Profa. ILEANA RUBIO e-mail: ilerubio@gmail.

com

TCNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR III

Disciplina: Biologia Molecular
UNIFESP

Moodle: Biologia Molecular biomol

Avisos
Reposio de aula: 1/10/2011

Aulas prticas 14/9 e 21/9 laboratrio (Eldorado) Montar 10 grupos

Ler protocolo (moodle)

Bolsa para o exterior (moodle)

Tipo de Vetores

Regio Regulatria
Promotor

Regio Codificadora
Gene

Vetor de clonagem

Vetor de expresso

1 e 2 genes de resistncia antibitico 3 origem de replicao

Contm requisitos para expresso, como um promotor

Gene reporter
Gene presente em plasmdio cuja expresso facilmente visualizada. Codifica uma protena de fcil deteco e mensurvel, se possvel.

Gene reporter- usos

Determinar se uma sequncia tem atividade de promotor

Vetor com gene reporter

Gene reporter PoliA signal

Amilase Glicoamilase Luciferase

Vetor com gene reporter

Determinar se uma sequncia tem atividade de promotor

S e q u e n c i a

XhoI

XhoI

Grfico da luciferase

Gene reporter- usos

Determinar se uma sequncia tem atividade de promotor

Calvanese et al. BMC Molecular Biology 2008 9:81 doi:10.1186/1471-2199-9-81

Gene reporter- usos

Determinar se uma o vetor estvel.

Levedura trasnformada com vetor com o gene da glicoamilase (placa de meio de cultura com amido corada com vapor de iodo)

Gene reporter- usos

Localizar a expresso em um organismo transgnico

GFP expression in haematopoietic colonies from transgenic mice ( carrying the green fluorescent protein (GFP)-reporter gene under the control of Kit (stem cell factor receptor) regulatory elements. Adult multipotential cells can be monitored for their ability to engraft, differentiate and regenerate different tissues

Programa

Gene reporter
Desfosoforilao do DNA PCR (Polimerase Chain Reaction) PCR em Tempo Real Seqenciamento de DNA

Desfosforilao
Remoo dos grupos 5 P das extremidades do DNA pela fosfatase alcalina para impedir a recircularizao do vector (aumenta a eficincia de clonagem).
5 P Digesto com enzima de restrio
3OH 3OH 5 P Tratamento com fosfatase alcalina 3OH 3OH

Ligao T4 Dna ligase

Programa

Gene reporter
Desfosoforilao do DNA PCR (Polimerase Chain Reaction) PCR em Tempo Real Seqenciamento de DNA

Polimerizao de DNA

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

Polimerizao de DNA

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

Polimerizao de DNA
T T C T

G
T A

A G T T C A A C AC T T C A G G T TG A G C A C C C A G T 5 3 G A ATGCTTC ||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

3

Polimerizao de DNA
T T C

T T G C A C A T A G T A AC T C A G T G T G TG C C AG A C C C T A G 5 3 G A ATGCTTC ||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA C

3

Polimerizao de DNA
T C

A G T T A C A C CA AC T T G T A G TG G C A G A C C C A G T 5 3 G A ATGCTTCTG |||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

3

Polimerizao de DNA
A

TT C A T G C A T T CA C G C A C T G A TT A G G T G A C G A C CC G 5 3 A ATGCTTCTGGCAGATCT ||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

3

Polimerizao de DNA
T GA A G A T G T T T T GA G C TA C T T GT G C A C C GA T C C G CA C A CC 5 3 ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA |||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3

Polimerizao de DNA
A T GA C C T T G A T T A C A GT C G T G G T C TA C G T G T C GA C CA CA C 5 3 ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG |||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3

Polimerizao de DNA
G C C A T T T T T A G G C T T G T G T C C A T C TA C GA A CC G AC GA A C

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT |||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

Polimerizao de DNA
A
G C C A T T T T C GT G G T T T C A T C TA C G A G C G GA A C CA A CC A 5 3 ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA
3

Polimerizao de DNA
G G C T T T T T CG A C A G T A T T C TA C G G T C A G C G A GA A A C C C AC
5

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

Polimerizao DNA Polimerizao de de DNA

5

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

Um Pouco de Histria.....
1983 Kary Mullis
"for his invention of the polymerase chain reaction (PCR) method Nobel Prize in Chemistry - 1993
1944

