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Jos Serra
Ministro de Estado da Sade
Joo Yunes
Secretrio de Polticas de Sade
Pedro Chequer
Coordenador Nacional de DST e Aids
Autores:
Ana Maria Coimbra Gaspar Clara T. Tachibana Yoshida Dagmar Kiesslich Edwin Antnio S. Castillo Geni N. Noceti de Lima Cmara Neiva Sellan Lopes Gonales Luiz Alberto Peregrino Ferreira Maristela Arantes Marteleto (pedagogia)
Hepatites Virais Triagem e diagnstico sorolgico em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica. Braslia: Ministrio da Sade, Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids. 1998. 68 p.: il. (Srie TELELAB ) 1. Hepatites Virais Triagem e diagnstico sorolgico em unidades hemoterpicas e laboratrios de sade pblica I. Coordenao Nacional de Doenas Sexualmente Transmissveis e Aids (Brasil) II. Srie TELELAB
Apresentao
Coordenao Nacional de DST e Aids e a Coordenao de Sangue e Hemoderivados do Ministrio da Sade, em nome do compromisso com a melhoria do atendimento populao, unem seus esforos a fim de promover o aperfeioamento dos profissionais dos laboratrios de sade pblica e das unidades hemoterpicas. Nessa perspectiva, os cursos do Sistema de Educao a Distncia TELELAB, organizados numa abordagem favorvel ao repensar da prtica profissional, oferecem aos profissionais da sade uma oportunidade de adquirir conhecimentos embasados em critrios tcnico-cientficos de qualidade para assegurar o padro de excelncia desejvel no atendimento aos usurios dos servios de sade. Queremos deixar registrado nosso agradecimento a todos os que contriburam na produo dos vdeos e dos manuais que compem os cursos. Esses especialistas de reas to diversas aproveitaram as diferenas para realizar um trabalho harmnico e integrado, o que refora a nossa idia de que em equipe e em parceria que se constri um sistema nico de sade com qualidade. Aos alunos do TELELAB nossas boas vindas e votos de sucesso! Pedro Chequer
Coordenador Nacional de DST e Aids
HEPATITES VIRAIS
Observaes: 1. Voc se inscreve em um curso por vez, escolhido de acordo com seu interesse e/ou necessidade do servio, respeitando os pr-requisitos identificados. 2. O curso Controle de Qualidade de Testes Sorolgicos complemento essencial para todos os cursos de diagnstico sorolgico. Ele deve ser feito imediatamente aps a concluso do primeiro desses cursos (06 ou 07 ou 11 ou 12 ou 13). 3. Os cursos de Equipamentos (15) e de Biossegurana (16) so complementos essenciais para todos os outros cursos e devem ser feitos aps o primeiro curso concludo por voc.
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Como funciona
Os cursos do TELELAB esto programados de modo a no interferir na sua rotina de trabalho e voc tem 1 ms para concluir cada curso que fizer. Em cada um deles, voc: Pr-teste faz um pr-teste e, depois, assiste a um vdeo Vdeo quantas vezes quiser, no lugar combinado com a coordenao local do TELELAB; Manual Ps-teste Certificado estuda o manual correspondente, no tempo, horrio e lugar de sua preferncia; faz um ps-teste para avaliao de sua aprendizagem; depois de acertar no mnimo 80% do psteste, recebe, um certificado.
Para esclarecimentos de dvidas e sempre que precisar, comunique-se diretamente com: TELELAB - CN-DST/AIDS MS Fax gratuito: 0800-612436
Ao final do curso "Hepatites Virais - Triagem e Diagnstico Sorolgico em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica", voc ser capaz de: identificar os procedimentos e as tcnicas recomendados pelo Ministrio da Sade para a triagem sorolgica de doadores de sangue e para o diagnstico sorolgico das hepatites virais; executar os testes para deteco dos marcadores sorolgicos das hepatites virais A, B e C, obedecendo a critrios tcnicos e de controle de qualidade.
Sumrio
INTRODUO HEPATITES VIRAIS introduo principais vrus formas de transmisso e distribuio geogrfica manifestaes clnicas vacinas 7 7 9 10 12 13 14
TRIAGEM SOROLGICA DE DOADORES DE SANGUE E DIAGNSTICO SOROLGICO DAS HEPATITES VIRAIS 15 vrus investigados na triagem de doadores de sangue e vrus investigados para o diagnstico etiolgico 17 pesquisa do HDV e do HEV 17 principais marcadores sorolgicos do HAV, do HBV e do HCV deteco dos marcadores do HAV no curso sorolgico tpico da hepatite A deteco dos marcadores do HBV no curso sorolgico tpico da hepatite B caracterizao sorolgica da evoluo para a forma crnica da infeco pelo vrus da hepatite B identificao do marcador do HCV no curso sorolgico tpico da hepatite C marcadores sorolgicos pesquisados na triagem de doadores de sangue fluxograma de testagem na triagem de doadores de sangue procedimentos com doadores com resultados reagentes ou indeterminados marcadores sorolgicos pesquisados para o diagnstico etiolgico fluxograma para diagnstico das hepatites virais agudas fluxograma para diagnstico da hepatite C METODOLOGIAS PARA DIAGNSTICO SOROLGICO DAS HEPATITES VIRAIS dosagem bioqumica mtodos de biologia molecular testes sorolgicos hemaglutinao radioimunoensaio quimioluminescncia imunoenzimtico testes imunoenzimticos ELISA e Imunoblot ELISA fase slida, antgeno, anticorpo, enzima, substrato e cromgeno tipos e seqncias das reaes dos ELISA utilizadas na deteco dos marcadores sorolgicos das hepatites A, B e C sanduche para pesquisa de antgeno 18 19 20 22 23 23 24 26 26 26 28 31 33 33 34 34 35 35 35 35 36 37 38
