Cambios en la protena reguladora de protena G, RGS-4, en la esquizofrenia.

Resumen La etiologa de la esquizofrenia involucra una combinacin de factores genticos y epigenticos siendo la corteza prefrontal el sitio donde ocurren las mayores alteraciones. Los receptores presentes en esta regin alterada tienen en comn un componente: estn acoplados a la protena G. En consecuencia, la cascada de eventos que modulan la formacin y liberacin de la seal presinptica y la transduccin postsinptica mediada por los receptores acoplados a protena G, podra ser un punto clave que podra estar fallando en la esquizofrenia. La activacin de una protena G es iniciada por la unin del agonista a su receptor, generndole a ste un cambio conformacional que es transmitido a la protena G, causando que la subunidad Ga libere el GDP y se una al GTP. Posteriormente, la subunidad a se disocia de la bg y cada uno de estos componentes es capaz de activar distintos efectores. La sealizacin termina cuando la subunidad a hidroliza GTP, vuelve al estado unido a GDP y se reasocia con el dmero bg para volver a formar el heterotrmero inactivo. Las protenas activadoras de GTPasas (GAPs o RGS), son inducidas por la activacin del receptor para "apagar" la sealizacin. La expresin de la RGS-4 se encontr reducida de un 50 a un 84 % en la mayora de los pacientes esquizofrnicos. Esta protena reduce la duracin de la respuesta ya sea en receptores acoplados a protena G presinpticos o postsinpticos, incluyendo el receptor metabotrpico glutamatrgico (Gq y Gi), el serotonrgico 5-HT2 (Gq), el colinrgico muscarnico M1 (Gq) y el dopaminrgico D2 (Gi). La disminucin en los niveles de RGS-4 podra ser un mecanismo adaptativo para compensar el exceso de dopamina (DA) en el paciente con esquizofrenia y as restablecer la funcin modulatoria normal del circuito, o podra ser un factor causal. Palabras clave esquizofrenia RGS-4 protena G Introduccin La esquizofrenia afecta ms del 1% de la poblacin mundial, con sntomas clnicos que aparecen en la adolescencia tarda o la adultez temprana. La etiologa de la esquizofrenia involucra una combinacin de factores genticos y epigenticos, en procesos del neurodesarrollo, con aproximadamente 10 sitios cromosmicos vinculados a la enfermedad, siendo la corteza prefrontal el sitio donde ocurren las mayores alteraciones (2, 15). Los cambios en la corteza prefrontal pareceran involucrar una contra-adaptacin neuroqumica compensatoria. En todos los casos, los receptores involucrados tienen en comn un componente: estn acoplados a la protena G. En consecuencia, el nfasis se ha puesto en determinar algn sitio de anormalidad en la cascada de eventos que modulan la formacin y liberacin de la seal presinptica y la transduccin postsinptica mediada por los receptores acoplados a protena G (1), ya que se encontr que distintas enfermedades se caracterizaban por una insuficiente o excesiva transmisin de seales. Los defectos o excesos en la activacin de la protena G y sus protenas reguladoras pueden causar enfermedades de distintas formas. La produccin de una protena G defectuosa, que no puede hidrolizar GTP y terminar la seal, produce una actividad elevada y persistente del efector an en ausencia del estmulo. La disminucin de la produccin de una protena G normal o la produccin de una protena G inestable puede reducir la respuesta normal a la estimulacin. Por

