los estadios evolutivos de los parsitos encontrados.

INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algn parasito durante la realizacin de esta prueba se deber anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito as como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

*ESTUDIO DE AMIBAS DE VIDA LIBRE

GENERALIDADES: Las amebas de vida libre son numerosas y se encuentran en la naturaleza, en medios como: agua, suelos y vegetacin. Los gneros Naegleria y Acanthamoeba ; tienen importancia en salud pblica ya que pueden producir enfermedades de tipo mortal como la meningoencefalitis. La puerta de entrada para estas amebas al ser humano es a travs de la piel o de las mucosas, as como tambin la inhalacin de agua o aire contaminados con estos patgenos. Una vez en el organismo, aparece una lesin y a travs del sistema circulatorio, las amebas pueden alcanzan el sistema nervioso central. En este tipo de infeccin las lesiones se caracterizan por formar grnulos o tumoraciones en los tejidos. Naegleria fowleri; causa una infeccin llamada meningoencefalitis amebiana primaria (MEAP). Esta infeccin se adquiere por la inhalacin de agua con amebas. Una vez en las fosas nasales las amebas viajan rpidamente a travs de los tejidos olfatorios llegando al cerebro y concentrndose en el encfalo. Dado que la invasin es muy rpida y las amebas se reproducen aceleradamente, comienza la destruccin masiva del cerebro y ocurren numerosas hemorragias en gran parte del sistema nervioso central, y la muerte sobreviene en el lapso de tres y siete das, dependiendo del manejo y resistencia del paciente, as como de la virulencia del microorganismo invasor. infeccin se adquiere por la inhalacin de agua con amebas. Las amebas del gnero Acanthamoeba son capaces de producir un padecimiento llamado encefalitis amebiana granulomatosa (EAG) o acantamebiosis, adems de otras enfermedades en ojo, odos, piel, pulmn, hgado, prstata y tero entre otros rganos.

DIAGNOSTICO EN EL LABORATORIO: Para identificar las amebas de Naegleria fowleri; se debern realizar frotes de LCR y teir con Wright o Giemsa. Es importante decir, que en estas preparaciones, las amibas muestran abundante citoplasma azulado y un nucleo pequeo y delicado de color rosa.El LCR en estos casos es purulento o sanguinolento, con leucocitos, principalmente neutrofilos hasta ms de 20,0007mm3, la glucosa es baja y el contenido de protenas alto. Para la identificacin de Acanthamoeba en LCR se deben Observar de manera directa de la formas trofozoiticas. En tejido nervioso se deben observar las formas qusticas.

* ESTUDIO DE PROTOZOARIOS CILIADOS INTESTINALES

FUNDAMENTO: Este mtodo permite hacer la identificacin por medio de un examen coproparasitoscpico directo del trofozoito en heces diarreicas y el quiste en heces formadas del parsito Balantidium coli.

MATERIAL Y EQUIPO Aplicadores de madera Portaobjetos de 25 X 76 mm Cubreobjetos de 22 X 22 mm Solucin Salina isotnica Lugol Agua destilada Microscopio Materia fecal porcina

METODO a) Colocar en un lado del portaobjetos una gota de solucin salina y del otro extremo una gota de lugol. b) Agregar una porcin de materia fecal porcina y homogeneizar. c) Colocar el cubreobjetos procurando no hacer vacos. d) Observar al microscopio con objetivos de 10X y 40X. e) Hacer los dibujos y anotar resultados. INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algn parasito durante la realizacin de esta prueba se deber anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito as como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos)