ELISA indireto ELISA de captura para lgM ELISA competitivo definio de resultado no ELISA clculo da zona cinza componentes do Imunoblot seqncia de Imunoblot definio do resultado no Imunoblot critrio para utilizao do Imunoblot na testagem das amostras PROCEDIMENTOS PARA REALIZAO DOS TESTES SOROLGICOS PARA DIAGNSTICO DAS HEPATITES VIRAIS tipos de amostras registro de amostras, distribuio em alquotas, acondicionamento e conservao de amostras em laboratrios de unidades hemoterpicas registro de amostras, distribuio em alquotas, acondicionamento e conservao de amostras em laboratrios de sade pblica equipamentos e materiais para execuo do ELISA e do Imunoblot procedimentos gerais para execuo do ELISA procedimentos gerais para execuo do Imunoblot garantia de qualidade dos testes imunoenzimticos ANEXOS anexo 1: relao entre os resultados dos marcadores sorolgicos da hepatite B, o estgio e a evoluo da infeco anexo 2: exemplo de planilha de resultados em servio de hemoterapia anexo 3: exemplo de planilha de resultados de sorologia de hepatites utilizada em laboratrios de sade pblica anexo 4: exemplo de protocolo de ELISA em microplaca anexo 5: exemplo de protocolo de Imunoblot anexo 6: exemplo de planilha de resultados para teste complementar Imunoblot BIBLIOGRAFIA
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Introduo
A hepatite uma inflamao do fgado que pode estar relacionada a causas diversas, tais como: uso de alguns medicamentos, intoxicao por defensivos agrcolas, uso excessivo de bebidas alcolicas e agentes infecciosos. Os vrus so os principais agentes infecciosos causadores das hepatites. As hepatites virais apresentam distribuio mundial e ampla e esto entre as doenas infecciosas de maior importncia em sade pblica. Antes da descoberta dos vrus, a diferenciao dos tipos de hepatite s era possvel pela observao do tempo de incubao da doena e forma provvel de contgio. Assim, eram identificados apenas dois tipos de hepatite: de transmisso fecal-oral, por exemplo pela gua ou alimentos contaminados, e a de transmisso sangnea. Na dcada de 60, Blumberg, pesquisando as protenas do sangue, observou no soro de um australiano a presena de um antgeno que denominou de "antgeno Austrlia", hoje reconhecido como o antgeno de superfcie do vrus da hepatite B. Desde ento, a rpida evoluo dos conhecimentos possibilitou a deteco de diferentes vrus capazes de causar hepatites na espcie humana. Nos anos 70, foram descritas as partculas do vrus da hepatite B, por Dane, do vrus da hepatite A, por Feinstone e da hepatite D, por Rizzetto. Na dcada de 80, Choo descobriu o vrus da hepatite C e Balayan o vrus da hepatite E. A medida em que os vrus foram sendo descobertos, os testes para sua identificao puderam ser desenvolvidos, possibilitando o diagnstico. A utilizao rotineira dos testes sorolgicos em unidades hemoterpicas tem contribudo, de forma decisiva, para a reduo do nmero de casos de hepatites B e C ps-transfusionais.
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Observe que as partculas virais so constitudas por uma molcula de cido nucleico, envolvida por uma estrutura proteica chamada capsdeo.
cido nucleico viral o material gentico constitudo pelo RNA (cido ribonucleico) ou DNA (cido desoxiribonucleico) onde esto contidas as informaes para a produo de novos vrus.
O HAV - Vrus da Hepatite A - e o HEV - Vrus da Hepatite E - so vrus de RNA com capsdeos formados pelos antgenos HAVAg e HEVAg, respectivamente.
Antgeno - Ag - qualquer substncia que o organismo identifica como estranha e que induz a produo de protenas especficas (anticorpos) pelo sistema imune.
Observe, tambm, que o HBV - Vrus da Hepatite B - o nico com DNA e, alm disso, ele revestido por duas camadas: uma externa constituda por HBsAg - antgeno de superfcie do vrus da hepatite B; uma interna, ou core, constituda por HBcAg - antgeno c do vrus da hepatite B. O HBV possui, ainda, uma outra protena, HBeAg - antgeno e do vrus da hepatite B. Veja que o cido nucleico do HDV Vrus da Hepatite D - tambm chamado vrus Delta, constitudo de RNA com um antgeno associado o HDVAg. O envoltrio do HDV constitudo pelo HBsAg que o antgeno de superfcie do vrus da hepatite B, do qual o Delta depende para penetrar na clula e se multiplicar. Por isso, a infeco pelo HDV est sempre associada infeco pelo HBV. Finalmente, voc pode ver que o HCV Vrus da Hepatite C - um vrus RNA que possui capsdeo e um envoltrio mais externo, o envelope, de constituio lipoproteica. Alm das diferenas de estrutura e classificao, os vrus apresentam formas de transmisso e distribuio geogrfica distintas. Confira no prximo item.
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A infeco pelo HCV ocorre principalmente por via sangnea atingindo, com maior freqncia, indivduos que fazem uso compartilhado de seringas e os doentes crnicos, como por exemplo os doentes renais e os hemoflicos, que so expostos, constantemente, ao risco de contaminao em transfuses e em equipamentos de uso comum durante a dilise. O estabelecimento de critrios cada vez mais rigorosos para a triagem sorolgica dos doadores de sangue vem permitindo reduzir quase totalmente o risco de transmisso transfusional das hepatites B e C.
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Como voc pode ver, no h formas crnicas nas hepatites A e E. Observe que na hepatite B a evoluo para a forma crnica est relacionada idade em que o indivduo adquiriu a infeco.
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Ateno: no manual "Coleta de Sangue" do TELELAB voc encontra orientaes sobre o acondicionamento das amostras para transporte.