ejemplo, puede producirse una enfermedad por exceso de la seal (en el clera, una mutacin en Gas inhibe la hidrlisis del GTP; en los adenomas adrenales, una mutacin en Gai inhibe la hidrlisis del GTP); por deficiencia de la seal (en el pseudohipoparatiroidismo hay una disminucin de la respuesta a hormonas por alteraciones en Gas) o por una seal inadecuada o excesiva (la toxina Pertussis induce una modificacin en un aminocido del Gai, bloquea la activacin por el receptor y disminuye la seal; en la Hipertensin Esencial, una subunidad b defectuosa aumenta la activacin del receptor e incrementa la seal). En esta revisin se describirn los sistemas de recepcin acoplados a protena G, as como su mecanismo de accin y su regulacin y su posible relacin con la esquizofrenia. Mecanismo de accin de la protena G. Unin a receptores La sealizacin a travs de receptores acoplados a protena G est involucrada en las respuestas celulares a estmulos extracelulares, lo cual debe estar muy regulado a corto y largo plazo (5). Los receptores acoplados a protena G juegan un rol importante en la transduccin de seales y son blancos de un gran nmero de drogas teraputicas (5). Estos receptores tienen una estructura en comn: poseen 7 dominios transmembrana conectados por 3 bucles extracelulares y 3 citoplasmticos. Los bucles extracelulares y todas las porciones de los dominios que apuntan hacia el lado extracelular son los dominios de la unin al ligando; los bucles citoplasmticos y el extremo carboxi-terminal contienen los sitios de unin a la protena G y el de fosforilacin para la cascada de desensibilizacin (12) (Figura 1).

Receptores de familias de diversa estructura molecular y vas de sealizacin diferente se pueden comunicar unos con otros compartiendo componentes de sealizacin, como por ejemplo una misma protena G. Como resultado, las clulas pueden registrar y procesar simultneamente estmulos distribuidos en un complejo medio ambiente, de una manera eficiente y ordenada (8). Las protenas G son protenas transductoras de seales que se ubican en la superficie interna de las membranas celulares. Son heterotrmeros (tres subunidades diferentes) que median los efectos de una gran cantidad de seales biolgicas y de compuestos farmacuticos importantes desde el punto de vista mdico (13). En su conformacin inactiva contienen las subunidades a, b y g y la a est unida a la guanosina difosfato (GDP). La activacin de una protena G es iniciada por la unin del agonista a su receptor, generndole a ste un cambio conformacional que es transmitido a la protena G causando que la subunidad Ga libere el GDP y se una al GTP (Figura 2). Posteriormente, la subunidad a se disocia de la bg y cada uno de estos componentes es capaz de activar distintos efectores, independientemente uno del otro. La sealizacin termina cuando la subunidad a hidroliza GTP, vuelve al estado unido a GDP y se reasocia con el dmero bg para volver a formar el heterotrmero inactivo (13). La unin del GTP a la subunidad Ga altera la conformacin de 3 regiones "interruptoras" en dicha subunidad, que son sus sitios de contacto primario con Gbg, promoviendo la disociacin de las subunidades. El intercambio de nucletidos de guanina puede ocurrir espontneamente, pero es acelerado por el receptor activado por el agonista y retardado por la unin a Gbg. Es decir que el receptor es un estimulador de la disociacin de los nucletidos de guanina y la Gbg un inhibidor. La activacin de la protena G depende de la tasa a la cual el receptor unido al ligando cataliza el intercambio de GDP por GTP en la subunidad a. Luego del intercambio, la subunidad a se disocia del receptor y de bg. El tiempo que Ga-GTP y Gbg pueden interactuar con los efectores, est determinado por la tasa a la cual Ga hidroliza el GTP a GDP. Luego de la hidrlisis, la Ga-GDP se une a Gbg con alta afinidad y termina su sealizacin (9, 20). La inactivacin requiere la hidrlisis del GTP unido a Ga, desplazando el equilibrio de la reaccin a favor de la re-asociacin de las subunidades (17) (Figura 3). El tiempo de vida de Ga-GTP y sus eventos de sealizacin asociados, est dictado por el tiempo de vida del complejo bg (18).

Muchos de los efectos fisiolgicos de las protenas G heterotrimricas estn determinados por sus subunidades a activadas (GTP unido), las cuales interactan con efectores tales como la enzima adenilil ciclasa y la fosfolipasa C. A su vez, la terminacin de estas respuestas es dependiente de la tasa de desactivacin de Ga, lo cual ocurre por hidrlisis de GTP a GDP, conduciendo a la re-unin con las subunidades bg y a la re-formacin del heterotrmero inactivo (21).