Thermus aquaticus

Bactria que vive em altas temperaturas DNA polimerase resistente a altas temperaturas (Taq DNA polymerase)

Life at High Temperatures by Thomas D. Brock - Biotechnology in Yellowstone, 1994http://www.bact.wisc.edu/Bact303/b27

Hibridizao
A hibridizao se baseia em uma das principais caractersticas da dupla-fita de DNA a complementaridade das seqncias das duas fitas As fitas podem ser separadas pela ao da temperatura A dupla fita pode se restabelecer perfeitamente a partir de duas fitas separadas previamente

Hibridizao

Hibridizao
As fitas de DNA podem ser separadas pela ao do calor

Com o resfriamento, as fitas complementares encontram-se, umas com as outras, e re-hibridizam

PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR usado para amplificar seqncias especficas de DNA O DNA molde desnaturado (96oC) suas fitas so separadas A temperatura diminuda (50-60oC) e dois oligonucleotdeos, complementares as extremidades 3 do segmento de interesse (previamente adicionados reao), se ligam ao DNA molde Os oligos funcionam como iniciadores (primers) para a sntese de DNA, a qual ocorre na presena de nucleotdeos e de uma polimerase resistente a temperatura

PCR (Polymerase Chain Reaction)

A Taq Polimerase tem a capacidade de estender os oligos em temperaturas ao redor de 72C, sintetiza DNA (enzima de modificao). Quanto a sntese esta terminada, aquece-se de novo a 96C para, novamente separar-se as dupla-fitas de DNA A repetio (30 40 vezes) deste ciclo de sntese, rapidamente gera muitas cpias de DNA

PCR (Polymerase Chain Reaction)

DNA molde

Primers
dNTPs (nucleotdeos)

Tampo da Enzima
Taq Polimerase Magnsio (MgCl2)

PCR (Polymerase Chain Reaction)

DENATURAO DENATURAO INICIAL ANELAMENTO EXTENSO EXTENSO FINAL

2 min

45 seg 45 seg

1 min

10 min

96oC

96oC

54oC 30-40 X

72oC

72oC

20oC

PCR (Polymerase Chain Reaction)

Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis and H. A. Erlich., Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase (1988) Science 239: 487-491

As Mquinas de PCR

Ciclo 1

96oC

DNA original = 1

Cpia original = 0

Cpia delimitada = 0

96oC

DNA original = 1

Cpia original = 0

Cpia delimitada = 0

54oC

DNA original = 1

Cpia original = 0

Cpia delimitada = 0

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 0 +

Cpia delimitada = 0

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 0 +

Cpia delimitada = 0

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 0 +

Cpia delimitada = 0

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 1

Cpia delimitada = 0

Ciclo 2

96oC

DNA original = 1

Cpia original = 1

Cpia delimitada = 0

96oC

DNA original = 1

Cpia original = 1

Cpia delimitada = 0

54oC

DNA original = 1

Cpia original = 1

Cpia delimitada = 0

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 1 +

Cpia delimitada = 0 +

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 1 +

Cpia delimitada = 0 +

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 1 +

Cpia delimitada = 1

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 1 +

Cpia delimitada = 1

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 2

Cpia delimitada = 1

Ciclo 3

96oC

DNA original = 1

Cpia original = 2

Cpia delimitada = 1

96oC

DNA original = 1

Cpia original = 2

Cpia delimitada = 1

54oC

DNA original = 1

Cpia original = 2

Cpia delimitada = 1

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 2 +

Cpia delimitada = 1 +

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 2 +

Cpia delimitada = 1 +

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 2 +

Cpia delimitada = 4

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 2 +

Cpia delimitada = 4

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 3

Cpia delimitada = 4

Ciclo 4

96oC

DNA original = 1

Cpia original = 3

Cpia delimitada = 4

96oC

DNA original = 1

Cpia original = 3

Cpia delimitada = 4

54oC

DNA original = 1

Cpia original = 3

Cpia delimitada = 4

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 3 +

Cpia delimitada = 4 +

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 3 +

Cpia delimitada = 4 +

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 3 +

Cpia delimitada = 4 +

72oC

DNA original = 1

Cpia original = 4

Cpia delimitada = 11

Ciclo
1 2 3 4 5 6 7 10 20 30 35 40 50

Cpia delimitada
0 1 4 11 26 57 120 1.013 1.048.555 1.073.741.793 34.359.738.332 1.099.511.627.735 1.125.899.906.842.570