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HCV
Como voc j sabe, o vrus da hepatite B possui tambm uma protena interna chamada HBcAg. Este antgeno est no tecido heptico, mas no circula no sangue e, portanto, no um marcador sorolgico.
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Observe que: os anticorpos anti-HAV IgM aparecem em torno de quatro semanas aps a exposio, caracterizando a infeco aguda que coincide com o aparecimento dos sintomas e com os nveis mximos de ALT.
ALT - alanina aminotransferase. Veja no bloco "Metodologias para diagnstico das Hepatites Virais" mais informaes sobre essa enzima.
o anti-HAV IgM desaparece, em geral, em torno de 16 a 20 semanas aps a infeco, o que o classifica como um marcador de infeco recente; anticorpos anti-HAV IgG substituem gradativamente os anticorpos anti-HAV IgM e persistem por toda a vida, sendo indicativos de imunidade contra o vrus da hepatite A. O anti-HAV IgG pode tambm ser detectado para avaliar a resposta vacinal.
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Observe que: o HBsAg est presente no soro antes mesmo do incio das alteraes da ALT e do aparecimento dos sintomas. Este , portanto, o primeiro marcador a aparecer e sua concentrao mxima coincide com os sintomas. Por isso, um dos marcadores pesquisados tanto na triagem de doadores de sangue em unidades hemoterpicas quanto no diagnstico em laboratrios de sade pblica; o HBeAg surge no incio da infeco e pode ser detectado durante vrias semanas. Este marcador indica intensa multiplicao viral e, portanto, um maior potencial de transmisso;
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o anti-HBc IgM surge na fase aguda, podendo permanecer detectvel at oito meses aps o incio da infeco; o anti-HBc IgG substitui gradativamente o anti-HBc IgM e, em geral, persiste por toda vida, sendo til para indicar que houve em algum momento infeco pelo vrus da hepatite B; o anti-HBc (IgM+IgG) o nico marcador que define a etiologia da doena, detectvel entre o desaparecimento dos antgenos e o aparecimento dos anticorpos. Por isso, o anti-HBc pesquisado tanto na triagem de doadores de sangue, em unidades hemoterpicas, quanto no diagnstico em laboratrios de sade pblica; o anti-HBe pode ser detectado aps o desaparecimento do HbeAg indicando diminuio da multiplicao viral e a provvel evoluo para a cura da infeco; o anti-HBs pode ser detectado aps o desaparecimento do HBsAg. A presena de anti-HBs indica imunidade em relao infeco ou resposta vacinal. Em cerca de 5% a 10% dos casos de infeco pelo vrus da hepatite B no h desenvolvimento de imunidade, configurando a evoluo para a forma crnica.
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Como caracterizada sorologicamente a evoluo para a forma crnica da infeco pelo vrus da hepatite B?
Confira, na Figura 4, como se caracteriza sorologicamente a evoluo para a forma crnica da infeco pelo vrus da hepatite B:
Observe que a permanncia do HBsAg por mais de seis meses caracteriza a forma crnica da infeco. Este marcador est sempre presente ao longo do curso sorolgico da forma crnica. No curso sorolgico da infeco crnica pode ainda ser detectado o HBeAg ou o anti-HBe: a presena do HBeAg sinaliza uma forma mais grave da infeco; o anti-HBe indicador de um estgio com diminuio da multiplicao viral.
No Anexo 1, voc encontra um quadro que relaciona os marcadores sorolgicos da hepatite B com o estgio e a evoluo da infeco.
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Como voc pode ver, o anti-HCV detectado tardiamente, ou seja, cerca de trs meses aps a infeco. Assim, na faixa identificada como limiar de deteco, s possvel caracterizar a infeco pela identificao do RNA, por mtodos de biologia molecular. Veja o bloco de "Metodologias para Diagnstico Sorolgico das Hepatites Virais". Observe, tambm, que a dosagem de ALT no soro apresenta nveis variveis ao longo da infeco pelo HCV.
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Qual o fluxograma recomendado para a pesquisa dos marcadores HBsAg, anti-HBc e anti-HCV na triagem sorolgica de doadores de sangue?
Veja, a seguir, o fluxograma recomendado para a testagem dos marcadores HBsAg, anti-HBc e anti-HCV em unidades hemoterpicas:
Figura 6 -
Para a compreenso deste fluxograma, importante observar que: a amostra (soro ou plasma) testada para deteco dos marcadores sorolgicos HBsAg, anti-HBc e anti-HCV: a amostra no reagente para o marcador testado ser considerada amostra negativa para o mesmo;
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a amostra reagente ou indeterminada para qualquer um dos marcadores deve ser retestada em duplicata com o mesmo conjunto diagnstico; na retestagem em duplicata: a amostra no reagente para o marcador testado ser considerada amostra negativa para o mesmo.
Importante: Em caso de amostras reagentes na testagem inicial e no reagentes na retestagem, no libere nenhum dos resultados obtidos com as outras amostras testadas no mesmo protocolo. Isto porque possvel que tenha havido erro de transcrio no protocolo ou troca de amostras. Se o protocolo estiver correto, faa novamente o teste de todas as amostras.
sero descartados os hemocomponentes correspondentes amostra reagente, indeterminada ou com resultados discordantes para qualquer um dos marcadores sorolgicos testados; a definio do resultado de cada amostra deve obedecer aos critrios apresentados no Quadro 3:
Quadro 3 - Critrios para definio do resultado final da triagem sorolgica de doadores de sangue para os marcadores das hepatites B e C
Resultados da Triagem (-) ( + ) OU ( I ) ( + ) OU ( I ) (+) ( + ) OU ( I ) Resultados da retestagem em duplicata (-/-) (+/+) ( + / - ) ou ( - / + ) ou ( +/ I ) ou ( I / + ) ( - / I ) ou ( I / - ) ou ( I / I ) Resultados final Negativo Negativo Reagente Reagente Indeterminado
Ateno: a liberao dos hemocomponentes s pode ser feita quando todos os testes sorolgicos obrigatrios, conforme as normas vigentes do Ministrio da Sade, apresentarem resultados negativos.
