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UNIVERSIDAD DEL MAGDALENA CATEDRA BIOQUIMICA LABORATORIO DE ESPECTROFOTOMETRIA

Herrera Herrera Anglica Esther 2011163001 Prez Huguett Daniel Mauricio - 2011163029 Pineda Garca Andrs 2011163054 Rojas Gmez Ana Mara 2011163030

GRUPO #1

Lic. JOAQUIN PINTO MENDEZ

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE ODONTOLOGIA SANTA MARTA MAGDALENA 27 de Septiembre de 2011

RESUMEN. Desde hace muchos aos se ha usado el color como ayuda para reconocer las sustancias qumicas; al reemplazar el ojo humano por otros detectores de radiacin se puede

estudiar la absorcin de sustancias, no solamente en la zona del espectro visible, sino tambin en ultravioleta e infrarrojo. Se denomina espectrofotometra a la medicin de la cantidad de energa radiante que absorbe un sistema qumico en funcin de la longitud de onda de la radiacin, y a las mediciones a una determinada longitud de onda. A continuacin haremos la medicin de ciertas muestras en medio cido y medio alcalino respectivamente con ayuda del espectrofotmetro, mediremos tambin la Transmitancia y Absorbancia de dichas muestras. Tabularemos y discutiremos los resultados.

PALABRAS CLAVES. Espectrofotmetro; Radiacin; Transmitancia; Absorbancia.

ABSTRAC. For many years it has been used the color to help recognize the chemical substances; to the replace the human eye by other radiation detectors can be study the absorption of substances, not only in the area of the visible spectrum, but also in ultraviolet and infrared. It is called spectrophotometry to the measurement of the amount of radiant energy that absorbs a chemical system in function of the wavelength of the radiation, and measurements to a specific wavelength. Below we will the measurement of certain samples in an acid environment and alkaline medium respectively with the help of the spectrophotometer, we will measure also the transmittance and absorbance of the samples. Sort and discuss the results.

KEY WORDS. Spectrophotometer; radiation; transmittance, absorbance.

MATERIALES Y METODOS MATERIALES Los materiales que se utilizaron para llevar a cabo esta prctica fueron: Tubos de ensayos con anticoagulantes. Gradilla para tubo de ensayo. Pipetas graduadas de 1,5 y 10 ml. Espectrofotmetro celdas. Torundas de algodn. Guantes de manejo. Jeringas de 5 CC. Pipeteador manual. Agua destilada o solucin salina a 0,9 %. Alcohol. Solucin de rojo fenol. HCL 0,1N. NaOH 0,1 N. Tambin preparamos una solucin patrn de rojo de fenol en un tubo de ensayo al cual le adicionamos 5 ml de solucin de rojo de fenol 2,5 mg %, 5 ml de agua destilada, pero como era para medio alcalino le adicionamos 0,1 de NaOH 0,1 N, e hicimos lo mismo tomamos primero la longitud de onda de 380 y luego de 20 en 20 hasta llegar a METODOS PRIMERA PARTE: ESPECTRO DE 620. Con el valor obtenido de transmitancia, hallamos la absorbancia en cada longitud de onda. visible con sus Para el desarrollo de esta parte del laboratorio preparamos una solucin

patrn de rojo de fenol en un tubo de ensayo al cual le adicionamos 5 ml de solucin de rojo de fenol 2,5 mg %, 5 ml de agua destilada y 0,1 ml de cido clorhdrico 0,1 N (Cl.) Luego vertimos las soluciones patrn y blanco en las cubetas para as del poder

espectrofotmetro

introducirlas en este, para la obtencin de estos datos tomamos como longitud de onda inicial 380 y luego bamos subiendo de 20 en 20 hasta llegar a 620, esto lo hacamos midiendo primero la transmitancia del blanco y luego la de la muestras.

ABSORCION DEL ROJO DE FENOL EN MEDIO ACIDO Y EN MEDIO

ALCALINO.