* ESTUDIO DE PROTOZOARIOS CILIADOS EN CAVIDADES

FUNDAMENTO: Este mtodo permite demostrar la presencia de protozoarios flagelados en exudados vaginales y uretrales y en orina por medio de examen directo. El parasito ms comnmente encontrado es Trichomonas vaginalis. MATERIAL Y EQUIPO Microscopio Hisopo Portaobjetos Cubreobjetos Tubo de ensaye con sol. Isotnica estril Espejo vaginal Puente de tincin Pipeta Pasteur con bulbo Aceite de inmersin Colorante de Wright Secrecin vaginal, uretral u orina Pizeta con agua destilada METODO: a) b) c) d) e) Se coloca a la paciente en posicin ginecolgica. Introducir con cuidado el espejo vaginal. Con un hisopo tomar la muestra del fondo de saco posterior. Depositar la primera toma en un portaobjetos limpio y hacer un extendido. La segunda toma depositarla en un tubo de ensaye con solucin salina conservando a 37C. f) Una vez seco el extendido se procede a teir con el colorante de Wright de 1 a 3 min. g) Se observa al microscopio con objetivos de 10X, 40X y 100X agregando a ste ltimo aceite de inmersin. h) Con una pipeta Pasteur se toma una gota del fondo del tubo de ensaye y se deposita en un portaobjetos y se cubre. i) Examinar con objetivos de 10X y 40X. INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algn parasito durante la realizacin de esta prueba se deber anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito as como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos).

* ESTUDIO DE EXPECTORACION PARA LA BUSQUEDA DE

PARASITOS PULMONARES
FUNDAMENTO: este mtodo consiste en investigar en secreciones pulmonares, presencia de protozoarios. MATERIAL Y EQUIPO Microscopio Portaobjetos 25 X 76 mm Aplicador de madera Mechero Puente de tincin Colorante de Giemsa Sol. Buffer ph 7.0-7.2 Aceite de inmersin Frasco con expectoracin o material de aspiracin bronquial

METODO: a) En un portaobjetos limpio y desengrasado hacer un frotis de la expectoracin. b) Dejar secar 5 minutos. c) Proceder a teir cubriendo el frotis con sol. colorante de Giemsa por 30 minutos, escurrir y lavar con sol. buffer, escurrir y dejar secar. d) Observar al microscopio con objetivos de 10X, 40X y 100X agregando a esta ltima observacin aceite de inmersin. INTERPRETACION DE RESULTADOS: En caso de encontrar algn parasito durante la realizacin de esta prueba se deber anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito as como su estadio evolutivo (trofozoito o quiste en el caso de los protozoos y huevo o larva en caso de helmintos).

* ESTUDIO DE PLASMODIUM

GENERALIDADES: El procedimiento para el diagnstico de protozoos en sangre circulante es el estudio al microscopio de preparaciones en portaobjetos las cuales son la extensin fina y la gruesa. La extensin fina ideal es la que tiene el grosor de una clula y en la que los elementos celulares aparecen algo aplanados. La extensin fina es til para estudiar detalles de los hemates y de los parsitos de la sangre, su principal limitacin es que la cantidad de sangre presente en la muestra es pequea.La extensin gruesa contiene 6-20 veces ms sangre por unidad de superficie que la extensin fina. Es fundamental que no se fije antes de la tincin ya que los hemates tienen que deshemoglobinizarse durante el procedimiento. La rotura de los hemates y la prdida de su hemoglobina permite la visin microscpica de las dems estructuras, incluidos los parsitos sanguneos, aunque se encuentren en la parte ms profunda de la extensin. La extensin gruesa resulta til para el diagnstico rpido de las parasitemias demasiado leves para apreciarse en la extensin fina, pero no sirve para estudios anatmicos finos. La toma de sangre perifrica para Plasmodium vivax y P. Malarie deben efectuarse cuando el paciente presenta escalofros para la bsqueda de esquizontes maduros. Para P. Falciparum se debe tomar la muestra despus del acceso febril para observar los eritrocitos con varios trofozoitos antes que estos desaparezcan en capilares de rganos internos. Con el colorante Giemsa las estructuras se tien de la siguiente manera: Plasmodium: Citoplasma azul o azul grisceo. Eritrocitos: Azulosos, grisceos y en ocasiones rosados. Ncleo de los Leucocitos: Violeta o morado. Plaquetas: Violeta ligero o rosa plido.