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Quais os marcadores sorolgicos pesquisados para o diagnstico etiolgico das hepatites virais em laboratrios de sade pblica?
Para definio do diagnstico etiolgico das hepatites em laboratrios de sade pblica so pesquisados os marcadores anti-HAV IgM, HBsAg, anti-HBc IgM e o anti-HCV. Para testagem desses marcadores, so recomendados dois tipos de fluxogramas: um para a testagem dos marcadores HBsAg, anti-HBc IgM e anti-HAV IgM no diagnstico das hepatites virais agudas; um para a testagem do anti-HCV no diagnstico da hepatite C.
Qual o fluxograma recomendado para o diagnstico das hepatites virais agudas em laboratrios de sade pblica?
O Sistema de Vigilncia Epidemiolgica para as hepatites virais do Ministrio da Sade prope que a pesquisa dos marcadores sorolgicos para os casos de infeco aguda, seja realizada somente quando a dosagem da ALT indicar valores iguais ou maiores do que trs vezes o normal. Veja, na pgina seguinte, o fluxograma para o diagnstico etiolgico das hepatites virais agudas.
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Para a compreenso do fluxograma de diagnstico etiolgico das hepatites virais agudas, importante observar que: a amostra reagente tem seu resultado definido como "Amostra Positiva para o marcador testado"; a amostra no-reagente tem seu resultado definido como "Amostra Negativa para o marcador testado"; a amostra indeterminada para qualquer um dos marcadores deve ser retestada em duplicata com o mesmo conjunto diagnstico; na retestagem em duplicata a amostra reagente tem seu resultado definido como "Amostra positiva para o marcador testado"; a amostra no-reagente em duplicata tem seu resultado definido como "Amostra Negativa para o marcador testado"; a amostra indeterminada ou com resultados discordantes tem seu resultado definido como "Amostra Indeterminada para o marcador testado".
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Para compreenso deste fluxograma importante observar que: a amostra deve ser submetida a um ELISA para deteco do anti-HCV e seu resultado interpretado de acordo com os seguintes critrios: se a razo DO/CO (densidade tica/cut-off) for menor que 0,9 a amostra ser considerada no reagente e seu resultado definido como "amostra negativa para anti-HCV";
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se a razo DO/CO for maior que 0,9 e menor que 1,1, a amostra ser considerada indeterminada para anti-HCV e dever ser testada em duplicata, com o mesmo conjunto diagnstico; se a razo DO/CO for igual ou maior do que 5,0 a amostra ser considerada reagente e seu resultado definido como "amostra positiva para anti-HCV"; se a razo DO/CO for maior do que 1,1 e menor do que 5,0, a amostra ser considerada reagente com baixa relao DO/CO devendo ser testada por Imunoblot; na retestagem em duplicata: a amostra ser considerada negativa, indeterminada, reagente ou reagente com baixa relao DO/CO para anti- HCV, de acordo com os mesmos critrios definidos para a testagem anterior; a amostra indeterminada, com resultados discordantes ou reagente com baixa relao DO/CO dever ser testada por Imunoblot. no teste de Imunoblot: a amostra reagente tem seu resultado definido como "amostra positiva para anti-HCV"; a amostra no reagente tem seu resultado definido como "amostra negativa para anti-HCV"; a amostra indeterminada tem seu resultado definido como "amostra indeterminada para anti-HCV". Ateno: no bloco "Metodologias para Diagnstico Sorolgico das Hepatites Virais", voc encontra mais informaes sobre o critrio recomendado para definir as amostras reagentes a serem testadas por Imunoblot. Lembre-se: os laboratrios de sade pblica devem notificar casos de hepatites virais vigilncia epidemiolgica local.
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A dosagem bioqumica por sua simplicidade, o mtodo de primeira escolha para se detectar laboratorialmente a inflamao no fgado. Na maioria das hepatites virais, a elevao da ALT o primeiro indicador do processo inflamatrio. Por isso, o Ministrio da Sade, obriga que, na triagem sorolgica de doadores de sangue, seja realizada a dosagem da enzima alanina aminotransferase (ALT). Alm disso, a ALT importante na avaliao da evoluo da doena e da eficcia do tratamento. Mas para se definir qual a etiologia, ou seja, o agente causador da doena preciso realizar testes sorolgicos ou mtodos de biologia molecular.
A reao de amplificao de cidos nucleicos permite a produo de grande quantidade de fragmentos especficos do DNA que se deseja detectar na amostra, a partir de um molde inicial do material gentico (cidos nucleicos). Para a deteco de vrus RNA, torna-se necessrio fazer primeiro a transcrio reversa para DNA, ou seja, sntese do DNA, a partir do RNA, realizada pela enzima transcriptase reversa.
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Os mtodos de biologia molecular so amplamente utilizados em laboratrios de pesquisa e de referncia, mas ainda no esto disponveis para a rede de laboratrios. Por isso, a partir daqui sero enfocados os testes sorolgicos que so rotineiramente empregados no diagnstico das hepatites virais.
Que testes sorolgicos podem ser utilizados no diagnstico das hepatites virais?