Cmo una protena G convierte la informacin temporal dinmica en respuestas celulares apropiadas, depende de la cintica del proceso de transduccin. Una cintica rpida permite a la clula preservar informacin temporal, mientras que respuestas ms lentas pueden ser tiles para filtrar, integrar y mediar respuestas (12). Las protenas G comprenden una superfamilia que incluye al menos 17 isoformas de Ga, 5 Gb y 6 Gg, permitiendo muchas combinaciones posibles (6). Se han descripto distintas familias de protenas G que se acoplan a distintos receptores. Entre ellas, se pueden mencionar: la protena Gs, que estimula la adenilil ciclasa, o sea que aumenta los niveles de AMPc (por ejemplo, el receptor dopaminrgico D1); la Gi, que inhibe la adenilil ciclasa, o sea que disminuye los niveles de AMPc (por ejemplo, el receptor dopaminrgico D2, el receptor metabotrpico glutamatrgico 4, 6 y 7 y el receptor muscarnico M4) y la Gq, que estimula la fosfolipasa C (PLC), la cual genera diacilglicerol (DAG) e inositol trifosfato (IP3), favoreciendo la salida de Ca2+ desde el retculo endoplsmico y estimulando a la protena kinasa C (PKC) (12) (Figura 4). Regulacin de sistemas de protenas G Las clulas tienen mecanismos regulatorios que limitan la duracin de la sealizacin: como la subunidad a de la protena G tiene una actividad GTPsica lenta, estos mecanismos la aceleraran, disminuyendo la duracin de la seal. La regulacin a corto plazo de la sealizacin ocurre tanto a nivel del receptor como de la protena G. El mecanismo regulatorio a nivel del receptor, es la desconexin del agonista dependiente de la protena G transductora a travs de la fosforilacin por kinasas de receptores acoplados a protena G (GRKs), unin de una protena llamada arrestina, la desfosforilacin del receptor en endosomas y el reciclado del mismo a la membrana (5).

Un segundo mecanismo involucra la down-regulation del nmero de receptores acoplados a protena G, conduciendo a una desensibilizacin a largo plazo. Tambin la sealizacin por protena G puede ser inhibida por protenas que activan las actividades GTPsicas para hacer que la subunidad a vuelva a su estado inactivo de unin a GDP. Las protenas reguladoras de la sealizacin por protena G se denominan Regulators of G Protein Signalling (RGS). Son elementos clave que reducen la seal generada por la unin de hormonas, pptidos u otros ligandos a sus respectivos receptores acoplados a la protena G (3). La capacidad de las clulas de regular la sealizacin a nivel del receptor y de la protena G parece redundante, pero juegan distintos roles: las GRKs previenen que ligandos adicionales acten sobre los receptores, mientras que las protenas RGS, mediante la inactivacin de las protenas G, acortan la seal que ya fue generada (5). El "encendido" lo provee la unin del agonista al receptor y el "apagado" la RGS (19). Familia de protenas RGS- mecanismo de accin En la dcada de 80 se identific la primera protena activadora de GTPasa (GAP) en la levadura (SST2), en la que se encontraron mutaciones que fallaban en el desarrollo de una down-regulation de la respuesta a feromonas (hormonas de atraccin sexual) que es mediada por la protena G. La SST2 se expresa a un bajo nivel en forma continua y es activada transcripcionalmente por la feromona. Su induccin parece ser responsable de la desensibilizacin por feromonas. La gran importancia de estas protenas se basa en datos experimentales donde se observa que la prdida de la funcin GAP conduce a la hiperactivacin de la va de sealizacin, consistente con una va de accin primaria para suprimir la sealizacin por protena G (21). Hasta hace pocos aos era aceptado que en mamferos las hormonas y los neurotransmisores usaban un receptor acoplado a protena G, una protena G y un efector para transmitir la seal a travs de la membrana. Sin embargo, en 1996 se descubri que tambin en organismos superiores haba una familia de protenas reguladoras de la sealizacin por protena G, llamadas RGS (regulators of G protein signalling) que representaron el cuarto componente de la va de sealizacin, ya que se unen a la subunidad Ga activada para bloquear su actividad. Hasta el momento se han descripto aproximadamente 16 RGS diferentes (RGS 1-15 y GAIP) (13). Estas protenas se agruparon en una familia por contener dominios RGS, los cuales consisten en un bloque de 120 aminocidos que est evolutivamente conservado (6, 18). Muchos miembros de esta familia poseen dominios modulares que sirven como sitios de unin para varias protenas (10). Por la gran ubicuidad de la protena G, las RGS estaran involucradas en modular diferentes funciones celulares como la proliferacin, la diferenciacin, la respuesta a neurotransmisores, el trfico a travs de la membrana y el desarrollo embrionario. Al menos una RGS se expresa en cada rgano y muchos tejidos pueden expresar mltiples RGS. En el cerebro, por ejemplo, se expresan 9 RGS diferentes, con algunas restricciones a regiones y tipos celulares especficos. Por ejemplo, el RGS-9 est altamente enriquecido en las regiones estriatales, incluyendo el Caudado y el Putamen, el Ncleo Accumbens y el Tubrculo Olfatorio. Dentro de la corteza, el RGS-4 muestra una distribucin especfica de capa (capas II, III y V). El RGS-3 se encuentra especialmente en el tlamo y el RGS-10 en la capa granulosa del giro dentado del hipocampo (9).