* COLORACION DE HEMATOXILINA FERRICA DE HEIDENHAIN

FUNDAMENTO:Esta tincin permite colorear estructuras internas de especmenes adultos o fragmentadas del mismo . Se usa en casos de cestodos y trematodos.
MATERIAL Y EQUIPO: portaobjetos Cubreobjetos Frasco coplin o placas Petri Colorante de hematoxilina Cytoseal o blsamo de Canad Alcoholes 50%, 70%, 85%, 95% Solucin Schaudinn Solucin mordiente de sulfato de fierro y amonio Tintura de yodo Solucin fisiolgica Microscopio binocular

METODO:
a) Preparar un set de placas petri 100 x 150 mm o el frasco Coplin con los reactivos correspondientes y con ayuda de un estilete o pinza curva hacer un frotis fino en la lmina o la laminilla, esta ltima sujeta al porta-laminilla. b) Si la muestra es dura, hacer una emulsin previa en solucin fisiolgica, realizar el frotis y pasaren solucin Schaudinn por 3 a 5 minutos. c) Pasar por alcohol 70% ms 1 a 2 gotas de tintura de yodo por 5 minutos d) Pasar por alcohol 70% y 50% de 5 a 10 minutos cada vez.-Pasar por agua corriente por 5 a 10 minutos e) Pasar por la solucin mordiente 2% de 5 a 10 minutos y enjuagar con agua corriente. f) Pasar por colorante por 5 a 10 minutos (1 mL de solucin colorante hematoxilina y 9 mL de agua) g) Lavar con agua y pasar por una segunda solucin de mordiente al 2% para decolorar, observandola intensidad de la coloracin h) Lavar con agua corriente a chorro continuo de 10 a 15 minutos i) Deshidratar pasando por alcohol 70%, 85%, 95% y absoluto, de 10 a 15 minutos cada uno j) Aclarar con xilol agitando el frotis, montar con cytoseal o blsamo de Canad y observar al microscopio. k) Informar el nombre del parsito y el estadio evolutivo

NOTA:
Observar con objetivo de inmersin 1000x. El citoplasma de los parsitos se observan de color azul oscuro y los ncleos de color morado intenso a negruzco.

INTERPRETACION DE RESULTADOS :En caso de encontrar algn parasito en la

tincin se deber anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito as como su estadio evolutivo .

* TCNICA DE ZIEHL NEELSEN

(MODIFICADA PARA OBSERVAR COCCIDIAS:

CRIPTOSPORIDIUM)
FUNDAMENTO: Se basa en el comportamiento acido-resistente de la cubierta de estos parsitos , los cuales se tien de rojo y destacan sobre un fondo verde o azul , dependiendo del colorante de contraste usado.

MATERIAL Y EQUIPO: Portaobjetos Cubreobjetos Puente para tincin Fucsina fenicada Verde de malaquita o azul de metileno acuoso Metanol Hidrxido de sodio al 4% Alcohol acido

METODO: a) b) c) d) e) Realizar un frote de heces en el portaobjetos y dejar secar. Colocar las laminas sobre el puente de tincin Fijar la lamina con alcohol metlico de 2 a 3 minutos y dejar secar Agregar hidrxido de sodio, sobre el preparado por un minuto y eliminar el exceso con agua de la llave. Cubrir la lamina con fucsina fenicada (previa agitacin del frasco que contiene dicho reactivo). Por 5 minutos. Es importante recordar que la fucsina debe ser diluida previamente con agua al tercio (1 ml de colorante mas 2 ml de agua) Lavar suavemente la lamina con agua corriente Cubrir el portaobjetos con alcohol acido por unos segundos hasta quitar el colorante. Lavar suavemente la lamina con agua corriente Colocar el colorante de contraste a la lamina que puede ser verde de malaquita al 1% o azul de metileno al 1.4%, durante 5 minutos( diluidas previamente al tercio) Lavar suavemente la lamina con agua corriente y secar a temperatura ambiente.

f) g) h) i)

j)

k) Realizar el montaje con cytoseal, blsamo de Canad o Permount, cubrir con un portaobjetos. l) Observar al microscopio.

NOTA: Los ooquistes de Cryptosporidium, Isospora y Cyclospora, aparecen de un color rojo fucsina, sobre un fondo verdoso (verde de malaquita). En algunos no se colorean bien, pero la refringencia caracterstica permite diferenciarlos.

INTERPRETACION DE RESULTADOS:
En caso de encontrar algn parasito acido alcohol resistente en la tincin se deber anotar en la hoja de resultados el nombre del parasito as como su estadio evolutivo .

*PROTOZOOARIOS INTESTINALES:

ENTAMOEBAS :

Entamoeba :

QUISTE

TROFOZOITO

*AMIBAS DE VIDA LIBRE :

AMEBA

TROFOZOITO

FLAGELADO TRANSITORIO

QUISTE

Naegleria fowleri

Acanthamoeba sp..

Balamuthia mandrillaris..

*PROTOZOOARIOS FLAGELADOS :

*PROTOZOOARIOS INTESTINALES CILIADOS , COCCIDIOS Y BLASTOCYISTIS:

* HELMINTOS :
HUEVOS DE NEMATODOS Y CESTODOS PRESENTES EN HECES :

*PROTOZOOARIOS INTESTINALES CILIADOS , COCCIDIOS Y BLASTOCYISTIS:

* HELMINTOS :
HUEVOS DE NEMATODOS Y CESTODOS PRESENTES EN HECES :

* HUEVOS DE TREMATODOS PRESENTES EN LAS HECES

ETAPAS JUVENILES , DE UNCINARIAS Y STRONGYLOIDES :

* PROGLOTIDOS GRAVIDOS Y ESCOLICES DE CSTODOS.

*ETAPAS RABDITOIDES Y FILARIFORMES DE UNCINARIAS Y STRONGYLOIDES:

*NOTA : LARVA RABDITOIDE : Larva de vida libre (viven en el ambiente ) LARVA FILARIFORME : Tipo de forma larvaria en la cual se transforma una larva rabditoide al encontrar un hospedero a quien parasitar

* TAMAO COMPARATIVO DE HUEVOS DE HELMINTOS :

* HEMOFLAGELADOS : Tripanosoma y Leishmania :

AM ASTIGOTE LEISHMANIA

PROMASTIGOTE LEPTOMONA

EPIMASTIGOTE CRITHIDIA

TRIPOMASTOGOTE TRIPANOSOMA

Cinetoplasto Cinetoplasto

Flagelo

Cinetoplasto

Flagelo

Cinetoplasto

Flagelo

Grnulos de votulina Cuerpo Basal Membrana ondulante Membrana ondulante Ncleo Ncleo *Forma transitoria *Forma infectante al hombre Ncleo Ncleo

* Plasmodium FASE ERITROCITARIA :

JOVEN

VIEJO

INMADURO

MADURO

MASCULINO

FEMENINO

TROFOZOITOS

EZQUIZONTES

GAMETOCITOS

* FIJADORES y/o CONSERVADORES

Los fijadores sirven para preservar protozoarios, sin que se modifiquen las estructuras internas, sobre todo cuando las muestras no pueden ser procesadas inmediatamente. El conservador mas utilizado en el laboratorio por econmico y eficaz es la Solucin de formalina al 10 % tambin conocido como formol , aldehdo frmico o formaldehido. Sin embargo a continuacin se har referencia a diversos conservadores que tambin se utilizan ampliamente dentro del laboratorio de Parasitologia :

I.

PAF (phenol-alcohol-formol):

UTILIDAD: Conserva las estructuras de los parsitos (trofozotos, quistes, huevos y larvas), pudindose incluso observarse en semanas o meses (6) sin que haya ocurrido deterioro alguno. Es recomendable mantener el fijador preparado en frascos color mbar. Adems, permite observar el material al microscopio. MATERIAL: Fijador PAF Tionina o azure A Agua destilada. Hisopo. Tubos de centrfuga de 15 mL. Aplicadores. Tritn NE. ter. Embudo de vidrio. Solucin fisiolgica

PROCEDIMIENTO: a) La muestra de heces se mezcla con el fijador en un recipiente en la proporcin 1:1. b) Para la observacin microscpica. Mezclar bien la muestra fijada en PAF y con ayuda de un embudo y una gasa doblada en un tubode 15 mL, colar de 3 a 4 mL del material fijado c) Agregar solucin salina hasta un volumen de 12 mL y centrifugar a 1800 r.p.m. por 3 minutos.