Para o diagnstico das hepatites virais so utilizados os seguintes testes sorolgicos: hemaglutinao, radioimunoensaio, quimioluminescncia e imunoenzimtico. teste de hemaglutinao o teste em que a reao antgeno-anticorpo evidenciada pela aglutinao de hemcias sensibilizadas com antgenos ou anticorpos. A leitura, em geral, feita a olho nu. Os testes de hemaglutinao para pesquisa de marcadores sorolgicos das hepatites virais so realizados em placa de microtitulao, com diluies seriadas das amostras a serem testadas, permitindo uma anlise quantitativa do ttulo de antgenos ou anticorpos presentes. O ttulo corresponde ltima diluio da amostra em que foi observada aglutinao. Embora seja um teste de fcil execuo e com boa sensibilidade e especificidade, no existem, atualmente, conjuntos diagnsticos disponveis no mercado.
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A sensibilidade de um teste a sua capacidade de dar um resultado positivo quando o indivduo est verdadeiramente infectado. A especificidade de um teste a sua capacidade de dar um resultado negativo quando o indivduo no est infectado.
teste radioimunoensaio (RIA) o teste que utiliza uma substncia radioativa para deteco da reao antgeno-anticorpo. O resultado definido pela medida da radioatividade e sua leitura feita em equipamento prprio. Embora bastante sensvel, o RIA no muito utilizado devido aos riscos de manipulao, ao curto prazo de validade e s exigncias sanitrias para o descarte do material radioativo. teste de quimioluminescncia o teste que emprega uma substncia luminescente para deteco da reao antgeno-anticorpo. O resultado definido por emisso de luz que captada e analisada em equipamento prprio. Embora seja muito sensvel e especfico, o sistema de deteco por quimioluminescncia exige equipamentos especiais e ainda tem custo elevado. teste imunoenzimtico o teste onde a interao antgeno-anticorpo evidenciada pela ao de uma enzima e o substrato apropriado, e revelada por um cromgeno. Cromgeno - substncia que revela a ao de uma enzima sobre o substrato por meio de mudana de cor. Os testes imunoenzimticos so os mais utilizados porque so de fcil execuo, baixo custo e possibilitam a automao. Por isso, daqui para a frente voc vai ver com detalhes os testes imunoenzimticos.
Quais os testes imunoenzimticos mais utilizados em unidades hemoterpicas e em laboratrios de sade pblica?
O teste imunoenzimtico mais comumente usado em unidades hemoterpicas e em laboratrios de sade pblica o ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Como voc j sabe, no diagnstico da hepatite C, em funo dos resultados obtidos no ELISA, algumas amostras so testadas tambm por Imunoblot.
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Tanto o ELISA quanto o Imunoblot apresentam como componentes: fase slida, antgeno, anticorpo, enzima, substrato e cromgenos.
Fase slida: material capaz de adsorver o antgeno ou o anticorpo que ser empregado no teste.
Quais as variaes encontradas nos componentes do ELISA para o diagnstico das hepatites virais?
Confira, no Quadro 4, as variaes encontradas nos componentes do ELISA para o diagnstico das hepatites virais.
Quadro 4 - Variaes encontradas nos componentes do ELISA Fase Slida placas de microtitulao: produzidas, geralmente, em poliestireno transparente com 96 cavidades ou em tiras (strips) de 8 ou 12 cavidades, com fundo chato ou arredondado; ou prolas: pequenas esferas de poliestireno. obtido de plasma ou soro humano de indivduo infectado; ou produzido em cultura celular infectada com vrus; ou peptdeo sinttico: fragmento de protena sintetizada pela adio ordenada de aminocidos, de acordo com uma seqncia conhecida de cido nucleico; ou recombinante: protenas sintetizadas em organismos vivos (bactrias ou fungos), a partir de fragmento de cido nucleico modificado. monoclonal: anticorpo extremamente puro e especfico produzido por uma nica clula hbrida; ou policlonal: anticorpo especfico produzido pela inoculao de antgeno em animais de laboratrio. peroxidase. perxido de hidrognio (H2O2) ortofenilenodiamina (OPD); ou tetrametil benzidina (TMB). H2SO4; ou HCI.
Antgeno
Anticorpo
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A forma de combinar esses componentes caracteriza diferentes tipos de ELISA possibilitando a pesquisa de antgenos e anticorpos especficos.
Quais os tipos de ELISA utilizados para deteco dos marcadores sorolgicos das hepatites A, B e C?
Veja, no Quadro 5, os tipos de ELISA mais utilizados para o diagnstico da infeco pelo vrus das Hepatite A, B e C:
Quadro 5 - Tipos de ELISA mais utilizados
HEPATITES A MARCADORES SOROLGICOS anti-HAV IgM anti-HAV B HbsAg e HBe Ag anti-HBc IgM anti-HBc e anti-HBe anti-HBs C anti-HCV ELISA Captura para IgM Competitivo Sanduche para pesquisa de antgeno Captura para IgM Competitivo Indireto e sanduche para pesquisa de anticorpo Indireto
Ateno: os conjuntos diagnsticos para anti-HAV e anti-HBc detectam anticorpos totais (IgM +IgG). Nos prximos itens voc vai acompanhar a seqncia da reao em cada um dos tipos de ELISA.
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Figura 9 - Seqncia esquemtica de um ELISA sanduche para pesquisa de antgeno com uma amostra reagente
Observe que: na etapa 1, os anticorpos especficos esto adsorvidos fase slida; na etapa 2, adicionada a amostra que, sendo reagente, contm antgenos especficos que se ligam aos anticorpos da fase slida; na etapa 3, adicionado um conjugado, composto de uma enzima ligada a um anticorpo tambm especfico que interage com o antgeno da amostra; na etapa 4, adiciona-se o substrato e o cromgeno; na etapa 5, a ao da enzima no substrato revelada pelo cromgeno que sofre um processo de oxidao dando origem a um produto com cor na amostra reagente. A cor varia de acordo com o tipo de cromgeno utilizado. Nesta etapa, adicionada uma soluo de bloqueio que interrompe o processo de oxidao. Se esse processo no for interrompido, haver aparecimento de cor em todas as amostras levando a resultados falso-positivos.