Aunque hay distinta distribucin anatmica de las RGS, no pareceran estar relacionadas a un sistema de neurotransmisin especfico (15), pero s a una determinada familia de protena G, regulando Gi y Gq pero no Gs. El mecanismo de activacin de la actividad GTPsica parecera ser por unin y estabilizacin de la protena G en su estado de transicin para la reaccin de hidrlisis (21) (Figura 5).

Las RGS pueden actuar como reguladores negativos, tanto activando la actividad GTPasa como inhibiendo la liberacin de GDP, para impedir que se una el GTP. Se conocen tambin otros mecanismos de accin de las RGS: pueden funcionar como antagonistas de efectores y aumentando la afinidad de la subunidad Ga por bg luego de la hidrlisis del GTP, acelerando as la re-formacin del heterotrmero (5). La RGS-1, la RGS-4 y la GAIP se unen con alta afinidad a las formas activadas de Gi, G0 y Gq-GDP-AIF4, una conformacin que se cree que simula el complejo pentavalente del estado de transicin de la reaccin de GTPasa y acelera su hidrlisis (7). La RGS-4, especficamente activa la Gai y Gaq estabilizando la transicin GTP-GDP y se localiza en la membrana (4, 22). En general, las RGS son inducidas por la activacin del receptor para que se frene la sealizacin. Si regula Gi, acorta la duracin de la seal y se va a observar un aumento en los niveles de AMPc. Si regula Gq, acorta la duracin de la seal y se va a observar una inhibicin de la activacin de la va de la MAP kinasa (MAPK) (11). RGS e intervencin farmacolgica en enfermedades Como la sobreexpresin de la actividad RGS altera las cascadas de sealizacin, las protenas RGS representan potenciales blancos para agentes teraputicos. Por ejemplo, la administracin de un compuesto que genere up regulation de una RGS podra ser tan efectivo como administrar un antagonista para prevenir la iniciacin de una va de sealizacin (5).