SEGUNDA PARTE: CONSTRUCCION DE UNA CURVA DE CALIBRACION DE ROJO DE FENOL. Para la realizacin de este procedimiento tomamos cuatro tubos de ensayo; en el primer tubo de ensayo agregamos 10 ml de solucin de rojo de fenol 2,5 mg % y 0,1 ml de cido clorhdrico 0,1 N (HCl); en el segundo tubo en ensayo

acido como alcalino, esto dependiendo de la muestra que bamos a utilizar, la que contena HCl pues colocbamos la mayor longitud de onda para medio acido, pero si era la que tena NaOH utilizbamos la mayor longitud de onda para medio alcalino.

adicionamos 5 ml de solucin de rojo de fenol 2,5 mg %, 5 ml de agua destilada y 0,1 ml de cido clorhdrico 0,1 N (HCl); en el tercer tubo de ensayo agregamos 1 ml de solucin de rojo de fenol 2,5 mg %, 9 ml de agua destilada y 0,1 ml de cido clorhdrico 0,1 N (HCl); y el cuarto tubo que es la muestra blanco agregamos 10 ml de agua destilada y 0,1 ml de cido clorhdrico 0,1 N (HCl), todos tenan el mismo volumen final que esa 10,1. Luego hallamos la concentracin final de cada uno de los tubos, mientras

TERCERA PARTE: CUANTIFICACION DE LA HEMOGLOBIN EN UNA

MUESTRA DE SANGRE. Para realizar la siguiente parte del experimento, tomamos tres tubos de ensayo, el primer tubo (blanco) se le adicion 2,5 de solucin patrn con 10 ml de agua destilada; al segundo tubo de ensayo (muestra1) le agregamos 12 ml de solucin patrn con 10u de sangre; y en el tercer tubo (muestra 2)

adicionamos 10u de sangre ms 12 ml de agua destilada. Luego vertimos cada mezcla de los tubos del procedimiento anterior en cubetas para introducirlos en el espectrofotmetro, a una longitud de onda de 540, para hallar el valor de absorbancia de cada uno hemoglobina en la sangre.

obtenamos estos datos dejamos los tubos en reposo por 5 minutos. Seguido vertimos las distintas soluciones y blanco en las cubetas del

espectrofotmetro y seleccionamos la mxima longitud de onda tanto en media

RESULTADOS Y DISCUSIONES. RESULTADOS. En la experiencia el de laboratorio de cual la nos con el fin de evitar errores posteriores y realizar una lectura uniforme en el espectrofotmetro y finalmente para

utilizamos

mtodo con lo

espectrofotometra

realizar la medicin espectrofotomtrica tuvimos que calibrar el aparato a 0 absorbancia para lo cual usamos la muestra blanco, adems de esto,

pudimos dar cuenta Este es un mtodo muy confiable, siempre y cuando se tengan las precauciones del caso, como seria la limpieza en el trabajo, el orden y la precisin

debimos elegir cubetas que estuvieran en buen estado, es decir, que estuvieran dentro del rango de absorbancia

El practico realizado nos sirvi para valorar este mtodo bioqumico, ya que es muy usado y til como examen en el diagnostico en sospecha de alguna patologa de este tipo.

permitida de 0.015, ya que si hubiramos usado cubetas defectuosas se alterara la lectura real de nuestra muestra. Finalmente es importante considerar que, si bien se prepara una curva de con

Adems nos permiti darnos cuenta de la precisin y la dedicacin que se debe tener al

calibracin

lmites de linealidad determinados, en ms de algn caso la muestra a analizar puede tener concentraciones que se encuentren por sobre ese lmite de dilucin. En caso que ocurriera esto, lo ms conveniente es separar la muestra en varios recipientes y diluir cada uno de ellos en diferentes medidas, para as tener una que se pueda ubicar dentro del lmite de linealidad y que por ende sea cuantificable. Se debe tener el cuidado, posterior multiplicar a la la cuantificacin, por de el

realizar este tipo de procedimientos, ya que cualquier error en el mtodo nos entregara un resultado equivoco, cosa que no es para nada conveniente al momento de realizar un

diagnstico mdico. Es por eso que tuvimos el mximo de cuidado en esos puntos crticos.

El primer problema que se nos presento fue calcular correctamente las diluciones necesarias procurando usar

correctamente las unidades de medida, otro punto importante fue realizar una homogenizacin correcta de los tubos,

concentracin

nmero de veces que se diluyo la muestra a analizar para as obtener el resultado que requeramos.

continuacin

mostraremos

la

La segunda parte es la continuacin de la anterior, puesto que necesitamos saber en qu longitud de onda se present un mayor valor, para as poder

tabulacin de los resultados.