Se no houver antgeno especfico na amostra, ou seja, se ela for uma amostra no reagente, a reao no acontecer e, conseqentemente, no haver desenvolvimento de cor.
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No ELISA indireto voc deve observar que: na etapa 1, os antgenos esto adsorvidos fase slida; na etapa 2, adicionada a amostra que, sendo reagente, contm anticorpos especficos que se ligam ao antgeno da fase slida; na etapa 3, com a adio de um conjugado composto de uma enzima ligada a um anti-anticorpo (anti-imunoglobulina humana) ocorre a interao anti-anticorpo e anticorpo da amostra. Neste caso, o conjugado no utiliza um anticorpo especfico para o antgeno, mas um antianticorpo humano, e por isso o teste considerado indireto; na etapa 4, adicionado o substrato e o cromgeno; na etapa 5, como voc j viu no ELISA tipo sanduche, a ao da enzima do substrato revelada pelo cromgeno, que possibilita o desenvolvimento de cor na amostra reagente. Nesta etapa, adicionada uma soluo de bloqueio que interrompe o processo de oxidao do cromgeno para evitar a ocorrncia de resultados falsopositivos.
Se no houver anticorpo especfico na amostra, ou seja, se ela for no reagente, a reao no acontecer e conseqentemente no haver desenvolvimento de cor.
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Figura 11 -
Seqncia esquemtica de um ELISA de captura para IgM com uma amostra reagente
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Na seqncia de um ensaio de captura para IgM, importante voc observar que: na etapa 1, os anticorpos anti- (anti-IgM humano) esto adsorvidos fase slida; na etapa 2, adicionada a amostra que, sendo reagente, contm anticorpos IgM que se ligam aos anticorpos da fase slida. Os anticorpos anti- da fase slida capturam os anticorpos IgM da amostra; na etapa 3, acrescenta-se antgeno especfico do teste que se liga aos anticorpos IgM especficos da amostra; na etapa 4, adiciona-se um conjugado composto de uma enzima ligada a um anticorpo contra esse antgeno especfico; na etapa 5, adiciona-se o substrato e o cromgeno; na etapa 6, do mesmo modo que nos ELISA sanduche e indireto, a ao da enzima sobre o substrato revelada pelo cromgeno que sofre um processo de oxidao, dando origem a um produto com cor na amostra reagente. A soluo de bloqueio, adicionada nesta etapa, interrompe o processo de oxidao do cromgeno evitando aparecimento de cor em todas as amostras, o que levaria a resultados falso-positivos. Se no houver na amostra anticorpo IgM especfico para o antgeno utilizado no teste, ou seja, se ela for no reagente, a reao no acontecer e, conseqentemente, no haver desenvolvimento de cor.
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Figura 12 -
Como voc pode ver: na etapa 1, os antgenos esto adsorvidos fase slida; na etapa 2, so adicionados a amostra e o conjugado. O conjugado composto de uma enzima ligada a um anticorpo especfico. Quando existem anticorpos na amostra eles competem com o anticorpo especfico do conjugado pela ligao com o antgeno adsorvido fase slida; na etapa 3, adiciona-se o substrato e o cromgeno; na etapa 4, no ELISA competitivo, quando a amostra reagente a ligao do conjugado no acontece, no h ao da enzima sobre o substrato e, conseqentemente, no h desenvolvimento de cor pelo cromgeno.
Observe que, ao contrrio dos outros testes, no ELISA competitivo a ausncia de cor ao final da reao indica que a amostra reagente e a presena de cor caracteriza a amostra no reagente.
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Ateno: se no houver anticorpo especfico na amostra, ou seja, se ela for uma amostra no reagente, a ao do conjugado sobre o substrato acontecer e ser evidenciada pelo desenvolvimento de cor promovido pela oxidao do cromgeno. Por isso, nesta etapa adicionada uma soluo de bloqueio que interrompe esse processo de oxidao para evitar o aparecimento de cor em todas as amostras levando a resultados falso-negativos.
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Figura 13 -
importante voc observar que: na etapa 1, ou seja, na fase slida, diferentes antgenos esto adsorvidos em uma fita de nitrocelulose; na etapa 2, adicionada a amostra que, sendo reagente, contm anticorpos especficos que se ligam aos diferentes antgenos da fase slida; na etapa 3, adicionado um conjugado composto de uma enzima ligada a um anti-anticorpo (anti-imunoglobulina humana) que interage com o anticorpo da amostra; na etapa 4, adicionado o substrato e o cromgeno; na etapa 5, quando a amostra reagente a ao da enzima sobre o substrato d origem a um produto insolvel que se precipita sobre a fita. A oxidao do cromgeno promove o aparecimento de cor no local da reao dando origem s bandas. Nesta etapa, adicionada gua para lavagem e eliminao da colorao inespecfica que impede a leitura do resultado.
Se no houver anticorpo especfico na amostra, ou seja, se ela for uma amostra no reagente, a reao no acontecer e, conseqentemente, no sero visualizadas as bandas caractersticas.
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Qual o critrio recomendado para definir as amostras que devem ser testadas por Imunoblot em funo dos resultados obtidos no ELISA?
Recomenda-se o seguinte critrio: Testar por Imunoblot as amostras que, na investigao da Hepatite C, obtiveram, no ELISA, resultados indeterminados ou reagentes com valores da razo DO/CO maior do que 1,1 e menor do que 5,0. Este critrio baseia-se em resultados obtidos por COUROUC e colaboradores (1991), MARTINS e colaboradores (1994) e GONALES (1997). Acompanhe um exemplo da aplicao deste critrio: Num EISA para investigar Hepatite C com CO = 0,329, duas amostras obtiveram os seguintes resultados: 0,600 calculando a razo DO = CO amostra 2: DO = 1,800 calculando a razo DO = CO amostra 1: DO = 0,600 = 1,8 0,329 1,800 = 5,4 0,329
Como voc pode ver, neste exemplo, a razo DO/CO 1,8 indica que a amostra 1 deve ser testada tambm por Imunoblot; a razo DO/CO 5,4 indica que a amostra 2 tem seu resultado definido no ELISA como amostra positiva para anti-HCV e, neste caso, dispensvel o teste por Imunoblot.