d) Decantar el sobrenadante y obtener un sedimento de 0,5 mL; si es menor, agregar de la muestra filtrada una cantidad suficiente y volver a centrifugar para obtener el volumen del sedimento deseado. e) Decantar el sobrenadante y completar 12 mL con solucin fisiolgica, emulsionar con el aplicador centrifugar a 1800 r.p.m. por 3 minutos. f) Repetir el centrifugado y lavar de 2 a 3 veces ms. g) Agregar 2 mL de solucin fisiolgica al sedimento final, emulsionar y obtener una gota del sedimento con una pipeta Pasteur y colocarla en una lmina portaobjetos h) Agregar una gota del colorante tionina o azure A, cubrir con una laminilla cubreobjetos y examinar al microscopio. i) Al sedimento emulsionado y sobrante del procedimiento anterior, agregar 10 mL de solucin fisiolgica y una gota de Triton NE. j) Mezclar, agregar 2 mL de ter, tapar con un tapn de jebe o de corcho, agitar suavemente y destapar. k) Centrifugar a 2 000 r.p.m. por 3 minutos, decantar y eliminar los detritus de las paredes del tubo mediante un aplicador cubierto de algodn. l) Agregar al sedimento 1 2 gotas de solucin fisiolgica, mezclar y obtener del fondo del tubo con una pipeta Pasteur una gota que se colocar en una lmina portaobjeto. m) Agregar una gota de colorante tionina o azure A, cubrir con una laminilla y observar al microscopio NOTA: Se debern observar los elementos parasitarios: el citoplasma se ve de color azul y el ncleo azul oscuro.

II.

PVA (alcohol polivinlico):

UTILIDAD: Fija y preserva, principalmente los trofozotos y quistes de protozoarios, por tiempo muy prolongado sin modificacin importante de su morfologa. MATERIAL: Solucin fijadora Conservador de PVA Aplicador Viales de vidrio de 3 a 4 mL. Portaobjetos

PROCEDIMIENTO: a) Colocar en una lmina portaobjetos 1 2 mg de muestra, b) Secar el frotis, agregar 2 3 gotas de PVA y secar o guardar hasta por 3 meses para colorearlos, c) Agregar al frasco que contiene la muestra v/v 1 a 4 mL. Generalmente se puede preservar por meses y cuando se considere conveniente se realizar la coloracin con Trichrome Gomori Wheatley.

III.

MIF (merthiolate - yodo - formol):

UTILIDAD: Fija y colorea simultneamente los quistes y huevos de parsitos, permitiendo la observacin inmediata de la muestra. MATERIAL: Solucin MIF Viales de vidrio de 3 a 4 mL. Aplicador

PROCEDIMIENTO: a) Colocar 1 2 mL de la solucin MIF en el vial con ayuda del una pipeta. b) Para la observacin microscpica, colocar 1 2 mL o su equivalente de la muestra fresca de heces. c) Mezclar y observar al microscopio. NOTA: Se debern observar los parsitos teidos de color amarillo oro.

IV.

FIJADORES PARA PRESERVAR HELMINTOS ADULTOS:

UTILIDAD: Conserva ejemplares adultos para su estudio morfolgico, su preservacin en museos o para contar con muestras de referencia. Los ms usados suelen ser formol al 10%, AFA (cido actico - Formol- Alcohol) o SAF (Acetato sodio - cido actico - formol)

MATERIAL: Formol 10% Solucin AFA Alcohol 70% Glicerina 5% Lminas portaobjetos. Pabilo o pesas de metal segn modelo Frascos boca ancha 150 200 mL. Placas petri 150 x 100 mm y 240 x 200 mm. PROCEDIMIENTO: Coleccin y lavado de los helmintos: a) Todo espcimen aislado del hospedero debe mantenerse fresco (agua o suero fisiolgico) en un frasco con tapa. b) Los adultos colectados son lavados varias veces con solucin fisiolgica, para eliminar la mucosidad y otras sustancias adheridas al cuerpo del helminto. c) Finalmente, se lava con agua para permitir el relajamiento del parsitoCalentar a 55C de temperatura, alcohol de 70%, formol 10% AFA, para que con la fijacin los ejemplares queden estirados y pueda observarse sus estructuras internas. Fijacin: d) Para una conservacin apropiada usar formol 10% (para cstodos y tremtodos) o una mezcla de alcohol 70% (para nemtodos), ambos con glicerina 5%. e) Todos los frascos deben ser rotulados, indicando el nombre del parsito, procedencia, localizacin y fecha de coleccin. f) Para la identificacin, en ocasiones se requiere hacer el aclaramiento con lactofenol. Aplanamiento: g) til para cstodes y tremtodes, los cuales se colocan entre lminas y se les ajusta con el pabilo para favorecer su aplanamiento h) Se sumerge en formol 10% o AFA de 1 a 3 das, luego del cual se puede colorear o conservar como pieza de museo en formol 10% y glicerina 5%. i) Los tremtodes como Fasciola y/o Paragonimus pueden prepararse y conservarse siguiendo los pasos dados para los cstodos.