Medio acido Nm 360 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 T% 17.8 7.0 3.5 3.5 7.5 20.7 48.6 79.5 92.4 94.5 96.5 97.4 97.5 A 0.749 1.154 1.455 1.455 1.124 0.684 0.313 0.099 0.034 0.024 0.015 0.011 0.010

Medio alcalino T% 54.9 87.2 80.00 63.8 43.4 23.4 8.3 1.6 0.2 3.8 63.2 94.0 A 0.260 0.059 0.096 0.195 0.362 0.630 1.080 1.795 2.698 1.420 0.199 0.026

hallar la absorbancia, teniendo en cuenta que es necesario conocer cul es la concentracin final de rejo de fenol. Analizamos que la absorbancia y la concentracin son dependientes, ya que a medida que la concentracin es mayor la absorbancia tambin lo ser, es decir son directamente proporcional esto se da en el medio acido; mientras que en el medio alcalino a medida que la

concentracin era mayor la absorbancia es menor, esto nos dice que son indirectamente proporcional. La tercera parte, tomamos la muestra

DISCUSIONES. En la primera parte los resultados obtenidos en cada longitud de onda tanto en el medio acido como en el medio bsico son datos que varan, y eso es dependiendo a la cantidad de absorcin de luz. Adems se observ que la transmitancia y la absorbancia en los dos medios son inversamente

sangunea de nuestro compaero el cual se encuentra entre la edad de 18- 74 aos sexo masculino, el presenta 16,8 g/dL y esto nos muestra que est dentro de los valores normales de la

hemoglobina ya que es de 13,5-17,5 g/dL en hombres.

proporcionales, lo cual se sustent en el medio acido donde a medida que

aumentaba la transmitancia disminua considerablemente la absorbancia.

BIBLIOGRAFIA. LOPEZ COLOME, Ana Mara. Bioqumica y Biologa Molecular.

RENDINA George. Tcnicas de Bioqumica Aplicada.

SKOGG, D y WEST, D, HOLLER F. Qumica Analtica. 6Ed. Mc Graw Hill. Mxico. 1995.

CRISTIAN, D. Qumica Analtica. 2Ed. Limusa. Mxico 1981.

Hematologa, Salvat, Williams-Heuter-Erstev-Hundles, Tomo I y II

Leanza H, Giacoletto S, Najun C, Barreneche M: Niveles de hemoglobina y probabilidad de mejor calidad de vida en hemodializados crnicos.

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS 1. Realice una grfica en papel milimetrado con los datos de la tabla 4; as, % transmitancia Vs longitud de onda; y otra de absorbancia Vs longitud de onda Qu diferencia observa entre los dos grficos?

R// LA GRAFICA VER EN ANEXOS En la grfica de medio acido de % transmitancia Vs longitud de onda se observa que tiende a ser lineal y llega un momento en el que es casi constante; a diferencia en la de medio alcalino que primero desciende y luego asciende. En la grfica de medio acido de absorbancia Vs longitud de onda podemos ver claramente como la grfica desciende totalmente hasta llegar a un punto de ser negativo y en el medio alcalino la grfica va ascendiendo. 2. Cul es el valor mximo de absorbancia para el rojo de fenol en medio cido y en medio alcalino? Qu conclusin saca de esta diferencia?

R// En el medio acido la mayor absorbancia es de 0,74 con una longitud de onda de 400. En el medio alcalino la mayor absorbancia es de 0,89 con una longitud de onda de 540. De esto podemos concluir que en el medio acido se necesit una menor longitud de onda para mostrar su mayor absorbancia y que esto se da por lo que compone a cada una de las muestras ya que una es acida y la otra bsica.

3. Grafique en papel milimetrado los datos de la tabla 5 y la 6. Localizando los valores de absorbancia en el eje de las (Y) y la concentracin de los patrones en el eje de las (X). Localice el valor de absorbancia de la muestra problema y mediante interpolacin lineal calcule su concentracin.

R// VER ANEXOS

ANEXOS.