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Que tipo de amostra deve ser utilizada para o diagnstico das infeces pelos vrus das hepatites?
Soro ou plasma. Veja informaes sobre a preparao das amostras no manual TELELAB "Coleta de Sangue". Ateno: as amostras no podem estar turvas, lipmicas ou hemolisadas. Em qualquer desses casos elas devem ser descartadas e novas amostras devem ser solicitadas. Manipule sempre as amostras como material potencialmente infeccioso.
Em quantas alquotas devem ser distribudas as amostras, antes das anlises, em unidades hemoterpicas?
Em unidades hemoterpicas, antes de serem analisadas, as amostras de soro ou plasma devem, obrigatoriamente, ser distribudas em no mnimo duas alquotas: uma para os testes de rotina; outra para a contraprova. Recomenda-se se que a alquota da contraprova tenha um volume de aproximadamente 1 ml. A distribuio em um nmero maior de alquotas e o volume das mesmas fica a critrio de cada servio.
A alquota da contraprova deve ficar armazenada obrigatoriamente a 20C e estar disponvel por seis meses para a vigilncia sanitria.
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Como acondicionar e conservar as alquotas, antes de fazer as anlises nas unidades hemoterpicas?
Distribua as alquotas para os testes de rotina, em tubos ou frascos com tampa, previamente identificados com os dados correspondentes; Ateno: as alquotas das amostras podem ser conservadas em geladeira, entre 2 C e 8 C por 72 horas no mximo. Depois desse perodo, elas precisam ser congeladas a 20C; distribua em frascos prprios para congelamento a alquota da contraprova e demais alquotas a serem congeladas; acondicione esses frascos em caixas de papelo ou plstico rgido identificadas com informaes que facilitem a localizao dessas alquotas.
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preciso distribuir em alquotas as amostras para anlises nos laboratrios de sade pblica?
Nos laboratrios de sade pblica no existe a obrigatoriedade da alquota para contraprova. No entanto, recomenda-se que a amostra seja distribuda no mnimo em duas alquotas: uma para realizar os testes solicitados, e outra para atender necessidades relacionadas, por exemplo, execuo de testes complementares. Para acondicionar e armazenar as amostras utilize os mesmos procedimentos j apresentados no item anterior. Quais os materiais necessrios para executar um ELISA e um teste de Imunoblot? No Quadro 7 esto os materiais geralmente fornecidos pelo fabricante.
Quadro 7 - Materiais geralmente fornecidos pelo fabricante ELISA placa de microtitulao ou prolas sensibilizadas com antgenos ou anticorpos Imunoblot fitas de nitrocelulose com protenas adsorvidas em bandas pinas plsticas para manipulao de fitas de nitrocelulose canaletas plsticas para a colocao das fitas selos ou tampas de cobertura soro-controle negativo soro-controle positivo solues-tampo para a diluio das amostras e do conjugado soluo-tampo para a lavagem conjugado substrato e cromgeno soluo-tampo para diluir o substrato
selos ou tampas de cobertura soro-controle negativo soro-controle positivo solues-tampo para a diluio das amostras e do conjugado soluo-tampo para a lavagem conjugado substrato e cromgeno soluo-tampo para diluir o substrato soluo de bloqueio de reao
No Quadro 8, a seguir, voc pode conferir os outros materiais necessrios mas no fornecidos pelo fabricante.
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Quadro 8- Materiais no fornecidos pelo fabricante para o ELISA e Imunoblot pipetas manuais de volume ajustvel ( 5 a 50 l, de 50 a 200 l e de 200 a 1.000 l) mono e multicanal ponteiras descartveis para pipetas ajustveis pipetas sorolgicas de 5 ml, 10 ml e 20 ml pra de borracha ou outro auxiliar de pipetagem barquetes (reservatrios) para a utilizao de pipetas multicanal (ELISA) bquer de 1.000 ml provetas de 1.000 ml, 500 ml e 100 ml frasco com tampa de 1.000 ml basto de vidro equipamentos de proteo individual: luvas, mscaras, avental ou jaleco recipiente de paredes rgidas, boca larga e tampa contendo hipoclorito de sdio a 2%. soro para controle de qualidade interno da reao. Veja orientaes no curso TELELAB "Controle de Qualidade de Testes Sorolgicos em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica" protocolos (vide bloco "Anexos")
Observe que as pipetas multicanal so utilizadas apenas para os ELISA e os outros materiais so necessrios nos dois testes. Alm dos materiais constantes dos Quadros 7 e 8, o laboratrio deve estar equipado com: banho-maria com termostato para regulagem de temperatura; agitador orbital; estufa com termostato regulvel e sistema de lavagem e de leitura compatveis com os mtodos empregados e com as especificaes dos conjuntos diagnsticos disponveis. Antes de iniciar um procedimento, verifique se os equipamentos esto " em condies adequadas de uso. No curso TELELAB Equipamentos - Utilizao e Monitoramento em Unidades Hemoterpicas e Laboratrios de Sade Pblica", voc encontra as orientaes necessrias.