Amplificao por PCR

A PCR exponencial
O produto (P) aumenta exponencialmente com o nmero de ciclos (n)

A quantidade de produto de PCR depende do nmero de cpias de molde (M) presentes no incio da reao

P = (2)n M

Amplificao por PCR

Para 2X mais molde no incio, existe 2X mais produto de PCR, na fase exponencial. Para 4X Molde, existe 4X mais produto de PCR, etc.
10

PCR product

4T 2T T

0 0 5 10 Cycle number 15 20

Amplificao por PCR

Fase de Plato
Os produtos de PCR no podem dobrar para sempre
Limites
Quantidade dos reagentes (primer, dNTPs) Atividade da Taq Polimerase

Uma vez atingido o plato...

No h mais aumento na quantidade de produto

Amplificao por PCR

Fase de Plato

Quantidade de DNA

10

15

20

25

30

35

Ciclos de PCR

Deteco tipo end point

Nmero fixo de ciclos e depois se verifica a formao de produto atravs de eletroforese

Gel de Agarose

Amplificao por PCR

Fase de Plato

Quantidade de DNA

10

15

20

25

30

35

Ciclos de PCR

Gel de Agarose

Concluso......

A reao de PCR convencional qualitativa

A reao de PCR convencional

no quantitativa

PCR (Polymerase Chain Reaction)

DNA molde

Primers
dNTPs (nucleotdeos)

Tampo da Enzima
Taq Polimerase Magnsio (MgCl2)

concentrao de MgCl2 : especificidade

Atividades das DNA Polimerases

DNA Pol I (bactria): 1- cataliza a polimerizao de nucleotdeos na direo 53 usando uma fita molde de DNA

2- Com atividade 35 exonuclease ("proofreading) para a correo de erros durante a sntese

3- Com atividade 53 exonuclease para substituir nucleotdeos (nick translation).

Atividades das DNA Polimerases

DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment : 1- DNA polimerase 53 2- Com atividade 3 5 exonuclease 3- Sem atividade 53 exonuclease Para transformar stios coesivos em abruptos - Completa as extremidades coesivas 5 protuberantes - Digere as extremidades 3protuberantes - No digere a dupla fita .

Atividades das DNA Polimerases

Taq DNA polimerase (Thermus aquaticus) 1- DNA polimerase 53 2- Sem atividade 3 5 exonuclease sem atividade proofreading 3- Com atividade 53 exonuclease (knick translation)

DNA Molde
DNA cromossomal
DNA plasmidial

Clulas intactas
No amplifica RNA!! Quantidade Teoricamente: a partir de 1 moleulas de DNA em geral de 1000 a 100.000 molculas (50ng-100ngDNA) Qualidade: no necessrio purificar o DNA, evitar colocar inibidores da enzima e DNA muito quebrado.

Primers- iniciadores
5

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

Moleculas de ~20 nucleotdeos (pb), fita simples Bases homlogas que flanqueiam a regio que se deseja amplificar PCR: um par de primers

Tm similar, elevada maior especificidade(<72oC= temperatura do extenso da Taq pol.)

Programa : Primer3 Escrever os primers: 5 3

Primers- iniciadores
Temperatura de melting: na qual 50% do DNA est denaturado

Quanto maior a porcentagem de pares GC, mais difcil a desnaturao

TM = 2C(A+T) + 4C(G+C) Molculas pequenas

Primers- iniciadores

Primers- iniciadores
5

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

Primers- iniciadores Polimerizao de DNA

5

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ||||||| TAACGAA 5 3 3 5 ATGCTTC ||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

3 5

Primers- iniciadores Polimerizao de DNA

5

ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ||||||| TAACGAA 5 3 3 5 ATGCTTC ||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

3 5
NNN-F: ATGCTTC (Forward - sense-senso)
NNN-R: AAGCAAT (Reverse - antisense-antisenso)

Gel de Agarose

Figura 4: Eletroforese de gel de agarose 1,5%. 1: Ladder 1 Kb plus; 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14: produtos de amplificao da reao de PCR dos fragmentos 1, 2, 3, 4 ,5, 6 e 7, respectivamente. 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15: PCR controles negativos.