Por otro lado, los inhibidores de RGS podran ser utilizados como potenciadores de funciones de agonistas endgenos, para aumentar la especificidad de un agonista exgeno o para bloquear la sealizacin por RGS de un efector (21). Inhibidores de la protena RGS-4 dirigidos a las regiones involucradas en el control del dolor (como la sustancia gris periacueductal), pueden servir como analgsicos. Al haber menos RGS-4 en zonas como el Ncleo Accumbens, los opioides podran llegar al efecto analgsico deseado, reduciendo el potencial riesgo de dependencia, sugiriendo la posibilidad de requerimientos menores de dosis. Para apagar la seal, la protena G debe clivar el a-fosfato del GTP en una reaccin que requiere la asociacin del dicho fosfato con el oxgeno de una molcula de agua. Para catalizar esta reaccin, los tomos deben ubicarse adyacentes a ciertos residuos de aminocidos de la subunidad Ga. Cuando empeora la capacidad de estos aminocidos de estabilizar ese complejo, la hidrlisis del GTP es ms lenta; por ejemplo si hay poca cantidad de protena RGS y, en consecuencia, la terminacin de la seal est retrasada, se pueden producir trastornos caracterizados por seales excesivas y persistentes. Algunas enfermedades parecen resultar de mutaciones en genes que codifican para las protenas RGS. La regionalizacin de las RGS en el SNC asegura la especializacin y compartimentalizacin de las distintas funciones proteicas y, dado su amplio rol en la sealizacin celular, su selectiva disfuncin puede contribuir a enfermedades especficas. La expresin de RGS-10, por ejemplo, est reducida durante las convulsiones agudas, lo cual demuestra la capacidad de esta RGS de ser dinmicamente regulada. El RGS-2 presenta una up regulation luego de la induccin de convulsiones en modelos experimentales de epilepsia (10). Durante el stress, el CRF (factor liberador de corticotropina), acta estimulando la adenilil ciclasa, lo cual implicara un aumento en RGS-4 para que la Gi est desactivada y por lo tanto no inhiba a la adenilil ciclasa. El stress crnico disminuye el RGS-4 en el ncleo paraventricular (PVN) pero aumenta en el locus coeruleus (LC). Lo primero potencia la funcin Gi e inhibe la adenilil ciclasa contribuyendo a la retroalimentacin negativa sobre el eje HPA (hipotlamo-pituitario-adrenal). El aumento de RGS-4 en el LC disminuye la funcin de Gi y se produce una up regulation de la va del AMPc (17). RGS en la esquizofrenia Utilizando la tcnica de ADN microarrays, se encontr que la expresin del RGS-4 estaba reducida (50 a 84 %) en la mayora de los pacientes. Esta protena reduce la duracin de la respuesta de las neuronas luego de la liberacin del neurotransmisor que se une a un receptor acoplado a la protena G, ya sea presinptico o postsinptico incluyendo el receptor metabotrpico glutamatrgico (Gq y Gi), el 5-HT2 (Gq), el M1 (Gq) y el D2 (Gi). Mirnics y col. (16) encontraron que el RGS-4 (entre 7800 genes evaluados) estaba alterado en la mayora de los pacientes esquizofrnicos. Esta disminucin se debe a una disminucin en el nivel de la transcripcin. De 70 genes que mapean en la misma "regin cromosmica de susceptibilidad" para la esquizofrenia, el RGS-4 es el nico que muestra un cambio consistente. Esta disminucin no se observ en otras enfermedades psiquitricas. Otros miembros de la familia de las RGS pueden "compensar" la funcin disminuida de RGS-4 y puede no observarse un efecto funcional neto. El efecto de la deficiencia de RGS-4 en circuitos neurales especficos tambin depende del balance entre la sealizacin excitatoria e inhibitoria (16).

Existen dos potenciales mecanismos que explicaran la disminucin de la expresin de la protena RGS-4 en la esquizofrenia: 1) Como la esquizofrenia es una enfermedad multifactorial con mltiples loci (sitios cromosmicos) genticos implicados en el patrn hereditario, la disminucin del RGS-4 podra reflejar un factor de susceptibilidad hereditario. El RGS-4 mapea en la regin 1q2122 (2), locus de susceptibilidad de la esquizofrenia. 2) La disminucin en el RGS-4 podra ser una respuesta adaptativa asociada a la esquizofrenia, para compensar la reduccin en el nmero o funcionamiento de la sinapsis. En la infancia, la gran densidad sinptica podra compensar la eficacia sinptica empeorada, pero al llegar a la adolescencia donde ocurre la "poda sinptica", se "hara evidente" esa falta de sinapsis ya que quedaran menos sinapsis que lo normal. Es probable que en la esquizofrenia las neuronas induzcan una down regulation de la RGS-4 como mecanismo para restaurar los niveles de sealizacin por protena G pre-poda, resultando en una prdida de la actividad GAP de la RGS-4 y una prolongacin de la sealizacin a travs de protena G (16). En la esquizofrenia estn disminuidos tanto los marcadores presinpticos como los postsinpticos, lo cual refleja una reduccin en el nmero de contactos sinpticos formados. Esto se puede deber a una poda sinptica excesiva. Los hallazgos de una disminucin en los niveles de RGS-4 en la esquizofrenia, implican que se tratara de una enfermedad con una disfuncin en la comunicacin sinptica. Experimentos recientes donde se encontr una disminucin en la expresin de genes relacionados con el metabolismo celular, como la malato deshidrogenasa, apoyan la idea de la existencia de defectos en la comunicacin neuronal, como factores relevantes en la patofisiologa de la enfermedad (14). Cambios en RGS: su significado fisiolgico El significado fisiolgico de una reduccin en RGS determina la prolongacin de la sealizacin pre y postsinptica. Esto ha sido asociado con la exacerbacin de los sntomas tpicamente exhibidos por sujetos con esquizofrenia cuando se enfrentan a una situacin de stress. La deficiencia en RGS-4 podra ser una consecuencia de la menor eficiencia de la liberacin presinptica de neurotransmisor como mecanismo compensatorio para restablecer la neurotransmisin normal. Esto es consistente con la eficacia teraputica del haloperidol y los antipsicticos atpicos, los cuales tienen como blanco receptores acoplados a Gi o Gq que son regulados por RGS-4. Los antipsicticos tpicos como el haloperidol son antagonistas selectivos de los receptores D2 acoplados a Gi, mientras los atpicos antagonizan tambin el 5-HT2A, inhibiendo Gi y Gq. El haloperidol modula los niveles de transcripto de RGS-4, mientras que los atpicos compensaran la capacidad del RGS-4 de actuar como GAP en la esquizofrenia, inhibiendo la sealizacin hiperactiva mediada por Gi y Gq (16). Qu receptores podran estar afectados en el circuito que est alterado en la esquizofrenia si la RGS-4 (reguladora de Gi y Gq) est disminuida? (Figura 2 y 6). (Ver: Fadel D. Antipsicticos Tpicos y Atpicos. Implicancias clnicas de sus diferentes mecanismos de accin. Psicofarmacologa 2002; 14: pags 15-21). Receptor D2: Como est acoplado a Gi, una disminucin de RGS-4 implicara una prolongacin de la seal, por lo cual habra una mayor inhibicin de la produccin de AMPc. Esto significa una menor liberacin de neurotransmisores desde el punto de vista de los receptores presinpticos (dopamina, glutamato, acetilcolina) y una mayor inhibicin

de la descarga de las neuronas GABArgicas en la va indirecta desde el punto de vista de los receptores postsinpticos, implicando una activacin motora. Receptor 5-HT2A: Como est acoplado a Gq, una disminucin de RGS-4 implicara una persistente activacin de la PKC. Como son receptores presinpticos de las neuronas dopaminrgicas, que normalmente inhiben la liberacin de dopamina, la reduccin de RGS-4 llevara a una an menor liberacin de DA. Receptor M1: Si bien el exceso de DA inhibe la liberacin de Ach por unin al receptor D2, el receptor M1 que est acoplado a Gq activa persistentemente a la PKC si hay dficit de RGS-4, lo cual restablecera la descarga de la neurona GABArgica. Todos estos resultados conducen a plantear un interrogante: son mecanismos adaptativos para compensar el exceso de DA y restablecer la funcin modulatoria normal del circuito o son factores causales? Conclusiones En sntesis, la cascada de eventos que modula la formacin y liberacin de la seal presinptica y la transduccin postsinptica mediada por los receptores acoplados a protena G, podra ser un punto clave que estara fallando en la esquizofrenia. La disminucin en los niveles de RGS-4 observada en la mayora de los pacientes esquizofrnicos evaluados, podra ser un mecanismo adaptativo para compensar el exceso de dopamina (DA), de modo de restablecer la funcin modulatoria normal del circuito. Esto es consistente con la eficacia teraputica del haloperidol y los antipsicticos atpicos, los cuales tienen como blanco receptores acoplados a Gi o Gq, que son regulados por RGS-4. Sin embargo, no se puede descartar que estos cambios sean factores causales de la enfermedad.
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