AFA: Fijador conteniendo alcohol, formol y cido actico. CPSULA OVGERA: Vescula que contiene huevos. CESTODO: Gusano o helminto platelminto de forma acintada. COLORANTE VITAL: Colorante que permite ver la estructura interna del parsito vivo. COPRO-ANTGENO: Antgeno presente en las heces. CRISTAL DE CHARCOT - LEYDEN: Cristales de protenas provenientes de los grnulos de eosinfilos, que se destruyen en el intestino. DIAFANIZAR: Aclarar para facilitar la visualizacin microscpica DIAGNSTICO PARASITOLGICO: Demostracin directa o indirecta de alguna forma o estadio evolutivo del parsito. ENTEROPARSITO: Parsito que tiene por hbitat el tubo digestivo, especialmente el intestino. ESPORA: Esporoquiste aislado. ESPOROQUISTE: Quiste con cubierta definida que contiene esporozotos. ESTRBILA: Porcin del cuerpo de las tenias o cstodes formadas por una cadena de progltidos. FIJACIN: Conservacin de la estructura del parsito. HECES: Mezcla de productos de excrecin y secrecin que se eliminan por el intestino. HELMINTO: Ser pluricelular con exoesqueleto flexible, ausencia de apndices y con movimientos reptantes. HPG: Nmero de huevos por gramo de heces. HUEVO: Producto de la fecundacin con potencialidad de desarrollar un nuevo ser. LARVA: Estadio evolutivo de algunos seres vivos como los helmintos y los artrpodos en quienes an no se han desarrollado los aparatos genitales. MIF: Fijador que contiene merthiolate, yodo y formol. MONTAR: Colocar el espcimen entre lmina y laminilla con blsamo de Canad para su conservacin permanente. NEMATODO: Gusano o helminto de forma cilndrica. OOQUISTE: Quiste que contiene el huevo o cigoto.

PAF: Fijador y/o conservador conteniendo fenol, alcohol y formol para muestras con parsitos, sobretodo protozoario. PVA: Alcohol polivinlico, fijador para conservar los parsitos en muestras fecales. PARSITO: Ser vivo de escala zoolgica inferior que vive a expensas de otro de escala superior. PATOGENICIDAD: Capacidad de producir dao. PROTOZOARIO: Ser unicelular. PROGLTIDE: Segmento o anillo de la estrbila de las tenias o cstodes y que puede ser inmaduro, maduro o grvido, segn el estado de desarrollo de sus aparatos genitales.

QUISTE: Forma de resistencia de los protozoos, los cuales se rodean de una membrana dura e impermeable. SOLUCIN SOBRESATURADA: Solucin en la cual el soluto est en su mxima concentracin. TROFOZOTO: Forma vegetativa, libre y en movimiento de los protozoos. TREMTODE: Gusano aplanado o platelminto, que presenta su cuerpo indivisible.

BIBLIOGRAFIA:

http://groups.msn.com/parasitologia1 http://www.invdes.com.mx/anteriores/Febrero2002/htm/amebas.html http://www.drscope.com/privados/pac/generales/parasitologia/teniasis.html http://www.scribd.com/doc/2362490/Manual-parasitologia-laboratorio-parte-I http://www.scribd.com/doc/2362916/MANUAL-PARASITOLOGIALABORATORIO-PARTE-II http://www.scribd.com/doc/995852/165-NT37