Programa

PCR (Polimerase Chain Reaction)

PCR em Tempo Real Seqenciamento de DNA MicroRNA (RNA de Interferncia - RNAi)

 Usar os dados da fase exponencial

Quantidade de produto proporcional a quantidade de molde inicial

Quantidade de DNA

Como estimar a quantidade inicial de molde ???

5 10 15 20 25 30 35

Ciclos de PCR

Neste caso, necessrio avaliar o produto de PCR a cada ciclo

Usar fluorescncia A fluorescncia deve ser proporcional quantidade de produto

Usar uma mquina que verifique a fluorescncia em cada ciclo (Real Time-PCR)

real-time real-time real-time PCR

real-time
hardware

5700
Applied Biosystems

iCycler
BioRad

7700
Applied Biosystems

LightCycler
Roche

7500
Applied Biosystems

FluorTracker
Stratagene

FluorImager
Molecular Dynamics

Amplificao por PCR

Deteco em tempo real

Amplificao por PCR

Deteco em tempo real

Threshould = linha que corta as curvas de amplificao no mesmo ponto, Ct (cycle threshold)= ciclo onde a reao cruza o limiar de deteco (threshold) (incio da fase exponencial (ciclo do PCR)

Amplificao por PCR

Deteco em tempo real

14

CT (nmero de ciclos) M (molde)

P = (2)n M

A tem (2)14 mais molde que B

Treshold cycle

PCR em Tempo Real

Syber Green
Intercalante de DNA
Se liga a dupla fita de DNA

Intensificao da emisso de fluorescncia quando ligado fita dupla de DNA A quantidade de fluorescncia proporcional a quantidade de DNA Corante no-especfico

PCR em Tempo Real

Syber Green
Vantagem:
Flexvel Barato

Grfico de temp de melting

Desantagem:
Pouco especfico Todo e qualquer produto formado contribuir para o aumento da fluorescncia

Primer dimers so um problema

Necessita de uma otimizao para que no haja formao de produtos inespecficos na reao

Real Time PCR

Taqman probes
Sonda marcada com um fluorforo (reporter ) e um quencher A sonda se liga ao produto de PCR durante a fase de annealing o reporter emite fluorescncia que captada pelo quencher
Excitation Emission

Amplicon

ANNEALING

EXTENSION

A atividade exonuclesica 5-3 da Taq polimerase hidroliza a sonda e permite que o reporter se afaste do quencher

Amplicon

5-3 exonuclease

Reporter

Quencher

Real Time PCR

Taqman probes
O acmulo de reporter livre proporcional a quantidade de produto de PCR A fluorescncia capitada na fase de extenso Vantagem
Alta especificidade, Dmeros de primers no so detectados. No influenciado por amplificao no-especfica
Excitation Emission

Amplicon

ANNEALING

EXTENSION

Amplicon

5-3 exonuclease

Reporter

Quencher

Excitation

Emission

Amplicon

ANNEALING

EXTENSION

Amplicon

5-3 exonuclease

Reporter

Quencher

Vantagens e Aplicaes Real Time PCR

Pode ser utilizada pouca quantidade do DNA alvo.
Determinar o nmero de cpias de um gene alvo em uma amostra Quantificao do nmero de cpias de transgnicos, identificao de organismos geneticamente modificados Determinao de contaminao de alimentos, Deteco e quantificao de patgenos

Diagnstico de doenas, e acompanhamento do paciente (LMC fuso dos genes BCR e ABL)
Determinar carga viral Expresso gnica

Pergunta do projeto: Estudar expresso gnica

Dogma Central da Biologia

Mutaes, nmero de cpias do gene: DNA

Expresso gnica: RNAm Protena Localizao celular: protena Atividade biolgica: protena

Expresso gnica: Northern blott e PCR em tempo real

Mas o RNA no amplificado por PCR. E agora??

Transcriptase Reversa
Ciclo de vida de um retrovrus

David Baltimore

Howard Temin pela descoberta da interao entre os

vrus que causam tumores e o material gentico das clulas hospedeiras

Nobel de Fisiologia ou Medicina 1975

Transcrio Reversa
Enzima de modificao
Sintetiza DNA apartir de um RNA molde Necessita de um primer: oligo(dT), ou random exmeros (random primers6nt).

Transcrio Reversa

No laboratrio para PCR:

- sntese da primeira fita de cDNA - molde para a PCR (RTPCR, transcritase reversaPCR) ou PCR Real time

Sntese de cDNA (RT)

Reao de RT RNA total ou RNAm OilidT (random primers) dNTPs (nucleotdeos) Tampo da Enzima Transcritase reversa PCR cDNA molde Primers dNTPs (nucleotdeos) Tampo da Enzima Taq Polimerase Magnsio (MgCl2) Syber green ou sonda (Real time)

Controle interno
A diferena de expresso detectada no PCR em tempo real deve-se pipetagem de maior quantidade de amostra?
Quantificar um gene com expresso constante (similar) em tecidos ou clulas em estudo, e no altervel com o tratamento.

Resultado final: valore de expresso do gene alvo normalizado pelo controle interno.

Controle interno

IL-1 induces MCP1 expression in HASMCs. (A) HASMCs were treated with 5 ng/ml IL1 for the indicated times. Total RNA was isolated and RT-PCR analysis was performed using MCP1 gene-specific primers and the internal control gene, -actin. Exp Mol Med. 2009 Oct;41(10):757-764.

Modulation of p21 by LAQ824 in A2058 and HMV-1 melanoma cell lines.

Kato Y et al. Mol Cancer Ther 2007;6:70-81

2007 by American Association for Cancer Research

Vantagens e Aplicaes Real Time PCR

Expresso gnica: quanto se expressa um determinado gene num determinado tecido?
1- Extrair RNA do tecido

2- Sntese de cDNA com transcritase reversa

3- PCR em tempo Real com primers especficos para o gene em estudo

Hora do lanche......

Programa

PCR (Polimerase Chain Reaction)

PCR em Tempo Real Seqenciamento de DNA MicroRNA (RNA de Interferncia - RNAi)

O Banco de Dados GenBank

Em 1982.
606 seqncias 680.338 nucleotideos

Em 2005.
52.016.762 seqncias 56.037.734.462 nucleotdeos

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/genbankstats.html

Frederick Sanger Walter Gilbert

1975: Sanger desenvolve o mtodo de seqenciamento de DNA baseado em terminao de cadeia por incorporao de ddNTPs
(Mtodo Enzimtico)

(1918)
(1932)

1977: Gilbert desenvolve um outro mtodo baseado em degradao qumica dos nucleotdeos
(Mtodo Qumico)

por suas contribuies sobre a

determinao da seqncia de bases dos cidos nuclicos

Nobel de Qumica 1980
Sanger, F. and Coulson, A.R, A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase (1975). J Molec Biol, 94: 441-448. Maxam, A.M., Gilbert, W., A new method for sequencing DNA (1977) Proc Natl Acad Sci, 74 (2): 560-4.

Seqenciamento de DNA

Manual X
Automtico

O DNA um Colar de Contas

A
T

C
G

T
A

G
C

O Dideoxi-Nucleotdeo

O Dideoxi-Nucleotdeo

C A

T G

Polimerizao de DNA

o dideoxi
C

A G T T C A A C AC T T C A G G T TG A G C A C C C A G T 5 3 G A ATGCTTC ||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

3

C T

G
T A

Polimerizao de DNA

o dideoxi
C

A G T T A C A C CA AC T T G T A G TG G C A G A C C C A G T 5 3 G A ATGCTTCTG |||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

3

T C

Polimerizao de DNA

o dideoxi
C

TT C A T G C A A T CA C G T C C A C T G A TT A G G T G A G A C CC G G 5 3 A ATGCTTCTGGCAGATCT ||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

3

Polimerizao de DNA

o dideoxi

T GA A G A T G T T T T GA G C TA C T T GT G C A C C GA T C C G CA C A CC 5 3 ATGCTTCTGGCAGAT ||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

3

Polimerizao de DNA

o dideoxi

ATGCTTCTGGCAGAT ||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

T T GA CC A G A T T T C A GT C G T G G A T C TA C G T G T C GA C C CA C A

Seqenciamento de DNA
ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCT ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTGGCAGAT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TACGAAGACCGTCTAGACTTGTCACAATGACTATAACGAA

Seqenciamento de DNA
ATGCTTCT ATGCTTCTGGCAGAT ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

Seqenciamento de DNA
DNA molde Primers dNTPs Tampo Polimerase
ddATPs

dCTP*

ddGTPs

ddTTPs

ddCTPs

Seqenciamento Manual

Seqenciamento Manual
~0.1 cm

~60 cm

~20 cm

Seqenciamento Manual

Seqenciamento Manual

Seqenciamento Manual

Seqenciamento Manual

Seqenciamento Manual

Seqenciamento Manual

Seqenciamento Manual

Seqenciamento Manual

Seqenciamento Manual

Filme de Raio X

G G A T A T A A C C C C T G T

Seqenciamento Manual

Seqenciamento Manual
Reao Gel Eletroforese

Filme de Raio X
Leitura

Seqenciamento Automtico de DNA

Estrutura do Cromforo

Seqenciamento Automtico
ATGCTTCT ATGCTTCTG ATGCTTCTGG ATGCTTCTGGC ATGCTTCTGGCA ATGCTTCTGGCAG ATGCTTCTGGCAGA ATGCTTCTGGCAGAT ATGCTTCTGGCAGATC ATGCTTCTGGCAGATCT ATGCTTCTGGCAGATCTG ATGCTTCTGGCAGATCTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAA ATGCTTCTGGCAGATCTGAAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTAC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATA ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATAT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTG ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGC ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCT ATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT AATGCTTCTGGCAGATCTGAACAGTGTTACTGATATTGCTT

T A G C

PCR X Sequenciamento

Seqenciamento Automtico
Reao de sequenciamento termociclador DNA Primer (nico) dNTPs (nucleotdeos) ddNTPs marcados Tampo da Enzima Taq polimerase

Big Dye Anlise por eletroforese

1. 96 C 1 min 2. 25 ciclos: 96 C 10 sec 50 C 5 sec 60 C 4 min 3. 4 C for ever 4. Purificao por precipitao

Seqenciamento Automtico

Laser

Seqenciamento Automtico

Seqenciadores de Gel
ABI Prism 377

ABI Prism 377

ABI Prism 377

ABI Prism 377

ABI Prism 377

ABI Prism 377

Imagem do Gel

Imagem do Gel

Seqenciadores com Capilares

ABI Prism 310

ABI Prism 3130

ABI Prism 3100 e 3130XL

ABI Prism 3730

ABI Prism 3700 e 3730XL APB MegaBace 1000

APB MegaBace 4000

ABI Prism 310

1 capilar

ABI Prism 3130

4 capilares

ABI Prism 3100 e 3130xl

16 capilares

ABI Prism 3730

48 capilares

ABI Prism 3700 e 3730xl

96 capilares

MegaBace 1000

96 capilares

MegaBace 4000

384 capilares

A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 3.000pb / 6 meses 3.000pb / 180 dias 3.000pb / 4.320 horas 3.000pb / 259.200 minutos 0,01pb / minuto 1pb / 100 minutos

A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 310: 3130: 0,01pb / minuto 4,2pb / minuto 16,6pb / minuto
1600 1400 1200 1000 800

3100: 3130xl
3730: 3700: 3730xl MB 1000 MB 4000:

66pb / minuto
200pb / minuto 400pb / minuto

600 400 200 0 Manual 1 4 16 48 96 384

Capilares

1.600pb / minuto

O Banco de Dados GenBank

Em 1982.
606 seqncias 680.338 nucleotideos

Em 2005.
52.016.762 seqncias 56.037.734.462 nucleotdeos

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/genbankstats.html

A Velocidade de Seqenciamento

1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 0 Manual 1 4 16 48 96 384

Capilares

Uma Data Histrica

28 de Julho de 1995

Bactria
1,6 Mb - 1.700 genes
Fleichmann et al. (1995), Science 269:496

O Genoma Humano

International Human Genome Consortium, Initial sequencing and analysis of the human genome (2001) Nature, 409: 860-921. Venter, J.C. Adams, M.D., Myers, E.W., Li, P.W., Mural, R.J., et al., The sequence of the human genome Science, 291: 1304-1351.

Futuro.......
Ultra-Low-Cost Sequencing (ULCS)

Personal Genome Project

Incio do HGP US $ 1,00 / base

Fim do HGP Futuro

US $ 0,10 / base US $ 1.000,00 / genoma

Sequenciamento do genoma completo de um indivduo (15 semana) Associaes gentipo-fentipo

Diversidade microbiana (estudos metagenmicos)

Sequenciadores de Nova Gerao

Microelectrophoretic Sequencing

Hybridization sequencing
Cyclic-array sequencing
Fluorescent in situ sequencing (FISSEQ) Massively Parallel Signature Sequencing (MPSS) Pyrosequencing

Shendure, J.; et al. (2004). Nature Reviews Genetics 5: 335-344

J Foi Notcia......

O Estado de So Paulo, 11/08/2009

Usos do sequnciamento

Confirmar clonagens Confirmar alteraes de uma sequencia :

mutagnese stio dirigida

Identificar genes Rastrear mutaes me pacientes Fazer diagnstico em famlias (cancer, RET BRCA1,2doena de Hungtington)

Usos do sequenciamento
Homozigose Deteco de mutaes em pacientes

Usos do sequenciamento
Heterozigose Deteco de mutaes em pacientes

Programa

PCR (Polimerase Chain Reaction)

PCR em Tempo Real Seqenciamento de DNA MicroRNA (RNA de Interferncia - RNAi)

Andrew Z. Fire Craig C. Mello

1998: Estudos com Caenorhabditis elegans - RNA de interferncia Sense RNA s/ efeito dsRNA perda da funo

(1959)
(1960)

Anti-sense RNA s/ efeito

pela descoberta do RNA de

interferncia silenciamento gnico por RNA dupla-fita

Nobel de Fisiologia ou Medicina 2006

Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC., Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. (1998) Nature 391(6669):806-11

Presente em vrios organismos

C. elegans (Fire et al., 1998)

Drosophila (Carthew et al., 1998)

Planaria (Newmark et al., 1998) Trypanosoma (Ullu et al., 1998)

Hydra (Lohmann et al., 1999)

Zebrafish (Wargelius et al., 1999) Camundongo (Wianny & Zernicka-Goetz, 2000) Arabdopsis thaliana

O que RNA de interferncia ?

Pequenas molculas de RNA no-codificantes que regulam a expresso gnica ao nvel da traduo uma molcula de RNA dupla-fita (dsRNA) suprime a expresso do gene cuja a seqncia complementar a sua (gene-alvo)

Silenciamento Gnico Ps-Transcricional (PTGS)

Tipos de RNA no processo

Pri-microRNA (primitivo)
RNA simples-fita (500 - 3.000 nt) Codificados no genoma Formam estruturas secundrias (hairpin) Sofrem ao do complexo DROSHA, dando origem aos pre-microRNAs

Tipos de RNA no processo

Pre-microRNA (precussor)
70-80nt RNA simples-fita Formam estruturas secundrias (hairpin)

Aps ao da DICER originam microRNAs

Tipos de RNA no processo

microRNA (maduro)
short-interference RNA 21-23nt Produto da ao da DICER Incorporado pelo complexo RISC Complementar a parte do mRNA do gene-alvo

Como funciona ???

DROSHA
Presente no ncleo das clulas Corta os Pri-microRNAs, produzindo os Pre-microRNAs

DICER
Membro da famlia das RNase III
(degrada RNA dupla-fita)
Pre-microRNA

Corta Pre-microRNA produzindo fragmentos de 21-23 nt

(microRNAs ou short-interference - siRNA)

siRNA (21-23nt)

19 nt duplex

2-3 nt 3 overhangs

RISC
RNAi Silencing Complex Usa o microRNA como guia para reconhecer e cortar o mRNA do gene-alvo
Depois, exonucleases celulares degradam o mRNA cortado

RNA de Interferncia

(RNAi)

RNA de Interferncia

(RNAi)

Resumindo.......

Para serve?
Mecanismo de defesa celular contra infeco viral Mecanismo de regulao da expresso gnica (microRNA)

Uso na Biologia Molecular

Estudos funcionais Mtodo para inativar genes especficos Gentica reversa
Inativar o gene Observar o fentipo Inferir a funo do gene

at semana que vem.......

Pirosequenciamento

Ronaghi M. Pyrosequencing sheds light on DNA sequencing. Genome Res 2001

Na reao......
DNA molde

Primer
Enzimas
DNA Polimerase ATP sulfurylase Luciferase Apyrase

Substratos
APS (adenosine 5 phosphosulfate)

Adio individual de cada um dos nucleotdeos

(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)

Luciferin
Obs: deoxyadenosine alfa-thio triphosphate (dATPaS) usado no lugar do dATP

Pirosequenciamento

C ........

Pirograma

AGGGGTGGCTTTGGGGTTGCAGTTG

O que um Gene?

Regio Regulatria

Regio Codificadora

Procariontes vs. Eucariontes Bactrias Vs mamferos

DNA
Sntese de RNA

RNAm
Codon de Incio da Traduo (AUG) Codon de Terminao da Traduo Sntese protica

Protena
Os genes dos procariontes so contnuos (1 triplete=1 aminocido). O gene o RNAm e as protenas so colineares

Procariontes vs. Eucariontes

Ponto de Incio da Transcrio
Start Codon
5UTR 3UTR

Ponto de Trmino da Transcrio

DNA

Codon de Incio da Traduo (AUG)

Codon de Terminao da traduo (UGA, UAA, UAG)

Sntese de RNA

Pre RNAm
1 2 3

Splicing
1

RNAm

Sntese proteca
1

Protena

Procariontes vs. Eucariontes

Ponto de Incio da Transcrio Start Codon Ponto de Trmino da Transcrio
5UTR 3UTR

DNA

Codon de Incio da Traduo (AUG) Sntese de RNA

Codon de Terminao da traduo (UGA, UAA, UAG)

Pre RNAm
1 2 Splicing 1 2 3 3

RNAm

Sntese proteca 1 2 3

Protena

Os eucariontes possuem genes interrompidos, formados por exons (codificantes) e introns (removidos no splicing) A ordem dos exons a mesma no gene, no RNAm e na protena O gene com introns maior que seu RNAm

Transcriptase Reversa
Ciclo de vida de um retrovrus

David Baltimore

Howard Temin pela descoberta da interao entre os

vrus que causam tumores e o material gentico das clulas hospedeiras

Nobel de Fisiologia ou Medicina 1975

Transcrio Reversa
Transcrio reversa usando oligo(dT)

A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 310: 0,01pb / minuto 500pb / 2 horas 500pb / 120 minutos 4,2pb / minuto

A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 310: 3130: 0,01pb / minuto 4,2pb / minuto 4 x 500pb / 2 horas 4 x 500pb / 120 minutos 2.000pb / 120 minutos 16,6pb / minuto

A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 310: 3130: 0,01pb / minuto 4,2pb / minuto 16,6pb / minuto

3100: 3130xl

16 x 500pb / 2 horas 16 x 500pb / 120 minutos 8.000pb / 120 minutos 66pb / minuto

A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 310: 3130: 0,01pb / minuto 4,2pb / minuto 16,6pb / minuto

3100: 3130xl 3730:

66pb / minuto

48 x 500pb / 2 horas 48 x 500pb / 120 minutos 24.000pb / 120 minutos 200pb / minuto

A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 310: 3130: 0,01pb / minuto 4,2pb / minuto 16,6pb / minuto

3100: 3130xl
3730: 3700: 3730xl MB 1000

66pb / minuto
200pb / minuto 96 x 500pb / 2 horas 96 x 500pb / 120 minutos 48.000pb / 120 minutos 400pb / minuto

A Velocidade de Seqenciamento
Manual: 310: 3130: 0,01pb / minuto 4,2pb / minuto 16,6pb / minuto

3100: 3130xl
3730: 3700: 3730xl MB 1000 MB 4000:

66pb / minuto
200pb / minuto 400pb / minuto

384 x 500pb / 120 minutos 1.600pb / minuto