Cintica de las Reacciones Enzimticas

Una reaccin qumica tiene dos caractersticas de importancia: la posicin de equilibrio (estabilidad de la concentracin de productos y reactivos) y la velocidad de reaccin (las reacciones tienen por objeto determinar el mecanismo y la velocidad con que interaccionan las molculas bajo determinadas condiciones). La velocidad de una reaccin qumica puede medirse como la velocidad de formacin de uno o ms de su productos o bien la velocidad de utilizacin de sus reactivos. Intuitivamente podemos suponer que al aumentar la concentracin de los reactivos la probabilidad de interaccin de los mismos aumenta conjuntamente con la velocidad que procede tal reaccin. Ambas variables (velocidad de reaccin y concentracin de los reactivos) son directamente proporcionales, as que matemticamente debe existir un valor constante, de esta manera podemos escribir: vr = k. [reactivos]n. (velocidad de reaccin) = (constante) . (concentracin de reactivos)n El valor del exponente n es el orden de la reaccin. As si n = 1, estamos en presencia de una reaccin de primer orden donde la velocidad es proporcional a la reaccin de un solo reactivo. vr = k. [A] Anlogamente, cuando n = 2, la velocidad es proporcional al producto de las concentraciones de dos reactivos o al cuadrado de la concentracin de uno solo. Este tipo de reacciones reciben el nombre de segundo orden. vr = k. [A] [B] = k [A] 2 La importancia de determinar el orden de una reaccin qumica radica en que a partir de ese parmetro puede obtenerse informacin sobre el mecanismo molecular en que opera. Velocidad de reaccin y equilibrio En un estado de equilibrio qumico las velocidades de reacciones directa e inversa son exactamente iguales. Considerando una reaccin de primer orden:

k1 [A] = k 1 [B] Este principio nos permite llegar fcilmente a una reaccin entre las constantes de velocidad y de equilibrio:

En principio, las consideraciones generales de la cintica qumica pueden aplicarse a las reacciones catalizadas enzimticamente, aunque estas ltimas tienen la particularidad de mostrar el fenmeno de saturacin por el sustrato. A una concentracin constante de enzima, si vemos el grfico de la velocidad de la reaccin catalizada enzimticamente en funcin de la concentracin del sustrato, es evidente que a bajas concentraciones del mismo la velocidad de formacin de producto es proporcional a la concentracin del sustrato. A medida que se aumenta la concentracin de sustrato se aprecia una prdida de la proporcionalidad, en esta zona la reaccin es de orden mixto y finalmente, a altas concentraciones, la velocidad de la reaccin es independiente de esta. Ya se ha dicho que el sustrato se une a la enzima en una regin determinada del mismo llamada sitio activo. El fenmeno de saturacin junto con otras evidencias llevaron a postular la existencia de un complejo enzima sustrato (E S) como etapa previa a la formacin de productos. En 1913 Lenor Michelis dedujo la relacin entre la velocidad mxima (vm) de una reaccin catalizada enzimticamente en trminos de la formacin del complejo E S. En base a estas consideraciones es lgico suponer que a altas concentraciones de sustrato, todos los sitios activos de la enzima estn ocupados y por lo tanto la velocidad alcanza un mximo. El modelo propuesto sirve de base para explicar las propiedades de la mayora de las enzimas y como se dijo antes asume la existencia de un complejo E S como intermediario en la catlisis.

Una enzima E se combina con un sustrato S para formar el complejo E S, con una constante de velocidad k1. Este complejo E S puede seguir dos caminos: a) puede proceder para formar el producto con una constante de velocidad k3; b) el camino alternativo es disocindose, generando nuevamente E y S con una constante de velocidad k2. En base al modelo, la velocidad de la reaccin catalizada enzimticamente ser : v = k3 [E S] El valor [E S] no es fcilmente estimable de modo que se necesita una expresin equivalente con valores conocidos. Mediante desarrollo matemtico se ha desarrollado la siguiente ecuacin:

Efecto de la concentracin del sustrato sobre la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente. Obtencin del km y la vmax. Resumiendo, si se mantiene la concentracin de la enzima constante y variamos la concentracin de substrato se obtiene una curva hiperblica como la de la figura (arriba izquierda). Al principio un aumento de la concentracin de substrato produce un aumento rpido de la velocidad de reaccin, pero si se sigue aumentando la concentracin de substrato, la velocidad de reaccin comienza a disminuir; vemos que a muy altas concentraciones de substrato se observa que no cambia la velocidad de reaccin, se dice que los centros activos de la enzima se encuentran saturados. La velocidad de reaccin que se obtiene a esa alta concentracin de substrato se define como la velocidad mxima (vm) de la reaccin enzimtica bajo las condiciones especificadas. La concentracin de substrato [S], a la semivelocidad mxima de reaccin ( v ) se puede determinar de la figura y representa la constante de Michaelis o km, la cual es una caracterstica para cada enzima. La inversa de km, o 1/ km, mide aproximadamente la afinidad de la enzima por el substrato. Mientras ms pequeo sea el valor de km, mayor ser la afinidad de la enzima por el substrato. Si varias enzimas compiten en el metabolismo por el mismo substrato, ste ser transformado preferentemente por la enzima con mayor afinidad. As tendremos:

(simplificando) Si reordenamos la ecuacin tendremos que: [S] + km = 2 [S] (despejamos) km = [S] Esto significa que la concentracin del sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad es el valor de km de la enzima. La expresin de Michelis Menten puede ser transformada algebraicamente en otras formas, que son ms tiles para la expresin de los datos experimentales. Una de esas formas consiste en tomar los recprocos (inversa) de ambos miembros de la ecuacin.

Esta expresin conocida con el nombre de ecuacin Lineweaver Burk, corresponde a una recta de ecuacin : y = a.m + b

Midiendo las velocidades para distintas concentraciones de sustrato y representando grficamente (al lado) obtendremos una grfica del tipo lineal. Centro activo de una enzima Ya se haba mencionado que la porcin de la molcula en la enzima que se una al o a los sustratos es una zona relativamente pequea de la misma. Esta zona , responsable de la actividad cataltica, que favorece la orientacin de los grupos qumicos (que reaccionan para dar los productos de la reaccin) recibe el nombre de centro activo. Los grupos responsables de la actividad cataltica propiamente dicho se los denomina sitios catalticos. En algunos casos esos grupos pueden corresponder a los grupos prostticos de los cuales ya se ha hablado. Expresin de la actividad enzimtica La cantidad de enzimas presentes en un fluido biolgico es muy difcil de determinar en valores absolutos, mg. o moles, una forma de resolver este problema es midiendo la velocidad de reaccin catalizada por la misma empleando un sustrato especfico. La velocidad de reaccin puede expresarse como la cantidad de reactivo que se transforman en producto por unidad de tiempo. De all que la unidad internacional (UI) de cualquier enzima se define como la cantidad de la misma que cataliza la transformacin de un mol de sustrato por minuto, bajo condiciones definidas: pH, temperatura, concentracin de sustrato/s y cofactores, etc.

En base a lo que se acaba de explicar es posible expresar la cantidad de una enzima en un fluido biolgico en UI/cm3 o en UI/ mg. de protena total. Esta ltima expresin denominada actividad especfica es la cantidad de moles de sustrato transformados por minuto y por mg. de protena, debindose indicar la temperatura, el pH, etc. Es importante recordar que la actividad especfica de una enzima es una medida indirecta de la fraccin de la protena total en una preparacin que contienen a la enzima.