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11. verifique se os resultados obtidos para os controles esto de acordo com os critrios definidos pelo fabricante. Caso contrrio, faa novamente o teste procurando identificar e corrigir as causas dos resultados inadequados. S considere os resultados das amostras quando os resultados dos controles estiverem de acordo com os critrios do fabricante. 12. registre os resultados em sua planilha, no campo correspondente ao marcador sorolgico testado. 13. despreze as amostras e os resduos do conjunto diagnstico utilizado, conforme as orientaes do curso TELELAB - "Biossegurana em Unidades Hemoterpicas e em Laboratrios de Sade Pblica". Jamais inicie a execuo dos testes antes de arrumar sua bancada de trabalho com todos os materiais e equipamentos necessrios. Utilize sempre equipamentos de proteo individual e manipule as amostras como material potencialmente infeccioso.
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7. 8. 9. 10. 11.
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leia atentamente como preparar todas as solues antes de iniciar o teste. Utilize exatamente os volumes indicados, no faa qualquer alterao com o intuito de economizar tempo ou reagentes; deixe as amostras e os reagentes que sero utilizados atingirem a temperatura ambiente, antes de iniciar a reao; faa um protocolo de trabalho, relacionando os controles e o registro das amostras com o nmero existente em cada fita de nitrocelulose. Veja um exemplo de protocolo de Imunoblot no Anexo 5 deste manual; utilize pinas plsticas para manipular as fitas de nitrocelulose; coloque cada uma das fitas em uma canaleta, mantendo a face numerada voltada para cima; mantenha as canaletas cobertas de modo a evitar a mistura do contedo das mesmas; siga rigorosamente os ciclos de lavagem indicados pelo fabricante, tendo o cuidado de evitar a contaminao cruzada das amostras; observe, rigorosamente, todos os volumes, os tempos e as formas de homogeneizao e os perodos de incubao recomendados pelo fabricante; faa a leitura e interprete os resultados de acordo com as recomendaes do fabricante; verifique se os resultados obtidos para os controles esto de acordo com os critrios definidos pelo fabricante. Caso contrrio, faa novamente o teste procurando identificar e corrigir as causas dos resultados inadequados. S considere os resultados das amostras quando os resultados dos controles estiverem de acordo com os critrios do fabricante; registre os resultados do teste, de acordo com o seu protocolo de trabalho, em uma planilha de resultados de testes complementares como a apresentada no Anexo 6; despreze as amostras e os resduos do conjunto diagnstico utilizado, conforme as orientaes do curso TELELAB - "Biossegurana em Unidades Hemoterpicas e em Laboratrios de Sade Pblica".
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Como proceder para garantir a qualidade dos resultados dos testes imunoenzimticos?
No utilize as amostras de soro ou plasma que apresentarem turvao, hemlise ou lipemia. Para maiores informaes consulte o manual "Coleta de Sangue" do TELELAB; no use conjuntos diagnsticos ou reagentes com prazo de validade vencido; verifique se os reagentes apresentam turvao, precipitao ou alterao de cor, o que os torna imprprios para uso. no misture controles, conjugados, tampes, reagentes, prolas, placas, strips ou fitas de diferentes lotes e/ou fabricantes; armazene os conjuntos para diagnstico de acordo com as recomendaes do fabricante; no exponha o substrato luz durante o armazenamento ou incubao da reao, evitando assim a fotodecomposio do mesmo; no coloque o substrato em contato com substncias oxidantes ou metais, para evitar sua degradao evidenciada pela alterao de cor, tornando o produto imprprio para uso; faa a limpeza e a manuteno peridica dos equipamentos de lavagem, evitando dessa maneira o acmulo de sais e outros compostos qumicos; verifique se o filtro usado para a leitura da absorbncia aquele indicado pelo fabricante; Faa a limpeza e a manuteno peridica dos equipamentos utilizados na reao. A segurana e a confiabilidade dos testes para diagnstico dependem tambm, entre outros parmetros, da sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade.
A sensibilidade de um teste a sua capacidade de dar um resultado positivo quando o indivduo est verdadeiramente infectado. A especificidade de um teste a sua capacidade de dar um resultado negativo quando o indivduo no est infectado. A reprodutibilidade de um teste a sua capacidade de obter repetidamente os mesmos resultados em diferentes testes realizados com a mesma amostra, empregando a mesma metodologia e o mesmo conjunto diagnstico.
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ANEXO 1 CORRESPONDNCIA ENTRE OS RESULTADOS DOS TESTES DOS MARCADORES DA HEPATITE B E O ESTGIO/EVOLUO DA INFECO
Resultados dos testes dos marcadores sorolgicos da Hepatite B HBsAg HBeAg Anti-HBc lgM Anti-HBc Anti-HBe Anti-HBs Estgio/evoluo da infeco Perodo de incubao Hepatite B aguda Hepatite B aguda ou Hepatite B crnica Incio da fase de convalescncia Exposio ao HBV Imune infeco passada Imune resposta vacinal Suscetvel infeco pelo HBV
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ANEXO 3 EXEMPLO DE PLANILHA DE RESULTADO DE SOROLOGIA DE HEPATITES UTILIZADA EM LABORATRIOS DE SADE PBLICA
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Tcnico responsvel:__________________________________________
1 A B C D E F G H
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Mdia dos controles negativos: Mdia dos controles positivos: Valor do cut off: _________________________________________________________________ _________________________________________________________________
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Identificao
Bandas 1 2 3 4
Resultado
N do Lote:
Validade:__/__/__ Fabricante:
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Agradecimentos: Fundao Hemocentro de Braslia Instituto de Sade do Distrito Federal ISDF Instituto Oswaldo Cruz IOC FIOCRUZ Fundao Nacional de Sade FNS Fundao de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas HEMOAM Fundao de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Estadual de Campinas UNICAMP Universidade Federal de Santa Catarina UFSC Editora da Universidade de Braslia EDUNB Agradecimento Especial: Beatriz Mac Dowell Soares, Jos Antnio de Farias Vilaa e aos servidores da Fundao Hemocentro de Braslia, pelo apoio incondicional para a execuo deste projeto. Projeto Grfico, arte-final e impresso: